CN113274407B - 一种抗衰老的细胞制剂及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种抗衰老的细胞制剂及其制备方法。抽取健康年轻人的外周血，分离出单个核细胞群，然后用诱导细胞培养基培养单个核细胞，获得抗衰老的细胞制剂；所述的诱导细胞培养基在DMEM/F12基础培养基中添加有L‑谷氨酰胺、非必需氨基酸，rhbFGF、rhEGF、rhSCF、rhBDNF和人血清白蛋白。在体外分离获得外周血单个核细胞，再经过预诱导培养，可以去除外周血的终末细胞，还可以获得具有神经干细胞分化倾向的带有外周血干/祖细胞特性的细胞群体，这样的细胞异体输入老年虚弱的个体，不但可以增强虚弱老年个体的体质，还可以增加虚弱老年个体对周围环境的感知度，以及皮肤光亮度和年轻度增加。动物实验显示经过预诱导培养的这样的人的细胞，可以延长寿命。

Description

一种抗衰老的细胞制剂及其制备方法
技术领域：
本发明属于生物医药领域，具体涉及一种抗衰老的细胞制剂及其制备方法。
背景技术：
随着我国经济的发展，人的寿命越来越长。目前我国60岁以上的人口达到2.5亿左右， 预计2050年将达到5亿左右。所以我国已经进入老龄化社会，养老问题已成为社会的焦点。 这包括老年病的治疗、老年生活质量的提高、寿命的延长都是人们所关注的。虽然目前医药 和饮食水平的提高，可以解决一部分老年问题，但是还达不到人们的预期。而细胞治疗特别 是干细胞治疗给人们的抗衰老增加了一个新的希望。
众所周知，干/祖细胞除了自身可以增殖之外，还可以分化为多种组织的功能细胞，以及 还具有分泌一些可以促进组织再生和保持组织活力的活性因子，从而起到修复损伤组织和抗 衰老的作用。另外，年轻个体含有的干细胞数量比老年个体的多，其活力也比老年个体的强。 外周血单个核细胞群因含有外周血干/祖细胞，所以也具有上述干细胞的功能和作用。目前有 使用骨髓和脐带间充质干细胞进行抗衰老的研究，但这些细胞来源数量有限，制作复杂和耗 时，不利于临床的应用。
发明内容：
本发明的第一个目的是提供一种抗衰老的细胞制剂及其制备方法。
所述的抗衰老的细胞制剂是通过以下方法制备的：
抽取健康年轻人的外周血，分离出单个核细胞群，然后用诱导细胞培养基培养单个核细 胞，获得抗衰老的细胞制剂；
所述的诱导细胞培养基在DMEM/F12基础培养基中添加有L-谷氨酰胺、非必需氨基酸， rhbFGF、rhEGF、rhSCF、rhBDNF和人血清白蛋白。
优选，所述的健康年轻人是30岁以下的健康年轻人。进一步优选是30岁以下的血常规 和尿常规正常，心肺功能正常，无遗传病，无乙肝、艾滋病、钩端螺旋体等传染病的年轻人。
优选，所述的分离出单个核细胞群是用人单个核细胞分离液，2000rpm离心20min分离 出单个核细胞群。
优选，所述的用诱导细胞培养基培养单个核细胞是培养3天以上。
优选，所述的诱导细胞培养基为：DMEM/F12基础培养基中添加有1～3％L-谷氨酰胺 0.5～3ml/100ml，100×非必需氨基酸0.5～3ml/100ml，rhbFGF 500～3000ng/100ml，rhEGF 500～3000ng/100ml，rhSCF 100～500ng/100ml，rhBDNF 500～2000ng/100ml和人血清白蛋白 50～200mg/100ml，所述的DMEM/F12基础培养基是由DMEM和F12培养基按照体积比1:1 混合而成。
所述的用诱导细胞培养基培养单个核细胞是用诱导细胞培养基培养单个核细胞，5％CO2、 100％湿度、37℃培养箱内进行培养48小时，培养48小时后半量更换培养液，在体外共培养 3天，然后收集细胞，获得抗衰老的细胞制剂。
本发明的第二个目的是提供一种抗衰老的细胞疗法，其是将上述抗衰老的细胞制剂注射 到病人体内。
优选是经外周静脉输入到病人体内。
优选，每个月将上述抗衰老的细胞制剂注射到病人体内，连续4个月，每次输入的单个核 细胞来自不同的供血者。
本发明从细胞数量来源、制作程序和制作时间上进行改进，大大提高细胞数量来源，简 化制作程序，缩短制作时间。我们的研究发现在体外分离获得外周血单个核细胞，再经过一 定培养条件的预诱导培养，可以去除外周血的终末细胞，还可以获得具有神经干细胞分化倾 向的带有外周血干/祖细胞特性的细胞群体，这样的细胞异体输入老年虚弱的个体，不但可以 增强虚弱老年个体的体质(包括免疫力的提高和体重的增加)，还可以增加虚弱老年个体对周 围环境的感知度(包括精神状态的提升和对周围环境反应性提高)，以及皮肤光亮度和年轻度 增加。动物实验显示经过预诱导培养的这样的人的细胞，可以延长寿命。
与现有技术相比所具有的优点、特点和积极效果如下：
1、细胞来源丰富，可以由年经的供血者不断提供；
2、细胞采集时对供血者所造成的外伤为最小，所造成的心里压力为最小；
3、细胞体外分离和培养程序简单，时间短，仅为3天即可获得可输入的细胞。
具体实施方式：
下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例1：
一、外周血单个核细胞的分离
1、每次抽取30岁以下健康年轻人(血常规和尿常规正常，心肺功能正常，无遗传病， 无乙肝、艾滋病、钩端螺旋体等传染病)外周血200ml；
2、用人单个核细胞分离液(天津灏洋华科生物科技有限公司)，2000rpm离心20min分 离出单个核细胞群；
3、计数后进行下步的培养。
二、外周血单个核细胞的预诱导培养和鉴定
1、诱导细胞培养基：DMEM/F12(100ml/100ml)，LG((质量分数3％L-谷氨酰胺溶液，100×，1ml/100ml)，非必需氨基酸(100×，1ml/100ml)，重组人碱性成纤维细胞生长因子rhbFGF(2000ng/100ml)，基因重组人表皮生长因子rhEGF(2000ng/100ml)，重组人干细胞因子 rhSCF(400ng/100ml)，重组人脑源性神经营养因子rhBDNF(1000ng/100ml)和人血清白蛋白 (100mg/100ml)混匀后，0.22μm过滤器过滤后4℃保存备用。
2、用上述诱导细胞培养基培养自外周血分离获得的外周血单个核细胞，5％CO2、100％ 湿度、37℃培养箱内进行培养48小时；
3、培养48小时后半量更换培养液；
4、自外周血分离获得的外周血单个核细胞在体外共培养3天，然后收集细胞，进行下 一步的鉴定和治疗用；
5、细胞鉴定：刚分离获得的外周血单个核细胞和在体外预诱导培养3天的细胞进行血 液细胞标志物、免疫原性标志物和神经干细胞标志物的鉴定，使用的鉴定方法是：免疫荧光 检测法、流式细胞检测法、RT-PCR。检测指标有：CD45、CD3、CD19、CD16、HLA-I、HLA-DR、 Nestin、Vimentin。经过3天预诱导培养后血液细胞标志物CD45、CD3、CD19、CD16和免疫原性标志物HLA-I、HLA-DR表达降低，而神经干细胞标志物Nestin、Vimentin表达上升，细胞总数降低三分之一左右。和刚分离获得的外周血单个核细胞比较，经预诱导培养3天后的细胞免疫原性更低，终末细胞少，细胞干性更高，提示不容易引起受体免疫排斥反应以及干细胞功能作用更强。
三、预诱导培养的外周血单个核细胞的体内治疗方案
1、200ml 30岁以下健康年轻人外周血单个核细胞经体外3天培养后，收集细胞、计数， 然后用无人血清白蛋白的诱导细胞培养基悬浮细胞，调成1╳106个/ml的细胞浓度，保存在 10℃的环境中传送到临床；
2、经过外周静脉输入到病人体内；
3、每个月一次输入上述经过预诱导培养的年轻人外周血单个核细胞；连续4个月，共 输入4次为一疗程；每次输入的外周血单个核细胞来自不同的供血者；
4、每次疗程维持5年左右不等，效果开始衰退时可以重新进行输入。
四、治疗后的观察指标
1、精神状态：细胞输入后第二天病人精神状态明显改善，对周围事物的反应性提高；
2、皮肤状态：细胞输入后第二天病人皮肤光泽度提高，无瘙痒和红疹等不良反应出现；
3、胃肠反应：细胞输入后病人食欲增强，无腹泻、反胃等不良反应；
4、体温变化：细胞输入后病人体温正常，无异常体温出现。
5、体重变化：自第一次细胞输入后，经过4次细胞输入，半年内病人的体重会逐渐增 加，但是不会过度的肥胖；
6、血清超氧化物歧化酶(SOD)的变化：每次细胞输入后1～2周，血清超氧化物歧化酶会增高，提示抗氧化损伤能力提高，同时也提示产生抗衰老的作用；
7、血清丙二醛含量(MDA)的变化：每次细胞输入后1～2周，血清丙二醛含量降低，提示体内氧化损伤过程降低，同时也提示产生抗衰老的作用。
以猴子治疗为案例：
一、猴子：4只2.0-2.2岁大(相当于人8-9岁，2公2母，平均体重约2.13Kg)的年轻食蟹猴为供体组；3只12.6-14.9岁老龄猴(相当于人50-60岁，2公1母，平均体重约6.23Kg)作为实验组，4只12.5-15.0岁老龄猴(相当于人50-60岁，2公2母，平均体重约6.74Kg) 作为对照组。
二、外周血单个核细胞的分离
1、4只2.0-2.2岁的年轻食蟹猴，通过肌肉注射舒泰50(5mg/kg)进行麻醉，每只采集静 脉血约20ml，装入事先准备好的抗凝管中；
2、用猴单个核细胞分离液(天津灏洋华科生物科技有限公司)，2000rpm离心20min分 离出单个核细胞群；
3、细胞计数；4只年轻食蟹猴平均每只供血3次，平均每只每次供血获得约2.15×107个 外周血单个核细胞，进行下步的培养。
三、外周血单个核细胞的预诱导培养
1、用上述步骤二中的诱导细胞培养基培养获得的外周血单个核细胞，5％CO2、100％湿 度、37℃培养箱内进行培养48小时；
3、培养48小时后半量更换培养液；
4、在体外共培养3天，然后收集细胞，计数，获得预诱导培养的外周血单个核细胞平 均每只猴子每次约1.43×107个细胞。
四、预诱导培养的外周血单个核细胞的体内治疗方案
1、用无人血清白蛋白的诱导细胞培养基悬浮细胞，调成1╳106个/ml的细胞浓度，每 次平均约有14.3ml的细胞悬液，保存在10℃的环境中传送到临床；
2、实验组和对照组的老龄猴，体弱，精神状态差，对周围事物的反应欠佳，食欲不佳； 实验组3只老龄猴经过外周静脉输入上述约14.3ml/只的细胞悬液，对照组外周静脉输入和实 验组等体积的无细胞无人血清白蛋白的诱导细胞培养液；
3、每个月一次，连续4个月输入上述经过预诱导培养的年轻猴外周血单个核细胞(实 验组)和无细胞无人血清白蛋白的诱导细胞培养液(对照组)，每只老龄猴共输入4次为一疗 程；实验组每次输入的外周血单个核细胞来自不同的年经猴；
五、治疗后的观察指标
1、精神状态：细胞输入后第二天实验组老龄猴精神状态明显改善，对周围事物的反应性 提高；对照组老龄猴则无明显改善；
2、皮肤状态：细胞输入后第二天实验组老龄猴皮肤和毛发光泽度提高，对照组老龄猴则 无明显改善；两组老龄猴都无瘙痒和红疹等不良反应出现；
3、胃肠反应：细胞输入后第二天起实验组老龄猴食欲增强，对照组老龄猴则无明显改善； 两组都无腹泻、呕吐等不良反应；
4、体温变化：细胞输入后两组老龄猴体温都正常，无异常体温出现(见表1)；
表1两组各个时间点的体温的统计描述
Figure BDA0003000037930000071
Figure BDA0003000037930000072
Figure BDA0003000037930000081
体重变化：自第一次细胞输入后，经过4次细胞输入，半年内实验组老龄猴的体重逐渐 增加，由第一次输入前体重约6.23Kg，半年后体重升至约7.95Kg，但是不会过度的肥胖；对 照组老龄猴由第一次输入前体重约6.74Kg，半年后体重升至6.93Kg，体重无明显变化(见表 2)；
表2两组各个时间点体重的统计描述
Figure BDA0003000037930000082
编号 称重时间 实验组 对照组 实验组-对照组
0 移植前14天 6.23±2.40 6.74±1.24 -0.51
1 移植一第0天 6.81±2.72 6.89±1.54 -0.07
2 移植一第14天 6.96±2.72 6.82±1.56 0.14
3 移植二第0天 7.22±2.91 6.88±1.50 0.34
4 移植二第14天 7.29±2.90 6.87±1.61 0.42
5 移植三第0天 7.27±2.92 6.76±1.66 0.51
6 移植三第14天 7.38±2.93 6.78±1.67 0.60
7 移植四第0天 7.51±2.96 6.91±1.85 0.60
8 移植四第14天 7.62±3.03 6.91±2.03 0.71
9 移植结束30天 7.83±3.03 7.03±2.15 0.80
10 移植结束60天 7.95±3.08 6.93±2.13 1.03
5、血清超氧化物歧化酶(SOD)的变化：每次细胞输入后二周，实验组老龄猴血清超氧化物歧化酶会增高，提示抗氧化损伤能力提高，同时也提示产生抗衰老的作用；而对照组老龄猴随着时间的推移数值有所下降(见表3)；
表3两组各个时间点SOD活力的变化分析(X±S,U/ml)
编号 采血时间 实验组 对照组
0 移植前14天 102.53±4.42 102.02±7.85
2 移植一第14天 106.54±4.47 106.39±7.57
4 移植二第14天 115.35±3.53 101.45±6.40
6 移植三第14天 125.74±7.90 94.57±12.51
8 移植四第14天 137.34±5.54 92.53±10.62
9 移植结束30天 144.59±2.32 90.72±8.77
10 移植结束60天 158.42±6.95 89.45±4.84
7、血清丙二醛含量(MDA)的变化：每次细胞输入后二周，实验组老龄猴血清丙二醛含量降低，提示体内氧化损伤过程降低，同时也提示产生抗衰老的作用；而对照组老龄猴则无明显变化(见表4)；
表4两组各个时间点MDA含量的变化分析(X±S,nmol/ml)
编号 采血时间 实验组 对照组
0 移植前14天 4.18±0.56 3.04±0.54
2 移植一第14天 3.80±0.39 4.20±0.60
4 移植二第14天 2.88±0.64 4.24±0.97
6 移植三第14天 2.20±0.46 4.26±0.66
8 移植四第14天 2.04±1.04 4.24±0.59
9 移植结束30天 2.07±0.61 4.64±0.24
10 移植结束60天 2.16±0.96 4.78±1.13
8、停止实验后，已经过接近两年的饲养观察，实验组老龄猴和对照组的都无异常，但实 验组老龄猴的精神状态明显比对照组的好。

Claims (5)

1.一种抗衰老的细胞制剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
抽取健康年轻人的外周血，分离出单个核细胞群，然后用诱导细胞培养基培养单个核细胞，获得抗衰老的细胞制剂；
所述的诱导细胞培养基为：DMEM/F12基础培养基中添加有1～3% L-谷氨酰胺 0.5～3ml/100ml，100×非必需氨基酸0.5～3 ml/100ml，rhbFGF 500～3000ng/100ml，rhEGF 500～3000ng/100ml，rhSCF 100～500ng/100ml，rhBDNF 500～2000ng/100ml和人血清白蛋白50～200mg/100ml，所述的DMEM/F12基础培养基是由DMEM和F12培养基按照体积比1:1混合而成；
所述的用诱导细胞培养基培养单个核细胞是用诱导细胞培养基培养单个核细胞，5%CO2、100%湿度、37℃培养箱内进行培养48小时，培养48小时后半量更换培养液，自外周血分离获得的外周血单个核细胞在体外共培养3天，然后收集细胞，获得抗衰老的细胞制剂。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的健康年轻人是30岁以下的健康年轻人。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的分离出单个核细胞群是用人单个核细胞分离液，2000rpm离心20min分离出单个核细胞群。
4. 根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的诱导细胞培养基为：DMEM/F12基础培养基中添加有3% L-谷氨酰胺 1 ml/100ml，100×非必需氨基酸1 ml/100ml，rhbFGF2000ng/100ml，rhEGF 2000ng/100ml，rhSCF 400ng/100ml，rhBDNF1000ng/100ml和人血清白蛋白100mg/100ml，所述的DMEM/F12基础培养基是由DMEM和F12培养基按照体积比1:1混合而成。
5.一种根据权利要求1、2、3或4所述的制备方法制备得到的抗衰老的细胞制剂。
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