CN111534482B - 脐带间充质干细胞成软骨分化、成软骨分化培养基 - Google Patents

脐带间充质干细胞成软骨分化、成软骨分化培养基 Download PDF

Info

Publication number
CN111534482B
CN111534482B CN202010444192.0A CN202010444192A CN111534482B CN 111534482 B CN111534482 B CN 111534482B CN 202010444192 A CN202010444192 A CN 202010444192A CN 111534482 B CN111534482 B CN 111534482B
Authority
CN
China
Prior art keywords
chondrogenic differentiation
group
stem cells
mesenchymal stem
umbilical cord
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202010444192.0A
Other languages
English (en)
Other versions
CN111534482A (zh
Inventor
朱阳晨
赵玲
杨旭
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Shandong Zhuodong Biotechnology Co ltd
Original Assignee
Shandong Zhuodong Biotechnology Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Shandong Zhuodong Biotechnology Co ltd filed Critical Shandong Zhuodong Biotechnology Co ltd
Priority to CN202010444192.0A priority Critical patent/CN111534482B/zh
Publication of CN111534482A publication Critical patent/CN111534482A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN111534482B publication Critical patent/CN111534482B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0652—Cells of skeletal and connective tissues; Mesenchyme
    • C12N5/0655—Chondrocytes; Cartilage
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/30—Organic components
    • C12N2500/32—Amino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2506/00—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells
    • C12N2506/13—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from connective tissue cells, from mesenchymal cells
    • C12N2506/1346—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from connective tissue cells, from mesenchymal cells from mesenchymal stem cells
    • C12N2506/1369—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from connective tissue cells, from mesenchymal cells from mesenchymal stem cells from blood-borne mesenchymal stem cells, e.g. MSC from umbilical blood

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明公开了脐带间充质干细胞成软骨分化、成软骨分化培养基。蛋白聚糖和Ⅱ型胶原蛋白为软骨特异性基质产物，对照诱导组hUC‑MSCs在基础诱导培养基的诱导下出现了明显的成软骨分化，L‑酪氨酸衍生物1、2诱导组比对照诱导组中蛋白聚糖和Ⅱ型胶原蛋白含量更高，说明L‑酪氨酸衍生物1、2诱导组中的L‑酪氨酸衍生物1、2可以进一步促进hUC‑MSCs成软骨分化，且具有剂量效应。由此可见，L‑酪氨酸衍生物1、2具有在体外促进脐带间充质干细胞成软骨分化的作用，可以用于制备促进脐带间充质干细胞成软骨分化的培养基。

Description

脐带间充质干细胞成软骨分化、成软骨分化培养基
技术领域
本发明属于干细胞领域，涉及脐带间充质干细胞诱导分化，具体涉及脐带间充质干细胞成软骨分化、成软骨分化培养基。
背景技术
软骨组织工程是治疗软骨损伤疾病的重要生物工程手段。在软骨组织工程中，种子细胞的选择主要考虑以下几点：细胞易获取并且来源充足，对取材对象损伤小；较低的免疫排斥；具有诱导分化潜力并且增殖分化能力较强等；可以通过体外扩增技术获取大量传代细胞。
软骨修复和再生以往集中在软骨细胞方面，尽管这些细胞取材方便和免疫原型较低，但其获取细胞量很少并且具有去分化等缺点，这限制了软骨修复再生的发展。在诱导具有分化潜力的细胞向软骨向分化的研究中，各种来源的细胞被报道，其中间充质干细胞具有不可替代的成软骨诱导分化能力被广泛关注。虽然人骨髓间充质干细胞等作为干细胞源是软骨组织工程的主要对象，但受年龄限制的骨髓移植过程不可避免地伴随着疼痛和损伤，而且骨髓基质干细胞的利用率很低，增殖分化能力随年龄的增长而下降。相较于其它干细胞，脐带间充质干细胞具有低免疫原型，同时具备成软骨潜力，可以作为软骨组织工程的细胞来源之一。
人脐带间充质干细胞(hUC-MSCs)是一类具有多向分化能力和自我更新能力的间充质干细胞。因脐带具有取材容易，不容易被污染，不涉及道德、伦理和法律方面的问题等诸多优点，被广泛用于hUC-MSCs的提取。而且，研究发现hUC-MSCs的体外扩增和多向分化能力比其他组织来源的间充质干细胞更强。
冯学涛等发现，血小板裂解液在体外具有定向诱导人脐带间充质干细胞分化成软骨细胞中的作用(血小板裂解液对人脐带间充质干细胞体外成软骨分化的影响，中国修复重建外科杂志，2011年10期)。
罗二梅等发现，还原型谷胱甘肽对人脐带间充质干细胞的成软骨诱导具有促进作用(还原型谷胱甘肽对人脐带间充质干细胞成软骨诱导的影响，中国生物工程杂志，2013年03期)
更多的脐带间充质干细胞成软骨分化诱导剂尚待寻找发现。
发明内容
本发明是为了克服现有技术中存在的不足，提供一种脐带间充质干细胞成软骨分化、成软骨分化培养基。
本发明技术方案如下：
一种L-酪氨酸衍生物在体外促进脐带间充质干细胞成软骨分化中的应用。
进一步地，所述L-酪氨酸衍生物为如下化学结构式所示的L-酪氨酸衍生物：
Figure BDA0002505006420000021
一种L-酪氨酸衍生物用于制备促进脐带间充质干细胞成软骨分化培养基的用途。
进一步地，所述L-酪氨酸衍生物为如下化学结构式所示的L-酪氨酸衍生物：
Figure BDA0002505006420000022
一种用脐带间充质干细胞制备软骨细胞的培养基，含有L-酪氨酸衍生物。
进一步地，所述L-酪氨酸衍生物为如下化学结构式所示的L-酪氨酸衍生物：
Figure BDA0002505006420000023
有益技术效果：
本发明发现，L-酪氨酸衍生物1、2具有在体外促进脐带间充质干细胞成软骨分化的作用，可以用于制备促进脐带间充质干细胞成软骨分化的培养基。
附图说明
图1为L-酪氨酸衍生物1和L-酪氨酸衍生物2的化学结构式；
图2为hUC-MSCs的表型流式鉴定图；
图3为各组蛋白聚糖的含量比较；
图4为各组Ⅱ型胶原蛋白的含量比较。
具体实施方式
下面通过具体的实施例详细介绍本发明实质性内容，但不能以此限定本发明的保护范围。
一、试验材料
DMEM/F12培养基和胎牛血清购自Gibco公司。
谷胺酰胺和双抗购自南京森贝伽生物科技有限公司。
PBS缓冲液按照配方配制后于4℃保存，24h内使用完。
Ⅳ型胶原酶和胰酶购自上海懋康生物科技有限公司，按照说明书使用。
L-酪氨酸衍生物1和L-酪氨酸衍生物2的化学结构式如图1所示，纯度不低于98％。
二、试验方法
1、hUC-MSCs的提取培养和鉴定
使用的hUC-MSCs与专利2020104333269、2020104333714中相同，制备和鉴定方法为：
取正常足月剖腹产新生儿脐带约12cm(脐带采集后4℃保存于含1％双抗的PBS缓冲液中，6h内提取干细胞培养)，用含1％双抗的PBS缓冲液冲洗去除脐动静脉及脐带外膜，剪成约1mm3大小的组织块，置于37℃恒温震荡仪内，先后加入Ⅳ型胶原酶、胰酶分别消化60min和30min提取细胞，再用含20％FBS、25mmol/L谷胺酰胺和1％双抗的DMEM/F12培养基重悬细胞，以1.0×106/mL接种于细胞培养瓶内，培养4d后更换培养基，之后2～3d换液1次，待细胞80％融合时传代。取第5代细胞进行实验。
取第5代hUC-MSCs，胰酶消化，充分吹打均匀，制备成单细胞悬液，加入CD34-PE、CD45-PE、CD73-PE、CD90-PE和CD105-FITC。室温避光孵育30min，多聚甲醛固定后，流式细胞仪进行检测。
2、hUC-MSCs向软骨细胞的诱导分化
2.1分组
低浓度L-酪氨酸衍生物1诱导组(A1组)：使用含终浓度为6.25mg/L胰岛素、6.25mg/L转铁蛋白、10μg/L转化生长因子β1、0.1μmol/L地塞米松、50mg/L维生素C、20μM L-酪氨酸衍生物1(DMSO助溶)、5％FBS和1％双抗的DMEM/F12培养基诱导培养；
高浓度L-酪氨酸衍生物1诱导组(A2组)：使用含终浓度为6.25mg/L胰岛素、6.25mg/L转铁蛋白、10μg/L转化生长因子β1、0.1μmol/L地塞米松、50mg/L维生素C、40μM L-酪氨酸衍生物1(DMSO助溶)、5％FBS和1％双抗的DMEM/F12培养基诱导培养；
低浓度L-酪氨酸衍生物2诱导组(B1组)：使用含终浓度为6.25mg/L胰岛素、6.25mg/L转铁蛋白、10μg/L转化生长因子β1、0.1μmol/L地塞米松、50mg/L维生素C、20μM L-酪氨酸衍生物2(DMSO助溶)、5％FBS和1％双抗的DMEM/F12培养基诱导培养；
高浓度L-酪氨酸衍生物2诱导组(B2组)：使用含终浓度为6.25mg/L胰岛素、6.25mg/L转铁蛋白、10μg/L转化生长因子β1、0.1μmol/L地塞米松、50mg/L维生素C、40μM L-酪氨酸衍生物2(DMSO助溶)、5％FBS和1％双抗的DMEM/F12培养基诱导培养；
对照诱导组(C组)：使用含终浓度为6.25mg/L胰岛素、6.25mg/L转铁蛋白、10μg/L转化生长因子β1、0.1μmol/L地塞米松、50mg/L维生素C、5％FBS和1％双抗的DMEM/F12培养基(基础诱导培养基)诱导培养，培养基中添加与A、B组等体积的DMSO溶媒。
2.2诱导培养
取第5代生长良好的细胞hUC-MSCs，胰酶消化，充分吹打均匀，制备成单细胞悬液，以2×105/孔接种于6孔板中，待细胞85％融合时，按照上述分组更换培养基，诱导培养18d，每3d更换一次对应的培养基。每组设3个复孔。
3、蛋白聚糖的含量测定
诱导18d后，取各组细胞上清200μL，加入40μL木瓜蛋白酶消化24h；加入100μL8mol/L盐酸胍和750μL 0.25％阿利新蓝溶液，4℃反应1h；12000r/min离心15min，弃上清，加入150μL异丙醇溶解沉淀，600nm波长处测定吸光度值。以一系列浓度梯度的硫酸软骨素标准液制作标准曲线，将吸光度值代入标准曲线求得蛋白聚糖含量。
4、Ⅱ型胶原蛋白的含量测定
诱导18d后，取各组细胞上清250μL，加入羟脯氨酸消化液50μL，加入羟脯氨酸反应液2mL，60℃水浴15min，冷却后3500r/min离心10min，取150μL上清，560nm波长处测定吸光度值。以一系列浓度梯度的羟脯氨酸标准液制作标准曲线，将吸光度值代入标准曲线求得Ⅱ型胶原蛋白含量。
5、数据分析
在SPSS 17.0中，数据以均值±SD表示，并进行t检验，P＜0.05说明差异有统计意义。
三、试验结果
1、hUC-MSCs的提取培养和鉴定结果
hUC-MSCs的表型鉴定流式结果如表1和图2所示，CD34-PE和CD45-PE阴性表达，CD73-PE、CD90-PE和CD105-FITC阳性表达，符合hUC-MSCs的表型特征。
表1 hUC-MSCs的表型鉴定结果
表达率
CD34-PE 0.35％
CD45-PE 0.47％
CD73-PE 95.2％
CD90-PE 96.8％
CD105-FITC 98.5％
2、蛋白聚糖的含量测定结果
各组蛋白聚糖的含量如表2和图3所示，与对照诱导组(C组)相比，L-酪氨酸衍生物1诱导组(A1、A2组)和L-酪氨酸衍生物2诱导组(B1、B2组)蛋白聚糖的含量显著升高，且存在明显的剂量依赖性，A2组高于A1组，B2组高于B1组。
表2各组蛋白聚糖的含量
组别 含量(μg/mL)
对照诱导组(C组) 22.5±2.8
低浓度L-酪氨酸衍生物1诱导组(A1组) 37.9±3.2
高浓度L-酪氨酸衍生物1诱导组(A2组) 70.2±3.4
低浓度L-酪氨酸衍生物2诱导组(B1组) 41.8±2.9
高浓度L-酪氨酸衍生物2诱导组(B2组) 75.5±3.7
3、Ⅱ型胶原蛋白的含量测定
各组Ⅱ型胶原蛋白的含量如表3和图4所示，与对照诱导组(C组)相比，L-酪氨酸衍生物1诱导组(A1、A2组)和L-酪氨酸衍生物2诱导组(B1、B2组)Ⅱ型胶原蛋白的含量显著升高，且存在明显的剂量依赖性，A2组高于A1组，B2组高于B1组。
表3各组Ⅱ型胶原蛋白的含量
组别 含量(μg/mL)
对照诱导组(C组) 208.3±15.6
低浓度L-酪氨酸衍生物1诱导组(A1组) 351.8±17.5
高浓度L-酪氨酸衍生物1诱导组(A2组) 682.0±24.4
低浓度L-酪氨酸衍生物2诱导组(B1组) 390.5±19.2
高浓度L-酪氨酸衍生物2诱导组(B2组) 715.7±23.9
本领域技术人员知道，蛋白聚糖和Ⅱ型胶原蛋白为软骨特异性基质产物，对照诱导组hUC-MSCs在基础诱导培养基的诱导下出现了明显的成软骨分化，L-酪氨酸衍生物1、2诱导组比对照诱导组中蛋白聚糖和Ⅱ型胶原蛋白含量更高，说明L-酪氨酸衍生物1、2诱导组中的L-酪氨酸衍生物1、2可以进一步促进hUC-MSCs成软骨分化，且具有剂量效应。由此可见，L-酪氨酸衍生物1、2具有在体外促进脐带间充质干细胞成软骨分化的作用，可以用于制备促进脐带间充质干细胞成软骨分化的培养基。

Claims (2)

1.一种L-酪氨酸衍生物在体外促进脐带间充质干细胞成软骨分化中的应用，所述L-酪氨酸衍生物为如下化学结构式所示的L-酪氨酸衍生物中的一种：
Figure FDA0003661263000000011
2.一种L-酪氨酸衍生物用于制备促进脐带间充质干细胞成软骨分化培养基的用途，所述L-酪氨酸衍生物为如下化学结构式所示的L-酪氨酸衍生物中的一种：
Figure FDA0003661263000000012
CN202010444192.0A 2020-05-23 2020-05-23 脐带间充质干细胞成软骨分化、成软骨分化培养基 Active CN111534482B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010444192.0A CN111534482B (zh) 2020-05-23 2020-05-23 脐带间充质干细胞成软骨分化、成软骨分化培养基

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010444192.0A CN111534482B (zh) 2020-05-23 2020-05-23 脐带间充质干细胞成软骨分化、成软骨分化培养基

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN111534482A CN111534482A (zh) 2020-08-14
CN111534482B true CN111534482B (zh) 2022-09-27

Family

ID=71972318

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202010444192.0A Active CN111534482B (zh) 2020-05-23 2020-05-23 脐带间充质干细胞成软骨分化、成软骨分化培养基

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN111534482B (zh)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111534483B (zh) * 2020-05-23 2020-12-18 广东壹加再生医学研究院有限公司 一种胰岛素样生长因子结合蛋白7激活剂在人脐带间充质干细胞成软骨分化中的应用

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105647856A (zh) * 2016-02-04 2016-06-08 关节动力安达（天津）生物科技有限公司 促进人脐带间充质干细胞向软骨细胞分化的方法
CN106906182A (zh) * 2017-04-28 2017-06-30 北京赛斯达生物技术有限公司 一种间充质干细胞无血清培养基
CN109456939A (zh) * 2018-11-23 2019-03-12 北京太东生物科技有限公司 诱导脐带间充质干细胞成软骨分化的培养方法，以及该方法所用的培养基
CN110241014A (zh) * 2019-06-27 2019-09-17 南京温博生物科技有限公司 间充质干细胞诱导分化及包被培养皿制备
CN110934132A (zh) * 2019-12-30 2020-03-31 苏州君欣生物科技有限公司 一种无血清无dmso细胞冻存液及其制备方法

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105647856A (zh) * 2016-02-04 2016-06-08 关节动力安达（天津）生物科技有限公司 促进人脐带间充质干细胞向软骨细胞分化的方法
CN106906182A (zh) * 2017-04-28 2017-06-30 北京赛斯达生物技术有限公司 一种间充质干细胞无血清培养基
CN109456939A (zh) * 2018-11-23 2019-03-12 北京太东生物科技有限公司 诱导脐带间充质干细胞成软骨分化的培养方法，以及该方法所用的培养基
CN110241014A (zh) * 2019-06-27 2019-09-17 南京温博生物科技有限公司 间充质干细胞诱导分化及包被培养皿制备
CN110934132A (zh) * 2019-12-30 2020-03-31 苏州君欣生物科技有限公司 一种无血清无dmso细胞冻存液及其制备方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
透明质酸在间充质干细胞向软骨细胞分化中的应用;张清芳等;《中国生物工程杂志》;20160615;第36卷(第06期);第92-99页 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN111534482A (zh) 2020-08-14

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Tay et al. Cell yield, proliferation, and postexpansion differentiation capacity of human ear, nasal, and rib chondrocytes
CN111534483B (zh) 一种胰岛素样生长因子结合蛋白7激活剂在人脐带间充质干细胞成软骨分化中的应用
CN112048470B (zh) 一种利用人诱导多能干细胞制备临床级别间充质干细胞制剂的方法
Farrell et al. Functional consequences of glucose and oxygen deprivation on engineered mesenchymal stem cell-based cartilage constructs
CN114292816B (zh) 肺癌类器官培养液及其培养试剂组合和培养方法
CN109706115B (zh) 一种小鼠骨髓间充质干细胞细胞系的构建方法
CN112553147B (zh) 一种促进肌肉干细胞增殖的生长因子组合物及其应用
CN111534482B (zh) 脐带间充质干细胞成软骨分化、成软骨分化培养基
He et al. Phenotypic redifferentiation of dedifferentiated microtia chondrocytes through a three-dimensional chondrogenic culture system
CN111424011A (zh) 一种能够维持脐带间充质干细胞细胞形态的三维培养方法
CN109652377B (zh) 一种肺癌干细胞的制备方法及应用
CN108048390B (zh) 一种制备血管内皮细胞的方法及其专用试剂盒
CN107164325B (zh) MSCs来源的少突胶质细胞的制备方法及试剂盒
CN110592001A (zh) 一种输卵管上皮细胞的纯化培养体系
CN111518760A (zh) 一种促进脐带间充质干细胞体外增殖并促进其分化的培养基
CN114703132A (zh) 一种细胞外囊泡在制备缓解iPSC-MSCs衰老培养基的应用
CN111961643A (zh) 一种干细胞向软骨细胞分化的诱导方法
CN113717933B (zh) Fgf7在制备干细胞扩增与表型维持试剂中的应用
CN111534485A (zh) 一种促进脐带间充质干细胞体外增殖并维持其干细胞特性的培养基
CN112941017A (zh) 一种诱导人间充质干细胞成脂分化培养基及其制备方法
CN117448268B (zh) 牙髓间充质干细胞的无血清培养基及其培养方法
TWI555847B (zh) Culture and production of adipose - derived stem cells and their stem cell secretions
CN111388503A (zh) 一种人脐带间充质干细胞源外泌体及在抗皮肤衰老、提高人皮肤弹性方面的应用
CN111450118A (zh) 一种人脐带间充质干细胞源外泌体及抗皮肤衰老、提高人皮肤弹性的用途
Dai et al. Development of a serum‐free medium for myoblasts long‐term expansion and 3D culture for cell‐based meat

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
TA01 Transfer of patent application right
TA01 Transfer of patent application right

Effective date of registration: 20220907

Address after: 250000 rooms 601, 602, 603 and 607, 6 / F, building 2, future entrepreneurship Plaza, southwest corner of the intersection of jingshidong road and Gangxi Road, comprehensive free trade zone, high tech Zone, Jinan City, Shandong Province

Applicant after: Shandong zhuodong Biotechnology Co.,Ltd.

Address before: 210043 No.268, Lidao Road, Baguazhou street, Qixia District, Nanjing City, Jiangsu Province

Applicant before: Nanjing fanyida Biotechnology Co.,Ltd.

GR01 Patent grant
GR01 Patent grant