CN116731984A - 一种基于TadA8e突变体实现碱基颠换的编辑工具及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种基于TadA8e突变体实现水稻G‑C碱基颠换的编辑工具。其中，所述碱基编辑工具cCDc‑CGBE包括：腺嘌呤脱氨酶TadA编码基因的突变体TadA‑CDc、失活型nSpCas9以及鳕鱼源的尿嘧啶DNA糖基化酶cUNG基因序列。采用本发明提供的包含cCDc‑CGBE编辑工具的表达载体，可以造成基因组特异位点的C到G碱基转换替换。实验证明，利用本发明设计的融合编辑工具构建水稻靶向编辑载体，导入水稻细胞后造成水稻特异基因位点DNA上G‑C的高效碱基颠换，同时保留了TadA脱氨酶的高保真性，产生较少的副产物和indels频率。
Description
技术领域
本发明涉及基因编辑技术领域，具体涉及一种实现水稻G-C碱基颠换的编辑工具cCDc-CGBE及应用
背景技术
碱基编辑是在不产生DNA双链断裂的情况下实现单核苷酸靶向突变的技术。目前已开发的碱基编辑系统主要包括胞嘧啶碱基编辑器(CBEs)、腺嘌呤碱基编辑器(ABEs)和鸟嘌呤碱基编辑器(CGBEs)等。ABE和CBE系统主要产生嘧啶到嘧啶或嘌呤到嘌呤碱基的转变，无法实现嘧啶与嘌呤如C-G、A-T之间的碱基颠换。研究发现，CBE系统除诱导C-T碱基转换外，特定条件下，如剔除融合蛋白中的尿嘧啶糖基化酶抑制剂(UGI)组分会诱导部分位点发生C-A和C-G碱基颠换，在该思路的指引之下CGBE碱基编辑器得以开发。2020年，张学礼和毕昌昊实验室以及J.Keith Joung和Julian Grünewald实验室在相同思路的指引下，通过改造现有的单碱基编辑工具CBE，构建出哺乳动物细胞适用的介导C-G碱基颠换的新工具GBE/CGBE。CGBE碱基编辑器主要包括Cas9切口酶(nCas9-D10A)、胞苷脱氨酶和尿嘧啶-N-糖基化酶(UNG)三部分。这一系列新工具的出现让单碱基编辑再添新武器，也为后续的基础研究和临床转化提供了新的助力。
然而现有的CBEs/CGBEs均依赖于天然的胞嘧啶脱氨酶AID/APOBEC家族成员，由于胞嘧啶脱氨后会激活碱基切除修复通路，不可避免的会产生较高的indels副产物。主要表现在两个方面：CBE除了将C转换为T以外，还有一定的几率将C转变为G/A，这是由于UDG可以将碱基U切除形成无嘧啶无嘌呤的位点AP，在AP裂解酶或自发断裂下产生一个缺口，进而与nCas9在非编辑链产生的缺口刚好形成一个DSB，经过NHEJ修复途径产生indels.更为重要的是现有的CBE会产生显著的不依赖于Cas9的DNA和RNA随机脱靶，而且较宽的编辑窗口引起难以避免的旁观者效应，在安全性等方面存在隐患。与CBE/CGBEs不同，ABE使用从TadA(大肠杆菌中的一种转移RNA(tRNA)腺嘌呤脱氨酶)进化而来的非天然腺嘌呤脱氨酶，以非常高的产品纯度(超过99.9％)、最少的indels和相对紧凑的编辑窗口诱导DNA中A-G的转换。2019年，Sangsu Bae/Jin-Soo Kim研究团队在NBT上发表的研究论文表明，腺嘌呤碱基编辑还在狭窄的编辑窗口(C5-C7)和受限的TC*N中将胞嘧啶转化为鸟嘌呤或胸腺嘧啶；其中，腺嘌呤碱基编辑诱导的胞嘧啶效率高达11.2％，这表明进化的TaDA具有胞嘧啶脱氨能力；而且不同版本ABE碱基编辑器转化效率是有差异的，表明各种TadA突变对碱基编辑特异性的影响不同。基于此，2022年华东师范大学李大力和哈佛大学Broad研究所David R.Liu实验室分别使用不同的方法对腺嘌呤脱氨酶TadA-8e重新设计改造，开发了系列消除固有的腺嘌呤脱氨酶活性的新型Td-CBEs(TadA-derived Cytosine Base Editor)，展现出非常低的indels事件，创新性地构建了一系列不依赖天然胞嘧啶脱氨酶家族的“精准且安全”的新型胞嘧啶碱基编辑器。
在植物中，产生更多的碱基替代类型可以扩大其应用，并有助于创造新的种质资源。在之前的研究中，基于第一代CGBEs，Yiping Qi及陆钰明/朱健康研究组在水稻、番茄和白杨物种中实现了碱基C-G的颠换，这种CGBEs为植物的C-to-G碱基编辑带来了巨大的希望，但是效率较低并且伴随大量的副产物难以在植物中推广应用，因此本发明希望在植物中建立基于腺嘌呤脱氨酶TadA变体的高效CGBE碱基编辑器，在实现更高编辑效率的同时，保持基因编辑的精准性，降低副产物的产生，为植物育种以及创制新的种质资源提供有力工具。
发明内容：
针对上述问题，本发明提供了一种基于TadA8e突变体(R26G/E27R/V28G/I76F/H96N/M151I，将该变体命名为TadA-CDc)，融合鳕鱼源的尿嘧啶DNA糖基化酶cUNG，构建新型的CGBE碱基编辑器cCDc-CGBE，实现由G-C的高效碱基颠换。
本申请的发明人在水稻基因研究过程中发现了一种TadA8e突变体，发明人发现，将该突变体与融合鳕鱼源的尿嘧啶DNA糖基化酶cUNG配合使用，构建碱基编辑工具，可以高效地在水稻中实现碱基颠换。
具体而言，本发明提供一种基于TadA8e突变体实现水稻G-C碱基编辑器。实验中，发明人针对TadA8e进行6个特定氨基酸的点突变，并且进行水稻密码子优化，融合水稻密码子优化的失活型SpCas9(nSpCas9)以及鳕鱼源的尿嘧啶DNA糖基化酶cUNG，得到TadA-CDc-nSpCas9-cUNG表达框，将该表达框整合到植物表达载体中构建相应的打靶载体，而后通过水稻遗传转化实现对水稻特异基因编辑。
在第二个方面，本发明提供一种含有所述TadA-CDc-nSpCas9-cUNG表达框的植物表达载体。该植物表达载体的构建方法是利用PstI/SacI酶切位点，用PstI/SacI酶切pHUCSpR载体并回收，由于TadA-CDc-nSpCas9-cUNG基因两端加有PstI/SacI酶切位点，可以利用T4连接酶将TadA-CDc-nSpCas9-cUNG连接到pHUC SpR载体，得到植物中间表达载体pHUC-TadA-CDc-nSpCas9-cUNG；进一步地，通过HindIII酶切位点引入35S CMYLCV SpR sg2.0PolyT复合型启动子表达框，得到植物打靶载体pHUC420-TadA-CDc-nSpCas9-cUNG，命名为cCDc-CGBE。
另一方面，本发明在表达载体的基础上，根据实验的实际需要，构建相应的基因打靶载体。
另一方面，本发明还提供一种表达盒，所述表达盒中包含上述的TadA-CDc-nSpCas9-cUNG基因。
另一方面，本发明还提供一种上述基因、表达盒或载体的应用，所述应用包括利用所述TadA-CDc-nSpCas9-cUNG基因完成水稻体内G-C的碱基颠换，获得带有突变位点的转基因植物或植物部分。
在另一个方面，本发明提供一种利用cCDc-CGBE表达载体将打靶载体导入水稻细胞的方法，利用cCDc-CGBE表达载体在表达载体的基础上只需进行简单的退火、酶切连接作用即可获得特异基因的打靶载体(cCDc-CGBE-ACC)，然后将打靶载体导入水稻细胞。
该方法包括下述步骤：
(1)将日本晴水稻种子去壳、灭菌后将胚分离出来，置于愈伤组织诱导培养基上以产生次级愈伤组织；
(2)将次级愈伤组织转移至新的愈伤组织诱导培养基预培养；
(3)将步骤(2)中获得的愈伤组织与携带cCDc-CGBE-ACC的打靶载体的农杆菌充分接触15分钟；
(4)将步骤(3)的愈伤组织转移到其上垫有三张无菌滤纸(加入2.5-3.5mL农杆菌悬浮培养基)的培养皿中，21-23℃培养48小时；
(5)将步骤(4)的愈伤组织置于前筛选培养基上培养5-7天；
(6)将步骤(5)的愈伤组织转移筛选培养基上，以获得抗性愈伤组织；
(7)将抗性愈伤组织转移到分化再生培养基中分化成苗；和
(8)将步骤(7)的苗转移到生根培养基中生根。
其中所述步骤(1)中的种子是日本晴成熟种子；所述步骤(1)、(2)中的诱导培养基是说明书表1所列出的诱导培养基；所述步骤(3)中的与农杆菌接触是将愈伤组织浸泡在所述农杆菌悬浮液中；所述步骤(4)中的农杆菌悬浮培养基是说明书表1所列出的悬浮培养基；所述步骤(5)中的前筛选培养基是说明书表1所列出的前筛选培养基；所述步骤(6)中的筛选培养基是说明书表1所列出的筛选培养基；所述步骤(7)中的分化再生培养基是说明书表1所列出的分化再生培养基；所述步骤(8)中的生根培养基是说明书表1所列出的生根培养基。
另一方面，本发明提供一种利用所述的编辑工具获得编辑植株的方法，所述方法包括：
(1)将日本晴水稻种子去壳、灭菌后将胚分离出来，置于愈伤组织诱导培养基上以产生次级愈伤组织；
(2)将次级愈伤组织转移至新的愈伤组织诱导培养基预培养；
(3)将步骤(2)中获得的愈伤组织与携带cCDc-CGBE-ACC的打靶载体的农杆菌充分接触15分钟；
(4)将步骤(3)的愈伤组织转移到2.5-3.5mL农杆菌悬浮培养基上，21-23℃培养；
(5)将步骤(4)的愈伤组织置于前筛选培养基上培养5-7天；
(6)将步骤(5)的愈伤组织转移筛选培养基上，以获得抗性愈伤组织；
(7)将抗性愈伤组织转移到分化再生培养基中分化成苗；和
(8)将步骤(7)的苗转移到生根培养基中生根，
优选地，上述步骤中，以LOC_Os05g22940中的核苷酸序列
cctcgctaactggagaggcttct为打靶位点。
在优选的实施方案中，其中所述水稻是粳稻，更优选地，所述水稻是粳稻日本晴。
表1培养基的示例性配方
表格中所提到的“优化的N6大量元素”指的是，该N6大量元素中[NO3-]/[NH4+]＝40mM/10mM。
在优选的实施方案中，所述TadA-CDc-nSpCas9-cUNG的核苷酸序列为SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列，具体如下：
附图说明
图1为cCDc-CGBE载体质粒示意图。
图2为cCDc-CGBE介导ACC基因产生G到C突变。
图3为ACC基因编辑植株的除草剂抗性鉴定图。
具体实施方式
以下结合附图叙述本发明的实施例。应该说明，下述实施例仅用于对本发明的示例性实现方式进行说明，而并非对本发明进行任何限制。本领域技术人员可以对本发明作出某些等同的改动和显而易见的改进。
在没有其他具体说明的情况下，下述具体实施方式中的操作均采用本领域通用的常规操作来进行。本领域技术人员可以很容易地从现有技术中获得关于这样的常规操作的教导，例如可以参照教科书Sambrook and David Russell，Molecular Cloning:ALaboratory Manual,3rd ed.,Vols1,2；Charles Neal Stewart,Alisher Touraev,Vitaly Citovsky and Tzvi Tzfira,Plant Transformation Technologies等。下述实施例中所用的药材原料、试剂、材料等，如无特殊说明，均为市售购买产品。
实施例1——TadA-CDc-nSpCas9-cUNG的获得
本发明在植物密码子优化的TadA8e基因基础上，进行点突变，得到TadA8e变体，并将其命名为TadA-CDc。具体而言，发明人根据TadA8e序列设计点突变引物，使用全式金公司的多点突变试剂盒对TadA8e进行多点点突变R26G/E27R/V28G/I76F/H96N/M151I，并将获得的TadA8e变体命名为TadA-CDc。另外，通过NEB公司Gibson Assembly无缝克隆将TadA-CDc、实验室保存的失活型nSpCas9、以及鳕鱼源的尿嘧啶DNA糖基化酶cUNG进行克隆，设计中含有PstI/SacI酶切位点的引物，与全氏金的T载体进行无缝连接，获得T-TadA-CDc-nSpCas9-cUNG的中间载体。
发明中的TadA-CDc-nSpCas9-cUNG基因5’端添加GCCACC的kozrk序列，有助于基因的高效表达，同时在5’和3’端分别添加核定位信号bpNLS，有利于基因入核。
实施例2——cCDc-CGBE碱基编辑器植物靶向载体的构建
从上面含有T-TadA-CDc-nSpCas9-cUNG载体的大肠杆菌XL-blue，用Axygen质粒提取试剂盒中提取质粒，用PstI/SacI酶切，回收TadA-CDc-nSpCas9-cUNG片段。同时利用PstI/SacI酶对pHUC SpR(实验室保存)进行线性化处理，回收pHUC载体骨架(SpR基因被PstI/SacI切掉)，将上述的TadA-CDc-nSpCas9-cUNG片段和pHUC片段用T4连接酶(购于NEB公司)进行连接，得到植物中间表达载体pHUC-TadA-CDc-nSpCas9-cUNG(图1)。进一步地，通过HindIII酶切位点引入复合型启动子表达框35S CMYLCV SpR sg2.0PolyT，得到pHUC420-TadA-CDc-nSpCas9-cUNG，命名为cCDc-CGBE。选择水稻中的ACC基因(LOC_Os05g22940，其序列如序列表SEQ ID No.2所示)中的核苷酸序列cctcgctaactggagaggcttct。(下划线部分为5’-CCT-3’结构的PAM序列)，作为打靶位点。因为PAM序列为CCT，所以在目标基因组序列上产生的碱基颠换为G突变成C。合成如下靶标序列：
ACC for TdCGBE FP:TGCAAGAAGCCTCTCCAGTTAGCG
ACC for TdCGBE RP:AAACCGCTAACTGGAGAGGCTTCT
斜体部分为载体上的接头序列，将FP和RP退火形成双链。
将退火产物与cCDc-CGBE进行连接，得到cCDc-CGBE-ACC。使用液氮冻融法将植物表达载体cCDc-CGBE-ACC转入根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)EHA105菌株中(安徽农业大学水稻精准育种实验室保存)，用于遗传转化。
实施例3——以cCDc-CGBE-ACC为打靶载体的水稻遗传转化及突变体的获得。
将上述转入了重组表达载体的根癌农杆菌，对水稻愈伤组织进行遗传转化。该遗传转化、转化子筛选及转基因植株再生等参照Yongbo Duan(Yongbo Duan，ChenguangZhai，et al.An efficient and high-throughput protocol forAgrobacteriummediated transformation based on phosphomannose isomerasepositive selection in Japonica rice(Oryza sativa L.)[J].Plant Cell Report，2012.DOI 10.1007/s00299-012-1275-3.)等提出的方法。一共获得42株再生植株。采用CTAB法提取获得的植株DNA，将所得基因组DNA样品用于PCR分析。用于扩增ACC所在的基因组区段的PCR引物如下所示，扩增的片段大小约为650bp。
ACC CHECK FP:GAAGGTTGGGCTAAGACAGT
ACC CHECKRP:AGGCATCAACTGTTTTGTTC
将PCR组分首先在95℃保持5分钟，然后进行32个循环：94℃30秒、60℃30秒、72℃20秒，最后在72℃延伸10分钟。将PCR产物直接送测序。所测结果与野生型序列进行比对(图2)，结果发现在所测的42株转基因植株中有27株实现了G-C的碱基颠换。由此可得，cCDc-CGBE碱基编辑器能够实现高效的G-C碱基的突变频率，且这个27株中有20株发生了G-C的碱基突变，即，indel和其他的副产物比较少，因此cCDc-CGBE在作物改良中的应用前景广阔。特别本发明中是利用cCDc-CGBE编辑了ACC基因，使其产生G-C的碱基颠换，导致ACC编码蛋白在2125位置的氨基酸由色氨酸(W，TGG)变成了半胱氨酸(C，TGC)，从而使编辑后的植株获得了除草剂抗性。
如图3所示，左边是野生型水稻，右边是cCDc-CGBE-ACC产生的编辑植株，在喷施甲禾灵除草剂后，编辑植株生长正常，而野生型水稻均未存活。
Claims (9)
1.一种基于TadA8e突变体实现水稻G-C碱基颠换的编辑工具，其特征在于，所述编辑工具为cCDc-CGBE，其包括：腺嘌呤脱氨酶TadA编码基因的突变体TadA-CDc、Cas9切口酶片段以及鳕鱼源的尿嘧啶DNA糖基化酶cUNG。
2.根据权利要求1所述的编辑工具，其特征在于，所述编辑工具为融合蛋白，在所述融合蛋白中，所述腺嘌呤脱氨酶TadA编码基因的突变体TadA-CDc位于Cas9切口酶片段的N端，鳕鱼源的尿嘧啶DNA糖基化酶cUNG位于Cas9切口酶片段的C端，优选地，所述编辑工具的核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.1所示。
3.根据权利要求2所述的编辑工具，其特征在于，所述融合蛋白还包括核定位信号片段，其中所述核定位信号片段位于所述融合蛋白的N端和/或C端，优选地，所述核定位信号片段为BPNLS或其变体，所述变体与BPNLS具有80％以上序列相似性且具有BPNLS的功能，所述编辑工具还包括柔性连接肽片段。
4.如权利要求3所述的编辑工具，其特征在于，在所述编辑工具中，自N端到C端依次是核定位信号片段、腺嘌呤脱氨酶TadA编码基因的突变体TadA-CDc、连接肽、nCas9核酸酶、连接肽、鳕鱼源的尿嘧啶DNA糖基化酶cUNG、核定位信号片段，所述融合蛋白的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。
5.一种实现水稻基因组序列中G到C碱基颠换的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：将所述融合蛋白的编码基因和sgRNA的编码基因导入受体生物或受体生物细胞中，；其中，所述sgRNA靶向靶点序列，所述靶标碱基G位于所述靶点序列。
6.一种利用cCDc-CGBE表达载体将打靶载体导入水稻细胞的方法，
该方法包括下述步骤：
(1)将日本晴水稻种子去壳、灭菌后将胚分离出来，置于愈伤组织诱导培养基上以产生次级愈伤组织；
(2)将次级愈伤组织转移至新的愈伤组织诱导培养基预培养；
(3)将步骤(2)中获得的愈伤组织与携带cCDc-CGBE-TAC的打靶载体的农杆菌充分接触15分钟；
(4)将步骤(3)的愈伤组织转移到其上垫有三张无菌滤纸(加入2.5-3.5mL农杆菌悬浮培养基)的培养皿中，21-23℃培养48小时；
(5)将步骤(4)的愈伤组织置于前筛选培养基上培养5-7天；
(6)将步骤(5)的愈伤组织转移筛选培养基上，以获得抗性愈伤组织；
(7)将抗性愈伤组织转移到分化再生培养基中分化成苗；和
(8)将步骤(7)的苗转移到生根培养基中生根。
7.一种利用权利要求1所述的编辑工具获得除草剂抗性植株的方法，其特征在于所述方法包括：
(1)将日本晴水稻种子去壳、灭菌后将胚分离出来，置于愈伤组织诱导培养基上以产生次级愈伤组织；
(2)将次级愈伤组织转移至新的愈伤组织诱导培养基预培养；
(3)将步骤(2)中获得的愈伤组织与携带cCDc-CGBE-ACC的打靶载体的农杆菌充分接触15分钟；
(4)将步骤(3)的愈伤组织转移到2.5-3.5mL农杆菌悬浮培养基上，21-23℃培养；
(5)将步骤(4)的愈伤组织置于前筛选培养基上培养5-7天；
(6)将步骤(5)的愈伤组织转移筛选培养基上，以获得抗性愈伤组织；
(7)将抗性愈伤组织转移到分化再生培养基中分化成苗；和
(8)将步骤(7)的苗转移到生根培养基中生根，
优选地，上述步骤中，以LOC_Os05g22940中的核苷酸序列
cctcgctaactggagaggcttct为打靶位点。
8.一种含有权利要求1所述编辑工具的表达载体或表达盒。
9.一种权利要求1所述的编辑工具、权利要求8所述载体在植物基因组编辑中的应用，其中，所述植物基因组编辑包括对植物基因组进行剪切，获得含有G到C的碱基颠换的转基因植物或植物部分，优选地，所述植物为单子叶植物，优选为水稻，更优选为粳稻，进一步优选为粳稻日本晴。
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