CN110878305A - 一种高效的宽窗口单碱基编辑基因及其应用和育种方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种高效的单碱基编辑系统OsSpCas9‑eCDA及其应用和育种方法。本发明通过大量的实验，尝试采用不同的方式对SpCas9‑ABE进行改造，终于成功获得了一个高单碱基编辑效率、宽窗口的CP1249‑OsSpCas9‑eABE编辑器。并且本发明还提供了包含该CP1249‑OsSpCas9‑eABE基因的表达盒和一种表达载体，以及该表达盒和表达载体在水稻基因编辑方面的应用。本发明利用设计的CP1249‑OsSpCas9‑eABE基因构建植物表达载体，进而构建水稻打靶载体，导入水稻细胞后造成水稻特异基因位点的单碱基替换，特别是实现由A/T碱基突变成C/G。利用该编辑器进行水稻基因编辑，可以编辑更多的突变体，获得更多的随机突变或者得到突变更多的突变体库。

Description

一种高效的宽窗口单碱基编辑基因及其应用和育种方法

技术领域

本发明涉及生物技术和植物基因工程技术领域。具体而言，本发明涉及一种高效的单碱基编辑窗口拓宽系统CP1249-OsSpCas9-eABE在水稻基因打靶方面的应用。

背景技术

目前的基因编辑技术(ZFN，TALEN，CRISPR/Cas9)依赖于靶向位点的DNA双链断裂，进而激活DNA修复机制，实现基因矫正的目的。因此，基于双链断裂的基因编辑技术不仅容易产生DNA片段插入和缺失，且可能会产生脱靶效应，最终影响靶基因的功能。而单碱基编辑技术的出现有效地克服了这一问题。

单碱基基因编辑技术(base editors，BEs)，指能在基因组特定位点引起单个碱基替换的基因编辑技术。基本原理是将胞嘧啶脱氨酶(APOBEC)或腺苷脱氨酶与现存Cas9n(D10A)融合而形成，依赖于CRISPR原理使得靶点远离PAM端的4-8位的单个碱基发生改变的基因编辑技术。目前的单碱基基因编辑包括两种，一种是CBEs(Cytidine base editors)，即嘧啶碱基转换技术(C/G到T/A)，另一种是ABEs(Adenine base editors)，即嘌呤碱基转换技术(A/T到G/C)。

基于CRISPR/Cas9基因编辑系统，2016年4月和2017年11月，哈佛大学生物化学家David Liu组先后在《自然》和《科学》杂志上报告了两种基因编辑工具——嘧啶碱基转化技术和嘌呤碱基转化技术。之后科研工作者利用不同来源的胞嘧啶脱氨酶和腺苷脱氨酶实现了各物种的碱基编辑。

在植物中，共有三种由C/G到T/A的编辑器已被测试，一种是使用小鼠的胞嘧啶脱氨酶(APOBEC)的BE3系统、一种是使用海七鳃鳗胞嘧啶脱氨酶(targeted activation-induced cytidine deaminase(PmCDA)的定向激活诱导的AID系统，一种是使用了人AID系统变体的rBE5系统。这三种系统与SpCas9或SaCas9系统融合，已在水稻、玉米、小麦、拟南芥、番茄和西瓜中成功实现了单碱基编辑。但目前使用的单碱基编辑系统仍然存在一定的缺陷，如植物的单碱基编辑效率不高，编辑窗口受限等。

但是，高编辑效率和宽窗口的编辑器非常难以获得，往往是可遇而不可求的，目前高编辑效率和宽窗口的编辑器的报道并不多见。

发明内容

针对上述问题，本发明希望提供一种高编辑效率的、窗口拓宽的，由A/T到G/C的单碱基编辑系统，命名为CP1249-OsSpCas9-eABE。

为了获得这样的CP1249-OsSpCas9-eABE编辑器，本申请的发明人反复进行了大量的实验，通过尝试采用不同的方式对SpCas9-ABE以及其上下游的基因序列交叉替换、顺序调整等，在经历大量失败试验之后，终于意外获得了一种高单碱基编辑效率、宽窗口的CP1249-OsSpCas9-eABE编辑器，其序列见序列表SEQ ID No.1。本发明为CRISPR/Cas9基因编辑系统又提供了一个优秀的基因资源，具有重大的研究意义和社会价值。并且，本发明将CP1249-OsSpCas9-eABE基因整合到表达载体中，在此基础上构建相应的打靶载体，而后通过水稻遗传转化实现对水稻特异基因编辑。

具体而言，在第一个方面，本发明提供一种高效的宽窗口单碱基编辑基因，其特征在于，所述编辑基因为CP1249-OsSpCas9-eABE，其至少包含：

(a)SEQ ID NO:1中所示的核苷酸序列；或者

(b)在SEQ ID NO:1中所示的核苷酸序列中取代一个或多个核苷酸且能够进行水稻基因组剪切的核苷酸序列；或者

(c)在SEQ ID NO:1中所示的核苷酸序列中添加一个或多个核苷酸且能够进行水稻基因组剪切的核苷酸序列；或者

(d)SEQ ID NO:1中所示的核苷酸序列缺失一个或多个核苷酸且能够进行水稻基因组剪切的核苷酸序列。

优选地，所述单碱基编辑基因CP1249-OsSpCas9-eABE由序列表中SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列构成。

另一方面，本发明提供一种表达盒，其特征在于，所述表达盒中包含权利要求1所述单碱基编辑基因CP1249-OsSpCas9-eABE。

另一方面，本发明提供一种表达载体，其特征在于，所述表达载体包含权利要求1所述单碱基编辑基因CP1249-OsSpCas9-eABE或权利要求3所述的表达盒。

另一方面，本发明提供一种所述的单碱基编辑基因的应用，其特征在于，所述应用包括利用所述编辑窗口拓展的CP1249-OsSpCas9-eABE基因对水稻基因组进行单碱基编辑，实现由A/T碱基突变成C/G，获得含有单碱基突变的转基因植物或植物部分。

另一方面，本发明提供一种所述表达盒的应用，其特征在于，所述应用包括利用所述单碱基编辑基因CP1249-OsSpCas9-eABE对水稻基因组进行单碱基编辑，实现由A/T碱基突变成C/G，获得含有单碱基突变的转基因植物或植物部分。

另一方面，本发明提供一种所述表达载体的应用，其特征在于，所述应用包括利用所述单碱基编辑基因CP1249-OsSpCas9-eABE对水稻基因组进行单碱基编辑，实现由A/T碱基突变成C/G，获得含有单碱基突变的转基因植物或植物部分。

所述应用包括利用所述CP1249-OsSpCas9-eABE基因识别带有NGG特征的PAM序列，完成水稻体内DNA双链的剪切，并在自身修复系统的作用下，获得带有由A/T到G/C的单碱基突变位点的转基因植物或植物部分。

本发明的含有CP1249-OsSpCas9-eABE基因的植物表达载体的构建方法是：利用NotI/SacI酶切位点，用NotI/SacI酶切pHUN900载体并回收，由于CP1249-OsSpCas9-eABE序列两端加有NotI/SacI酶切位点，可以利用T4连接酶将CP1249-OsSpCas9-eABE连接到pHUN900载体，得到植物表达载体pHUN-CP1249-OsSpCas9-eABE，命名为pHUN411 CP1249-eABE。

另一方面，在表达载体的基础上，根据实验的实际需要，构建相应的基因打靶载体。在另一个方面，本发明提供一种利用pHUN411-eABE表达载体(其含有所述高编辑效率、编辑窗口拓宽的CP1249-OsSpCas9-eABE基因，在表达载体的基础上只需进行简单的退火、酶切连接作用即可获得特异基因的打靶载体(pHUN411 CP1249-eABE-PDS))，，将打靶载体导入水稻细胞的方法，包括下述步骤：

(1)将水稻种子去壳、灭菌后将胚分离出来，置于愈伤组织诱导培养基上以产生次级愈伤组织；

(2)将次级愈伤组织转移至新的愈伤组织诱导培养基预培养；

(3)将步骤(2)中获得的愈伤组织与携带CP1249-OsSpCas9-eABE的打靶载体(pHUN411 CP1249-eABE-PDS)的农杆菌接触15分钟；

(4)将步骤(3)的愈伤组织转移到上垫上三张无菌滤纸(加入2.5-3.5mL农杆菌悬浮培养基)的培养皿中，21-23℃培养48小时；

(5)将步骤(4)的愈伤组织置于前筛选培养基上培养5-7天；

(6)将步骤(5)的愈伤组织转移筛选培养基上，以获得抗性愈伤组织；

(7)将抗性愈伤组织转移到分化再生培养基中分化成苗；和

(8)将步骤(7)的苗转移到生根培养基中生根。

其中所述步骤(1)中的种子是成熟种子；所述步骤(1)、(2)中的诱导培养基是说明书表1所列出的诱导培养基；所述步骤(3)中的与农杆菌接触是将愈伤组织浸泡在所述农杆菌悬浮液中；所述步骤(4)中的农杆菌悬浮培养基是说明书表1所列出的悬浮培养基；所述步骤(5)中的前筛选培养基是说明书表1所列出的前筛选培养基；所述步骤(6)中的筛选培养基是说明书表1所列出的筛选培养基；所述步骤(7)中的分化再生培养基是说明书表1所列出的分化再生培养基；所述步骤(8)中的生根培养基是说明书表1所列出的生根培养基。

在优选的实施方案中，其中所述水稻是粳稻，更优选地，所述水稻是粳稻日本晴。

表1培养基的示例性配方

表格中所提到的“优化的N6大量元素”指的是，该N6大量元素中[NO₃-]/[NH₄+]＝40mM/10mM。

在优选的实施方案中，所述CP1249-OsSpCas9-eABE标记基因的核苷酸序列为SEQID NO:1所示的核苷酸序列。

技术效果

本发明所提供的CP1249-OsSpCas9-eABE编辑器，单碱基编辑效率更高，编辑窗口得到了大幅度的扩展，本发明对该编辑器进行了反复验证，证明其可以有效应用于水稻等农作物中用作新型的宽窗口编辑器。利用该编辑器进行水稻基因编辑，可以编辑更多的突变体，获得更多的随机突变或者得到突变更多的突变体库。

本发明为CRISPR/Cas9基因编辑系统又提供了一个优秀的基因资源，具有重大的研究意义和社会价值。

附图说明

图1为PHUN411 CP1249-eABE载体质粒示意图。

图2为转基因植株中CP1249-OsSpCas9-eABE产生的靶向突变。

图3为转基因植株中pHUN411-ABE编辑后产生的突变形式。

具体实施方式

以下结合附图叙述本发明的实施例。应该说明，下述实施例仅用于对本发明的示例性实现方式进行说明，而并非对本发明进行任何限制。本领域技术人员可以对本发明作出某些等同的改动和显而易见的改进。

在没有其他具体说明的情况下，下述具体实施方式中的操作均采用本领域通用的常规操作来进行。本领域技术人员可以很容易地从现有技术中获得关于这样的常规操作的教导，例如可以参照教科书Sambrook and David Russell，Molecular Cloning:ALaboratory Manual,3rd ed.,Vols1,2；Charles Neal Stewart,Alisher Touraev,VitalyCitovsky and Tzvi Tzfira,Plant Transformation Technologies等。下述实施例中所用的药材原料、试剂、材料等，如无特殊说明，均为市售购买产品。

实施例1——CP1249-OsSpCas9-eABE基因合成

本申请的基因被命名为CP1249-OsSpCas9-eABE，序列如SEQ ID NO:1所示。

将CP1249-OsSpCas9-eABE的基因序列送苏州金唯智生物科技有限公司合成后，进行PCR扩增，并转入大肠杆菌XL-blue。需要说明的是，本申请发明人在研发过程中所获得的CP1249-OsSpCas9-eABE是通过基因顺序、片段的各种交叉组合调整后获得的，具体获得过程属于技术秘密不予详述。本领域技术人员按照本发明的公开内容也可以直接合成，并不影响本发明的实现，只是成本会有所上升。

对照基因的构建，对照基因采用普通的碱基编辑器OsSpCas9-ABE编辑器，下面实施例2和3中对于本发明基因编辑器的载体构建以及细胞导入过程，均同时对该对照编辑器同步进行。

实施例2——含有CP1249-OsSpCas9-eABE基因植物打靶载体的构建

从上面含有CP1249-OsSpCas9-eABE载体的大肠杆菌XL-blue，用Axygen质粒提取试剂盒中提取质粒，用NotI/SacI酶切，回收CP1249-OsSpCas9-eABE片段。同时利用NotI/SacI酶对pHUN900进行线性化处理，回收pHUN900，将上述的CP1249-OsSpCas9-eABE片段和pHUN900片段用T4连接酶(购于TaKaRa公司)进行连接，得到植物表达载体pHUN CP1249-OsSpCas9-eABE(图1)，命名为pHUN411CP1249-eABE。

选择水稻PDS基因(Os03g0184000)中第1外显子的核苷酸序列AAGGAAAAAGATTCCGTCGGAGG，(下划线部分为所述5’NGG-3’结构的PAM序列)，作为打靶位点。将靶位点序列与pHUN411 CP1249-eABE融合形成pHUN41 CP1249-eABE-PDS。利用冻融法将植物表达载体转入根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)EHA105菌株中(安徽省农业科学院水稻研究所保存)，用于遗传转化。

同理，对于碱基编辑器ABE-PDS，利用其构建PHUN CP1249-ABE-PDS表达载体，转入根癌农杆菌EHA105菌株中，用于遗传转化。

实施例3——以PHUN CP1249-eABE-PDS为打靶载体的水稻遗传转化及突变体的获得。

1、成熟胚愈伤组织的诱导和预培养

将日本晴水稻的成熟种子去壳，选取外观正常、洁净无霉斑的种子，用70％酒精，摇晃90sec，倒掉酒精；再用含Tween20的50％次氯酸钠(原液有效氯浓度大于4％，每100毫升加入1滴Tween20)溶液清洗种子，在摇床上晃动45min(180r/min)。倒掉次氯酸钠，无菌水洗5-10遍至无次氯酸钠气味，最后加入无菌水，30℃浸泡过夜。用手术刀片沿糊粉层分离胚，盾片朝上放置在诱导培养基(成分见表1)上，12粒/皿，30℃暗培养以诱导愈伤组织。

两周后出现球形、粗糙、浅黄色的次级愈伤组织，可以进行预培养操作，即将次级愈伤转至新的愈伤组织诱导培养基上，30℃暗培养预培养5天。预培养结束后，将状态良好、分裂旺盛的小颗粒用勺收集至50mL的无菌离心管中，用于农杆菌侵染。

2、农杆菌菌株的培养和悬浮液准备

将含有PHUN CP1249-eABE-PDS载体的农杆菌菌株EHA105在含有50mg/L卡那霉素的LB平板上划线(成分见表1)，28℃黑暗培养，24h后用无菌接种环将活化的农杆菌接种至新鲜的50mg/L卡那霉素的LB平板上，进行第二次活化，28℃黑暗培养过夜。在50mL的无菌离心管中加入20-30mL农杆菌悬浮培养基(成分见表1)，用接种环将活化2次的农杆菌刮下，调整OD660至约0.10-0.25，室温静置30min以上。

3、侵染和共培养

向准备好的愈伤组织中(见步骤1)，加农杆菌悬浮液，浸泡15min,其间不时轻轻晃动。浸泡结束后倒掉液体(尽量将液体滴净)，用无菌滤纸吸去愈伤组织表面的多余的农杆菌菌液，并在超净台中用无菌风吹干。在100×25mm的一次性无菌培养皿垫上三张无菌滤纸，加入2.5mL农杆菌悬浮培养基，将吸干后的愈伤组织均匀分散在滤纸上，23℃黑暗培养48h。

4、前筛选和筛选培养

共培养结束后，将经共培养的愈伤组织均匀散布于前筛选培养基(成分见表1)中，30℃黑暗培养5天。前筛选培养结束后，将愈伤组织转至筛选培养基上(成分见表1)，每个培养皿接25粒愈伤组织，30℃黑暗培养，2-3周后，抗性愈伤组织生长明显，可进行分化再生操作。

5、分化再生

每个独立转化体挑选2-3颗生长状态良好、新鲜的小颗粒，转至分化再生培养基上(成分见表1)。每培养皿接5个独立转化体。28℃光照培养，光照周期为16h光照8h黑暗，光强度为3000-6000lx。

6、生根与移栽

当抗性愈伤组织分化的芽长至约2cm时，每个独立转化体只取一株生长良好的苗，移至生根培养基上(成分见表1)，28℃光照培养，光照周期为16h光照8h黑暗，光强度为3000-6000lx。两周后，选择根系发达的小苗，用水洗去培养基，移栽入土。

7、分子鉴定

在移栽之前，采取水稻叶片样品，用CTAB法进行DNA小提。将所得到的基因组DNA样品用于PCR分析。设计PCR引物5’-GGCTGCCTGTCATCTATGAACA-3’及5’-ATACCTGCTCCAGCAATCACG-3’，用于扩增PDS靶标附近的150bp左右的序列。将PCR组分首先在95℃保持5分钟，然后进行32个循环：94℃45秒、56℃45秒、72℃45秒，最后在72℃延伸10分钟。将PCR产物测序。所测结果与野生型序列进行比对(图2和图3)。在pHUN411 CP1249-eABE-PDS获得的植株中，在检测的32株植株中出现24株突变，都是在靶标序列中不同位置的A突变成G，单碱基变异效率达到75％，而且除了远离PAM端4-8位出现了A到G的替换以外，在远离PAM端的第2、9和11位分别发生了A突变为G(图2)。同样的，在pHUN411-ABE-PDS获得的植株中，在检测的40株植株中有18株靶标序列出现单碱基变异，突变率仅为45％，其编辑窗口仅为4-8位。由此可见，pHUN411 CP1249-eABE不仅能获得更高的单碱基突变率，而且可以将编辑窗口扩展，将编辑窗口由原来的5位扩展到至少10位，窗口宽度翻倍，可以编辑更多的突变，获得更多的随机突变或者得到突变更多的突变体库，因此，其是非常有应用前景的基因编辑工具，具有非常好的研究价值、使用价值和社会价值。

序列表

<110> 安徽省农业科学院水稻研究所

<120> 一种高效的宽窗口单碱基编辑基因及其应用和育种方法

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 4891

<212> DNA

<213> cas9编辑器(Cas9)

<400> 1

gcggccgcgc caccatggcc ccaaagaaga agcgcaaggt ctccgaggtg gaatttagcc 60

acgagtattg gatgaggcac gcgctcacac tcgccaagag ggcgagggac gagagggaag 120

tgccagtcgg cgcggtgctg gtgctgaaca accgcgtgat cggcgagggt tggaataggg 180

ccattggcct ccacgacccg acagcccatg ccgagattat ggccctcagg cagggtggtc 240

tggtgatgca gaactatcgc ctcatcgacg ccaccctcta cgtcaccttt gagccatgcg 300

tgatgtgcgc cggcgccatg atccactcca ggatcggccg cgtcgtcttc ggcgtgagga 360

acgccaaaac aggcgccgcg ggcagcctca tggatgtgct ccactacccg gggatgaatc 420

acagggtgga aatcaccgaa ggcattctcg ccgatgagtg cgctgctctg ctgtgctact 480

tctttaggat gccgaggcag gtgtttaacg cccagaagaa ggcgcaatcc tccaccgata 540

gcggtggttc ctccgggggc tcctccggct ccgaaactcc gggcacaagc gaaagcgcca 600

caccggaatc ctccggcggg tcctccggtg gttccgagga caacgagcaa aagcagctgt 660

tcgtcgagca gcacaagcac tacctcgacg agatcatcga gcagatctcc gagttctcca 720

agcgcgtgat cctcgccgat gccaacctcg ataaggtgct cagcgcctac aacaagcacc 780

gcgataagcc aattcgcgag caggccgaga acatcatcca cctcttcacc ctcaccaacc 840

tcggcgctcc agccgccttc aagtacttcg acaccaccat cgaccgcaag cgctacacct 900

ctaccaagga ggttctcgac gccaccctca tccaccagtc tatcacaggc ctctacgaga 960

cacgcatcga cctctcacaa ctcggcggcg atggtggctc gggtggctcg ggtggcagtg 1020

gtgggagcgg cggatcgggt ggctctggtg gagacaagaa gtactccatc ggcctcgaca 1080

tcggcaccaa ttctgttggc tgggccgtga tcaccgacga gtacaaggtg ccgtccaaga 1140

agttcaaggt cctcggcaac accgaccgcc actccatcaa gaagaatctc atcggcgccc 1200

tgctgttcga ctctggcgag acagccgagg ctacaaggct caagaggacc gctagacgca 1260

ggtacaccag gcgcaagaac cgcatctgct acctccaaga gatcttctcc aacgagatgg 1320

ccaaggtgga cgacagcttc ttccacaggc tcgaggagag cttcctcgtc gaggaggaca 1380

agaagcacga gcgccatccg atcttcggca acatcgtgga tgaggtggcc taccacgaga 1440

agtacccgac catctaccac ctccgcaaga agctcgtcga ctccaccgat aaggccgacc 1500

tcaggctcat ctacctcgcc ctcgcccaca tgatcaagtt caggggccac ttcctcatcg 1560

agggcgacct caacccggac aactccgatg tggacaagct gttcatccag ctcgtgcaga 1620

cctacaacca gctgttcgag gagaacccga tcaacgcctc tggcgttgac gccaaggcta 1680

ttctctctgc caggctctct aagtcccgca ggctcgagaa tctgatcgcc caacttccgg 1740

gcgagaagaa gaatggcctc ttcggcaacc tgatcgccct ctctcttggc ctcaccccga 1800

acttcaagtc caacttcgac ctcgccgagg acgccaagct ccagctttcc aaggacacct 1860

acgacgacga cctcgacaat ctcctcgccc agattggcga tcagtacgcc gatctgttcc 1920

tcgccgccaa gaatctctcc gacgccatcc tcctcagcga catcctcagg gtgaacaccg 1980

agatcaccaa ggccccactc tccgcctcca tgatcaagag gtacgacgag caccaccagg 2040

acctcacact cctcaaggcc ctcgtgagac agcagctccc agagaagtac aaggagatct 2100

tcttcgacca gtccaagaac ggctacgccg gctacatcga tggcggcgct tctcaagagg 2160

agttctacaa gttcatcaag ccgatcctcg agaagatgga cggcaccgag gagctgctcg 2220

tgaagctcaa tagagaggac ctcctccgca agcagcgcac cttcgataat ggctccatcc 2280

cgcaccagat ccacctcggc gagcttcatg ctatcctccg caggcaagag gacttctacc 2340

cgttcctcaa ggacaaccgc gagaagattg agaagatcct caccttccgc atcccgtact 2400

acgtgggccc gctcgccagg ggcaactcca ggttcgcctg gatgaccaga aagtccgagg 2460

agacaatcac cccctggaac ttcgaggagg tggtggataa gggcgcctct gcccagtctt 2520

tcatcgagcg catgaccaac ttcgacaaga acctcccgaa cgagaaggtg ctcccgaagc 2580

actcactcct ctacgagtac ttcaccgtgt acaacgagct gaccaaggtg aagtacgtga 2640

ccgaggggat gaggaagcca gctttcctta gcggcgagca aaagaaggcc atcgtcgacc 2700

tgctgttcaa gaccaaccgc aaggtgaccg tgaagcagct caaggaggac tacttcaaga 2760

aaatcgagtg cttcgactcc gtcgagatct ccggcgtcga ggataggttc aatgcctccc 2820

tcgggaccta ccacgacctc ctcaagatta tcaaggacaa ggacttcctc gacaacgagg 2880

agaacgagga catcctcgag gacatcgtgc tcaccctcac cctcttcgag gaccgcgaga 2940

tgatcgagga gcgcctcaag acatacgccc acctcttcga cgacaaggtg atgaagcagc 3000

tgaagcgcag gcgctatacc ggctggggca ggctctctag gaagctcatc aacggcatcc 3060

gcgacaagca gtccggcaag acgatcctcg acttcctcaa gtccgacggc ttcgccaacc 3120

gcaacttcat gcagctcatc cacgacgact ccctcacctt caaggaggac atccaaaagg 3180

cccaggtgtc cggccaaggc gattccctcc atgaacatat cgccaatctc gccggctccc 3240

cggctatcaa gaagggcatt ctccagaccg tgaaggtggt ggacgagctg gtgaaggtga 3300

tgggcaggca caagccagag aacatcgtga tcgagatggc ccgcgagaac cagaccacac 3360

agaagggcca aaagaactcc cgcgagcgca tgaagaggat cgaggagggc attaaggagc 3420

tgggctccca gatcctcaag gagcacccag tcgagaacac ccagctccag aacgagaagc 3480

tctacctcta ctacctccag aacggccgcg acatgtacgt ggaccaagag ctggacatca 3540

accgcctctc cgactacgac gtggaccata ttgtgccgca gtccttcctg aaggacgact 3600

ccatcgacaa caaggtgctc acccgctccg acaagaacag gggcaagtcc gataacgtgc 3660

cgtccgaaga ggtcgtcaag aagatgaaga actactggcg ccagctcctc aacgccaagc 3720

tcatcaccca gaggaagttc gacaacctca ccaaggccga gagaggcggc ctttccgagc 3780

ttgataaggc cggcttcatc aagcgccagc tcgtcgagac acgccagatc acaaagcacg 3840

tggcccagat cctcgactcc cgcatgaaca ccaagtacga cgagaacgac aagctcatcc 3900

gcgaggtgaa ggtcatcacc ctcaagtcca agctcgtgtc cgacttccgc aaggacttcc 3960

agttctacaa ggtgcgcgag atcaacaact accaccacgc ccacgacgcc tacctcaatg 4020

ccgtggtggg cacagccctc atcaagaagt acccaaagct cgagtccgag ttcgtgtacg 4080

gcgactacaa ggtgtacgac gtgcgcaaga tgatcgccaa gtccgagcaa gagatcggca 4140

aggcgaccgc caagtacttc ttctactcca acatcatgaa tttcttcaag accgagatca 4200

cgctcgccaa cggcgagatt aggaagaggc cgctcatcga gacaaacggc gagacaggcg 4260

agatcgtgtg ggacaagggc agggatttcg ccacagtgcg caaggtgctc tccatgccgc 4320

aagtgaacat cgtgaagaag accgaggttc agaccggcgg cttctccaag gagtccatcc 4380

tcccaaagcg caactccgac aagctgatcg cccgcaagaa ggactgggac ccgaagaagt 4440

atggcggctt cgattctccg accgtggcct actctgtgct cgtggttgcc aaggtcgaga 4500

agggcaagag caagaagctc aagtccgtca aggagctgct gggcatcacg atcatggagc 4560

gcagcagctt cgagaagaac ccaatcgact tcctcgaggc caagggctac aaggaggtga 4620

agaaggacct catcatcaag ctcccgaagt acagcctctt cgagcttgag aacggccgca 4680

agagaatgct cgcctctgct ggcgagcttc agaagggcaa cgagcttgct ctcccgtcca 4740

agtacgtgaa cttcctctac ctcgcctccc actacgagaa gctcaagggc tccccaccga 4800

agaagaagag gaagtgtccg gcggtagtcc aaagaagaag aggaaggtgt cgggaggtag 4860

cccaaagaag aagaggaagg tttgagagct c 4891

Claims (9)

1.一种高效的宽窗口单碱基编辑基因，其特征在于，所述编辑基因为CP1249-OsSpCas9-eABE，其至少包含：

(a)SEQ ID NO:1中所示的核苷酸序列；或者

(b)在SEQ ID NO:1中所示的核苷酸序列中取代一个或多个核苷酸且能够进行水稻基因组剪切的核苷酸序列；或者

(c)在SEQ ID NO:1中所示的核苷酸序列中添加一个或多个核苷酸且能够进行水稻基因组剪切的核苷酸序列；或者

(d)SEQ ID NO:1中所示的核苷酸序列缺失一个或多个核苷酸且能够进行水稻基因组剪切的核苷酸序列。

2.根据权利要求1所述的高效的宽窗口单碱基编辑基因，其特征在于，所述单碱基编辑基因CP1249-OsSpCas9-eABE由序列表中SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列构成。

3.一种表达盒，其特征在于，所述表达盒中包含权利要求1所述单碱基编辑基因CP1249-OsSpCas9-eABE。

4.一种表达载体，其特征在于，所述表达载体包含权利要求1所述单碱基编辑基因CP1249-OsSpCas9-eABE或权利要求3所述的表达盒。

5.一种权利要求1所述的单碱基编辑基因的应用，其特征在于，所述应用包括利用所述编辑窗口拓展的CP1249-OsSpCas9-eABE基因对水稻基因组进行单碱基编辑，实现由A/T碱基突变成C/G，获得含有单碱基突变的转基因植物或植物部分。

6.一种权利要求3所述的表达盒的应用，其特征在于，所述应用包括利用所述单碱基编辑基因CP1249-OsSpCas9-eABE对水稻基因组进行单碱基编辑，实现由A/T碱基突变成C/G，获得含有单碱基突变的转基因植物或植物部分。

7.一种权利要求4所述的表达载体的应用，其特征在于，所述应用包括利用所述单碱基编辑基因CP1249-OsSpCas9-eABE对水稻基因组进行单碱基编辑，实现由A/T碱基突变成C/G，获得含有单碱基突变的转基因植物或植物部分。

8.一种将权利要求1中所述的单碱基编辑基因CP1249-OsSpCas9-eABE导入水稻细胞的方法包括下述步骤：

(1)将水稻种子去壳、灭菌后将胚分离出来，置于愈伤组织诱导培养基上以产生次级愈伤组织；

(2)将次级愈伤组织转移至新的愈伤组织诱导培养基预培养；

(3)将步骤(2)中获得的愈伤组织与携带单碱基编辑基因CP1249-OsSpCas9-eABE的打靶载体的农杆菌接触15分钟；

(4)将步骤(3)的愈伤组织转移到其上垫有三张无菌滤纸的培养皿中，21-23℃培养48小时；

(5)将步骤(4)的愈伤组织置于前筛选培养基上培养5-7天；

(6)将步骤(5)的愈伤组织转移筛选培养基上，以获得抗性愈伤组织；

(7)将抗性愈伤组织转移到分化再生培养基中分化成苗；和

(8)将步骤(7)的苗转移到生根培养基中生根。

9.一种育种方法，其特征在于，所述育种方法包括将权利要求8中所述的水稻细胞培育成水稻，利用所培育的水稻进行育种。

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