CN115029308B - 干细胞外泌体制剂及其制备方法和应用 - Google Patents

干细胞外泌体制剂及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于干细胞培养技术领域，具体涉及富含细胞因子的干细胞外泌体制剂的制备方法和应用，该方法包括：在低氧的条件下培养干细胞；和或在含双氢青蒿素的培养基中培养干细胞；收集源自上述干细胞培养液的培养上清。采用上述培养方法培养的间充质干细胞高度表达IL‑6、IL‑8、TGF‑1、MCP‑1、VEGF、TIMP‑1和GM‑CSF因子，特别是其他培养方法中低表达或者是不表达的VEGF和GM‑CSF因子含量显著增加。

Description

干细胞外泌体制剂及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于干细胞培养技术领域。更具体地，涉及干细胞外泌体制剂及其制备方法和应用。
背景技术
已知多种细胞因子参与了组织损失修复的过程，其中，包括趋化因子，白细胞介素，生长因子和集落刺激因子等，在上述细胞因子中，发挥关键作用的主要有白细胞介素因子、TGF-1、MCP-1、VEGF、TIMP-1和GM-CSF等。其中，白细胞介素因子能够促进角质细胞增殖和迁移、促进上皮细胞组织再生和瘢痕组织形成；TGF-1可促进中性粒细胞、巨噬细胞迁移，刺激成纤维细胞增殖和瘢痕组织形成；MCP-1能够促进伤口部位上皮组织再生、血管发生和胶原蛋白的生成；VEGF能够促进伤口处血管生成和肉芽组织的形成；GM-CSF能够促进角质细胞分化、刺激内皮细胞增殖和迁移、加速伤口上皮细胞组织的再生；TIMP-1可以中和金属蛋白酶的作用，促进伤口的愈合。增强或提高间充质干细胞分泌上述细胞因子的能力可以改善伤口愈合状况，具有非常重要的临床意义。
然而，已有研究表明，现有培养的脐带间充质干细胞培养上清液中多表达白细胞介素因子、MCP-1和TIMP-1，但是对于GM-CSF和VEGF表达较低或者不表达。
发明内容
本发明涉及培养间充质干细胞的方法，该间充质干细胞能够同时高度表达TGF-1、GM-CSF和VEGF等伤口愈合相关因子；更一进步地，本发明涉及富含细胞因子的外泌体制剂，该外泌体制剂收集源自上述间充质干细胞培养液的培养上清；更进一步地，本发明涉及该外泌体制备促进皮肤修复、创伤愈合药物的用途。
具体而言，本发明的一个方面提供了培养高度表达细胞因子的间充质干细胞群的方法，第一种培养方法，包括：在低氧的条件下培养干细胞。已知低氧条件不会影响干细胞的表型及干性，并可促进干细胞增殖、分化、迁徙、抗凋亡及对缺血缺氧的耐受，但在申请日前，仍然不知低氧条件对间充质干细胞分泌伤口愈合相关因子效应的影响如何。根据本发明，低氧条件可通过低氧装置控制实现，在低氧条件下，氧气的浓度可以为1～3％，最好是1％、2％或3％。
在本发明具有代表性的实施例中，用于在低氧条件下培养间充质干细胞的培养基中可以包括加入或者未加入胎牛血清的基础培养基；基础培养基的例子包括DMEM、MEM或DMEM/F12；根据需要还可含有氨基酸、维生素、抗生素等活性成分。
氨基酸的例子包括：L-谷氨酰胺、L-组氨酸、L-异亮氨酸、L-亮氨酸、L-赖氨酸、L-蛋氨酸、L-苯丙氨酸、L-苏氨酸、L-色氨酸、L-缬氨酸等。在本发明的实施例中最好使用L-谷氨酰胺，L-谷氨酰胺的浓度通常介乎1～3mmol/L之间，例如2mmol/L。
维生素的例子包括：抗坏血酸或其衍生物，如抗坏血酸磷酸酯镁；在本发明的实施例中最好使用抗坏血酸，在培养基中，抗坏血酸的浓度通常介乎1～5mg/ml之间，例如约2mg/ml。
抗生素的例子包括链霉素和/或青霉素，当含有抗生素时，可以不包含其他添加剂成分，在本发明的实施例中最好使用链霉素和青霉素，青霉素的浓度通常介乎50～120U/ml之间，例如100U/ml。链霉素的浓度通常介乎于50～120μg/ml，例如100μg/ml。
本发明表1显示了2％O2、3％O2和常氧条件下培养的人脐带间充质干细胞细胞因子分泌情况，从结果可看出，低氧条件培养相关因子的表达量均比常氧条件下要高，特别是IL-6、IL-8和MCP-1表达量与常氧相比显著增加(P＜0.05)；但是GM-CSF和VEGF因子无论是在低氧或者常氧条件下的表达量均较低。
本发明另一方面提供了培养高度表达细胞因子的间充质干细胞群的第二种方法，包括：在含双氢青蒿素的培养基中培养干细胞；在申请日之前，尚未报道双氢青蒿素用于干细胞的培养，并刺激其高度表达相关细胞因子的例子。
特别的，在培养基中，双氢青蒿素的浓度通常介乎1～10μmol/L之间，例如3μmol/L、5μmol/L或6μmol/L。
特别的，在本发明具有代表性的实施例中，含有双氢青蒿素的培养基还可以进一步包含适量的基础培养基和2-巯基乙醇。基础培养基的例子包括DMEM、MEM或DMEM/F12，在本发明的实施例中最好使用DMEM基础培养基。
在本发明具有代表性的实施例中，2-巯基乙醇的存在是必要的，在培养基中，2-巯基乙醇的浓度通常介乎1～5μl之间，例如2μl或3μl。
特别的，可以不包含胎牛血清或者其他添加剂组分，如氨基酸、维生素、抗生素等。
本文中所述“干细胞”是指具有分化潜能和自我更新能力的细胞(全能干细胞、多能干细胞和单能干细胞)，在本发明中特指间充质干细胞，更具体的是特指脐带间充质干细胞，在本文中已经验证了第一和第二培养方法均能够刺激人脐带间充质干细胞高度表达白细胞介素因子、MCP-1、TIMP-1、GM-CSF等相关伤口愈合因子，这种效应有可能在其他间充质干细胞，如骨髓间充质干细胞的身上同样可观察到，但还有待进一步研究验证。
特别的，本发明第一培养方法和第二培养方法可以单独执行或者组合或者同时执行。在本发明具有代表性的实施例中，第一培养方法和第二培养方法同时执行，将在获得的间充质干细胞身上观察极强的细胞因子分泌效应，特别是第一培养方法中低表达的GM-CSF和VEGF观察到强的分泌效应。
本发明表3显示了第一培养方法和第二培养方法同时执行培养的间充质干细胞相关因子的表达情况，通过比较加入或者未加入双氢青蒿素干预培养的间充质干细胞分泌细胞因子的情况，结果显示，2％O2下，加入双氢青蒿素干预培养的间充质干细胞同时高度表达IL-6、IL-8、TGF-1、MCP-1、VEGF、TIMP-1和GM-CSF，特别是常氧或低氧下低表达或者是不表达的VEGF和GM-CSF因子；经双氢青蒿素干预培养的间充质干细胞分泌的VEGF和GM-CS细胞因子量更高。
本发明另一方面提供一种外泌体制剂，该外泌体制剂收集源自第一培养方法和第二培养方法单独执行或者组合或者同时执行培养的间充质干细胞培养液的培养上清。已然通过试验证明，该培养上清中富含白细胞介素因子、MCP-1、TIMP-1、GM-CSF等相关伤口愈合因子，这些因子对于促进皮肤的修复、创面的愈合、上皮组织的形成是非常有利的。
本发明另一方面提供了富含细胞因子的外泌体制剂在制备促进皮肤修复、创伤愈合药物中的用途。这些药物可用于创伤、烧伤和溃疡愈合的临床治疗。
小鼠创面愈合试验显示，在不同的时间点，经注射第一培养方法和第二培养方法同时执行培养的间充质干细胞培养液上清的小鼠创面残余面积均显著低于其他组，创面愈合速率明显较其他组快，第7天可观察到新生肉芽，第14天时基本完成上皮化。
具体实施方式
以下结合具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
试验一、氧气浓度对人脐带间充质干细胞分泌相关细胞因子的影响研究
试验方法：
人脐带间充质干细胞的培养：取经鉴定符合间充质干细胞表型特征的P2代人脐带间充质干细胞，以1×104/cm2的密度接种于培养皿中，加入培养基(L-谷氨酰胺2mmol/L、抗坏血酸2mg/ml+余量DMEM)，将培养皿放置于低氧装置中，以0.5L/min的流速通入混合气体(95％N2+5％CO2)来控制环境中的氧气浓度，分别于不同氧气浓度、37℃、体积分数5％CO2下培养96h，细胞达到80-90％融合后，收集上清液，离心去除死细胞和细胞碎片，微孔滤膜过滤，-20℃冻存，备用。
采用ELISA试剂盒按照说明书检测收集的上清液中IL-6、IL-8、TGF-1、MCP-1、VEGF、TIMP-1和GM-CSF含量，采用统计软件对数据进行统计分析，结果如下表1所示。
表1：
Figure BDA0003774330340000041
注：与常氧相比，*P＜0.05；**P＜0.01。
表1显示了2％O2、3％O2和常氧条件下培养的人脐带间充质干细胞细胞因子分泌情况，从结果可看出，低氧条件培养相关因子的表达量均比常氧条件下要高，特别是IL-6、IL-8、TIMP-1和MCP-1表达与常氧相比显著增加(P＜0.05)，但GM-CSF与VEGF的表达观察不到显著增加的趋势。
试验二、双氢青蒿素对人脐带间充质干细胞分泌相关细胞因子的影响研究
试验方法：取经鉴定符合间充质干细胞表型特征的P2代人脐带间充质干细胞，以1×104/cm2的密度接种于培养皿中，分别加入不同的培养基(表2)，将培养皿放置于低氧装置中，以0.5L/min的流速通入混合气体(95％N2+5％CO2)来控制环境中的氧气浓度为2％，在37℃、体积分数5％CO2下培养96h，细胞达到80-90％融合后，收集上清液，离心去除死细胞和细胞碎片，微孔滤膜过滤，-20℃冻存，备用。
采用ELISA试剂盒按照说明书检测收集的上清液中IL-6、IL-8、TGF-1、MCP-1、VEGF、TIMP-1和GM-CSF含量，采用统计软件对数据进行统计分析，结果如下表3所示。
表2：
双氢青蒿素(μmol/L) 2-巯基乙醇(μl) DMEM培养基
培养基A 3μmol/L 0 余量
培养基B 0 3μl 余量
培养基C 3μmol/L 3μl 余量
培养基D 5μmol/L 2μl 余量
表3：
Figure BDA0003774330340000051
与培养基C相比，*P＜0.05；**P＜0.01。
表3显示了2％O2下，加入或者未加入双氢青蒿素干预培养的间充质干细胞分泌细胞因子的情况，结果显示，加入双氢青蒿素干预培养的间充质干细胞同时高度表达IL-6、IL-8、TGF-1、MCP-1、VEGF、TIMP-1和GM-CSF，特别是常氧或低氧下低表达或者是不表达的VEGF和GM-CSF因子，经双氢青蒿素干预培养的间充质干细胞分泌量更高，与常氧条件相比，表达量增加了2倍左右。
试验三、对小鼠创面愈合的影响
试验方法：选用健康清洁级C57BL/6雄性小鼠50只，试验前12小时禁水禁食，用4％水合氯醛(0.01ml/g)腹腔注射麻醉小鼠，将其固定后除去小鼠背部毛发，将环形胶圈用尼龙线固定在小鼠背部中线两侧，距离小鼠耳朵2.5cm处，拉紧缝合线，使环形胶圈贴合在小鼠背部。使用皮肤打孔器在小鼠背部制作两个直径为1cm的创面，术后试验组分别经鼠尾静脉注射100μl试验例二制备的培养基A～D培养上清，空白组不做处理，分别于术后第0天、7天和14天观察创面愈合情况，拍照记录统计各时间点残余创面面积，创面愈合率(％)＝(造模初期创面面积-术后不同时间点创面面积)/造模初期创面面积*100％，结果如下表4所示。
表4：
Figure BDA0003774330340000061
由表4可知，在不同的时间点，培养基C和培养基D组小鼠创面残余面积均显著低于其他组，创面愈合速率明显较另外三组快，第7天可观察到新生肉芽，第14天时基本完成上皮化。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (4)

1.富含细胞因子的干细胞外泌体制剂的制备方法，其特征在于，该方法包括：
a1:在氧气体积分数为2%的条件下，在含3~5μmol/L双氢青蒿素、2~3μl 2-巯基乙醇的DMEM培养基中培养脐带间充质干细胞；
a2:收集源自上述干细胞培养液的培养上清。
2.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，所述细胞因子包括IL-6、IL-8、TGF-1、MCP-1、VEGF、TIMP-1和GM-CSF。
3.根据权利要求1或2所述制备方法制备得到的干细胞外泌体制剂。
4.根据权利要求3所述干细胞外泌体制剂在制备促进皮肤修复、创伤愈合药物中的用途。
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