CN115491352B - 促进干细胞外泌体分泌的培养液、外泌体制备及应用 - Google Patents

促进干细胞外泌体分泌的培养液、外泌体制备及应用 Download PDF

Info

Publication number
CN115491352B
CN115491352B CN202211435698.0A CN202211435698A CN115491352B CN 115491352 B CN115491352 B CN 115491352B CN 202211435698 A CN202211435698 A CN 202211435698A CN 115491352 B CN115491352 B CN 115491352B
Authority
CN
China
Prior art keywords
mesenchymal stem
culture
stem cell
vitamin
culture solution
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202211435698.0A
Other languages
English (en)
Other versions
CN115491352A (zh
Inventor
谢海涛
薛卫巍
谢炜豪
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Guangdong Xiankangda Biotechnology Co ltd
Original Assignee
Guangdong Xiankangda Biotechnology Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Guangdong Xiankangda Biotechnology Co ltd filed Critical Guangdong Xiankangda Biotechnology Co ltd
Priority to CN202211435698.0A priority Critical patent/CN115491352B/zh
Publication of CN115491352A publication Critical patent/CN115491352A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN115491352B publication Critical patent/CN115491352B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0652—Cells of skeletal and connective tissues; Mesenchyme
    • C12N5/0662—Stem cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/28—Bone marrow; Haematopoietic stem cells; Mesenchymal stem cells of any origin, e.g. adipose-derived stem cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/05—Inorganic components
    • C12N2500/10—Metals; Metal chelators
    • C12N2500/20—Transition metals
    • C12N2500/24—Iron; Fe chelators; Transferrin
    • C12N2500/25—Insulin-transferrin; Insulin-transferrin-selenium
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/30—Organic components
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/30—Organic components
    • C12N2500/38—Vitamins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/30—Organic components
    • C12N2500/44—Thiols, e.g. mercaptoethanol
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/11—Epidermal growth factor [EGF]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/115—Basic fibroblast growth factor (bFGF, FGF-2)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/998—Proteins not provided for elsewhere

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明公开了一种促进干细胞外泌体分泌的培养液、外泌体制备及应用，该培养液中包括基础培养基、重组人胰岛素1~10mg/L、人转铁蛋白5~10mg/L、重组人纤连蛋白20~40mg/L、人血清白蛋白1~5g/L、维生素C 50~200mg/L、维生素B6 5~20mg/L、维生素B1 60~150mg/L、维生素A 20~50mg/L、EGF 2~10μg/L、bFGF10~20μg/L、β‑巯基乙醇5~15mg/L、谷胱甘肽1~5mg/L及1~5umol/L的长梗秦艽酮。该培养液中长梗秦艽酮组分具有抗肿瘤及促进间充质干细胞抗炎外泌体的分泌作用；同时，低氧环境下培养，可以促进间充质干细胞的分泌活动，有效提高外泌体的浓度。

Description

促进干细胞外泌体分泌的培养液、外泌体制备及应用
技术领域
本发明涉及干细胞培养技术领域，尤其涉及一种促进间充质干细胞外泌体分泌的培养液、外泌体制备方法及应用。
背景技术
已知干细胞具有免疫调控的作用，如，对宿主体内的T细胞、B细胞、NK细胞、巨噬细胞、树突状细胞等多种免疫细胞均有免疫调节功能。干细胞对免疫调控主要起抑制作用，如，平衡Th1/Th2细胞群、诱导Treg细胞增殖、抑制T细胞增殖、抑制B细胞活化、抑制树突状细胞成熟、促进机体的免疫耐受等。对于干细胞的免疫调控作用，主要是由其分泌的外泌体发挥作用，间充质干细胞是分泌外泌体能力最强的细胞，间充质干细胞分泌的外泌体是一类直径为30nm~150nm，密度为1.13~1.19g/ml的膜性囊泡样小体。
为了对抗肝损伤，组织通过诱导免疫细胞活化来启动先天和适应性免疫反应。肝损伤和免疫反应之间的不平衡导致炎症和进一步的损伤；因此，免疫抑制是肝细胞再生和损伤修复所必需的。间充质干细胞外泌体能减少促炎细胞因子IL-1β、IL-12、IFN-α、IL-2和IL-4的分泌，并促进抗炎细胞因子TGF-β和IL-10的分泌，导致免疫抑制。因此间充质干细胞外泌体可用于各种肝损伤，包括急性和慢性肝炎、代谢性肝病、肝硬化的自身免疫和并发症以及肝细胞癌的治疗途径。
目前已有将脐带间充质干细胞和骨髓间充质干细胞分泌的外泌体用于肝损伤修复、急性肝衰竭和病毒性肝炎药物的报道，但存在稳定性和作用效果不够理想的问题。因此，提供一种稳定性好、肝脏修复效果好的一种间充质干细胞外泌体制剂具有重要意义。
发明内容
基于上述问题，本发明所要解决的问题在于提供一种可以促进间充质干细胞分泌外泌体的培养液以及外泌体获取方法与应用。
本发明所要解决的技术方案一如下：
一种促进间充质干细胞分泌外泌体的培养液，该培养液中包括基础培养基、重组人胰岛素1~10mg/L、人转铁蛋白5~10mg/L、重组人纤连蛋白20~40mg/L、人血清白蛋白1~5g/L、维生素C 50~200mg/L、维生素B6 5~20mg/L、维生素B1 60~150mg/L、维生素A 20~50mg/L、EGF 2~10μg/L、bFGF10~20μg/L、β-巯基乙醇5~15mg/L、谷胱甘肽1~5mg/L及1~5umol/L的长梗秦艽酮。
一实施例，所述培养液中，该培养液中包括基础培养基、重组人胰岛素2~8mg/L、人转铁蛋白6~8mg/L、重组人纤连蛋白25~35mg/L、人血清白蛋白2~4g/L、维生素C 80~160mg/L、维生素B6 10~15mg/L、维生素B1 80~120mg/L、维生素A 30~40mg/L、EGF 5~8μg/L、bFGF14~18μg/L、β-巯基乙醇8~12mg/L、谷胱甘肽2~4mg/L及2~4umol/L的长梗秦艽酮。
一实施例，所述培养液中，该培养液中包括基础培养基、重组人胰岛素5mg/L、人转铁蛋白7mg/L、重组人纤连蛋白31mg/L、人血清白蛋白3.2g/L、维生素C 100mg/L、维生素B612mg/L、维生素B1 110mg/L、维生素A 36mg/L、EGF 6μg/L、bFGF 15μg/L、β-巯基乙醇11mg/L、谷胱甘肽3mg/L及3umol/L的长梗秦艽酮。
一实施例，所述培养液中，所述基础培养基为a-MEM或DMEM。
本发明所要解决的技术方案二如下：
一种间充质干细胞外泌体的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
获取间充质干细胞；
将所述间充质干细胞接种至盛有培养液中的培养器中，进行静态培养；其中，所述培养液采用上述培养液；
培养结束后，对培养器中的培养液收集后进行离心处理，吸取保留上清液，获得间充质干细胞外泌体溶液。
一实施例，所述制备方法中，所述间充质干细胞为脐带间充质干细胞、骨髓间充质干细胞及胎盘间充质干细胞中的任一种。
一实施例，所述制备方法中，所述间充质干细胞的静态培养过程中，所述培养器内的O2浓度在5~8v/v％、CO2浓度为5 v/v％，温度控制在37℃，培养时间为96小时。
一实施例，所述制备方法中，离心处理时，离心力为1500~2500g，离心时间为8~15分钟。
上述方法制得间充质干细胞外泌体，可以在人体机能免疫调节、预防或治疗肝脏疾病药物中的得到应用。
本发明提供的培养液，其组分长梗秦艽酮具有一定的抗肿瘤作用，同时还能促进间充质干细胞抗炎细胞因子（即外泌体）的分泌，使得外泌体的分泌浓度达到8.9*106颗粒/mL，远大于对比例外泌体的分泌浓度3.2*106或5.7*106颗粒/mL；同时，低氧（O2浓度在5~8v/v％）环境下培养，可以促进间充质干细胞的分泌活动，有效提高外泌体的浓度。
附图说明
图1为实施例1中外泌体颗粒浓度浓度测定图；
图2为对比例1中外泌体颗粒浓度浓度测定图；
图3为对比例2中外泌体颗粒浓度浓度测定图；
图4为实施例1、对比例1、对比例2中的模拟受损L02细胞中LDH含量水平柱状图；
图5为实施例1、对比例1、对比例2中的模拟受损L02细胞中AST含量水平柱状图；
图6为实施例1、对比例1、对比例2中的模拟受损L02细胞分泌的总蛋白量柱状图；
图7为实施例1、对比例1、对比例2中的模拟受损L02细胞凋亡率柱状图；
图8为实施例1、对比例1、对比例2中的模拟受损L02细胞活率柱状图。
具体实施方式
下面结合附图，对本发明的较佳实施例作进一步详细说明。
本发明提供的促进间充质干细胞分泌外泌体的培养液，包括基础培养基，如，无血清培养基、a-MEM、DMEM或RPMI-1640等；在基础培养基中包含有：重组人胰岛素1~10mg/L、人转铁蛋白5~10mg/L、重组人纤连蛋白20~40mg/L、人血清白蛋白1~5g/L、维生素C 50~200mg/L、维生素B6 5~20mg/L、维生素B1 60~150mg/L、维生素A 20~50mg/L、EGF 2~10μg/L、bFGF10~20μg/L、β-巯基乙醇5~15mg/L、谷胱甘肽1~5mg/L及1~5umol/L的长梗秦艽酮。
在一个较好的实施例中，基础培养基中包括有：重组人胰岛素2~8mg/L、人转铁蛋白6~8mg/L、重组人纤连蛋白25~35mg/L、人血清白蛋白2~4g/L、维生素C 80~160mg/L、维生素B6 10~15mg/L、维生素B1 80~120mg/L、维生素A 30~40mg/L、EGF 5~8μg/L、bFGF 14~18μg/L、β-巯基乙醇8~12mg/L、谷胱甘肽2~4mg/L及2~4umol/L的长梗秦艽酮；其中，所述基础培养基为a-MEM或DMEM。
在一个更优的实施例中，上述基础培养基中包括：重组人胰岛素5mg/L、人转铁蛋白7mg/L、重组人纤连蛋白31mg/L、人血清白蛋白3.2g/L、维生素C 100mg/L、维生素B612mg/L、维生素B1 110mg/L、维生素A 36mg/L、EGF 6μg/L、bFGF 15μg/L、β-巯基乙醇11mg/L、谷胱甘肽3mg/L及3umol/L的长梗秦艽酮；其中，所述基础培养基为a-MEM或DMEM。
为了获得含量更高的间充质干细胞外泌体，本发明采用工艺步骤：
S1、从间充质干细胞培养种子库中获取间充质干细胞；
S2、将间充质干细胞接种至盛有培养液中的培养器中，进行静态培养；其中，培养液采用上述任一种培养液；
S3、培养结束后，对培养器中的培养液收集后进行离心处理，吸取保留上清液，获得间充质干细胞外泌体溶液。
上述步骤S1中，间充质干细胞为脐带间充质干细胞、骨髓间充质干细胞及胎盘间充质干细胞中的任一种。各种干细胞培养获取，属于现有技术，在此不再赘述。
上述步骤S2中，间充质干细胞的静态培养过程时，培养器内的O2浓度控制在5~8v/v％、CO2浓度为5 v/v％，温度控制在37℃，培养时间为96小时；其中，O2浓度是采用通入N2、CO2混合气体来控制；培养器可以是T175或T75培养瓶、细胞工厂（如，四层、十层细胞工厂）。
上述步骤S3中，离心处理时，离心力为1500~2500g，离心时间为8~15分钟；优选，离心力为2000g，离心时间为10分钟。
本发明的间充质干细胞外泌体，可以在人体机能免疫调节、预防或治疗肝脏疾病药物中的得到应用，如，急性和慢性肝炎、代谢性肝病、肝硬化的自身免疫和并发症以及肝细胞癌药物中起到抑制剂作用。
对于外泌体使用的检测，主要通过下述手段进行。
1、MTT法是一种检测细胞存活和生长的方法。MTT为黄色化合物,是一种接受氢离子的染料,可作用于活细胞线粒体中的呼吸链,在琥珀酸脱氢酶和细胞色素C的作用下,外源性MT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒( Formazan)并沉积在细胞中,而死细胞无此功能。二甲基亚砜(DMSO)能溶解细胞中的甲瓒,用酶联免疫检测仪在490nm波长处测定其光吸收值,可间接反映活细胞数量。在一定细胞数范围内,MT结晶形成的量与活细胞数成正比。数值最高，说明受损的L02细胞的生长也快，也间接说明细胞受损恢复得越快或者说健康的L02细胞生长快于受损死亡的L02细胞。
2、LDH，也叫乳酸脱氢酶，是糖的无氧酵解和糖异生的重要酶系之一。LDH广泛存在于人体组织中，以肾脏含量最高，其次是心肌、骨骼肌，红细胞内含量约为正常血清的100倍。乳酸脱氢酶是人体内糖酵解途径中至关重要的氧化还原酶，能够可逆的催化乳酸，使之氧化为丙酮酸，提供人体的能量来源。
乳酸脱氢酶的测定常用于诊断心肌梗死、肝脏疾病和某些恶性肿瘤，乳酸脱氢酶升高，常见于心肌梗死、肝脏疾病，比如急性肝炎、慢性活动性肝炎、肝硬化、肝癌等，都可以出现乳酸脱氢酶的增高情况。血液系统疾病里的白血病、贫血、恶性淋巴瘤等，也可以出现乳酸脱氢酶的增高情况。骨骼肌的损伤、恶性肿瘤转移，也可以测定出乳酸脱氢酶水平增高的结果。数值越高，代表L02细胞损伤越大。
3、AST是指谷草转氨酶，主要是分布于心肌，其次是肝脏、肾脏、骨骼肌中。正常的血清中谷草转氨酶的含量很低，但如果相应的细胞受损失，细胞膜通透性增加，细胞内的谷草转氨酶会释放入血，引起其升高。一般是作为脏器损伤的辅助检查，其正常值是0-40U/L，在出现某些急性的病毒性肝炎、肝细胞损伤时，以及肝硬化、胆道梗阻、肝癌都有可能会升高。同理LDH，数值越高，代表L02细胞损伤越大。
4、健康的细胞表达的蛋白越多，相反衰老接近死亡的细胞代谢活动越弱，表达蛋白越低。数值越高，代表L02细胞生理活性越强，代谢更旺盛。
下面通过具体实施例和对比例作进一步说明
一、间充质干细胞外泌体的获取
实施例1
人脐带间充质干细胞的培养：取经鉴定符合间充质干细胞表型特征的P1代人脐带间充质干细胞，以200ml人培养液接种1.0*107个细胞到培养瓶中；其中，培养液采用a-MEM作为基础培养基，在a-MEM基础培养基中还含有：重组人胰岛素5mg/L、人转铁蛋白7mg/L、重组人纤连蛋白31mg/L、人血清白蛋白3.2g/L、维生素C 100mg/L、维生素B6 12mg/L、维生素B1 110mg/L、维生素A 36mg/L、EGF 6μg/L、bFGF 15μg/L、β-巯基乙醇11mg/L、谷胱甘肽3mg/L及3umol/L的长梗秦艽酮。
随后，将培养瓶置于培养箱，37℃温度下静态培养96小时；其中，培养箱中通入N2、CO2混合气体，以调控环境中的O2浓度，使O2浓度控制在6 v/v％、CO2浓度为5 v/v％。
培养结束后，回收培养瓶中的所有培养液，2000g离心10分钟，收集上清液，得到间充质干细胞外泌体。
将获得的外泌体置于-20℃冻存，备用。
对比例1
人脐带间充质干细胞的培养：取经鉴定符合间充质干细胞表型特征的P1代人脐带间充质干细胞，以200ml人培养液接种1.0*107个细胞到培养瓶中；其中，培养液采用a-MEM作为基础培养基，在a-MEM基础培养基中还含有：重组人胰岛素1mg/L、人转铁蛋白10mg/L、重组人纤连蛋白35mg/L、人血清白蛋白4g/L、维生素C 200mg/L、维生素B6 5mg/L、维生素B160mg/L、维生素A 50mg/L、EGF 5μg/L、bFGF 14μg/L、β-巯基乙醇15mg/L及谷胱甘肽1mg/L。
随后，将培养瓶置于培养箱，CO2浓度为5v/v％、37℃温度下静态培养96小时。
培养结束后，回收培养瓶中的所有培养液，2000g离心15分钟，收集上清液，得到间充质干细胞外泌体。
将获得的外泌体置于-20℃冻存，备用。
对比例2
人脐带间充质干细胞的培养：取经鉴定符合间充质干细胞表型特征的P1代人脐带间充质干细胞，以200ml人培养液接种1.0*107个细胞到培养瓶中；其中，培养液采用DMEM作为基础培养基，在DMEM基础培养基中还含有：重组人胰岛素10mg/L、人转铁蛋白5mg/L、重组人纤连蛋白20mg/L、人血清白蛋白1g/L、维生素C 80mg/L、维生素B6 15mg/L、维生素B1120mg/L、维生素A 30mg/L、EGF 10μg/L、bFGF 10μg/L及β-巯基乙醇8mg/L。
随后，将培养瓶置于培养箱，37℃温度下静态培养96小时；其中，培养箱中通入N2、CO2混合气体，以调控环境中的O2浓度，使O2浓度控制在8 v/v％、CO2浓度为5 v/v％。
培养结束后，回收培养瓶中的所有培养液，2000g离心5分钟，收集上清液，得到间充质干细胞外泌体。
将获得的外泌体置于-20℃冻存，备用。
二、间充质干细胞外泌体的检测
1）外泌体浓度测定
采用纳米颗粒追踪分析 (Nanoparticle Tracking Analysis, NTA) 技术分析外泌体制剂中粒径30nm～150nm的颗粒峰值浓度含量。
实施例1、对比例1和2所制备的外泌体浓度使用纳米颗粒跟踪分析仪（制造商：德国PARTICLE METRIX公司；型号：Zeta View PMX-120）进行检测，检测结果，如表1、图1至3所示。图1至图3中，对应峰图为样本池内样本的检测结果，由仪器自行导出，并进行平滑处理。峰图对应面积表示为外泌体颗粒浓度。
Zeta View纳米颗粒跟踪分析仪检测参数如下：
1）样本参数：温度：随检测样本而定；pH值：7.0；样本稀释液：PBS; 其中：样本温度分别：实施例1为27.91℃；对比例1为33.23℃；对比例2为29.60℃；
2）仪器参数：激光波长：488nm；过滤波长：散射。
表1 实施例、对比例外泌体浓度测定表
Figure DEST_PATH_IMAGE001
实施例1中，培养组分中含有长梗秦艽酮，低O2浓度环境培养间充质干细胞；对比例1中，培养组分中无长梗秦艽酮，常规O2浓度环境培养间充质干细胞；对比例2中，培养组分中无长梗秦艽酮，低O2浓度环境培养间充质干细胞。
由表1、图1至3可知，实施例1、对比例1及对比例2中，各自的外泌体浓度含量分别为8.9*106颗粒/mL、3.2*106颗粒/mL、5.7*106颗粒/mL。这是由于实施例1中培养基组分含有长梗秦艽酮，其可以促进间充质干细胞外分泌体中特定细胞因子组分（如，IL-6、IL-10、TGF-1、MCP-1、MMP-8、TIMP-1、CINC-1、CINC-2α、CINC-3和VEGF）分泌；同时，低O2浓度细胞培养环境，又可以无差别地促进促进间充质干细胞外分泌体，即外泌体中各类细胞因子的分泌。
2）外泌体制剂中细胞因子的测定
采用ELISA试剂盒检测外泌体制剂中特定细胞因子IL-6、IL-10、TGF-1、MCP-1、MMP-8、TIMP-1、CINC-1、CINC-2α、CINC-3和VEGF含量。检测结果如表2所示。
表2外泌体中细胞因子浓度测定值
Figure 918377DEST_PATH_IMAGE002
由表2可知，实施例1中，培养基组分因为含有长梗秦艽酮，其可以促进间充质干细胞外分泌体中特定细胞因子组分（如，IL-6、IL-10、TGF-1、MCP-1、MMP-8、TIMP-1、CINC-1、CINC-2α、CINC-3和VEGF）分泌。
3）外泌体制剂对的损伤L02细胞的修复作用检测
a、D-氨基半乳糖诱导的L02细胞损伤模型
将L02细胞（人正常肝细胞）悬浮在补充培养液中，培养液中包括胎牛血清10v/v%、谷氨酰胺2 mM、青霉素100 IU/ml、链霉素10 mg/ml及DMEM基础培养基，并以1.0* 104cell/孔的密度铺在96孔板中;单层建立后，除去培养液，用含有20mM D-半乳糖胺的新鲜培养液替换，在5v/v%CO2、37℃环境中培养;第2天，通过甲基噻唑基-四唑溴化物(MTT)方法检测细胞增殖，并测量引起细胞损伤的D-半乳糖胺的LD50含量。
b、外泌体制剂与受损L02细胞共培养的存活性检测：制备受损的L02细胞后，将它们在含有20% 外泌体制剂的新鲜DMEM中孵育24小时。MTT法检测细胞活力。通过LDH和AST渗漏评估细胞损伤。使用总蛋白测定法评估细胞功能。用膜联蛋白V/碘化丙啶染色法通过流式分析检测外泌体制剂培养的L02细胞的凋亡。
如图4至8为受损L02细胞在外泌体作用下的活率、损伤程度检测值。如，LDH 、AST数值越高，表示LO2细胞损伤越大；总蛋白含量越高，表示LO2细胞生理活性越强，代谢更旺盛；因此，外泌体可以提升LO2细胞的活率、降低LO2细胞凋亡与损伤、促进与恢复LO2细胞的生理活性。
应当理解的是，上述针对本发明较佳实施例的表述较为详细，并不能因此而认为是对本发明专利保护范围的限制，本发明的专利保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (8)

1.一种促进间充质干细胞分泌外泌体的培养液，其特征在于，该培养液中包括基础培养基、重组人胰岛素5mg/L、人转铁蛋白7mg/L、重组人纤连蛋白31mg/L、人血清白蛋白3.2g/L、维生素C 100mg/L、维生素B6 12mg/L、维生素B1 110mg/L、维生素A 36mg/L、EGF 6μg/L、bFGF 15μg/L、β-巯基乙醇11mg/L、谷胱甘肽3mg/L及3umol/L的长梗秦艽酮。
2.根据权利要求1所述的培养液，其特征在于，所述基础培养基为a-MEM或DMEM。
3.一种间充质干细胞外泌体的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
获取间充质干细胞；
将所述间充质干细胞接种至盛有培养液中的培养器中，进行静态培养；其中，所述培养液采用权利要求1或2所述的培养液；
培养结束后，对培养器中的培养液收集后进行离心处理，吸取保留上清液，获得间充质干细胞外泌体溶液。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述间充质干细胞为脐带间充质干细胞、骨髓间充质干细胞及胎盘间充质干细胞中的任一种。
5.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述间充质干细胞的静态培养过程中，所述培养器内的O2浓度控制在5~8v/v％、CO2浓度为5 v/v％，温度控制在37℃，培养时间为96小时。
6.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，离心处理时，离心力为1500~2500g，离心时间为8~15分钟。
7.一种如权利要求3至6任一所述制备方法制得的间充质干细胞外泌体溶液。
8.权利要求7所述的间充质干细胞外泌体溶液在制备人体机能免疫调节、预防或治疗肝脏疾病药物中的应用。
CN202211435698.0A 2022-11-16 2022-11-16 促进干细胞外泌体分泌的培养液、外泌体制备及应用 Active CN115491352B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202211435698.0A CN115491352B (zh) 2022-11-16 2022-11-16 促进干细胞外泌体分泌的培养液、外泌体制备及应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202211435698.0A CN115491352B (zh) 2022-11-16 2022-11-16 促进干细胞外泌体分泌的培养液、外泌体制备及应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN115491352A CN115491352A (zh) 2022-12-20
CN115491352B true CN115491352B (zh) 2023-03-24

Family

ID=85115896

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202211435698.0A Active CN115491352B (zh) 2022-11-16 2022-11-16 促进干细胞外泌体分泌的培养液、外泌体制备及应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN115491352B (zh)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN117159729B (zh) * 2023-09-18 2024-04-02 大连医科大学附属第一医院 一种多孔的可负载干细胞的生物材料及其在疼痛治疗中的应用

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2850178A4 (en) * 2012-05-18 2015-10-28 Agency Science Tech & Res EXOSOMES OF MESHCHYMIC STROKE CELL OF UMBILICAL CORD
EP3333254A4 (en) * 2015-08-03 2019-05-08 Osaka University EXOSOM OF MESENCHYMAL STEM CELLS
CN114350603B (zh) * 2022-01-23 2022-08-23 上海揽微赛尔生物科技有限公司 包含外泌体的间充质干细胞胞外基质及其制备和在细胞修复中的应用
CN115029308B (zh) * 2022-07-30 2023-06-09 中邦干细胞科技有限公司 干细胞外泌体制剂及其制备方法和应用

Also Published As

Publication number Publication date
CN115491352A (zh) 2022-12-20

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR101614823B1 (ko) 조직 복구 및 재생을 위한 세포 증식 방법 및 약제학적 제제
EP3098307A1 (en) A culture medium for hematopoietic stem cells and the applications thereof as well as the stem cells cultire method
JP6850360B2 (ja) 臨床使用可能な細胞凍結保存液
EP3015545B1 (en) Trehalose and dextran-containing solution for transplanting mammalian cells
CN115491352B (zh) 促进干细胞外泌体分泌的培养液、外泌体制备及应用
KR20100035637A (ko) 신부전 치료를 위한 선택적 세포 치료법
EP3940061A1 (en) Storage liquid for mammalian cells
JP2021532091A (ja) 膵臓疾患のミトコンドリア増強療法
JP2022519409A (ja) 機能的ミトコンドリアで富化された幹細胞を用いたミトコンドリア増強療法
CN104839146A (zh) 组合物及其用途、胎盘保存制剂及其制备方法
CN112961825A (zh) 一种无血清培养基及其制备方法
JP2021532095A (ja) 肝臓疾患のミトコンドリア増強療法
CN115105531A (zh) 细胞治疗剂及其制备方法和应用
CN116474000B (zh) 脐带间充质干细胞制剂、制备方法及其在治疗膝骨关节炎中的应用
CN109874782B (zh) 一种nk细胞的冻存方法
Ziegler et al. Biopterin level in blood cells as a marker for hemopoietic cell proliferation during autologous bone marrow transplantation in beagle dogs
Goncalves et al. Bioactive factors secreted from mesenchymal stromal cells protect the intestines from experimental colitis in a three-dimensional culture
CN111172110A (zh) 一种脐带血cik细胞的培养方法
JP2021531281A (ja) 腎臓疾患のミトコンドリア増強療法
CN112425603B (zh) 一种脂肪干细胞运输保存液
CN106474157B (zh) 一种肝干细胞注射液及其制备方法
CN115315182A (zh) 细胞保存液及其试剂盒
CN112841170A (zh) 一种维持羊膜间充质干细胞活性的保存液及保存方法
CN103289957A (zh) 干细胞样肺癌细胞制备及其抗原组合物负载树突状细胞的方法与试剂盒
CN115644168B (zh) 一种成品免疫细胞的冻存液及其制备方法和冻存方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant