KR20240019971A

KR20240019971A - 엑소좀 농도 향상을 위한 조성물 및 방법

Info

Publication number: KR20240019971A
Application number: KR1020220097826A
Authority: KR
Inventors: 김민정; 박희기; 페리엘 야스민 마히딘
Original assignee: 주식회사 엠제이바이오젠
Priority date: 2022-08-05
Filing date: 2022-08-05
Publication date: 2024-02-14

Abstract

본 발명은 줄기세포 유래 엑소좀의 농도 향상을 위한 조성물 및 방법에 관한 것이다. 상기 조성물은 비필수 아미노산(NEAA) 및 인슐린 유사 성장인자-1(IGF-1) 중 어느 하나 이상을 포함하고, 이를 포함하는 배양액에서 줄기세포를 배양하는 경우, 줄기세포 유래 엑소좀의 생산을 증가시킬 수 있다. 또한, 상기 줄기세포를 배양한 조정배지(conditioned medium)의 pH를 조절하여 상기 조정배지 내의 엑소좀을 고농도로 추출할 수 있다.
본 발명에 따라 제조되는 비필수 아미노산(NEAA) 및 인슐린 유사 성장인자-1(IGF-1) 중 어느 하나 이상을 포함하는 조성물과 이를 제조하는 방법은 줄기세포 유래 엑소좀의 생산 및 농도를 향상시킬 수 있으므로, 엑소좀을 치료제나 관련 제품으로 이용하고자 할 때, 필요한 엑소좀을 고효율로 획득하는데 유용하게 사용될 수 있다. 이러한 장점을 가지는 본 발명에 따른 줄기세포 유래 엑소좀의 농도를 증가시키는 방법은 약학적 조성물이나 치료제 등 관련 제품의 생산이나, 관련 연구 개발에 유용하게 이용할 수 있다.

Description

엑소좀 농도 향상을 위한 조성물 및 방법{Composition and method for enhanced concentration of exosomes}

본 발명은 줄기세포 유래 엑소좀의 농도를 향상시키기 위한 조성물 및 방법에 관한 것으로, 구체적으로 비필수 아미노산(NEAA) 및 인슐린 유사 성장인자-1(IGF-1) 중 어느 하나 이상을 포함하는 줄기세포 유래 엑소좀의 생산 효율을 증가시키는 조성물 및 이를 이용하는 방법과 줄기세포가 배양된 조정배지의 pH 조절을 통한 엑소좀의 고농도 추출에 관한 것이다.

줄기세포(Stem Cells, SC)는 미분화된 세포로서 자기 복제 능력을 가지면서 필요한 때에 특정 조직의 세포로 분화할 수 있는 능력을 가지는 세포이다. 이러한 줄기세포의 다분화능과 생리활성 효과는 재생의학(regenerative medicine), 조직공학적 이식과 질병 치료에 이용될 수 있어 오랫동안 주목받고 있으나, 줄기세포 치료제의 인체 안정성 및 유효성 문제에 대한 한계로 임상 적용에 여전히 어려움을 가지고 있다.

최근에, 중간엽줄기세포(MSC)에서 분비되는 엑소좀(exosome)이 중간엽줄기세포(MSC)와 동일한 효과를 나타내고, 표적 전달, 낮은 면역원성, 높은 복구 가능성의 이점을 가지고 있음이 밝혀지면서, 중간엽줄기세포(MSC) 유래의 엑소좀(exosome)을 줄기세포를 대체하는 치료제로서 이용하고자 하는 연구들이 활발히 진행 중에 있다.

줄기세포(Stem Cells, SC)는 배아줄기세포(embryonic stem cells), 성체줄기세포(adult stem cells), 유도만능줄기세포(induced pluripotent stem cells, iPSCs)로 구분할 수 있다. 이 중, 성체줄기세포는 인간 또는 비인간 포유류 동물 조직 유래의 중간엽줄기세포 (mesenchymal stromal cell)와 제대, 제대혈, 골수, 지방, 근육, 신경, 피부, 양막 또는 태반으로부터 유래된 성체줄기세포를 포함한다.

임상에 적용하고자 시도되고 있는 대표적인 줄기세포는 중간엽줄기세포(Mesenchymal Stem Cells, MSC)를 꼽을 수 있다. 중간엽줄기세포(MSC)는 다분화능을 가진 기질세포로서, 골수, 탯줄, 양수, 지방, 간, 근육 등 신체 대부분의 장기에 존재하는 것으로 알려져 있으며, 자가증식능을 가지고 있고, 조골세포, 연골세포, 근육세포, 지방세포를 포함한 다양한 세포로 분화할 수 있다. 무엇보다도 배아 줄기세포와 달리 이미 성장한 동물의 조직으로부터 추출할 수 있기 때문에 윤리논쟁에서 자유로운 장점도 가지고 있다.

또한, 중간엽줄기세포는 다양한 결합조직으로 분화할 수 있는 다분화 기능에 더불어, 중간엽줄기세포가 분비하는 표피세포성장인자(Epithelial growth factor), 섬유아세포성장인자 (Fibroblast growth factor) 등 여러 다양한 성장인자(growth factors)와 케모카인(chemokine), 사이토카인(cytokine) 등의 분비인자(secretory factors)에 의한 면역조절, 염증 억제, 조직재생 및 세포간 신호전달 기능도 가지고 있다.

상기 분비인자들은 중간엽줄기세포의 세포외 소포체(Extracellular Vesicle)에서 분비되는데, 특히, 세포외 소포체 중 엑소좀(exosome)은 세포간 신호전달 및 면역조절에 크게 관여하여 세포의 운명, 기능, 분화 등에 다방면으로 영향을 미치고 임상적 치료효능이 있는 것으로 보고되고 있다.

한편, 엑소좀(exosome)은 여러 종류의 세포들로부터 세포 밖으로 분비되는 직경이 대략 30 ~ 150 nm인 막 구조의 작은 소낭으로, 원형질막으로부터 직접 떨어져 나가는 것이 아니라 다낭체(multivesicular bodies, MVBs)라고 불리는 세포 내 특정 부위에서 기원하며 세포 밖으로 방출 또는 분비되는 것으로 알려져 있다. 다시 말해, 다낭체와 원형질막의 융합에 의해 소낭들이 세포 밖 환경으로 방출되고, 이렇게 방출된 소낭들이 엑소좀인 것이다.

그러나, 아직까지 엑소좀이 어떤 분자 기전(mechanism)에 의해 만들어지는지 확실히 밝혀진 바가 없다. 다만, 살아있는 거의 모든 세포는 엑소좀을 분비하고, 엑소좀은 성장인자, 케모카인, 사이토카인, 다양한 수용체, 단백질, 지질, 핵산, 대사물질(metabolites) 및 miRNA 등의 생리활성 물질을 포함하고 있어서, 세포-세포 간 신호전달(cell to cell interaction) 및 주요한 생리적 기능에 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다.

또한, 엑소좀은 이들이 유래한 세포의 상태를 잘 반영하고 있다. 특히, 줄기세포 유래 엑소좀은 줄기세포의 기능을 발휘하는 사이토카인, 성장인자, 핵산 등을 엑소좀의 막 구조 내에서 캡슐화시켜 보유함으로써 쉽게 분해되지 않고 그 기능을 오랫동안 유지할 수 있도록 하는 장점을 가지고 있다. 게다가, 줄기세포 자체에 비해 동물 혈청을 적게 포함하고 있어 동물 혈청 감염의 위험의 부작용이 덜하고, 분리된 엑소좀은 무세포계(cell free system)이므로 종양 형성의 위험성이 적다.

줄기세포 유래 엑소좀은 상기의 우수한 특성 및 기능들을 토대로 줄기세포의 효과를 대변하는 줄기세포의 새로운 대체제로 주목받고 임상에 이용하고자 시도하고 있으나, 현재 사람에서 얻을 수 있는 중간엽줄기세포의 양은 제한되어 있고 이로부터 얻을 수 있는 엑소좀의 양도 매우 소량인 점은 앞서 언급한 치료제로써의 엑소좀 이용에 시급한 해결과제이다. 또한, 계대배양에 따른 분화능력 감소 문제는 엑소좀의 우수한 유용성에도 불구하고 엑소좀을 임상적용이나 상업적으로 이용하는데 큰 장애물이 되고 있다.

이에, 줄기세포의 증식률 및 분화능력을 유지하면서도 줄기세포 유래 엑소좀의 생산량을 증가시킬 수 있는 세포배양 방식이나 세포배양에 첨가되는 물질에 대한 개발과 줄기세포가 분비하는 엑소좀을 고순도, 고농도로 분리하는 방법의 개발이 요구되고 있는 실정이다.

대한민국 등록특허공보 제10-2120329호 대한민국 등록특허공보 제10-2047768호 대한민국 등록특허공보 제10-1643825호 대한민국 등록특허공보 제10-1985941호

Stem Cell Research & Therapy, Vol 12, No. 71, pp. 1-12 (2021) J. Clin. Med., Vol 9, No. 2380, pp. 1-25 (2020)

상기와 같은 문제점을 해결하기 위하여, 본 발명자들은 줄기세포(SC) 유래 엑소좀의 생산 효율을 증가시키는 배양액 첨가 물질과 고농도의 엑소좀을 높은 수율로 추출하기 위한 추출방법을 개발하여 궁극적으로는 줄기세포 유래 엑소좀의 농도를 향상시키기 위한 조성물과 방법을 완성하기 위하여 예의 노력하였다.

이에, 본 발명은 줄기세포 유래 엑소좀의 농도를 향상시키기 위한 조성물의 제공을 목적으로 한다.

본 발명의 다른 목적은 줄기세포 유래 엑소좀의 농도를 향상시키기 위한 방법을 제공하는 것이다.

본 발명은 또한 줄기세포 유래 엑소좀을 고농도로 추출하는 방법을 제공하고자 한다.

또한, 본 발명의 목적은 줄기세포 유래 엑소좀을 포함하는 세포배양물 및 이의 제조방법을 제공하는 것이다.

그러나, 본 발명의 다른 목적 및 본 발명이 해결하고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제로 제한되지 않으며, 언급되지 아니한 과제들은 본 명세서에 기재된 청구범위 및 도면과 함께 하기의 발명의 설명에 의해 보다 명확해질 것이다. 또한, 본 명세서에 언급되지 않은 또 다른 과제들은 이 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자(이하 '통상의 기술자'라 함)가 명확하게 이해하고 유추할 수 있는 것을 포함한다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 다음의 발명을 제공한다.

본 발명은 엑소좀의 농도를 향상시키기 위한 조성물을 제공한다.

일 실시예에 따르면, 상기 조성물은 유효성분으로 비필수 아미노산(NEAA) 및 인슐린 유사 성장인자-1(IGF-1) 중 어느 하나 이상을 포함하는 것일 수 있다. 구체적으로 상기 비필수 아미노산(NEAA)은 세포배양시 NEAA 농도가 0.5 내지 2 %가 되도록 첨가하고, 바람직하게는 NEAA 농도가 1 %가 되도록 첨가할 수 있다. 또한, 상기 조성물은 세포배양액의 IGF-1 농도는 50 내지 150 ng/mL가 되도록 첨가하고, 바람직하게는 100 ng/mL가 되도록 첨가할 수 있다. 가장 바람직하게는, 상기 조성물은 비필수 아미노산(NEAA) 농도가 1 % 이고, IGF-1 농도는 100 ng/mL가 되도록 첨가된 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

다른 일 실시예에 따르면, 상기 엑소좀은 섬유아세포(fibroblasts), 배아줄기세포(embryonic stem cells), 조혈모세포(hematopoietic stem cell), 중간엽줄기세포(mesenchymal stem cell), 신경줄기세포(neural stem cell) 등을 포함하는 성체줄기세포(adult stem cells), 또는 유도만능줄기세포(induced pluripotent stem cells, iPSCs) 유래의 엑소좀일 수 있다. 바람직하게는, 제대, 제대혈, 골수, 지방, 근육, 신경, 피부, 양막 또는 태반으로부터 유래된 성체 줄기세포(adult stem cell) 유래의 엑소좀일 수 있고, 더욱 바람직하게는 지방줄기세포 유래의 엑소좀일 수 있다. 가장 바람직하게는 개 지방줄기세포 유래의 엑소좀일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

일 실시예에서, 상기 조성물은 엑소좀의 생산을 증가시키기 위한 조성물일 수 있다.

일 실시예에서, 상기 조성물은 pH를 산성으로 조절하는 시약을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 것일 수 있다.

pH를 산성으로 조절하는 시약은 염화수소(HCl), 아세트산(Acetic acid), 포름산(formic acid) 또는 트리플루오로아세트산(trifluoroacetic acid)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명은 또한 줄기세포 유래 엑소좀의 농도를 향상시키기 위한 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

일 실시예에서, 상기 방법은 다음의 단계를 포함한다.

(a) 0.5 내지 2 % NEAA 및 50 내지 150 ng/mL 인슐린 유사 성장인자-1(IGF-1) 중 어느 하나 이상을 포함하는 세포배양액을 준비하는 단계;

(b) 상기 세포배양액에서 세포를 24 시간 내지 84 시간 동안 배양하는 단계;

(c) 상기 (b) 단계에서 얻어진 세포배양액을 회수하여 상기 세포로부터 분비된 엑소좀을 포함하는 조정배지(Conditioned medium, CM)를 수득하는 단계;

(d) 상기 조정배지를 원심분리하여 엑소좀을 수득하는 단계.

또한, 일 실시예에서, 상기 방법은 상기 (d) 단계 이전에, 상기 (c) 단계에서 수득된 조정배지의 pH를 약 pH 2 내지 pH 3으로 조절는 단계를 더 추가하는 것을 특징으로 하는 방법일 수 있다.

또다른 일 실시예에서, 상기 (b) 단계 이후에, 세포에서 분비된 엑소좀의 농도를 측정하는 단계를 더 포함하는 것일 수 있다.

일 실시예에서, 상기 세포는 섬유아세포, 줄기세포 또는 지방줄기세포일 수 있고, 바람직하게는 개 지방줄기세포일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 일 실시예에서, 상기 세포를 배양하는 시간은 24 시간 초과 78 시간 이내인 것, 바람직하게는 36 시간 이상 60 시간 이내인 것을 특징을 하는 방법일 수 있다. 다만, 이에 제한되는 것은 아니다.

또한, 본 발명은 줄기세포를 배양한 조정배지를 수득하고, 수득된 조정배지의 pH를 약 pH 2 내지 pH 3 으로 맞추는 단계를 포함하는 줄기세포 유래 엑소좀을 포함하는 배양액으로부터 엑소좀을 고농도로 추출하는 방법을 제공한다.

일 실시예에서, 상기 방법은 원심분리 단계를 더 포함할 수 있다. 이 때, 원심분리는 12000g 내지 15000g에서 10분 내지 20 분 동안 수행할 수 있다. 바람직하게 상기 원심분리는 14000g에서 15 분 동안 수행할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

일 실시예에서, 상기 줄기세포는 배아줄기세포(embryonic stem cells), 조혈모세포(hematopoietic stem cell), 중간엽줄기세포(mesenchymal stem cell), 신경줄기세포(neural stem cell)를 포함하는 성체줄기세포(adult stem cells), 유도만능줄기세포(induced pluripotent stem cells, iPSCs) 유래의 엑소좀일 수 있다. 바람직하게는, 제대, 제대혈, 골수, 지방, 근육, 신경, 피부, 양막 또는 태반으로부터 유래된 성체 줄기세포(adult stem cell) 유래의 엑소좀일 수 있고, 더욱 바람직하게는 지방줄기세포 유래의 엑소좀일 수 있다. 가장 바람직하게는 개 지방줄기세포 유래의 엑소좀일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명은 줄기세포 유래 엑소좀을 포함하는 세포배양물 및 이의 제조방법을 제공한다.

일 실시예에서, 상기 세포배양물은 0.5 내지 2 % NEAA 및 50 내지 150 ng/mL 인슐린 유사 성장인자-1(IGF-1) 중 어느 하나 이상을 포함하는 세포배양액에서 줄기세포를 배양하여 얻어지며 줄기세포 유래의 엑소좀을 포함하는 세포배양물일 수 있다. 이때, 상기 세포배양물은 줄기세포 유래의 엑소좀의 농도가 농도가 50.0 ug/mL 이상인 것을 특징으로 할 수 있다.

또한 일 실시예에서, 상기 세포배양물은 약 pH 2 내지 pH 3으로 조정된 세포배양물일 수 있고, 이때, 상기 줄기세포에서 분비되는 엑소좀의 농도가 50.0 ug/mL 이상인 것을 특징으로 할 수 있다.

다른 일 실시예에서, 상기 세포배양액은 DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium), MEM (Minimal Essential Medium), BME (Basal Medium Eagle), RPMI 1640, DMEM/F-10 (Dulbecco's Modified Eagle's Medium: Nutrient Mixture F- 10), DMEM/F-12 (Dulbecco's Modified Eagle's Medium: Nutrient Mixture F-12), α-MEM(α-Minimal essential Medium), G-MEM(Glasgow's Minimal Essential Medium), IMDM(Isocove's Modified Dulbecco's Medium), 및 KnockOut DMEM으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 배지인 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

또다른 일 실시예에 따르면, 상기 줄기세포 유래 엑소좀을 포함하는 세포배양물의 제조방법은 줄기세포를 0.5 내지 2 % NEAA 및 50 내지 150 ng/mL 인슐린 유사 성장인자-1(IGF-1) 중 어느 하나 이상을 포함하는 세포배양액에서 배양하는 단계를 포함하는 방법일 수 있다.

나아가, 상기 줄기세포 유래 엑소좀을 포함하는 세포배양물의 제조방법은 상기 줄기세포를 배양하는 단계 이후에, 세포배양물의 pH를 약 pH 2 내지 pH 3으로 조절하는 단계를 더 포함하는 방법일 수 있다.

일 실시예에서, 상기 줄기세포를 배양하는 시간은 24 시간 초과 78 시간이내 인 것, 바람직하게는 36 시간 이상 60 시간 이내인 것을 특징을 하는 방법일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

또한, 일 실시예에서, 상기 줄기세포는 중간엽줄기세포 또는 지방줄기세포일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에 따라 제조되는 비필수 아미노산(NEAA) 및 인슐린 유사 성장인자-1(IGF-1) 중 어느 하나 이상을 포함하는 엑소좀의 농도를 향상시키기 위한 조성물은 이를 줄기세포 배양에 이용하는 경우, 줄기세포 유래 엑소좀의 생산을 증가시킬 수 있고, 상기 줄기세포를 배양한 조정배지(conditioned medium)의 pH를 조절하여 상기 조정배지 내의 엑소좀을 고농도 추출할 수 있는 장점을 가진다.

본 발명에 따른 조성물 및 이를 위한 방법은 종래 알려진 기술에 비해 이용가능한 줄기세포 유래 엑소좀의 농도를 효율적으로 증가시키는 것이므로, 이를 약학적 조성물이나 치료제 등 관련 제품의 생산이나, 연구 개발에 유용하게 이용할 수 있다.

도 1은 본 발명의 일 실시예에 따라 세포를 배양한 조정배지(conditioned medium)로부터 엑소좀을 추출하는 과정에서, 조정배지의 pH 조절에 따른 엑소좀의 농도 변화를 확인한 결과이다.
대조군은 세포를 배양한 조정배지 (conditioned medium)의 pH를 조절하지 않은 것으로 이 때의 조정배지는 pH 8 이다. 세포를 배양한 조정배지의 pH를 각각 pH 5, pH 4, 및 pH 3으로 조절한 경우에 추출된 엑소좀의 농도 변화를 대조군과 비교하여 나타냈다(p < 0.05).
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따라 조정배지의 pH를 pH 2로 조절한 조건에서 엑소좀의 농도 증가를 확인한 결과이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따라 1% NEAA 및 100 ng/mL IGF-1가 첨가된 세포배양액에서 세포를 24 시간, 48 시간, 72 시간 동안 배양하는 시간에 따른 엑소좀의 생산양 변화를 분석한 결과이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따라 선별된 세포배양 및 추출 조건에서 줄기세포 유래 엑소좀의 농도 향상을 확인한 결과이다.
대조군(Control)은 NEAA 및 IGF-1가 첨가되지 않은 세포배양액에서 지방줄기세포를 48 시간동안 배양하였고, 실험군(NEAA IGF)은 1% NEAA 및 100 ng/mL IGF-1가 되도록 첨가된 세포배양액에서 지방줄기세포를 48 시간 동안 배양하였다. 각 세포배양액에서 세포배양 후에 조정배지의 pH를 pH 2로 조절하거나(pH=2), pH가 조절하지 않은 조정배지(pH=8)에서 줄기세포 유래의 엑소좀 농도를 비교하여, 엑소좀 농도 향상 조건을 분석하였다). 여기서, a, b, c 및 ab의 p value는 각각 p = 0.0424, p = 0.0108, p < 0.0001 및 p < 0.0001 임.
도 5는 본 발명에 따른 줄기세포 유래의 엑소좀의 투과 전자 현미경(TEM) 사진 결과이다.

본 발명자들은 줄기세포 유래 엑소좀의 생산 효율을 증가시키는 배양액 첨가 물질과 고농도의 엑소좀을 높은 수율로 추출하기 위한 추출방법을 개발하여, 궁극적으로 줄기세포 유래 엑소좀의 농도를 향상시키기 위한 조성물과 이를 위한 방법을 발명하고자 하였다.

그 결과, 줄기세포 배양액에 비필수 아미노산(Non Essential Amino Acids, NEAA) 및 인슐린 유사 성장인자-1(Insulin-like Growth Factor-1, IGF-1) 중 어느 하나 이상을 포함하여 배양하는 경우 줄기세포 유래 엑소좀의 생산 효율이 증가함을 확인하였다. 또한, 줄기세포를 배양한 조정배지 (conditioned medium)의 pH를 산성이 되도록 조절하는 경우에 상기 조정배지 내의 엑소좀을 고농도 추출할 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다.

본 발명에 따른 조성물 및/또는 방법은 줄기세포 유래의 엑소좀 생산을 촉진시키고 엑소좀의 추출 효율도 증가시키는 우수한 효과를 가지고 있으므로, 이를 통해 종래 알려진 방법에 비해 줄기세포 유래 엑소좀을 높은 농도로 수득할 수 있다.

이하, 본 발명을 구체적인 실시예를 통하여 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 이 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

또한, 본 명세서에서 사용되는 용어는 본 출원에서의 기능을 고려하여 가능한 현재 널리 사용되고 있는 일반적인 용어를 선택하였으나 이는 본 출원이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자의 의도, 관례 또는 새로운 기술의 출현 등에 따라 달라질 수 있다. 다만, 이와 달리 특정한 용어를 임의의 의미로 정의하여 사용하는 경우에는 그 용어의 의미에 관하여 별도로 기재할 것이다. 따라서 본 명세서에서 사용되는 용어는 단순한 용어의 명칭이 아닌 그 용어가 가진 실질적인 의미와 본 명세서의 전반에 걸친 내용을 토대로 해석되어야 한다.

본 발명에서 "엑소좀(exosome)"은 세포에서 세포 밖으로 분비되는 세포물질로서, 직경이 대략 30 ~ 150 nm인 지질 이중막 구조의 작은 소낭(vesicle)이다. 엑소좀은 세포의 원형질막으로부터 직접 떨어져 나가는 것이 아니라 다낭체(multivesicular bodies, MVBs)라고 불리는 세포 내 특정 부위의 물질이고, 줄기세포, 섬유아세포, 비만세포, 신경세포, 내피세포, 종양세포 및 적혈구, B-림프구, T-림프구, 수지상 세포, 혈소판, 대식 세포 등의 다양한 면역세포들부터 세포 밖으로 방출 또는 분비될 수 있다.

특히, 줄기세포 유래의 엑소좀은 기원이 되는 줄기세포의 특징적인 세포물질 예를 들어, 표피세포성장인자(Epithelial growth factor), 섬유아세포성장인자 (Fibroblast growth factor) 등의 성장인자(growth factors), 케모카인(chemokine), 사이토카인(cytokine), 다양한 단백질, 수용체, 인지질, mRNA 및 마이크로 RNA(miRNA) 등을 포함하고 있어 줄기세포의 생리활성 효과를 나타낼 수 있다.

엑소좀은 세포가 배양된 세포배양액이나, 타액, 소변, 혈액, 혈장, 혈청, 점액, 담즙액, 복수액, 양수 등의 체액으로부터 분리할 수 있으며, 이제 제한되는 것은 아니다.

본 발명에서 엑소좀의 분리는 이 기술분야에서 통상적으로 사용하는 원심분리법, 면역결합법, 여과법 등을 이용할 수 있다.

본 발명에서 "줄기세포(Stem cell)"은 미분화된 세포로서 자기 복제 능력을 가지면서 필요한 때에 특정 조직의 세포로 분화할 수 있는 능력을 가지는 세포를 지칭한다.

본 발명의 줄기세포는 배아의 발생과정에서 추출한 배아줄기세포(embryonic stem cells), 성체줄기세포(adult stem cells), 분화된 세포들로부터 인위적인 역분화 과정을 통해 다능성 분화능을 가지도록 유도된 유도만능줄기세포(induced pluripotent stem cells, iPSCs)일 수 있고, 자가 또는 동종 유래의 줄기세포일 수 있으며, 인간 또는 비인간 포유류의 동물 유래 줄기세포일 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 줄기세포는 바람직하게는 성체 줄기세포(adult stem cell)일 수 있다. 여기서 성체 줄기세포는 제대혈이나 성인의 골수, 혈액 등에서 추출되는 세포로 특정의 조직이나 장기 세포로 세포로 분화되기 직전의 세포를 의미하며, 특정 신체 조직으로 분화할 수 있는 능력을 보유한 미분화 상태의 세포를 포함한다. 또한, 성체줄기세포는 인간을 포함하는 동물의 배아에서 추출하는 배아 줄기세포와 달리 골수나 뇌세포 등 이미 성장한 동물의 조직에서 추출하기 때문에 윤리논쟁을 피할 수 있는 장점도 가지고 있다.

본 발명에서 성체줄기세포는 중간엽줄기세포, 중간엽기질세포(mesenchymal stromal cell) 또는 다분화능 줄기세포 조혈모세포(hematopoietic stem cell)나 신경줄기세포(neural stem cell)일 수 있으며, 이에 제한되지 않는다.

구체적으로, 본 발명에서 사용되는 성체줄기세포는 인간 또는 비인간 포유류 동물 조직 유래의 성체 줄기세포로써 제대, 제대혈, 골수, 지방, 근육, 신경, 피부, 양막 또는 태반으로부터 유래된 것일 수 있다. 또한, 동물 조직 유래의 중간엽 줄기세포 (mesenchymal stromal cell) 및 조직 유래의 유도만능줄 기세포로부터 유래된 중간엽 줄기세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에서 "세포배양액"은 세포배지, 배지, 배양액, 세포배양 조성물 등과 혼용하여 사용될 수 있는 용어이다. 또한, 본 발명에서 세포배양액은 줄기세포를 배양한 세포배양액 또는 조정배지(conditioned medium)을 지칭할 수도 있다.

세포배양액은 세포의 성장과 증식에 필요한 필수성분을 포함하는, 생체 외(in vitro)에서 세포배양을 위한 조성물을 의미한다. 이 기술분야에서 통상적으로 사용되는 세포배양용 배지는 특별한 제한없이 모두 사용가능하다. 구체적으로, 세포배양액은 DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium), MEM (Minimal Essential Medium), BME (Basal Medium Eagle), RPMI 1640, DMEM/F-10 (Dulbecco's Modified Eagle's Medium: Nutrient Mixture F-10), DMEM/F-12 (Dulbecco's Modified Eagle's Medium: Nutrient Mixture F-12), α-MEM(α-Minimal essential Medium), G-MEM(Glasgow's Minimal Essential Medium), IMDM(Isocove's Modified Dulbecco's Medium), KnockOut DMEM 등의 상업적으로 이용가능하는 배지 또는 필요에 따라 포함하는 성분을 조절한 합성배지일 수 있다.

바람직하게, 본 발명에서는 상기 이용가능한 세포배양용 배지에 비필수 아미노산(NEAA) 및 인슐린 유사 성장인자-1(IGF-1) 중 어느 하나 이상을 포함하는 세포배양용 배지가 사용될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 세포배양액은 소 태아 혈청(FBS) 및/또는 항생제 등을 더 포함할 수 있다.

실험방법

1. 실험 디자인 (Experimental design)

줄기세포 유래 엑소좀의 농도 향상을 위한 조성물 및 방법을 개발하기 위해서 실험예로써 다음의 실험 1 내지 실험 5를 설계하였다.

실험 1 (Experiment 1)에서는 섬유아세포(fibroblasts)를 배양한 조정배지 (conditioned medium)를 회수한 후, 엑소좀을 추출하는 단계에서 조정배지의 pH를 pH 2 내지 pH 8 범위에서 조절하여, 조정배지의 pH 조절에 따른 엑소좀 추출 효율을 확인한다. 구체적으로 pH 8, pH 5, pH 4, pH 3 또는 pH 2에 따른 섬유아세포 유래 엑소좀의 농도를 분석할 수 있다.

실험 2 (Experiment 2)는 섬유아세포를 서로 다른 농도의 Non Essential Amino Acids(NEAA)가 첨가된 배지에서 배양시킨 후, 첨가된 NEAA 농도에 따른 섬유아세포 유래의 엑소좀 농도를 분석한다. NEAA의 농도 범위는 0.5% 내지 2%가 되도록 배지에 첨가할 수 있으며, 구체적으로, NEAA 농도가 0.5%, 1% 또는 2%가 되도록 세포배양배지에 첨가하여 실험을 수행한다.

실험 3 (Experiment 3)은 섬유아세포를 서로 다른 농도의 인슐린 유사 성장인자-1(Insulin-like Growth Factor-1, IGF-1)가 첨가된 배지에서 배양시킨 후, 첨가된 IGF-1의 농도에 따른 섬유아세포 유래 엑소좀의 농도를 분석한다. 이때, 첨가하는 IGF-1는 농도 범위는 50 내지 200 ng/mL가 되도록하고, 세포배양배지에 50, 100, 150 또는 200 ng/mL IGF-1를 각각 첨가하고 엑소좀 생산 효율을 확인한다.

실험 4 (Experiment 4)에서는 실험 2 및 실험 3의 결과에 따라 선택된, 섬유아세포 유래 엑소좀의 생산에 있어 최적의 NEAA 및 IGF-1 배지 함유 조건을 조합하여 세포를 배양한다. 이때, 세포 배양 시간에 따른 엑소좀 생산 효율을 24 시간 내지 72 시간 범위에서 분석한다. 구체적으로, 상기 배양조건에서 각각 24, 48 및 72 시간 배양에 따른 엑소좀 농도를 분석할 수 있다.

실험 5 (Experiment 5)에서는 줄기세포를 실험 4를 통해서 확인된 최적의 배양첨가물 조건 및 배양시간 조건에서 배양하고, 실험 1에서 확인된 최적의 엑소좀 추출조건에서 추출하여, 줄기세포(stem cells) 배양 및 추출 조건에 따른 줄기세포 유래 엑소좀의 농도 향상 여부를 분석한다.

2. 세포배양 (Cell culture)

전체 실험에서 세포는 37 ℃에서 5% CO₂를 포함하는 가습 환경에서 배양되었다. 구체적으로, 4 내지 5 계대 배양한 섬유아세포, 중간엽줄기세포 또는 지방줄기세포는 10㎝ 세포배양 접시에서 세포밀도(confluency)가 80%에 도달할 때까지 10% 소 태아 혈청(FBS)이 보충된 Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) 배양액을 사용하여 배양하였다. 세포밀도(confluency)가 80%에 도달하면, 세포배양 배지를 NEAA 또는 IGF-1이 있거나/없는 무혈청 DMEM으로 교체하고 세포를 이 세포배양 배지에서 배양하였다. 실험 1 내지 실험 3의 경우에는 24 시간 배양하였고, 실험 4 내지 실험 5의 경우에는 24 시간 내지 72 시간 배양하였다.

세포 배양 후에 조정배지(Conditioned medium, CM)를 회수하고, 2000g에서 30분간 원심분리한 후 상등액을 0.22μm 필터로 여과하여 세포 파편 등 불순물을 제거하였다. 여과된 조정배지(CM)는 소량씩 분취하여 추가 사용이 있을 때까지 -80 ℃에서 보관하였다.

3. 조정배지(Conditioned medium, CM)의 pH 조절

원심분리 및 여과 후, 1M 염화수소(HCl)를 사용하여 조정배지(CM)의 pH 조정을 수행하고 pH 미터(Thermo Fisher Scientific, MA, USA)를 사용하여 조정배지(CM)의 pH를 측정하였다. NEAA 또는 IGF-1가 있거나/없는 조정배지(CM)도 실험 1에서 얻은 최적의 엑소좀 추출을 위한 pH 값으로 조정하여 이후 실험에 사용하였다.

4. 세포수, 생존율 및 평균 생존세포 크기 측정

실험 2 및 실험 3에서 엑소좀 농도 이외에 Countess^TM (Invitrogen) 사용하여 제조사의 프로토콜에 따라 세포수, 생존율 및 평균 생존세포 크기를 측정하였다. 간단하게 서술하면, 세포를 회수하여 세포 펠렛(Cell pellet)을 배지 1ml에 부유시킨 뒤, 0.4% trypan blue에 염색 후 Countess^TM slide glass에 넣어서 Countess^TM 로 염색 결과를 확인하였다.

5. 엑소좀 추출 (Exosome extraction)

조정배지(CM)에서 엑소좀은 ExoQuick TC ULTRA for Tissue Culture Media(System Biosciences, LLC., Palo Alto, California, USA)를 사용하여 제조사의 프로토콜에 따라 추출하였다.

1mL의 추출물을 5mL의 조정배지(CM)에 혼합하고 혼합물을 4

에서 밤새 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 샘플을 3000Хg에서 10분 간 원심분리하고, 얻어진 펠렛은 추가 측정 또는 정제 전에 단백질 정량화를 위해 PBS에 재현탁시켜 사용하였다.

6. 엑소좀 농도 측정 (Quantification of exosome concentration)

먼저, 본 발명의 실험방법 '1.5. 엑소좀 추출 단계'에서 얻어진, PBS에 재현탁된 엑소좀은 RIPA 용해 완충액(Thermo Fisher Scientific, Rockfort, Illinois, USA)을 사용하여 얼음 위에서 15분 동안 추출하고, 샘플을 14000×g에서 15분 동안 원심분리하였다.

다음으로, 상층액을 보관하거나 정량화를 위해 처리하기 전에 새로운 Eppendorf 튜브에 옮기고, 단백질 정량은 제조업체의 프로토콜에 따라 Pierce BCA 단백질 분석 키트(Thermo Fisher Scientific)를 사용하여 수행하였다.

흡광도 측정은 Multiskan Skyhigh Microplate Spectrophotometer(Thermo Fisher Scientific)를 사용하여 562 nm에서 수행하였고, 흡광도 결과는 BSA(Bovine Serum Albumin)를 기준값으로 하여 판독값에서 계산하였다.

7. TEM (Transmission Electron Microscope)

TEM 실험을 위해 PBS에 희석된 엑소좀을 사용하였다.

간단히 서술하면, 10 ㎕의 엑소좀 용액을 1분 동안 formvar 코팅된 그리드 위에 두었다. 블로팅 후, 2% 우라닐 아세테이트(uranyl acetate) 용액 10 ㎕를 20초 내지 1분 동안 그리드에 첨가하였다. 블로팅 후, 샘플을 건조시키고, 이미지 캡처 시스템이 장착된 투과 전자 현미경(JEM1010, JEOL Ltd, Tokyo, Japan)을 사용하여 판독하였다.

8. 통계 분석 (Statistical analysis)

실험 1 및 실험 4에서는 unpaired t-test를 사용하여 엑소좀 농도를 비교하였고, 실험 2, 실험 3, 실험 4는 Krustal-Wallis test를 사용하여 엑소좀 농도를 비교하였다. 통계 분석은 GraphPad Prism 5를 사용하여 실시하였고, 통계적 유의차는 p < 0.05일 때로 분석하였다.

실시예

실시예 1. 추출시 조정배지의 pH 조절에 따른 엑소좀 농도 변화 분석

세포배양 후의 세포배양물에 포함되어 있는 엑소좀의 농도를 향상시키는데 있어, 엑소좀을 추출하는 단계에서 조정배지의 pH가 어떤 영향을 미치는지 분석하였다.

이를 위해, 미리 설계된 실험 1 (Experiment 1)에 따라 실험을 진행하였다.

실험 1 (Experiment 1) : 섬유아세포 (fibroblasts)를 배양한 조정배지 (conditioned medium)를 회수한 후, 엑소좀을 추출하는 단계에서 조정배지의 다양한 pH에 따른 엑소좀의 농도 변화 분석.

실험 1에서, 세포를 배양한 조정배지(conditioned medium)의 pH를 조절하지 않은 것을 대조군(이때, 조정배지는 pH 8 임)으로 하고, 세포를 배양한 조정배지의 pH를 각각 pH 5, pH 4, 또는 pH 3으로 조절한 후, 추출된 엑소좀의 농도 변화를 측정하였다.

엑소좀을 추출하는 단계에서 조정배지의 pH에 따른 엑소좀의 농도를 측정한 결과, pH 5 또는 pH 4로 조정배지의 pH를 조절하고 추출하였을 때의 엑소좀의 농도는 대조군 (pH 8)에서 추출하였을 때의 엑소좀 농도 30.6 ± 2.5 ug/mL 과 유사한 정도를 나타냈다.

반면에, 조정배지의 pH를 pH 3으로 조절한 후 추출하였을 때 엑소좀의 농도는 37.0 ± 0.7 ug/mL으로, 대조군이나 pH 5 또는 pH 4로 조절된 경우에 비해 유의적으로 가장 증가된 결과를 보였다(도 1).

상기 결과를 통해서, 산성의 낮은 pH에서 엑소좀을 추출하는 것이 엑소좀 농도 향상에 유의미함을 확인하고, 조정배지를 pH 3보다 낮은 pH 2로 조절한 경우의 엑소좀 농도 향상 효과를 확인하고자 추가적인 실험을 진행하였다.

세포를 24 시간 동안 배양한 후, 엑소좀이 분비되어 있는 조정배지의 pH를 pH 3과 pH 2로 조절하고, 각각의 조건에서 추출된 엑소좀의 농도를 비교하였다.

그 결과, 조정배지의 pH를 pH 2로 조절하고 엑소좀을 추출하였을 때는 엑소좀의 농도가 58.6 ± 0.9 ug/mL로써, pH 3으로 조절에서 엑소좀을 추출하였을 때의 엑소좀 농도 54.0 ± 0.8 ug/mL 보다 엑소좀의 농도가 유의적으로 증가하였음 확인하였다(도 2).

상기의 결과들은 엑소좀을 추출하는 단계에서 조정배지의 pH는 pH 2 내지 pH 3의 산성인 경우, 바람직하게 pH 2인 경우 엑소좀의 농도가 가장 높게 추출됨을 의미하는 것이다.

또한, 상기 실험 1의 결과를 토대로, 엑소좀 추출 시 조정배지의 최적 pH 조건은 pH 2인 것으로 결정하였고, 이에 따라 후속 실험들은 엑소좀 추출 단계에서 조정배지의 pH를 pH 2로 조절하여 진행하기로 하였다.

실시예 2. NEAA 농도에 따른 엑소좀 농도, 세포 수 및 세포 생존율 변화 분석

다음으로, 세포 배양시 세포배양액에 NEAA(Non Essential Amino Acids)의 첨가가 엑소좀 생산 향상에 어떠한 영향을 미치는지 확인하였다.

이를 위해, 본 발명에서 설계한 실험 2 (Experiment 2)를 수행하였다.

실험 2 (Experiment 2) : 섬유아세포를 서로 다른 농도의 Non Essential Amino Acids (NEAA)가 첨가된 세포배양액에서 배양시킨 후, 첨가된 NEAA 농도에 따른 엑소좀의 농도 변화 분석.

실험 2에서, 세포는 NEAA 농도가 각각 0.5%, 1% 또는 2% 인 세포배양액에서 24 시간동안 배양되었다. 세포 배양 후, 세포수, 세포 생존율 및 생존세포 크기를 측정하였다. 또한, 세포 배양 후 회수된 조정배지의 pH를 실험 1에서 확인된 추출 시 최적의 조정배지 pH인 pH 2로 각각 조절한 후, 추출된 엑소좀의 농도 변화를 측정하였다.

측정 결과는 표 1에 나타내었다.

NEAA 농도에 따른 엑소좀 농도, 세포 수 및 세포 생존율

NEAA 농도 (%)	Exosome 농도 (ug/mL)	세포 수 (x 10⁶)	세포 생존율(%)
0.5	41.6 ± 3.2 ^a	1.1 ± 0.1	93.3 ± 2.2
1	53.1 ± 0.7 ^b	1.1 ± 0.0	95.7 ± 1.5
2	43.4 ± 1.2 ^a	1.1 ± 0.0	94.3 ± 1.9
^{a, b}는 통계적 유의차를 의미함 (p < 0.05)

실험 2에서 세포배양액의 NEAA 농도에 따른 엑소좀의 농도를 측정한 결과, 세포배양 배지에 첨가된 NEAA 농도가 0.5% 또는 2%일 때는 각각 41.6 ± 3.2 ug/mL 또는 43.4 ± 1.2 ug/mL로 NEAA를 첨가하지 않은 경우와 통계적으로 유의한 차이가 없었다.

반면에, NEAA 농도가 1%일 때에는 엑소좀의 농도가 53.1 ± 0.7 ug/mL로 0.5% 또는 2% 그룹일 때보다 유의적으로 훨씬 높게 나타났다.

또한, 세포 수와 세포 생존율은 세 실험군에서 통계적인 유의차가 없었으나 엑소좀의 농도 결과와 비슷한 경향을 나타내었다.

실험 2를 통해서, 세포배양시 NEAA 농도가 1%가 되도록 세포배양 배지(세포배양액)에 첨가하는 것이 엑소좀의 생산을 가장 많이 증가시키는 것임을 확인하였다.

이 결과를 토대로 엑소좀 생산을 위한 세포배양액의 최적 NEAA 농도는 1%인 것으로 결정하였고, 이에 따라, 추후 실험에서 사용되는 세포배양액은 NEAA 농도가 1%가 되도록 첨가하기로 하였다.

실시예 3. IGF 농도에 따른 엑소좀 농도, 세포 수 및 세포 생존율 변화 분석

다음으로, 세포 배양시 세포배양액에 인슐린 유사 성장 인자-1(IGF-1)의 첨가가 엑소좀 생성 향상에 어떠한 영향을 미치는지 확인하였다.

이를 위해, 본 발명에서 설계한 실험 3 (Experiment 3)을 진행하였다.

실험 3 (Experiment 3) : 섬유아세포를 서로 다른 농도의 인슐린 유사 성장 인자-1(IGF-1)가 첨가된 세포배양액에서 배양시킨 후, 첨가된 IGF-1 농도에 따른 엑소좀의 농도 변화 분석.

실험 3에서, 세포는 IGF-1 농도가 각각 50, 100, 150 또는 200 ng/mL인 세포배양액에서 24 시간동안 배양되었다. 세포 배양 후, 세포수, 세포 생존율 및 생존세포 크기를 측정하였다. 또한, 세포 배양 후 회수된 조정배지의 pH를 각각 pH 2로 조절한 후, 추출된 엑소좀의 농도 변화를 측정하였다.

측정 결과는 표 2에 나타내었다.

IGF-1 농도에 따른 엑소좀 농도, 세포 수 및 세포 생존율

IGF-1 농도 (ng/mL)	Exosome 농도 (ug/mL)	세포 수 (x 10⁶)	세포 생존율 (%)
50	45.9 ± 0.7 ^a	1.3 ± 0.1	96.3 ± 0.9
100	54.5 ± 0.9 ^b	1.2 ± 0.0	97.0 ± 1.0
150	46.1 ± 0.5 ^a	1.3 ± 0.1	98.0 ± 0.0
200	42.0 ± 0.4 ^c	1.2 ± 0.0	97.3 ± 0.7
^{a, b}는 통계적 유의차를 의미함 (p < 0.05)

실험 3에서 세포배양액의 IGF-1 농도에 따른 엑소좀의 농도를 측정한 결과, 세포배양액의 IGF-1 농도가 50 ng/mL 또는 150 ng/mL인 경우, 엑소좀 농도는 각각 45.9 ± 0.7 ug/mL 또는 46.1 ± 0.5 ug/mL로 통계적으로 유의한 차이가 없었다.

반면에, 세포배양액의 IGF-1 농도가 100 ng/mL인 경우에는 엑소좀의 농도가 54.5 ± 0.9 ug/mL로 50 또는 150 ng/mL 그룹일 때보다 유의적으로 훨씬 높았다. 그러나, IGF-1 농도가 200 ug/mL일 때에는 엑소좀의 농도가 42.0 ± 0.4 ug/mL로 실험군 중 가장 낮게 측정되었다.

실험 3을 통해서, 세포배양시 세포배양액의 IGF-1 농도가 100 ng/mL인 경우에 엑소좀의 생산을 가장 크게 향상시키는 것임을 확인하였다.

이 결과를 토대로 엑소좀 생산을 위한 세포배양액의 최적 IGF-1 농도는 100 ng/mL인 것으로 결정하였고, 이에 따라, 추후 실험에서 사용되는 세포배양액은 IGF-1 농도가 100 ng/mL가 되도록 첨가하기로 하였다.

실시예 4. 세포 배양 시간에 따른 엑소좀 농도 변화 분석

엑소좀 생산 증가를 위한 최적의 세포 배양 조건을 선별하기 위해서, 세포 배양시 최적 농도의 NEAA 및 IGF가 조합된 세포배양액을 준비하고, 상기 세포배양액에서 세포 배양 시간이 엑소좀 생산 향상에 어떠한 영향을 미치는지 확인하였다.

이를 위해, 본 발명에서 설계한 실험 4 (Experiment 4)를 수행하였다.

실험 4 (Experiment 4) : 실험 2 및 실험 3에서 확인된, 엑소좀의 생산에 있어 최적 농도의 NEAA 및 IGF-1가 포함된 세포배양액에서 섬유아세포를 배양하고, 이때, 세포 배양 시간에 따른 엑소좀 농도 변화 분석.

실험 4에서, 섬유아세포는 실험 2 및 실험 3에서 확인된 엑소좀의 생산에 있어 최적 농도의 NEAA 및 IGF-1가 포함된 세포배양액에서 배양하였다.

즉, 섬유아세포는 1% NEAA 및 100 ng/mL IGF-1가 첨가된 세포배양액에서 24시간, 48 시간 및 72 시간 동안 각각 배양되었다. 세포 배양 후, 세포수, 세포 생존율 및 생존세포 크기를 측정하였다. 또한, 세포 배양 후 회수된 조정배지의 pH를 각각 pH 2로 조절한 후, 추출된 엑소좀의 농도 변화를 측정하였다.

그 결과, 도 3에서 나타내는 바와 같이, 세포를 24 시간 배양한 처리군에서는 엑소좀의 농도가 41.1 ± 0.6 ug/mL 이었으나, 48 시간 이상 배양한 경우에는 즉, 48 시간 처리군과 72 시간 처리군에서는 엑소좀의 농도가 각각 44.9 ± 0.5 ug/mL과 45.2 ± 0.3 ug/mL로 통계적으로 유의하게 엑소좀 농도의 증가가 나타났다.

이는 엑소좀 생산 향상을 위해서는 최적 농도의 NEAA 및 IGF-1가 포함된 세포배양액에서 48 시간 이상 세포를 배양하는 것이 효과적임을 의미하는 것이다.

상기 결과를 토대로 엑소좀 생산을 위한 세포 배양 시간은 48 시간으로 결정하였고, 추후 실험에서도 세포 배양 시간에 이를 적용하기로 하였다.

실시예 5. 선별된 세포배양 및 추출 조건에서 줄기세포 유래의 엑소좀 농도 향상 확인

최종적으로, 본 발명에 따라 엑소좀 농도 향상을 위해 선별된 최적의 세포 배양조건 및 추출 단계에서 조정배지의 pH 조건에서, 줄기세포 유래의 엑소좀 농도 향상 여부를 분석하였다.

이를 위해, 본 발명에서 설계된 실험 5 (Experiment 5)를 실행하였다.

실험 5 (Experiment 5) : 실험 4에서 확인된 최적의 배양배지 및 배양시간 조건과 실험 1에서 확인된 조정배지의 최적 추출 pH 조건에서, 줄기세포 유래의 엑소좀 농도 변화 분석.

실험 5에서, 줄기세포는 개(dog)에서 얻은 지방줄기세포를 사용하였다. 상기 개 지방줄기세포는 NEAA 및 IGF-1가 첨가되지 않은 세포배양액과 1% NEAA 및 100 ng/mL IGF-1가 되도록 첨가된 세포배양액에서 각각 48시간 동안 배양하였다. 세포배양 후에 조정배지의 pH를 pH 2로 조절하고 줄기세포 유래의 엑소좀 농도를 측정하였다. 이때, pH가 조절되지 않은 조정배지(대조군), 즉 pH 8인 조정배지에서 추출한 줄기세포 유래의 엑소좀 농도를 비교하여, 엑소좀 농도 향상 조건을 분석하였다.

그 결과, 도 4에서 나타낸 바와 같이, NEAA와 IGF-1을 처리하지 않은 대조군보다 세포배양액의 NEAA와 IGF-1의 농도가 각각 1% NEAA 및 100 ng/mL IGF-1가 되도록 처리한 실험군과 48 시간동안 세포를 배양한 조정배지의 pH를 pH 2로 조절한 처리군에서 통계적으로 유의하게 더 많은 농도의 엑소좀이 추출되었다.

구체적으로, 지방줄기세포를 1% NEAA 및 100 ng/mL IGF-1가 되도록 첨가된 세포배양액에서 48 시간 동안 배양한 후 얻어진 조정배지를 pH 2로 조절하고 엑소좀을 추출하는 경우에, 줄기세포 유래의 엑소좀 농도가 60.0 ± 1.4 ug/mL로 추출되었다. 반면에, NEAA와 IGF-1을 처리하지 않은 세포배양액에서 배양한 후 얻어진 조정배지를 pH 2로 조절하여 추출한 경우의 엑소좀 농도 53.3 ± 1.9 ug/mL나 pH를 조절하지 않은 경우(pH 8)에 추출된 엑소좀 농도는 46.5 ± 1.7 ug/mL를 나타냈다.

이는 줄기세포 유래의 엑소좀 농도를 향상시키기 위해서는 줄기세포를 배양하는 세포배양 조건을 1% NEAA 및 100 ng/mL IGF-1가 되도록 첨가된 세포배양액에서 48시간 동안 배양하는 것으로 하고/하거나, 이 조건에서 배양된 줄기세포에서 유래한 엑소좀을 함유하는 조정배지를 pH 2로 조절하고 추출하는 것이 필요함을 의미하는 것이다.

실시예 6. 엑소좀의 TEM(Transmission Electron Microscope) 분석

본 발명에 따란 추출된 줄기세포 유래의 엑소좀의 형태를 투과 전자 현미경 (TEM)으로 확인하였다.

이를 위해, 먼저 10 ㎕의 엑소좀 용액을 1분 동안 formvar 코팅된 그리드 위에 두고, 블로팅 한 후 2% 우라닐 아세테이트(uranyl acetate) 용액 10 ㎕를 20초 내지 1분 동안 그리드에 첨가하였다. 다음으로, 샘플을 건조시키고, 이미지 캡처 시스템이 장착된 투과 전자 현미경(JEM1010, JEOL Ltd, Tokyo, Japan)을 사용하여 200nm에서 판독하였다.

그 결과 도 5에 나타낸 바와 같이, 약 50 내지 100 nm 크기의 소포-유사 입자(vesicles-like particles) 형태의 엑소좀을 확인하였다.

Claims

비필수 아미노산(NEAA) 및 인슐린 유사 성장인자-1(IGF-1) 중 어느 하나 이상을 포함하는, 엑소좀의 농도를 향상시키기 위한 조성물.
제1항에 있어서, 상기 엑소좀은 섬유아세포(fibroblasts), 배아줄기세포(embryonic stem cells), 성체줄기세포(adult stem cells) 또는 유도만능줄기세포(induced pluripotent stem cells, iPSCs) 유래의 엑소좀인 것을 특징으로 하는, 엑소좀의 농도를 향상시키기 위한 조성물.
제2항에 있어서, 상기 엑소좀은 지방줄기세포 유래의 엑소좀인 것을 특징으로 하는, 엑소좀의 농도를 향상시키기 위한 조성물.
제1항에 있어서, 상기 조성물은 엑소좀의 생산을 증가시키는 것인, 엑소좀의 농도를 향상시키기 위한 조성물.
제1항에 있어서, 상기 조성물은 pH를 산성으로 조절하는 시약을 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 엑소좀의 농도를 향상시키기 위한 조성물.
제1항에 있어서, 상기 조성물은 세포배양 시 세포배양액에 0.5 내지 2 % NEAA 및 50 내지 150 ng/mL 인슐린 유사 성장인자-1(IGF-1) 중 어느 하나 이상을 포함하도록 하는 것을 특징으로 하는, 엑소좀의 농도를 향상시키기 위한 조성물.
다음의 단계를 포함하는 엑소좀의 농도를 향상시키기 위한 방법으로서,
(a) 0.5 내지 2 % NEAA 및 50 내지 150 ng/mL 인슐린 유사 성장인자-1(IGF-1) 중 어느 하나 이상을 포함하는 세포배양액을 준비하는 단계;
(b) 상기 세포배양액에서 세포를 24 시간 내지 84 시간 동안 배양하는 단계;
(c) 상기 (b) 단계에서 얻어진 세포배양액을 회수하여 상기 세포로부터 분비된 엑소좀을 포함하는 조정배지(Conditioned medium, CM)를 수득하는 단계;
(d) 상기 조정배지를 원심분리하여 엑소좀을 수득하는 단계;를 포함하는,
엑소좀의 농도를 향상시키기 위한 방법.
제7항에 있어서, 상기 방법은 상기 (d) 단계 이전에, 상기 (c) 단계에서 수득된 조정배지의 pH를 약 pH 2 내지 pH 3으로 조절는 단계를 더 추가하는 것을 특징으로 하는, 엑소좀의 농도를 향상시키기 위한 방법.
제7항에 있어서, 상기 세포는 섬유아세포, 줄기세포 또는 지방줄기세포인 것을 특징으로 하는, 엑소좀의 농도를 향상시키기 위한 방법.
줄기세포를 배양한 조정배지를 수득하고, 수득된 조정배지의 pH를 약 pH 2 내지 pH 3으로 조절하는 단계를 포함하는, 줄기세포 유래 엑소좀을 고농도로 추출하는 방법.
0.5 내지 2 % NEAA 및 50 내지 150 ng/mL 인슐린 유사 성장인자-1(IGF-1) 중 어느 하나 이상을 포함하는 세포배양액에서 줄기세포를 배양하여 얻어지며 줄기세포 유래의 엑소좀을 포함하는, 세포배양물.
제11항에 있어서, 상기 세포배양물은 줄기세포 유래의 엑소좀의 농도가 농도가 50.0 ug/mL 이상인 것을 특징으로 하는, 세포배양물.
제11항에 있어서, 상기 세포배양물은 pH가 pH 2 내지 pH 3인 것을 특징으로 하는, 세포배양물.
줄기세포를 0.5 내지 2 % NEAA 및 50 내지 150 ng/mL 인슐린 유사 성장인자-1(IGF-1) 중 어느 하나 이상을 포함하는 세포배양액에서 배양하는 단계를 포함하는, 줄기세포 유래의 엑소좀을 포함하는 세포배양물의 제조방법.
제14항에 있어서, 상기 줄기세포는 중간엽줄기세포 또는 지방줄기세포인 것을 특징으로 하는, 줄기세포 유래의 엑소좀을 포함하는 세포배양물의 제조방법.