CN110038165B - 一种富集高活性脂肪颗粒细胞和脂肪干细胞的脂肪移植物及其制备方法和应用 - Google Patents

一种富集高活性脂肪颗粒细胞和脂肪干细胞的脂肪移植物及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于脂肪移植技术领域，具体涉及一种富集高活性脂肪颗粒细胞和脂肪干细胞的脂肪移植物及其制备方法和应用。该方法包括如下步骤：采用注射器手动负压抽脂后，将得到的脂肪离心获得脂肪层，再将脂肪层下层消化制得细胞悬液，上层推注得到用于移植的中间层，最后将细胞悬液与中间层混匀，即得到富集高活性脂肪颗粒细胞和脂肪干细胞的脂肪移植物。本发明的优点在于，该方法最终制得的脂肪移植物，与传统SVF‑gel相比得率更高，含有大量高活性的颗粒脂肪细胞、SVF‑cells及脂肪干细胞，这些细胞浓度是正常脂肪组织的5～10倍，移植脂肪存活率可以达到70％，移植脂肪质地更柔软均匀，出现油性纤维包块、纤维结节等不良反应的几率显著降低。

Description

一种富集高活性脂肪颗粒细胞和脂肪干细胞的脂肪移植物及 其制备方法和应用
技术领域
本发明属于脂肪移植技术领域，涉及一种脂肪组织的处理方法，尤其涉及一种富集高活性脂肪颗粒细胞和脂肪干细胞的脂肪移植物及其制备方法和应用。
背景技术
自体脂肪组织因其具有生物相容性、稳定性、术后效果自然、材料容易获得、来源丰富、对供区损伤较小和可重复手术等特点，被人们看作是理想的软组织填充材料。临床上整形医师对于自体脂肪移植的使用呈不断的上升趋势。
移植脂肪组织的存活与脂肪组织内血管神经的再建联系紧密，已经证实脂肪组织来源的脂肪干细胞具有刺激血管生成的作用，可在脂肪组织移植后缺血缺氧的条件下释放血管生成因子，促进血管的再建。在传统的脂肪移植中，脂肪抽吸物中的脂肪部分经分离后直接用于注射填充，抽吸的脂肪组织中，颗粒脂肪细胞被破坏严重，细胞外基质成分以及其中的祖细胞所占成熟细胞的比例明显降低，这些细胞外基质中的祖细胞对于脂肪组织的存活十分重要，祖细胞的缺乏可能是导致移植脂肪组织吸收萎缩的一个重要原因。细胞辅助的吸脂-脂肪移植疗法(Cell Assisted Liposuction，CAL)，是将新鲜分离的脂肪细胞外血管基质碎片细胞(SVF-cells)加入到脂肪抽吸物中，联合脂肪移植。研究证实，相对于传统的脂肪移植法，此种方法的脂肪存活率可提高20％～30％。但此种方法依旧面临着颗粒脂肪细胞被破坏严重、添加的SVF-cells活性不能保证，以及移植后由于游离油脂的存在会导致出现油性纤维包块、纤维结节等问题。
目前，应用物理方式破坏抽取的脂肪组织中的成熟脂肪细胞，通过离心去除油脂后保留脂肪细胞外的基质成分，制成可以局部注射填充的一种自体脂肪组织填充物(SVF-gel)，可以达到透明质酸、胶原蛋白等物质的填充效果。此种方式在破坏成熟脂肪细胞的同时，也破坏掉其余活细胞，最终得到类似于自体胶原的填充物。此种方式填充后SVF-gel吸收率低，并且凝胶产率只有10％～15％，一般只适用于小剂量的填充，对于治疗有大体积脂肪移植或自身脂肪储存量不够的患者存在很大局限。
发明内容
为了解决现有技术存在的上述问题，本发明目的在于提供一种富集高活性脂肪颗粒细胞和脂肪干细胞的脂肪移植物及其制备方法和应用。
本发明所采用的技术方案为：
本发明的主要目的是提供一种能够快速制取富集高活性脂肪颗粒细胞和脂肪干细胞的脂肪移植物的方法。通过适宜强度的机械处理，在去除脂肪和抽取部分脂肪细胞破坏所释放的油脂时，浓缩移植脂肪组织中的脂肪干细胞浓度，并且尽可能的维持细胞活性。此外，通过合适的移植脂肪分配，适宜的细胞添加浓度，促进脂肪移植存活，降低脂肪移植后油性纤维包块、纤维结节出现的几率。
本发明提供了一种富集高活性脂肪颗粒细胞和脂肪干细胞的脂肪移植物的制备方法，包括如下步骤：
(1)用注射器手动负压抽脂，去水，得到颗粒脂肪；
(2)向颗粒脂肪中加入生理盐水，混匀，离心，收集上层脂肪，得到脂肪层；
(3)将步骤(2)中得到的脂肪层分为上层脂肪层和下层脂肪层；
取所述下层脂肪层，消化，离心，去除红细胞后用人血白蛋白溶液重悬，得到细胞悬液；
将上层脂肪层转移至注射器一中，连接注射器一和注射器二，注射器中预留负压体积，经多次推注后，得到推注后上层脂肪层，于最后一次推注时将注射器一中的推注后上层脂肪层推注入注射器二中，混匀，得到混匀脂肪，推注次数小于10次，每次推注速度为5～10mL/秒；以小于1500g的离心力离心混匀脂肪，离心时间小于5min，得到分层的脂肪，收集中间层；
(4)将步骤(3)中下层脂肪层处理得到的细胞悬液加入到上层脂肪层处理得到的中间层中，混匀，即为所述富集高活性脂肪颗粒细胞和脂肪干细胞的脂肪移植物。
优选的，上述制备方法，所述注射器一中预留负压体积与上层脂肪层的体积比为1：4。
优选的，上述制备方法，将注射器一中的推注后上层脂肪层推注入注射器二中前，所述注射器二中预留负压体积与所述推注后上层脂肪层的体积比为1：4。
优选的，上述制备方法，所述步骤(1)中手动负压抽脂时所用抽脂针的孔径为1.2～2mm，所用抽脂针的孔数为3～5个，所述注射器的量程为10～20mL；所述步骤(2)中颗粒脂肪与生理盐水的体积比为1:2，所述步骤(2)中离心条件为300～500g离心3min。
优选的，上述制备方法，所述步骤(3)中上层脂肪层为步骤(2)中脂肪层的上4/5，所述步骤(3)中的下层脂肪层为所述步骤(2)中的脂肪层的下1/5。
优选的，上述制备方法，所述步骤(3)得到的细胞悬液中的SVF-cells活性大于80％；所述步骤(3)得到的中间层中颗粒脂肪细胞活性在60％以上。
优选的，上述制备方法，所述步骤(3)中通过使用4mm口径双通管将上层脂肪层转移至注射器一中；所述步骤(3)中通过2mm口径的鲁尔双通管连接注射器一和注射器二；所述步骤(3)中推注次数为3～5次；所述步骤(6)中离心力为1000～1500g，离心时间为2～5min。
优选的，上述制备方法，所述步骤(4)中添加的细胞悬液中SVF-cells的浓度为5×105～5×106个/mL。
本发明还提供了一种利用前述制备方法制备得到的富集高活性脂肪颗粒细胞和脂肪干细胞的脂肪移植物。
本发明还提供了一种前述富集高活性脂肪颗粒细胞和脂肪干细胞的脂肪移植物在制备脂肪移植物或非治疗形式的脂肪移植中的应用。
本发明的有益效果为：
本提供的富集高活性颗粒脂肪细胞和脂肪干细胞的脂肪移植物的制备方法，将脂肪分层处理，采用特定条件分别处理上层脂肪层和下层脂肪层，最终将处理上层脂肪层的细胞悬液和处理下层脂肪层得到的中间层即移植用脂肪凝胶层混合，即得到高活性颗粒脂肪细胞和脂肪干细胞的脂肪移植物，该移植物相对于传统的SVF-gel具有大量高活性的颗粒脂肪细胞、SVF-cells及脂肪干细胞，为后续提高移植存活率提供了保障。
总体而言，本提供的富集高活性颗粒脂肪细胞和脂肪干细胞的脂肪移植物的制备方法，首先，采用分层制备脂肪移植物，将含有较多纤维组织的高密度脂肪即下层脂肪层和含有颗粒脂肪细胞较多的脂肪即上层脂肪层分开处理；其次，下层脂肪层通过特定处理条件后得到含有大量高活性SVF-cells的细胞悬液，SVF-cells活性大于80％；再次，将含颗粒脂肪细胞较多的脂肪推注去油，通过选择合适直径的双通管、减少脂肪推注次数、减少离心次数、离心力和离心时间，尽可能减少机械作用力对颗粒脂肪细胞细胞和SVF-cells和脂肪干细胞活性的损伤，得到可用于移植用脂肪凝胶层，移植用脂肪凝胶层的得率约为上层脂肪层体积的30％～40％，是传统制备方法的两倍，且其中颗粒脂肪细胞活性在60％以上；最后，以5×105～5×106/mL的浓度添加SVF-cells，将细胞悬液和移植用凝胶脂肪层按比混合后制得脂肪移植物，其中含有大量高活性的颗粒脂肪细胞、SVF-cells及脂肪干细胞，这些细胞浓度是正常脂肪组织的5～10倍，使得本发明提供的脂肪移植物的移植脂肪存活率可以达到70％，移植脂肪质地更柔软均匀，移植后出现油性纤维包块、纤维结节等不良反应的几率显著降低，同时可以有效解决有较大移植体积需求人群但自体抽取脂肪量不足或过度抽脂等问题。
附图说明
图1是不同推注和离心方式制得的脂肪凝胶消化后SVF-cells活细胞计数；
图2是各组SVF-cells贴壁24h后贴壁活细胞计数对比；
图3是各组SVF-cells贴壁培养24h后培养瓶中贴壁细胞情况对比；
图4是脂肪移植物中脂肪干细胞流式检测结果；
图5是脂肪干细胞成脂成软骨诱导；
图6是裸鼠背部四组脂肪移植对比；
图7是裸鼠背部脂肪移植体积变化情况；
图8是裸鼠背部脂肪移植1月后结果对比；
图9是移植1月和3月后改良SVF-gel+SVF-cells组移植脂肪内部情况；
图10是移植脂肪油红与Masson三色染色结果。
具体实施方式
下面结合附图及具体实施例对本发明做进一步阐释。
本申请中，除特别标注外，材料器械均为商业购买。
细胞活率的计算：台盼蓝染色后，细胞存活率(％)＝未蓝染细胞数/总细胞数×100％。
实施例1
本实施例的目的在于选择最适的抽脂方式。
本实施例的脂肪抽取方式如下：
负压抽脂机：用目前常用的机器辅助负压抽脂机抽取脂肪；
手动抽取：用10mL或20mL注射器手动负压抽脂，抽取的脂肪下于4℃无菌条件下静置去水，得到脂肪(颗粒脂肪)，抽脂使用3～5孔1.2～2mm口径抽脂针，抽脂注射器使用10mL或20mL注射器为最佳。
两组的脂肪处理过程与结果记录见表1，如下：
表1
Figure BDA0002039035600000061
Figure BDA0002039035600000071
两组结果显示，相对于手动抽取，机器辅助负压抽脂来源的脂肪，需要增加离心次数和推注次数，才能去除游离油脂，最终可用于脂肪移植的得率小于20％，颗粒脂肪细胞和脂肪干细胞活性均受到显著影响，即减少离心次数和推注次数能提高最终制得的移植物中颗粒脂肪细胞和脂肪干细胞的活性。因此，本发明采用手动注射器负压抽脂来源的脂肪进行后续研究，可以最小程度的减少机械损伤维持体外移植脂肪中颗粒脂肪细胞、SVF-cells及脂肪干细胞的活性。
实施例2
本实施例的目的在于检测机械处理对脂肪中细胞的活性的影响。
本实施例的各组脂肪制备过程如下：
对照组：离心去水处理的普通脂肪；
A组：(1)用10mL或20mL注射器手动负压抽脂，抽取的脂肪于4℃无菌条件下静置去水，得到脂肪颗粒；所用抽脂针的孔径为1.2～2mm，所用抽脂针的孔数为3～5个；
(2)加入两倍于步骤(1)中的脂肪颗粒体积的生理盐水，摇晃混匀，以300～500g离心3min，离心后脂肪分为上层脂肪层和下层水层，弃下层水层和管底红细胞沉淀，得到脂肪层；
(3)将步骤(2)中得到的脂肪层分为上层脂肪层和下层脂肪层，上层脂肪层为步骤(2)中脂肪层的上4/5，下层脂肪层为脂肪层的下1/5；
取下层脂肪层(约1/5体积的含较多纤维组织的脂肪)，在GMP实验室，具体操作如下：
向下层脂肪层中加入终浓度0.1％浓度的Ⅰ型胶原酶溶液，37℃孵箱消化1h，每5min轻摇混匀一次，混匀后以300～500g消化后离心3min，去除上层上清，保留离心管细胞沉淀；向细胞沉淀中加入100～200mL生理盐水重悬细胞沉淀，再用100μm滤器过滤，滤液用300～500g离心3min；离心后弃上清，沉淀加入红细胞裂解液，37℃作用3min后去除红细胞，再次300～500g离心3min；离心后得到SVF-cells沉淀，用终浓度5％的人血白蛋白溶液重悬制备成细胞悬液(1～2mL)备用，细胞悬液的SVF-cells活性大于80％；
改良SVF-gel，在脂肪消化的同时，取颗粒脂肪细胞较多的脂肪即上层脂肪层，在GMP实验室，脂肪推注具体操作如下：
使用4mm口径双通管转移至20mL注射器一中，每次转移10mL；通过2mm口径双通管连接20mL注射器二，注射器一中另留出5mL空气体积，经多次推注(每次推注时上层脂肪层仍在注射器一中)处理后上层脂肪层后，在最后一次推注时将注射器一中的上层脂肪迅速推注入注射器二，推注速度为5～10mL/秒，每完成一次推注后上下晃动注射器3～5次，总共推注次数小于10次(以3～10次为优，最优为3～5次)；完成推注后注射器二抽吸约5mL体积负压，利用5mL体积的负压混匀脂肪组织3～5次，得到混匀脂肪；混匀脂肪以小于1500g(以1000g～1500g为优)的离心力离心混匀脂肪，离心时间小于5min(以2～5min为优)，得到分层的脂肪，顶层为纯油层，体积占比约20％～40％，底层为水层，体积占比约10％～30％，中间层为移植用脂肪凝胶层，体积占比约30％～40％，颗粒脂肪细胞活性在60％以上，收集中间层；
(4)将步骤(3)消化收集得到的细胞悬液按细胞悬液中SVF-cells 5×105～5×106个/mL的浓度加入，立即用于脂肪移植。
注意：若步骤(3)脂肪推注过程中，离心后未分成三层，或油脂层体积未在20％～40％区间内，可以去除下层水层后，再用4mm双通管连接注射器再次推注3～5次，推注后脂肪采用500～800g离心3min，重复步骤(4)即得。
B组：该组为传统的SVF-gel，处理步骤如下：
(1)用10mL或20mL注射器手动负压抽脂，抽取的脂肪于4℃无菌条件下静置去水，得到脂肪颗粒；所用抽脂针的孔径为1.2～2mm，所用抽脂针的孔数为3～5个；
(2)加入两倍于步骤(1)中的脂肪颗粒体积的生理盐水，摇晃混匀，以1200g离心3min，离心后脂肪分为上层脂肪层和下层水层，弃下层水层和管底红细胞沉淀，得到高密度脂肪；
(3)将步骤(2)中得到的高密度脂肪，用1.8mm口径双通管，以10mL速度来回推注10次；
(4)将步骤(3)推注后的脂肪，摇晃均匀，出现蛋花样絮状物，再以1800g～2000g离心3min；
(5)离心后分三层，顶层为纯油层，体积占比约50％～60％，底层为水层，体积占比约10％～30％，中间层为传统SVF-gel，体积占比约10％～15％，收集中间层。
利用注射器推注时的物理剪切力破坏脂肪细胞，此种方式得到的最终产物以脂肪细胞外基质为主，并且脂肪细胞外基质的得率在15％左右甚至更少。此过程中，离心力过大，离心次数过多，双通管直径，推注次数与推注速度会显著影响SVF-gel中细胞活性，最终导致SVF-gel中只含有少量甚至不含有活细胞。
C组：该组为纳米脂肪提取物(NSVF-gel)，制作过程如下：
(1)用10mL或20mL注射器手动负压抽脂，抽取的脂肪于4℃无菌条件下静置去水，得到脂肪颗粒；所用抽脂针的孔径为1.2～2mm，所用抽脂针的孔数为3～5个；
(2)加入两倍于步骤(1)中的脂肪颗粒体积的生理盐水，摇晃混匀，以1200g离心3min，离心后脂肪分为上层脂肪层和下层水层，弃下层水层和管底红细胞沉淀，得到高密度脂肪；
(3)将步骤(2)中得到的高密度脂肪，使用剪刀剪碎筋膜与脂肪中的纤维成分；
(4)将步骤(3)剪碎后的脂肪，使用0.8mm 5孔双通管，推注20次以上；
(5)2000g离心3min，离心后分三层，顶层为纯油层，体积占比约60～70％，底层为水层，体积占比约10％～30％，中间层为NSVF-gel，体积占比小于10％，收集中间层。
将前述对照组、A组、B组和C组得到的脂肪凝胶，分别通过胶原酶消化得到SVF-cells，并利用台盼蓝染色测其中活细胞数。结果如图1所示(n＝5)，与对照组、B组和C组相比，虽然A组中SVF-cells活性显著低于对照组，但也显著高于B组和C组中SVF-cells活性(P<0.05)。对照组为简单离心后的高密度脂肪，不利于后续使用，由此可见，A组的操作方式在能去除游离油脂的同时，能最大程度的保证SVF-cells活性(P<0.05)，而B组和C组由于过度的机械处理产率低，SVF-cells活性也随处理程度的增加而显著下降。
实施例3
本实施例的目的在于检测机械处理对脂肪移植物中脂肪干细胞的活性的影响。
具体操作如下：
(1)将实施例2中的四组脂肪消化收集得到的SVF-cells，去除红细胞后，按2×106个/mL的细胞浓度重悬培养于6孔板培养瓶中，1mL/孔，每孔接种约2×106个细胞。贴壁24h后，观察四组瓶中细胞大概贴壁情况。
(2)吸去培养瓶中的上清，加入生理盐水洗涤两次后，每瓶中加入0.25％胰酶消化，中和消化，400g离心3min后弃上清得到细胞沉淀；
(3)将细胞沉淀制备为细胞悬液，向细胞悬液中以9:1体积加入0.4％台盼蓝染色(细胞悬液:0.4％台盼蓝的体积比为9:1)，计数活细胞；
(4)计算贴壁率，贴壁率≈消化后活细胞数/接种总细胞数×100％。
结果如图2所示，在贴壁24h后，C组基本未见贴壁细胞，消化后细胞贴壁率<1％。A组和对照组贴壁率最高，达到15％和20％，A组脂肪凝胶中的贴壁细胞数略少于未经推注离心处理的脂肪消化中贴壁细胞数，B组贴壁细胞少于A组(P<0.05)。由此可见，过度的物理处理将显著影响脂肪干细胞的数量。
贴壁24h后的活细胞计数结果如图3所示，对照组细胞贴壁率约20％，A组贴壁率约15％，B组贴壁率<5％，C组几乎没有贴壁细胞。由此可见，采用本发明操作步骤处理脂肪(A组)，在有效除去移植脂肪中游离油脂的同时，可有效维持脂肪干细胞等祖细胞的活性。
结合实施例2和实施例3的结果，可以说明，通过物理方式破坏颗粒脂肪细胞，去除游离油脂的同时，也会破坏脂肪中包括脂肪干细胞等各种有利于脂肪移植存活的祖细胞，使得最终用于移植的SVF-gel主要是细胞外基质中的胶原蛋白和细胞膜碎片，未富集甚至不存在活细胞，最终导致移植效果不佳。
结合实施例2和实施例3的结果，可以得出如下结论：采用适宜的机械处理去除少部分抽脂过程中受损的颗粒脂肪细胞，去除游离油脂，维持脂肪干细胞及相关祖细胞的活性，再额外添加合适浓度的SVF-cells，最终得到的脂肪移植物中含有大量高活性的颗粒脂肪细胞，SVF-cells及脂肪干细胞浓度为正常脂肪组织的5～10倍。此种方式处理后的脂肪移植质地更柔软均匀，出现油性纤维包块、纤维结节等不良反应的几率显著降低。
实施例4
本实施例的目的在于确定机械处理后对脂肪干细胞干性的影响。
为确定本发明提供的脂肪组织处理方法(实施例2中所述的A组处理方式)是否对脂肪组织中所含干细胞的活性以及干性产生影响，对收集的贴壁细胞进行相关检测。
培养包括如下步骤：
(1)向实施例3中所述的贴壁24h后的贴壁细胞中加入脂肪干细胞培养基，培养；
(2)根据细胞情况，每2～3天更换干细胞培养基，细胞融合率达80％时进行传代；
(3)收集P3～P5代细胞，进行间充质干细胞流式检测和成脂成骨诱导培养。
采用BD人间充质干细胞鉴定试剂盒进行细胞流式鉴定。细胞流式检测结果如图4所示，经过本发明方式处理后的脂肪组织，提取到的脂肪干细胞能够表达CD90、CD105、CD73和CD44等间充质干细胞的表面标志物，证明提取得到的细胞为间充质干细胞，且干细胞纯度在95％以上。
成脂成骨诱导培养结果如图5所示，图5左图为脂肪干细胞成软骨诱导结果，诱导结果染色可见明显的软骨成分(箭头所示)，右图为脂肪干细胞成脂肪诱导结果，油红O染色结果可见均匀的脂滴成分(箭头所示)。结合实施例3、实施例4的结果可知，本发明方法所涉及到的脂肪处理操作可以有效的维持脂肪组织中脂肪干细胞的活性与干性。
实施例5
本实施例的目的在于探究移植了富集高活性颗粒脂肪细胞和脂肪干细胞的脂肪移植物的动物移植实验的长期移植存活率。
对比现阶段临床常用脂肪移植前脂肪组织处理方式，在同一裸鼠模型上进行注射移植，在不同时间点测量移植脂肪体积，切片染色，观察炎症、坏死、血管生成和脂肪生成等情况，多方面评估脂肪移植的效果。
具体分组如表2所示：
表2
序号 分组 初始移植体积
1 传统SVF-gel组 1mL
2 改良SVF-gel+SVF-cells组 1mL
3 改良SVF-gel组 1mL
4 NSVF-gel组 1mL
1组：即传统SVF-gel组，实施例2中的B组操作方式，为通过两次推注两次高速离心制作而成；
2组：即改良SVF-gel+SVF-cells组，为按本发明方法制作的富集高活性颗粒脂肪细胞和脂肪干细胞的脂肪移植物，SVF-cells添加浓度为106个/mL；
3组：即改良SVF-gel组，仅为上层脂肪层制备得到的移植用脂肪凝胶层；
4组：即NSVF-gel组，为纯脂肪细胞外基质凝胶。
按上述分组对脂肪进行处理，处理脂肪来源于一23岁女性大腿腹部，采用手动负压抽取。
为避免个体差异对结果的影响，裸鼠乙醚吸入麻醉后，在同一只裸鼠背部取四个点同时分别进行4个组对照注射，每个点24G注射器针头皮下注射1mL(图6)，分别于移植后30天(n＝8)、90天(n＝8)和180天(n＝8)，采用排水法测量移植脂肪体积，切片染色，观察炎症坏死、胶原增生、脂肪生成等情况，评估脂肪移植的效果。
脂肪移植体积的变化情况见图7。改良SVF-gel+SVF-cells组(2组)脂肪移植体积与传统SVF-gel(1组)存活体积没有差异，相对于改良SVF-gel组(3组)和NSVF-gel组(4组)，在1月、3月和6月的脂肪移植存活率有着显著的提升，移植存活率最高(P<0.05)。
裸鼠背部脂肪移植1月后结果对比如图8所示，在移植一月后，改良SVF-gel+SVF-cells组(2组)的血管最丰富、改良SVF-gel组(3组)次之，均明显优于传统SVF-gel组，而NSVF-gel组基本无血管生成。
移植3个月后改良SVF-gel+SVF-cells组(2组)移植脂肪的内部情况如图9所示，移植脂肪油红O染色结果如图10所示。图9中左图为改良SVF-gel+SVF-cells组(2组)1月结果，移植1月后，移植脂肪肉眼可见脂肪分布均匀，脂肪质地柔软。图9右图为改良SVF-gel+SVF-cells组(2组)3月结果，可以看出，移植脂肪仍然保持柔软均匀的质地。针对脂肪细胞分布的油红O染色结果显示，改良SVF-gel+SVF-cells组(2组)相对于其他三组，存活脂肪细胞分布最为均匀，移植脂肪几乎明显的无油性坏死与局部集中硬化的纤维结节。
本发明不局限于上述可选的实施方式，任何人在本发明的启示下都可得出其他各种形式的产品。上述具体实施方式不应理解成对本发明的保护范围的限制，本发明的保护范围应当以权利要求书中界定的为准，并且说明书可以用于解释权利要求书。

Claims (9)

1.一种富集高活性脂肪颗粒细胞和脂肪干细胞的脂肪移植物的制备方法，包括如下步骤：
（1）用注射器手动负压抽脂，去水，得到颗粒脂肪；
（2）向颗粒脂肪中加入生理盐水，混匀，离心，收集上层脂肪，得到脂肪层；
（3）将步骤（2）中得到的脂肪层分为上层脂肪层和下层脂肪层；
取所述下层脂肪层，消化，离心，去除红细胞后用人血白蛋白溶液重悬，得到细胞悬液；
通过使用4mm口径双通管将上层脂肪层转移至注射器一中，通过2mm口径的鲁尔双通管连接注射器一和注射器二，注射器一和注射器二中均预留负压体积，经多次推注后，得到推注后上层脂肪层，于最后一次推注时将注射器一中的推注后上层脂肪层推注入注射器二中，混匀，得到混匀脂肪，推注次数为3~5次，每次推注速度为5～10 mL/秒；以1000~1500g的离心力离心混匀脂肪，离心时间为2~5min，得到分层的脂肪，收集中间层；
（4）将步骤（3）中下层脂肪层处理得到的细胞悬液加入到上层脂肪层处理得到的中间层中，混匀，即为所述富集高活性脂肪颗粒细胞和脂肪干细胞的脂肪移植物。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述注射器一中预留负压体积与上层脂肪层的体积比为1：4。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：将注射器一中的推注后上层脂肪层推注入注射器二中前，所述注射器二中预留负压体积与所述推注后上层脂肪层的体积比为1：4。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述步骤（1）中手动负压抽脂时所用抽脂针的孔径为1.2~2 mm，所用抽脂针的孔数为3~5个，所述注射器的量程为10~20 mL；所述步骤（2）中颗粒脂肪与生理盐水的体积比为1:2，所述步骤（2）中离心条件为300～500 g离心3 min。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述步骤（3）中上层脂肪层为步骤（2）中脂肪层的上4/5，所述步骤（3）中的下层脂肪层为所述步骤（2）中的脂肪层的下1/5。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于：所述步骤（3）得到的细胞悬液中的SVF-cells活性大于80%；所述步骤（3）得到的中间层中颗粒脂肪细胞活性在60%以上。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于：所述步骤（4）中添加的细胞悬液中SVF-cells的浓度为5×105～5×106个/mL。
8.一种根据权利要求1-7任意一项所述的制备方法制备得到的富集高活性脂肪颗粒细胞和脂肪干细胞的脂肪移植物。
9.一种权利要求8所述的富集高活性脂肪颗粒细胞和脂肪干细胞的脂肪移植物在制备脂肪移植物或非治疗形式的脂肪移植中的应用。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114246883A (zh) * 2020-09-23 2022-03-29 北京瑷格干细胞科技有限公司 一种药物组合物及其治疗剂和应用
CN113398331A (zh) * 2021-05-25 2021-09-17 郑州市和沐生物科技有限公司 无细胞脂肪提取物及其制备方法、分析方法
CN115554478A (zh) * 2021-07-01 2023-01-03 高山艳 一种生物组织修复用自体活细胞制剂及其制备方法和应用
CN114796277A (zh) * 2022-04-14 2022-07-29 高山艳 脂肪间充质干细胞联合纳米脂肪的比例混合物制备方法

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102258810A (zh) * 2011-07-20 2011-11-30 王泰华 一种富集自体干细胞的脂肪组织隆胸材料的制备方法
CN104984399A (zh) * 2015-07-29 2015-10-21 西安芙金细胞科技有限公司 一种生物支架材料、svf辅助的脂肪组织制备方法
CN106178134A (zh) * 2016-07-14 2016-12-07 鲁峰 一种含高度浓缩的脂肪来源干细胞和细胞外基质的脂肪移植材料及其纯物理制备方法和应用
WO2017195225A1 (en) * 2016-05-10 2017-11-16 Promoitalia Group Spa Method for extracting and separating stem cells derived from adipose tissue for aesthetic treatments
CN107475190A (zh) * 2017-10-13 2017-12-15 上海莱馥医疗科技有限公司 一种脂肪svf细胞临床级高效制备和冻存的方法及其用途

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102258810A (zh) * 2011-07-20 2011-11-30 王泰华 一种富集自体干细胞的脂肪组织隆胸材料的制备方法
CN104984399A (zh) * 2015-07-29 2015-10-21 西安芙金细胞科技有限公司 一种生物支架材料、svf辅助的脂肪组织制备方法
WO2017195225A1 (en) * 2016-05-10 2017-11-16 Promoitalia Group Spa Method for extracting and separating stem cells derived from adipose tissue for aesthetic treatments
CN106178134A (zh) * 2016-07-14 2016-12-07 鲁峰 一种含高度浓缩的脂肪来源干细胞和细胞外基质的脂肪移植材料及其纯物理制备方法和应用
CN107475190A (zh) * 2017-10-13 2017-12-15 上海莱馥医疗科技有限公司 一种脂肪svf细胞临床级高效制备和冻存的方法及其用途

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