CN107550846A - 一种用于美容护肤的干细胞活性复合制剂及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明所述一种用于美容护肤的干细胞活性复合制剂及其制备方法，按体积比包括：人干细胞活性成份提取液30‑68％，人干细胞活性成份分泌液30‑68％，0.5％‑1％透明质酸，0.8％‑1.5％维生素E，0.5％‑1％人白蛋白，可以用于皮肤皱纹、色斑和瘢痕等美容护肤领域，其效果明显，而且纯天然，不含化学用品。

Description

一种用于美容护肤的干细胞活性复合制剂及其制备方法

技术领域

本发明属于干细胞活性复合制剂技术领域，尤其涉及一种用于美容护肤的干细胞活性复合制剂及其制备方法。

背景技术

随着经济社会的发展，人们对美的追求越来越高，能够拥有光洁白皙的皮肤更成为现代女性的追求。

爱美之心人皆有之，对不仅要美丽还要健康的现代女性来说，美容护肤不再是年轻女性的口号，而是真正落实到实际中。但随着环境的污染以及饮食的污染，人们被动的吸进许多毒素，为了身体和容貌，爱美女士常常服食一些美容护肤药物，但市场上的这种药物价格昂贵，且富含添加剂、防腐剂等附加成分，长期服用，会对人们身心健康造成很大伤害。

人们将护肤品涂覆在皮肤上，减少美容护肤药物对身体的伤害，但是随着外部环境的不断恶化，空气质量的下降，各种化学化妆品的大量使用，给我们的肌肤带来了众多的伤害，变得粗糙产生斑点。因此各种美容化妆品随之而来，但是这些化妆品大多只是在外表遮掩，并不能深层次的改善肌肤的状况。

发明内容

本发明克服了现有技术中的缺点，提供了一种用于美容护肤的干细胞活性复合制剂及其制备方法，该复合制剂可以用于皮肤皱纹、色斑和瘢痕等美容护肤领域。

为了解决上述技术问题，本发明是通过以下技术方案实现的：

一种用于美容护肤的干细胞活性复合制剂，按体积比包括：人干细胞活性成份提取液30-68％，人干细胞活性成份分泌液30-68％，0.5％-1％透明质酸，0.8％-1.5％维生素E，0.5％-1％人白蛋白。

进一步，所述的人干细胞活性成份提取液中含有胶原蛋白、弹性蛋白、粘连蛋白、血小板反应素、整合素和多肽，所述提取液是从人间充质干细胞破碎液中提取得到。

进一步，所述的人干细胞活性成份分泌液包括内皮细胞生长因子、成纤维细胞生长因子、干细胞生长因子、表皮细胞生长因子、肝细胞生长因子和转化生长因子，所述分泌液是从人脐带间充质干细胞培养上清液中获得。

一种用于美容护肤的干细胞活性复合制剂的制备方法，包括以下步骤：

1)人干细胞活性成份提取液的制备；

2)人干细胞活性成份分泌液的制备；

3)干细胞活性复合制剂的制备：

以步骤1所得干细胞活性成份提取液及步骤2所得干细胞活性成份分泌液为原料，按比例加入透明质酸，维生素E和人白蛋白。

进一步，所述的人干细胞活性成份提取液是通过以下的步骤制备而得的：

步骤1：复苏冻存的人脐带间充质干细胞UC-MSCs；

步骤2：大量培养的收集UC-MSCs，超声破碎，离心取上清；

步骤3：微孔径滤膜过滤，浓缩。

进一步，所述人干细胞活性成份提取液具体提取步骤如下：

(1)人UC-MSCs的复苏：液氮罐中取出冻存管迅速放入37℃的水浴锅中，缓慢摇晃冻存管直至内部所有固体溶解无冰晶，擦干并消毒冻存管外管壁后传入生物安全柜内，加入生理盐水多次洗刷冻存管后移入离心管中，1300rpm离心5min后，加入完全培养基重悬细胞，接种于细胞培养瓶中，37℃，5％CO₂环境中培养；

(2)大量培养人UC-MSCs：待细胞生长至70％～80％融合时，用0.25％胰蛋白酶消化2～3min，用含10％的完全培养基终止消化，反复吹打瓶壁细胞，制成单细胞悬液按1:3传代，倒置显微镜逐日观察，直至贴壁细胞彼此融合铺满瓶底时，重复上述操作，反复传代扩增，收集；

(3)人UC-MSCs用胰蛋白酶消化计数10⁷个，PBS洗涤3次，溶于30ml生理盐水中；超声破碎细胞，条件：超声10s，间隔时间5s，超声强度4，超声次数5次，使细胞内的蛋白及营养成分充分溶出；控制温度4℃，转速为10000r/min，离心10min，取上清液，去掉细胞碎片；用孔径为0.22μm的滤膜过滤，使其无菌，测定蛋白浓度，调整浓度为250μg/ml。

进一步，所述的人干细胞活性成份分泌液是通过以下的步骤制备而得的：

步骤1：复苏培养冻存的人脐带间充质干细胞UC-MSCs；

步骤2：饥饿培养UC-MSCs，收集培养上清液；

步骤3：微孔径滤膜过滤，浓缩。

进一步，所述人干细胞活性成份分泌液具体制备步骤如下：

(1)人UC-MSCs的复苏：液氮罐中取出冻存管迅速放入37℃的水浴锅中，缓慢摇晃冻存管直至内部所有固体溶解无冰晶，擦干并消毒冻存管外管壁后传入生物安全柜内，加入生理盐水多次洗刷冻存管后移入离心管中，1300rpm离心5min后，加入完全培养基重悬细胞，接种于细胞培养瓶中，37℃，5％CO₂环境中培养；

(2)人UC-MSCs的饥饿培养：培养至80％融合的人UC-MSCs加入蛋白酶抑制剂MG-132，10μmol/L，预处理30min，PBS轻轻洗2遍，去除残留的完全培养基，然后加入基础培养液DMEM，将细胞培养瓶置于缺氧罐中，放入缺氧催化剂，迅速关闭缺氧盒，置于37℃，5％CO₂细胞培养箱；

(3)细胞培养48h后，收集上层培养液；用50k超滤膜过滤，使其体积浓缩；用孔径为0.22μm的滤膜过滤，使其无菌，测定蛋白浓度，定浓度为250μg/ml。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

本发明所述一种用于美容护肤的干细胞活性复合制剂及其制备方法，按体积比包括：人干细胞活性成份提取液30-68％，人干细胞活性成份分泌液30-68％，0.5％-1％透明质酸，0.8％-1.5％维生素E，0.5％-1％人白蛋白，可以用于皮肤皱纹、色斑和瘢痕等美容护肤领域，其效果明显，而且纯天然，不含化学用品。

具体实施方式

以下对本发明的优选实施例进行说明，应当理解，此处所描述的优选实施例仅用于说明和解释本发明，并不用于限定本发明。

本发明所述用于美容护肤的干细胞活性复合制剂，该复合制剂中包含人干细胞活性成份提取液及含有人干细胞活性成份分泌液。

步骤1，所述提取液具体提取步骤如下：

(1)人UC-MSCs的复苏：液氮罐中取出冻存管迅速放入37℃的水浴锅中，缓慢摇晃冻存管直至内部所有固体溶解无冰晶。擦干并消毒冻存管外管壁后传入生物安全柜内，加入生理盐水多次洗刷冻存管后移入离心管中，1300rpm离心5min后，加入完全培养基重悬细胞，接种于细胞培养瓶中，37℃，5％CO₂环境中培养。

(2)大量培养人UC-MSCs：待细胞生长至70％～80％融合时，用0.25％胰蛋白酶消化2～3min，用含10％的完全培养基终止消化，反复吹打瓶壁细胞，制成单细胞悬液按1:3传代，倒置显微镜逐日观察，直至贴壁细胞彼此融合铺满瓶底时，重复上述操作，反复传代扩增，收集。

(3)人UC-MSCs用胰蛋白酶消化计数10⁷个，PBS洗涤3次，溶于30ml生理盐水中；超声破碎细胞，条件：超声10s，间隔时间5s，超声强度4，超声次数5次，使细胞内的蛋白及营养成分充分溶出；控制温度4℃，转速为10000r/min，离心10min，取上清液，去掉细胞碎片；用孔径为0.22μm的滤膜过滤，使其无菌，测定蛋白浓度，调整浓度为250μg/ml。

步骤2，所述分泌液具体制备步骤如下：

(1)人UC-MSCs的复苏：液氮罐中取出冻存管迅速放入37℃的水浴锅中，缓慢摇晃冻存管直至内部所有固体溶解无冰晶。擦干并消毒冻存管外管壁后传入生物安全柜内，加入生理盐水多次洗刷冻存管后移入离心管中，1300rpm离心5min后，加入完全培养基重悬细胞，接种于细胞培养瓶中，37℃，5％CO₂环境中培养。

(2)人UC-MSCs的饥饿培养：培养至80％融合的人UC-MSCs加入蛋白酶抑制剂MG-132(10μmol/L)预处理30min。PBS(磷酸缓冲盐溶液)轻轻洗2遍，去除残留的完全培养基，然后加入基础培养液DMEM。将细胞培养瓶置于缺氧罐中，放入缺氧催化剂，迅速关闭缺氧盒，置于37℃，5％CO₂细胞培养箱。

(3)细胞培养48h后，收集上层培养液；用50k超滤膜过滤，使其体积浓缩；用孔径为0.22μm的滤膜过滤，使其无菌，测定蛋白浓度，定浓度为250μg/ml。

步骤3，干细胞活性复合制剂的制备：以步骤1所得干细胞活性成份提取液10ml及步骤2所得干细胞活性成份分泌液10ml为原料，加入2ml透明质酸，加入3ml维生素E，加入2ml人白蛋白。

步骤4，将本发明制备的复合制剂进行应用，并与其他的美容护肤产品做相关的对比试验。

(1)将20名30-45岁的女性随机分成2组，每组10人。分别用实验组上述的细胞活性复合制剂和对照组的常规美容产品涂抹实验对象的眼眶周围，然后按摩涂液部位10分钟。每日两次，连续使用1周。最后评价实验组和对照组的去皱美白效果，结果如下表1所示。

	实验组	对照组
			效果显著	7	5
效果一般	1	2
			效果不明显	2	3

表1

(2)将20名30-45岁的女性随机分成2组，每组10人。在面部皮肤涂3～5mm的复方利多卡因乳膏，保持30min，进行面部麻醉后进行水光注射。实验组使用上述的细胞活性复合制剂注射，对照组使用常规美容产品注射，连续使用3次。最后评价实验组和对照组的面部年轻化治疗效果，结果如下表2所示。

	实验组	对照组
			效果显著	6	3
效果一般	2	4
			效果不明显	2	3

表2

最后应说明的是：以上仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换，但是凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种用于美容护肤的干细胞活性复合制剂，其特征在于，按体积比包括：人干细胞活性成份提取液30-68％，人干细胞活性成份分泌液30-68％，0.5％-1％透明质酸，0.8％-1.5％维生素E，0.5％-1％人白蛋白。

2.根据权利要求1所述一种用于美容护肤的干细胞活性复合制剂，其特征在于，所述的人干细胞活性成份提取液中含有胶原蛋白、弹性蛋白、粘连蛋白、血小板反应素、整合素和多肽。

3.根据权利要求1所述一种用于美容护肤的干细胞活性复合制剂，其特征在于，所述的人干细胞活性成份分泌液包括内皮细胞生长因子、成纤维细胞生长因子、干细胞生长因子、表皮细胞生长因子、肝细胞生长因子和转化生长因子。

4.根据权利要求1所述一种用于美容护肤的干细胞活性复合制剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)人干细胞活性成份提取液的制备；

2)人干细胞活性成份分泌液的制备；

3)干细胞活性复合制剂的制备：以步骤1所得干细胞活性成份提取液及步骤2所得干细胞活性成份分泌液为原料，按比例加入透明质酸，维生素E和人白蛋白。

5.根据权利要求4所述一种用于美容护肤的干细胞活性复合制剂的制备方法，其特征在于，所述的人干细胞活性成份提取液是通过以下的步骤制备而得的：

步骤1：复苏冻存的人脐带间充质干细胞UC-MSCs；

步骤2：大量培养的收集UC-MSCs，超声破碎，离心取上清；

步骤3：微孔径滤膜过滤，浓缩。

6.根据权利要求5所述一种用于美容护肤的干细胞活性复合制剂的制备方法，其特征在于，所述人干细胞活性成份提取液具体提取步骤如下：

(1)人UC-MSCs的复苏：液氮罐中取出冻存管迅速放入37℃的水浴锅中，缓慢摇晃冻存管直至内部所有固体溶解无冰晶，擦干并消毒冻存管外管壁后传入生物安全柜内，加入生理盐水多次洗刷冻存管后移入离心管中，1300rpm离心5min后，加入完全培养基重悬细胞，接种于细胞培养瓶中，37℃，5％CO₂环境中培养；

(2)大量培养人UC-MSCs：待细胞生长至70％～80％融合时，用0.25％胰蛋白酶消化2～3min，用含10％的完全培养基终止消化，反复吹打瓶壁细胞，制成单细胞悬液按1:3传代，倒置显微镜逐日观察，直至贴壁细胞彼此融合铺满瓶底时，重复上述操作，反复传代扩增，收集；

(3)人UC-MSCs用胰蛋白酶消化计数10⁷个，PBS洗涤3次，溶于30ml生理盐水中；超声破碎细胞，条件：超声10s，间隔时间5s，超声强度4，超声次数5次，使细胞内的蛋白及营养成分充分溶出；控制温度4℃，转速为10000r/min，离心10min，取上清液，去掉细胞碎片；用孔径为0.22μm的滤膜过滤，使其无菌，测定蛋白浓度，调整浓度为250μg/ml。

7.根据权利要求4所述一种用于美容护肤的干细胞活性复合制剂的制备方法，其特征在于，所述的人干细胞活性成份分泌液是通过以下的步骤制备而得的：

步骤1：复苏培养冻存的人脐带间充质干细胞UC-MSCs；

步骤2：饥饿培养UC-MSCs，收集培养上清液；

步骤3：微孔径滤膜过滤，浓缩。

8.根据权利要求7所述一种用于美容护肤的干细胞活性复合制剂的制备方法，其特征在于，所述人干细胞活性成份分泌液具体制备步骤如下：

(1)人UC-MSCs的复苏：液氮罐中取出冻存管迅速放入37℃的水浴锅中，缓慢摇晃冻存管直至内部所有固体溶解无冰晶，擦干并消毒冻存管外管壁后传入生物安全柜内，加入生理盐水多次洗刷冻存管后移入离心管中，1300rpm离心5min后，加入完全培养基重悬细胞，接种于细胞培养瓶中，37℃，5％CO₂环境中培养；

(2)人UC-MSCs的饥饿培养：培养至80％融合的人UC-MSCs加入蛋白酶抑制剂MG-132，10μmol/L，预处理30min，PBS轻轻洗2遍，去除残留的完全培养基，然后加入基础培养液DMEM，将细胞培养瓶置于缺氧罐中，放入缺氧催化剂，迅速关闭缺氧盒，置于37℃，5％CO₂细胞培养箱；

(3)细胞培养48h后，收集上层培养液；用50k超滤膜过滤，使其体积浓缩；用孔径为0.22μm的滤膜过滤，使其无菌，测定蛋白浓度，定浓度为250μg/ml。