CN107519126B - 一种脐带干细胞除皱剂及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种脐带干细胞除皱剂，包括以下成分：脐带干细胞、透明质酸、胶原蛋白和苹果原花青素。一种脐带干细胞除皱剂的制备方法，包括以下步骤：（一）脐带干细胞的分离培养，（二）完成制备。本发明的除皱剂通过脐带干细胞、透明质酸、胶原蛋白、苹果原花青素的协同作用，具有更好的除皱效果，其中用3×10⁷个/mL的脐带干细胞，8mg/mL苹果原花青素的除皱剂配方效果最好。

Description

一种脐带干细胞除皱剂及其制备方法

技术领域

本发明涉及美容化妆品技术领域，具体为一种脐带干细胞除皱剂及其制备方法。

背景技术

在生物体的生命过程中，衰老是无法避免的，而伴随着衰老带来的一系列外表现象的改变、内在组织变化以及衰老相关疾病的产生给正常生命活动带来极大困扰与不便。而在衰老过程中，体现在面部的变化是，从年轻时的光泽饱满变为年老时的凹陷皱褶，组织弹性也逐渐减弱，使得面部美观状态严重下降，这些主要表现为皱纹的增加。随着生物科学的发展、医学的进步，人们在抗衰老方面已经取得了一些进展，而对面部衰老的改变主要体现在除皱方面。除皱术主要是针对衰老引起的面部组织松弛而进行的一系列治疗方法。

目前除皱技术包括手术除皱术、激光类除皱术和生物除皱术。人们根据风险评估，越来越多的人选择生物除皱术。目前已有的生物除皱技术包括：A型肉毒杆菌毒素注射除皱、羊胎素注射除皱、胶原注射除皱、透明质酸注射除皱、组织工程自体真皮细胞注射除皱以及自体脂肪细胞移植除皱术。目前使用的生物除皱技术仍然存在很多问题，如A型肉毒菌毒素是一种迄今为止最为剧毒的药物，使用的肉毒素由于质量不过关，使得计量很难达到精准；羊胎素由于目前各种条件制约，这种注射方式在国内尚未正规使用；胶原蛋白，由于需要反复填充并且有异物肉芽肿发生的可能，国内现在很少开展；透明质酸持续时间与胶原蛋白一致，只有3-6个月，需要不停的注射补充；自体脂肪细胞移植除皱术制备及操作比较繁琐。这些技术缺陷的存在限制了目前除皱术的使用。因此，如何制备除皱效果好、且工序简单的除皱剂，具有重要的意义。

人脐带间充质干细胞（human umbilical cord-derived mesenchymal stemcells, hUC-MSCs），是指研究者分别从脐带华通氏胶和脐静脉内皮等部位分离出的间充质样细胞，这些细胞具有分化成为脂肪、软骨、成骨等组织细胞的能力，是间充质干细胞家族的新生代表，具有组织来源原始、生物性能稳定、增值分化能力强、采集方式对供着无侵害、无免疫排斥等优点。将其应用到除皱术中有很大的潜力。

此外，皱纹与自由基的产生密切相关。自由基通过通过氧化损伤加速胶原蛋白纤维的断裂。原花青素是迄今为止所发现的最强效的自由基清除剂，其抗自由基氧化能力是维生素C的20倍，维生素E的50倍，尤其是其体内活性，更是其他抗氧化剂无法比拟的。

发明内容

本发明的目的在于提供一种脐带干细胞除皱剂及其制备方法，以解决上述背景技术中提出的问题。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种脐带干细胞除皱剂，包括以下成分：脐带干细胞、透明质酸、胶原蛋白和苹果原花青素。

优选的，一种脐带干细胞除皱剂的制备方法，包括以下步骤：

（一）脐带干细胞的分离培养

S1、以DMEM/F12为基础培养基，加入血小板裂解物、bFGF、L-谷氨酰胺，使血小板裂解物、bFGF、L-谷氨酰胺的终浓度分别为5%、50ng/ml、4mM/ml，4度避光保存备用；

S2、将脐带组织转移到无菌采集瓶中，以2-8摄氏度保存；

S3、将脐带从脐带采集瓶中取出，浸泡清洗，然后用手术刀切除双侧手术线结扎及淤血部分，然后用含有双抗（1%青霉素和1%链霉素）的生理盐水冲洗3遍，去除血污；

S4、将清洗干净的脐带置于大号培养皿中，均分成几部分，平均每部分约3-4cm，并对每一小部分沿纵向进行分离，使脐带组织管状变为片状，再将片状脐带组织进行进一步的分离，切割为2-3mm²；

S5、用吸管将组织植入T75培养瓶中，密度为20-25块/瓶，稍稍倾斜培养瓶去除吸取组织时带进去的生理盐水，并将组织块均匀地铺在培养瓶中，置37摄氏度、5%CO2的培养箱中培养， 30min后组织块将贴壁于培养面，轻柔地加入6-9ml含5%血小板裂解物的DMEM/F12培养基浸润组织块，一天后进行全量换液，以后每2-3天进行半量换液，第9天时刮除组织块；

S6、细胞继续培养至细胞融合度达80%-90%时，去除培养瓶中培养基，用生理盐水冲洗2次，加入0.25%EDTA-胰酶进行消化，待细胞变圆时加入等体积完全培养基终止消化，收集离心后，用适量完全培养基重悬，调整细胞密度为0.5×10⁵/ml进行传代。当P1代细胞融合度达到90%以上时，调整细胞密度为0.5×10⁵/ml进行传代，后续均按此标准进行传代培养。

（二）完成制备

将透明质酸、胶原蛋白、苹果原花青素溶于生理盐水，并利用0.2μm滤膜进行过滤；在过滤后的溶液中加入脐带干细胞，重悬脐带干细胞，制备得到脐带干细胞除皱剂。

优选的，所述步骤S1-S4需在12小时内完成。

优选的，所述脐带干细胞的密度为3×10⁷个/mL，且脐带干细胞为第三代至第五代的脐带干细胞。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明利用透明质酸和胶原蛋白支撑脐带干细胞在皮下生长，并联合苹果原花青素在体内强大的抗氧化、抗衰老作用，使面部皱纹明显淡化，皮肤更加光滑，比传统的A型肉毒杆菌毒素和透明质酸等除皱剂具有更好的除皱效果。本发明的除皱剂通过脐带干细胞、透明质酸、胶原蛋白、苹果原花青素的协同作用，具有更好的除皱效果，其中用3×10⁷个/mL的脐带干细胞，8mg/mL苹果原花青素的除皱剂配方效果最好。

附图说明

图1为本发明的P3代脐带干细胞图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

请参阅图1，本发明提供一种技术方案：一种脐带干细胞除皱剂，包括以下成分：脐带干细胞、透明质酸、胶原蛋白和苹果原花青素。

一种脐带干细胞除皱剂的制备方法，包括以下步骤：

（一）脐带干细胞的分离培养

S1、以DMEM/F12为基础培养基，加入血小板裂解物、bFGF、L-谷氨酰胺，使血小板裂解物、bFGF、L-谷氨酰胺的终浓度分别为5%、50ng/ml、4mM/ml，4度避光保存备用；

S2、将脐带组织转移到无菌采集瓶中，以2-8摄氏度保存；

S3、将脐带从脐带采集瓶中取出，浸泡清洗，然后用手术刀切除双侧手术线结扎及淤血部分，然后用含有双抗（1%青霉素和1%链霉素）的生理盐水冲洗3遍，去除血污；

S4、将清洗干净的脐带置于大号培养皿中，均分成几部分，平均每部分约3-4cm，并对每一小部分沿纵向进行分离，使脐带组织管状变为片状，再将片状脐带组织进行进一步的分离，切割为2-3mm²；

S5、用吸管将组织植入T75培养瓶中，密度为20-25块/瓶，稍稍倾斜培养瓶去除吸取组织时带进去的生理盐水，并将组织块均匀地铺在培养瓶中，置37摄氏度、5%CO2的培养箱中培养， 30min后组织块将贴壁于培养面，轻柔地加入6-9ml含5%血小板裂解物的DMEM/F12培养基浸润组织块，一天后进行全量换液，以后每2-3天进行半量换液，第9天时刮除组织块；

S6、细胞继续培养至细胞融合度达80%-90%时，去除培养瓶中培养基，用生理盐水冲洗2次，加入0.25% EDTA-胰酶进行消化，待细胞变圆时加入等体积完全培养基终止消化，收集离心后，用适量完全培养基重悬，调整细胞密度为0.5×10⁵/ml进行传代。当P1代细胞融合度达到90%以上时，调整细胞密度为0.5×10⁵/ml进行传代，后续均按此标准进行传代培养。

（二）完成制备

将透明质酸、胶原蛋白、苹果原花青素溶于生理盐水，并利用0.2μm滤膜进行过滤；在过滤后的溶液中加入脐带干细胞，重悬脐带干细胞，制备得到脐带干细胞除皱剂。

所述步骤S1-S4需在12小时内完成。

所述脐带干细胞的密度为3×10⁷个/mL，且脐带干细胞为第三代至第五代的脐带干细胞。

实施例1

试验设计脐带干细胞除皱剂与其他除皱剂的效果比较，本实施例中，脐带干细胞的密度为2×10⁷个/mL，透明质酸、胶原蛋白、苹果原花青素的浓度分别为3mg/mL、12mg/mL、6mg/mL。其中脐带干细胞为第三代至第五代的脐带干细胞。

将200名年龄为30-60岁的女性受试者分为4组，每组按50人，每组平均年龄为40.5±5.6，第一组使用本实施例的除皱剂，第二组使用A型肉毒杆菌毒素作为除皱剂，第三组用透明质酸为除皱剂，第四组用透明质酸和富含血小板的高浓度血浆为组分的除皱剂。对4组受试者的面部通过水光注射使用制剂5mL，连续观察60天，对受试者进行评定。评定方法为客观评定和主观评定。

客观评定方法：客观评定采用VISIA皮肤测试仪。VISIA皮肤测定仪运用多重光谱影像科技从红色区、斑点、棕色斑、紫外线色斑、毛孔、紫质、皱纹等7个能影响面容、皮肤健康的指标进行分析。我们的客观评价指标为受试者抗皱治疗前后纹理绝对分值。其中，治疗前绝对值-治疗后绝对值>0表示有效。

主观评定方法：术后对患者的皮肤改善情况按照以下标准进行评价：1分，面部皱纹无明显变化；2分，皱纹有少许减少、皮肤略有改善（1%-25%）；3分，皱纹有所淡化（26%-50%）；4分，面部皱纹淡化、皮肤光滑（51%-75%）；5分，面部皱纹明显淡化、皮肤光滑（76%-100%）。

然后，客观与主观评定的指标用spss软件进行统计学处理。

测试完成后，各组的测试结果如下：

客观评价治疗组0天和第60天纹理绝对值

	第一组	第二组	第三组	第四组
					治疗前	5.52±1.52	5.35±1.02	5.66±0.92	5.47±1.81
治疗后	3.38±1.68	3.88±0.98	3.95±1.05	3.61±0.72
					P 值	0.0031	0.0252	0.0208	0.0126

主观评价治疗组0天和第60天得分：

	第一组	第二组	第三组	第四组
					5分	13	7	8	8
4分	28	16	18	19
					3分	6	12	10	11
2分	2	10	9	8
					1分	1	5	5	4

上述试验，可以看出使用本实施例的除皱剂，皱纹淡化或明显淡化的人数较其他组多，因此，本实施例的除皱剂有明显好于其他除皱剂的效果。

实施例2

设计实验不同浓度脐带干细胞制备除皱剂的效果评价，

本实施例中，脐带干细胞的密度分别为2×10⁷个/mL、3×10⁷个/mL和4×10⁷个/mL，透明质酸、胶原蛋白、苹果原花青素的浓度分别为3mg/mL、12mg/mL、6mg/mL.。其中脐带干细胞为第三代至第五代的脐带干细胞。

将150名年龄为30-60岁的女性受试者分为4组，每组按50人，每组平均年龄为42.5±5.6，第一组使用除皱剂为：脐带干细胞的密度为2×10⁷个/mL，透明质酸、胶原蛋白、苹果原花青素的浓度分别为3mg/mL、12mg/mL、6mg/mL.；第二组使用除皱剂为：脐带干细胞的密度为3×10⁷个/mL，透明质酸、胶原蛋白、苹果原花青素的浓度分别为3mg/mL、12mg/mL、6mg/mL.；第三组使用除皱剂为：脐带干细胞的密度为4×10⁷个/mL，透明质酸、胶原蛋白、苹果原花青素的浓度分别为3mg/mL、12mg/mL、6mg/mL.对3组受试者的面部通过水光注射使用制剂5mL，连续观察60天，对受试者进行评定。

评定方法如实施例1所述。

测试完成后，各组的测试结果如下：

客观评价治疗组0天和第60天纹理绝对值

	第一组	第二组	第三组
				治疗前	5.43±1.22	5.55±1.38	5.73±0.89
治疗后	3.36±0.97	3.01±0.75	3.09±1.23
				P 值	0.0031	0.0012	0.003

主观评价治疗组0天和第60天得分：

	第一组	第二组	第三组
				5分	13	14	15
4分	26	29	28
				3分	8	4	4
2分	2	3	2
				1分	1	0	1

上述试验，可以看出使用含有3×10⁷个/mL脐带干细胞的除皱剂效果与4×10⁷个/mL的效果差不多，并且都明显好于含有2×10⁷个/mL的除皱剂，考虑到细胞制备的成本，所以选择含有3×10⁷个/mL脐带干细胞的除皱剂最好。

实施例3

设计实验不同浓度苹果原花青素制备的除皱剂的效果评价，本实施例中，脐带干细胞的密度为3×10⁷个/mL，透明质酸、胶原蛋白的浓度分别为3mg/mL、12mg/mL，苹果原花青素的浓度分别为6mg/mL.、8mg/mL.、10mg/mL.。其中脐带干细胞为第三代至第五代的脐带干细胞。

将150名年龄为30-60岁的女性受试者分为3组，每组按50人，每组平均年龄为44.1±4.7，第一组使用除皱剂为：脐带干细胞的密度分别为3×10⁷个/mL，透明质酸、胶原蛋白、苹果原花青素的浓度分别为3mg/mL、12mg/mL、6mg/mL.；第二组使用除皱剂为：脐带干细胞的密度分别为3×10⁷个/mL，透明质酸、胶原蛋白、苹果原花青素的浓度分别为3mg/mL、12mg/mL、8mg/mL.；第三组使用除皱剂为：脐带干细胞的密度分别为3×10⁷个/mL，透明质酸、胶原蛋白、苹果原花青素的浓度分别为3mg/mL、12mg/mL、10mg/mL.对3组受试者的面部通过水光注射使用制剂5mL，连续观察60天，对受试者进行评定。

评定方法如实施例1所述。

测试完成后，各组的测试结果如下：

客观评价治疗组0天和第60天纹理绝对值

	第一组	第二组	第三组
				治疗前	5.51±1.33	5.48±1.15	5.56±0.93
治疗后	3.09±1.03	2.68±0.92	3.12±1.43
				P 值	0.0027	0.0009	0.0019

主观评价治疗组0天和第60天得分：

	第一组	第二组	第三组
				5分	14	15	15
4分	29	31	28
				3分	3	2	4
2分	3	2	2
				1分	1	0	1

上述试验，可以看出使用含有8mg/mL苹果原花青素的除皱剂效果较其他两组好。

综上所述，本发明的除皱剂通过脐带干细胞、透明质酸、胶原蛋白、苹果原花青素的协同作用，具有更好的除皱效果，其中用3×10⁷个/mL的脐带干细胞，8mg/mL苹果原花青素的除皱剂配方效果最好。

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。

Claims (3)

1.一种脐带干细胞除皱剂，其特征在于，包括以下成分：脐带干细胞、透明质酸、胶原蛋白和苹果原花青素；

其中，所述脐带干细胞的密度为3×10⁷个/mL，且脐带干细胞为第三代至第五代的脐带干细胞；所述苹果原花青素的浓度为8mg/mL。

2.根据权利要求1所述的一种脐带干细胞除皱剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

（一）脐带干细胞的分离培养

S1、以DMEM/F12为基础培养基，加入血小板裂解物、bFGF、L-谷氨酰胺，使血小板裂解物、bFGF、L-谷氨酰胺的终浓度分别为5%、50ng/ml、4mM/ml，4度避光保存备用；

S2、将脐带组织转移到无菌采集瓶中，以2-8摄氏度保存；

S3、将脐带从脐带采集瓶中取出，浸泡清洗，然后用手术刀切除双侧手术线结扎及淤血部分，然后用含有双抗的生理盐水冲洗3遍，去除血污，其中，所述双抗具体为1%青霉素和1%链霉素；

S4、将清洗干净的脐带置于大号培养皿中，均分成几部分，平均每部分3-4cm，并对每一小部分沿纵向进行分离，使脐带组织管状变为片状，再将片状脐带组织进行进一步的分离，切割为2-3mm²；

S5、用吸管将组织植入T75培养瓶中，密度为20-25块/瓶，稍稍倾斜培养瓶去除吸取组织时带进去的生理盐水，并将组织块均匀地铺在培养瓶中，置37摄氏度、5%CO₂的培养箱中培养， 30min后组织块将贴壁于培养面，轻柔地加入6-9ml含5%血小板裂解物的DMEM/F12培养基浸润组织块，一天后进行全量换液，以后每2-3天进行半量换液，第9天时刮除组织块；

S6、细胞继续培养至细胞融合度达80%-90%时，去除培养瓶中培养基，用生理盐水冲洗2次，加入0.25%EDTA-胰酶进行消化，待细胞变圆时加入等体积完全培养基终止消化，收集离心后，用适量完全培养基重悬，调整细胞密度为0.5×10⁵/ml进行传代，当P1代细胞融合度达到90%以上时，调整细胞密度为0.5×10⁵/ml进行传代，后续均按此标准进行传代培养；

（二）完成制备

将透明质酸、胶原蛋白、苹果原花青素溶于生理盐水，并利用0.2μm滤膜进行过滤；在过滤后的溶液中加入脐带干细胞，重悬脐带干细胞，制备得到脐带干细胞除皱剂；

其中，所述脐带干细胞的密度为3×10⁷个/mL，且脐带干细胞为第三代至第五代的脐带干细胞；所述苹果原花青素的浓度为8mg/mL。

3.根据权利要求2所述的一种脐带干细胞除皱剂的制备方法，其特征在于：所述步骤S1-S4需在12小时内完成。

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