CN108030783A - 乐伐替尼在制备防治黄斑变性的药物中的用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及乐伐替尼在制备防治黄斑变性的药物中的用途，属于医药领域。本发明所要解决的是黄斑变性现有治疗药物疗效不佳、病人依从性差的问题，技术方案是提供了乐伐替尼在制备防治黄斑变性的药物中的用途。乐伐替尼是一种抗VEGFR，PDGFR和bFGFR多靶点小分子靶向抑制剂，现已获FDA批准上市用于肿瘤的治疗。本发明发现乐伐替尼具有潜在治疗黄斑变性的潜力，并通过建立体内外评价模型证实了乐伐替尼的这一用途，具有较大的临床和社会意义。

Description

乐伐替尼在制备防治黄斑变性的药物中的用途

技术领域

本发明涉及乐伐替尼在制备防治黄斑变性的药物中的用途，属于医药领域。

背景技术

年龄相关性黄斑变性(AMD)，发病年龄在45岁以上，年龄越大，发病率越高，双眼先后发病，为老年人视力障碍的主要眼病之一；分为萎缩型和渗出型两类。萎缩型(又称为“干性”或“非渗出型”)AMD，主要为脉络膜毛细血管萎缩、玻璃膜增厚和RPE萎缩等引起的黄斑区萎缩变性。临床分成两期：1、早期(萎缩前期preatrophic stage)；2、晚期(萎缩期atrophic stage)。渗出型(又称为“湿性”或“盘状”)AMD，主要为玻璃膜破坏、脉络膜血管侵入视网膜下构成的新生血管，发生黄斑区视网膜色素上皮下或/神经上皮下浆液性或/和出血性盘状脱离，从而引起一系列渗出、出血、瘢痕改变。临床上分三期：1、早期(盘状变性前期predisciform stage)；2、中期(突变期evolutionary stage)；3、晚期(修复期reparative stage)。全世界大约2500万-3000万人患此病。在西方国家，黄斑变性是造成50岁以上人群失明的主要原因，在美国黄斑变性导致的失明比青光眼、白内障和糖尿性视网膜病变这三种常见病致盲人数总和还要多。在中国，50岁以上人群中，每5个人就有1人出现黄斑部病变，它已经取代白内障，成老年人失明的第一诱因。据统计，中国60-69岁的老年人发病率为6.04％-11.19％。随着中国人口老龄化的加快，该病有明显的上升趋势。

目前，医学界对黄斑变性的病因尚不完全清楚，有各种发病机制假说如：氧化损伤学说、血管模式机制、遗传与基因学说和炎症免疫学说等。一般认为，老年性黄斑变性的病理机制主要为黄斑区结构的衰老性改变。表现为视网膜色素上皮细胞对视细胞外界盘膜吞噬消化功能下降，使未被消化的盘膜残余小体潴留于基底部细胞原浆中，并向细胞外排出，形成玻璃膜疣，继发病理改变后，导致黄斑变性发生。

黄斑病变具有不可逆性，治愈有很大的困难。现有的治疗只能改善病情，提高视力。在两型AMD中，湿性AMD因中心凹下脉络膜新生血管(CNV)渗漏出血、视网膜色素上皮脱离，进而发展为后极广泛瘢痕，使黄斑功能丧失功能而失明。故目前治疗均集中于CNV的抑制或消退。现有临床的治疗方法分手术和药物治疗两种。其中，手术主要包括光动力疗法、放射、经瞳孔湿热疗法、手术、光凝等；药物治疗主要有皮质类固醇类，抗氧化剂，干扰素等，然而这样药物均没有明确的临床疗效。

近年来，随着抗体和生物制药技术的发展，玻璃体内注射抗新生血管抗体和Trap(如雷珠单抗，贝伐单抗，阿伯西普和康博西普等)对治疗老年湿性黄斑变性具有一定的临床收益，但是由于该类药物需玻璃体内注射，给病人带来了较大治疗风险且病人依从性差。

发明内容

本发明的目的在于提供乐伐替尼在制备防治黄斑变性的药物中的用途，以解决现有药物疗效不佳、病人依从性差的问题。

本发明提供了乐伐替尼在制备防治黄斑变性的药物中的用途。

进一步地，所述的黄斑变性为湿性黄斑变性。

进一步地，所述的黄斑变性为年龄相关性黄斑变性。

本发明提供了乐伐替尼在制备抗眼底新生血管增生的药物中的用途。

进一步地，所述药物通过抑制脉络膜微血管内皮细胞增殖抗眼底新生血管增生。

进一步地，所述药物通过抑制脉络膜微血管内皮细胞成管状抗眼底新生血管增生。

进一步地，所述药物通过抑制脉络膜微血管内皮细胞迁移抗眼底新生血管增生。

进一步地，所述药物是以乐伐替尼为活性成分，加入药学上可接受的辅料或者辅助性成分制备而成的制剂。

进一步地，所述制剂为口服制剂。

进一步地，单位制剂含有乐伐替尼1.13mg。本发明所述单位制剂对应人体每kg体重每天的给药量。

实施例2中给予小鼠乐伐替尼的剂量为10mg/kg/只/天，换算成人用剂量即为1.13mg/kg/只/天。

本发明提供了乐伐替尼在制备防治黄斑变性的药物中的用途。乐伐替尼是一种抗VEGFR，PDGFR和bFGFR多靶点小分子靶向抑制剂，现已获FDA批准上市用于肿瘤的治疗。本发明发现乐伐替尼具有潜在治疗黄斑变性的潜力，并通过建立体内外评价模型证实了乐伐替尼的这一用途，具有较大的临床和社会意义。

附图说明

图1为实施例1中不同浓度乐伐替尼对20ng/ml VEGF165刺激的HCMECs细胞增殖抑制率图；

图2为实施例1中不同浓度乐伐替尼对30ng/ml bFGF刺激的HCMECs细胞增殖抑制率图；

图3为实施例1中HCMECs细胞形成管状结构图；

图4为实施例1中HCMECs细胞迁徙图；

图5为实施例2中眼底血管造影图；

图6为实施例2中眼底血管渗漏面积图；

图7为实施例2中眼球HE冰冻切片图；

图8为实施例3中乐伐替尼和地塞米松的分子离子峰质谱扫描图；

图9为实施例3中乐伐替尼在视网膜和血浆中的药代动力学分析图。

具体实施方式

本发明具体实施方式中使用的原料、设备均为已知产品，通过购买市售产品获得。

实施例1乐伐替尼抗眼底新生血管增生能力的体外细胞学实验

人脉络膜微血管内皮细胞HCMEC是研究和评价眼底新生血管增生的原代细胞模型，HCMEC的增殖，成管状和迁移能力是眼底新生血管增生的病理过程，以下从三个方面来证实乐伐替尼具有抗眼底新生血管增生的能力。

1、人脉络膜微血管内皮细胞HCMEC的培养

人脉络膜微血管内皮细胞HCMEC用含5％FBS，1％生长因子添加剂ECGS的ECM培养基培养，为了保证细胞处于形态和生理特性的最佳时期，仅使用1-7代以内的细胞用于实验；以上细胞系在培养和实验过程中均需要加入100U/mL的青霉素和链霉素，培养在环境条件为37℃-5％CO2的孵箱中。

2、CCK-8法检测乐伐替尼对人脉络膜微血管内皮细胞HCMEC增殖的影响

分别消化并收集指数生长期的HCMEC，铺96孔板(10000个/孔/100ul)，正常培养。

第二天细胞贴壁后，HCMEC弃去培养液，细胞用PBS洗2遍以去除原培养液中生长因子的干扰，加入100ul对应的双无培养液(无血清无添加剂)。配制生长因子-药物干扰液，因子终浓度为VEGF16520ng/ml，bFGF 30ng/ml，乐伐替尼倍变剂量终浓度梯度为100μM-0.390625.因子用含2％FBS的基础培养液配制，乐伐替尼先用100％DMSO配制成20mM的母液，再用对应的基础培养液稀释成工作液，因子和乐伐替尼各取100ul加入用96孔板对应孔中。在HCMEC细胞中，分别检测单独VEGF、bFGF刺激条件下乐伐替尼的作用效果。药物处理48小时后，用CCK-8法检测各实验组吸光系数OD480，用SPSS统计软件计算出抗新生血管药物对内皮细胞的IC50值。实验结果见图1、2。

从图1可以看出，乐伐替尼能抑制由20ng/ml VEGF165刺激的HCMECs细胞增殖，IC₅₀为0.797μM。

从图2可以看出，乐伐替尼能抑制由30ng/ml bFGF刺激的HCMECs细胞增殖，IC₅₀为0.646μM。

3、乐伐替尼对人脉络膜微血管内皮细胞HCMEC成血管状的影响

实验用试剂：无因子基质胶、无菌tip吸头一套、无菌移液管、移液器、移液枪、无菌BD管、细胞计数板、台盼蓝、ECM双无培养基、ECM完全培养基、FBS。

实验步骤：HCMEC细胞培养。1-8代内HCMEC细胞正常培养至90％汇合度，细胞形态正常且活力在90％以上；4℃预冷100μLtip头和48孔板，基质胶4℃融解后铺板。无因子基质胶头天从-20℃取出放4℃过夜融解，第二天瞬离去气泡(4℃)，用预冷的100μLtip头吸取200μL基质胶均匀加入预冷的48孔板中(要求：分布均匀，无气泡)，平放37℃孵箱1-2h,待基质胶凝固。HCEC细胞铺入96孔板胶床。胰酶消化并收集HCEC细胞，用ECM双无重悬洗涤一次，1000rpm/min离心3min后收集细胞用含5％FBS的ECM双无再次重悬计数，按每孔6X10⁴个/100μL量铺入48孔板胶床中(注意：不能将胶床冲坏)。加入VEGF165和bFGF配伍因子mix,100μL.终浓度为20ng/ml VEGF165,30ng/ml bFGF，ECM基础培养液配制。加入乐伐替尼。设2个浓度梯度，终浓度分别为1μM和0.1μM，100μL/孔，设副孔2个，100μL。倒置显微镜下观察拍照时间点：6h、8h、16h、24h、48h，照相(倒置显微镜100×)，计数24h管腔形成数并统计。实验结果见图3。

从图3可以看出，乐伐替尼能抑制HCMECs细胞形成管状结构(图3中黑色标尺为200μM，白色的标尺为100μM)。

4、乐伐替尼对人脉络膜微血管内皮细胞HCMEC迁移能力的影响

HCMEC的迁移能力通过划痕实验来检测。HCMEC,G4-6 2X105个/孔，6孔板铺板，完全ECM培养基，细胞长到80％汇合度时开始划痕、加药。划痕，200μL枪尖水平划痕，无菌操作，每个孔划3条水平线，保证直且划痕齐，划完后用PBS洗去脱落细胞并加入基础培养液2ml。倒置显微镜下拍照记录划痕初始宽度，10X10倍。加药作用。条件对照组为单独或联合VEGF15/bFGF因子对照，终浓度均为20ng/ml，实验组为(单独或联合VEGF15/bFGF，终浓度均为20ng/ml)+(乐伐替尼,终浓度为1μM和0.1μM)，每组设2个平行对照。观察24小时、48小时后划痕宽度变化并统计分析，倒置显微镜下拍照记录，10X10倍。实验结果见图4。

从图4可以看出，乐伐替尼能抑制HCMECs细胞迁徙(图4中黑色标尺为200μM)，0.1μM乐伐替尼能显著抑制HCMECs细胞迁徙。

实施例2乐伐替尼治疗黄斑变性的体内动物实验

基于通过高能量激光光凝视网膜，破坏Bruch膜，随后发生继发性损伤修复反应、炎症，脉络膜上皮细胞、周细胞、纤维细胞、炎症细胞等进入视网膜下间隙，形成脉络膜新生血管，即视网膜下新生血管这一原理，建立C57小鼠脉络膜新生血管模型(CNV)评价乐伐替尼在体内治疗湿性AMD的新用途。

仪器及参数：迈达532nm氩激光治疗仪设置参数：激光光斑直径50μm；曝光时间：100ms；激发能量：150mw。

(1)麻醉：1％戊巴比妥钠(含20％乙醇),按小鼠体重50mg/kg 1％戊巴比妥钠腹腔注射给药。

(2)实验准备：盖玻片，B超用耦合剂，倍诺喜(局麻药)，美多丽(散瞳)，红霉素眼膏。

(3)实验步骤及注意事项：

1)将裂隙灯调至垂直角度，校准裂隙灯与激光定位指示点，让激光指示红点处于裂隙灯光带正中，调整激光治疗仪三个参数。

2)腹腔注射麻醉小鼠，美多丽散瞳。注意保持小鼠角膜湿润，麻醉成功后，尽快激光造模，减少角膜暴露时间。

3)小鼠麻醉成功后，将盖玻片涂上黄豆大小耦合剂，暴露小鼠上下眼睑，使眼球向前突出，轻轻将盖玻片平压小鼠眼球，让盖玻片与角膜紧密贴合。

4)裂隙灯调至16-25倍目镜，可先调至16倍，聚焦清楚后再调至25倍，镜下找到视盘，观察血管走形和方向，在距视盘1.5-2PD(视盘直径)处激发激光光凝视网膜(3,6,9,12点方向四个点)，尽量保持四个点距离视盘距离相等，激光指示点的角度尽量与眼底垂直，聚焦清楚以后才能激发激光。镜下造模成功的标志：光凝点见中央见小泡形成。小鼠双眼造模，注意保护另外一只眼，防止角膜干燥，尽快缩短造模时间，动作轻柔。

5)双眼完成造模后，双眼涂红霉素眼膏，置于笼具内复苏，注意保暖，观察小鼠心跳、呼吸情况，防止窒息。特别注意保护双眼，防止角膜干燥。

(4)模型评估：

眼底血管造影术：造模后第14天，行眼底血管造影术，评估成模情况。麻醉小鼠后，腹腔注射4％荧光素钠(20g体重小鼠注射100ul)，在早(2min)、中(5min)、晚期(8min)采集眼底造影图像。挑选成模好、荧光素渗漏均匀的小鼠备用。

(5)应用CNV模型对抗新生血管药物进行评估

1)给药途径：口服给药，模型组为建模后给予同等剂量的溶剂灌胃，正常对照组小鼠不造模，给予同等剂量的溶剂灌胃。

2)给药时间：造模当天开始口服给药，乐伐替尼10mg/kg/只/天，连续给药14天。

3)评价指标：眼底血管造影、眼底血管渗漏面积FFA和眼球HE冰冻切片。

图5的眼底血管造影技术显示，口服10mg/kg乐伐替尼在小鼠体内对由激光光凝作用诱导的眼底新生血管生成有显著抑制作用，主要表现为眼底渗漏面积较模型组有显著减少。眼底光学相干断成像技术从眼底横断面观察到乐伐替尼对由激光光凝作用诱导的眼底新生血管生成有抑制作用，表现为横断面厚度比模型组薄。

从图6可以看出，造模14天后，口服给药乐伐替尼(10mg/kg/天)的治疗组小鼠眼底新生血管渗漏面积较模型组有显著减少(p<0.01)。

图7的组织学HE染色结果显示了造模14天后各实验组小鼠眼底视网膜各层的变化。其中，乐伐替尼治疗组视网膜色素上皮层较模型组有所改善，并趋向正常对照组厚度。

实施例3乐伐替尼在视网膜中药代动力特征

1.动物与仪器准备:

25只雌性SD大鼠，体重210克左右，7-8周龄，北京华埠康；UPLC/MS/MS：岛津UPLC-MS8050系统；TL2010S中通量组织研磨仪(北京鼎昊源科技有限公司)

2.试剂耗材准备：

灌胃针、乙醚棉球、泡沫盒、timer、采样登记表(打印)、实验方案(打印)、1.5mL EP管(exygen)、抗凝管、棉签、干棉球、一次性台布、无菌生理盐水、解剖手术器械、眼科显微器械、75％酒精及棉球、防护口罩手套帽子、冰盒、EP管架、BD管架、标记笔、平皿、滤纸、体视镜、插线板、研磨钢珠3mm规格24X5颗

3.分析方法:

LC/MS/MS方法，乐伐替尼的离子对为：m/z 427.00/369.95碰撞能量(CE):25V,427.00/409.90CE:17V,427.00/312.00CE:45V；地塞米松(内标)m/z393.1/355.2CE:11V,393.1/373.2CE:9V,393.1/237.1CE:18V。LC条件为：流动相A：0.025％FA和1mM NH4OAC在水：ACN＝95:5；流动相B：0.025％FA和1mM NH4OAC在水：ACN＝5:95；流速：0.4ml/min；梯度洗脱：0-0.5min：15％B；0.5-1.6min:15％B-55％B；1.6-1.8min:55％B-90％B；1.8-2.0min:90％B；2.0-3.0min:15％B.柱温：45℃。进样体积：1微升。

4.实验方法:

1)动物实验

实验动物一次性灌胃口服给药10mg/kg，在给药后：5min，15min，30min，1h，2h，4h，6h，9h，12，16，20，24h，28h，36h，48h乙醚麻醉大鼠后摘眼球取血(血浆>100微升)并收集双眼视网膜，最后对大鼠实施脱臼处死。预估T_1/2在0.5-4h之间，因此，设计在该时段密集采样取血方式：眼底静脉丛取血，收集血浆100微升。同时做drug-free control，即未做任何灌胃处理的大鼠按上述方式收集血浆和视网膜样品。麻醉采血，乙醚吸入性麻醉大鼠，行眼底静脉丛采血。首先，戴好口罩和厚手套，将准备采血的大鼠放入装有乙醚棉球的泡沫盒，盖好盒盖摇动盒子，加快乙醚扩散，大约3min时间。使用弯镊夹住眼球根部摘出眼球,肝素抗凝管收集血样，尽可能多采集血样，一般可采2-4mL血样。轻轻摇晃采血管，使肝素与血液接触抗凝，4℃静置自然分层≥30min；4℃，3000g转速离心15min，取上层血浆-80℃度保存，分三份：血浆体积50μL、200μL、>200μL。处死取眼。采血后的大鼠随即颈部脱臼处死，按上述方法摘出另一只眼球。视网膜剥离(显微解剖器械，体视镜下操作)。眼球尽量不清洗、双眼视网膜放1个1.5ml EP管，若眼球不小心沾上血或毛发，可快速用PBS冲洗，洗去表面的血和毛发，立刻放在滤纸上吸干，准备好眼球。体视镜下沿眼球的角巩膜缘剪开，依次剖出晶状体、玻璃体等内容物，此时看到的位于晶状体以下、色素上皮以上的一层接近透明样的组织即视网膜，此时小心完整的将其剥离，放入1.5mL EP管中，编号后4℃暂存，转至-80℃保存。(一只鼠的双眼视网膜放一个EP管)。样本暂存、尸体处理，在取样期间，样品都暂时4℃保存；大鼠尸体放到指定地点，清洁解剖室和解剖器械。

2)样品处理：

A、标准品

精确称取2mg、5mg乐伐替尼分别置于2个EP管中，

B、血浆样品：

-80℃取出50μL体积的样本用于LC/MS/MS分析。

C、视网膜样品：

取出-80℃的视网膜样本，向EP管中加入预冷生理盐水及钢珠，100微升/管，5颗3mm钢珠/管。(准备钢珠：中性清洗剂泡洗30min，自来水洗净后，用100％乙醇超声清洗30min，Up水清洗晾干后使用)。

视网膜匀浆：启动匀浆机，打开防护罩，将样品盖紧放入研磨罐中，锁紧研磨罐，注意放样时配平。此时合上防护罩，设定研磨参数如下：

Speed:2000rpm；Cycle:6；Run Time:10s；Pause Time:5s。启动匀浆，程序完成后自动停止，取出研磨罐时先开防护罩，再向上托起锁紧装置并瞬时针旋转90°，然后顺时针旋转锁紧把手HD卡具向外移动，取出研磨罐。

D、取50微升的血浆或者视网膜匀浆液如EP管中，加入50微升的水溶液、涡旋混匀，加入300微升内标ACN工作液，涡旋混匀1分钟，13000rpm离心15分钟，取上清200微升于进样瓶中进样。

3)样品分析

血浆基质标准样品建立标准曲线：200,100,50,25,10,5,2.5,1,0.5ng/ml；

质控样品：50,5,1ng/ml的乐伐替尼；

分析样品：视网膜样品与血浆样品；

乐伐替尼[M+H]+:427.00,[M+Na]+:449.10[M+H]+:393.10,[M+Na]+:415.10和地塞米松的分子离子峰质谱扫描图见图8。乐伐替尼在视网膜和血浆中的药代动力学分析见图9；其中，A为乐伐替尼(T＝1.418min，保留时间)和内标地塞米松(T＝2.102min,保留时间)在UHPLC-ESI-MS/MS系统中的保留时间；B为质谱多反应监测下(MRM)乐伐替尼(m/z427.00/369.95,427.00/409.90,427.00/312.00)的阳离子图谱；C为质谱多反应监测下(MRM)内标地塞米松(93.1/355.2,393.1/373.2,393.1/237.1)的阳离子图谱；D为乐伐替尼在血浆中的药时曲线；E为乐伐替尼在视网膜中的药时曲线。

D、实验结论

表1乐伐替尼在血浆和视网膜中的药代动力学参数(口服单次给药10mg/kg)

注：AUC,药物浓度时间曲线下面积；Cmax,最大药物浓度；T1/2,半衰期；Tmax,最大浓度时间；MRT,平均滞留时间。

实验结果显示，乐伐替尼能透过血脑屏障，进入视网膜，且在视网膜中的药代动力学特征与血浆中类似，乐伐替尼在血浆中的半衰期为3.75±0.64小时；在视网膜中的半衰期为3.81±0.77小时。在血浆中的最大药物浓度为5630.28±964.52ng/ml；在视网膜中为10887.41±1742.21ng/g。

Claims (10)

1.乐伐替尼在制备防治黄斑变性的药物中的用途。

2.如权利要求1所述的用途，其特征是：所述的黄斑变性为湿性黄斑变性。

3.如权利要求1所述的用途，其特征是：所述的黄斑变性为年龄相关性黄斑变性。

4.乐伐替尼在制备抗眼底新生血管增生的药物中的用途。

5.如权利要求4所述的用途，其特征是：所述药物通过抑制脉络膜微血管内皮细胞增殖抗眼底新生血管增生。

6.如权利要求4所述的用途，其特征是：所述药物通过抑制脉络膜微血管内皮细胞成管状抗眼底新生血管增生。

7.如权利要求4所述的用途，其特征是：所述药物通过抑制脉络膜微血管内皮细胞迁移抗眼底新生血管增生。

8.如权利要求1～7任意一项所述的用途，其特征是：所述药物是以乐伐替尼为活性成分，加入药学上可接受的辅料或者辅助性成分制备而成的制剂。

9.如权利要求8所述的用途，其特征是：所述制剂为口服制剂。

10.如权利要求9所述的用途，其特征是：单位制剂含有乐伐替尼1.13mg。