CN102924573B - 一种肌动蛋白结合肽及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物医药领域，具体公开了一种肌动蛋白结合肽及其用途。本发明所述肌动蛋白结合肽氨基酸序列为LKKTETQ，合成难度及成本降低，适合进行大规模批次生产，对于多种角膜损伤均具有优越的修复作用，在用药过程中未见不良反应发生而促进角膜创口愈合及透明度恢复，较胸腺肽β4治疗优越性高，副作用小，可用于角膜修复治疗。

Description

一种肌动蛋白结合肽及其用途

技术领域

本发明涉及医药领域，特别涉及一种肌动蛋白结合肽及其用途。

背景技术

角膜是人体神经分布最密集的部位，主要分布于角膜基质前1P3的上皮下和上皮内。眼角膜既有体内一般上皮和纤维组织的共性，又有透明、无血管及感觉神经丰富的特性，角膜损伤后的自然愈合相对迟缓。角膜表面损伤的机会较多，其不适症状明显，致感染机会增加，促进角膜浅表伤口愈合的研究具有非常重要的意义。

角膜损伤后主要经历细胞凋亡、增殖、移行和分化，细胞外基质（ECM）分解、合成和沉积以及炎症浸润、新生血管形成等复杂的生物学过程，因此需要增加细胞与细胞之间以及细胞与基质之间的接触，从而促进结膜上皮细胞迁移，使角膜的清晰度升高。

角膜组织作为最重要的屈光间质，由于其结构和功能的特殊性，损伤后常严重影响视功能，治疗角膜损伤必须恢复其结构的完整性并减少炎症的破坏作用。治疗方法主要是抗感染、改善局部微环境以及应用促上皮生长的细胞因子（如rh-EGF滴眼液），或者进行结膜角膜移植术。但目前常用药物的治疗效果还不显著。有研究表明胸腺肽β4（Tβ4）在促进角膜上皮细胞增生、迁移、抗炎、抗凋亡和新生血管的调节方面有重要作用。

Tβ4是由43个氨基酸组成的多肽，相对分子质量约为4900，普遍存在于机体各种组织细胞中，是细胞迁移和分化的重要介质，可促进心肌细胞的迁移、生存和修复，加速皮肤胶原沉积、促进血管生长和伤口愈合、抑制炎症以及调控肿瘤转移。其序列中目前已鉴定出三个功能区域，分别为第1-4、1-15和17-23位氨基酸。17-23位氨基酸片段（序列为LKKTETQ）是与肌动蛋白结合的核心功能区，在球形肌动蛋白（G-actin）的参与下，通过LKKTETQ的介导，使5-15和30-40位的氨基酸残基形成N、C末端的螺旋折叠，分别与肌动蛋白的1、3亚基和2、4亚基结合，共同调节肌动蛋白的聚合和解聚。

大量体内和体外实验证明，Tβ4具有多功能性，在创伤修复、角膜损伤修复、心脏修复、中枢神经系统修复、组织保护、皮肤再生过程中起到重要作用。胸腺肽β4在多种眼外伤模型的治疗中均显示出促进角膜烧伤后创面愈合的作用，并调节一些关键细胞因子的产生。在兔角膜碱烧伤后，使用Tβ4能增加角膜愈合率，但不引起血管生长。Tβ4的局部和静脉注射使用均是安全的。但目前临床研究应用的Tβ4为化学合成产品，技术难度与成本很高，不适合进行大规模批次生产，且治疗效果不理想。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种治疗角膜损伤效果更佳的肌动蛋白结合肽，其氨基酸序列为LKKTETQ。

本发明的另一个目的是提供所述肌动蛋白结合肽在制备治疗角膜损伤的药物中的用途。

本发明还提供治疗角膜损伤的药物制剂，由氨基酸序列为LKKTETQ的肌动蛋白结合肽与药学上可接受的赋形剂或载体组成。

作为优选，所述肌动蛋白结合肽占药物制剂的重量百分比为0.001-1%。

更优选的，所述肌动蛋白结合肽占药物制剂的重量百分比为0.01-0.1%。

本发明所述含有氨基酸序列为LKKTETQ的肌动蛋白结合肽的药物制剂，其为溶液、凝胶、乳膏、糊剂、洗剂、喷剂、悬浮液、分散剂形式。

本发明所述药物制剂的给药方式包括：局部给药或全身给药。局部给药包括将含有LKKTETQ的溶液、凝胶、乳膏、糊剂、洗剂、喷剂、悬浮液、分散剂等与眼睛接触。全身给药包括静脉内、腹膜内或肌内注射包含LKKTETQ的药物组合物。优选局部给药。

经多种试验发现，本发明所述肌动蛋白结合肽LKKTETQ对于多种角膜损伤均具有优越的修复作用，在用药过程中未见不良反应发生而促进角膜创口愈合及透明度恢复。且较胸腺肽β4序列较短，合成难度及成本大大降低，更适合进行大规模批次生产，可成功应用于角膜修复治疗，对于多种角膜损伤均具有优越的修复作用，在用药过程中未见不良反应发生而促进角膜创口愈合及透明度恢复，较胸腺肽β4治疗优越性高，副作用小，具有极为广阔的应用前景。

具体实施方式

本发明公开了一种肌动蛋白结合肽及其用途，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的产品及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

为了使本领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细说明。

实施例1、本发明所述多肽LKKTETQ滴眼液的制备

以水为溶剂，氯化钠和氯化钾为渗透压调节剂，氯化钙和氯化镁为电解质，氢氧化钠为pH调节剂，通过含醋酸钠和柠檬酸钠的缓冲液，制备含主药LKKTETQ的滴眼液。

称取6.4g氯化钠、0.75g氯化钾、0.48g氯化钙、0.3g氯化镁、3.9g醋酸钠、1.7g柠檬酸钠置于容器中，加入约900ml无菌注射用水，搅拌使溶解；然后加入0.02g肌动蛋白结合肽（LKKTETQ肽）搅拌混匀，使用0.1mol／L氢氧化钠溶液调pH至7.0，最后加入无菌注射用水至1000ml。溶液通过无菌膜过滤，使用无菌聚丙烯瓶灌装得1ml:0.02mg规格的药液。

实施例2、LKKTETQ对板层切除后大鼠角膜上皮及基质难愈性损伤的修复试验

清洁级SD大鼠，8-9周龄，雄性。

制作大鼠半层角膜切除模型：1.5%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉大鼠，选择右眼为手术眼，手术刀完整削除角膜上皮及约1/2深度角膜基质层。

将8只板层切除模型大鼠随机分为2组，每组4只，分别使用LKKTETQ滴眼液（规格：1ml:0.02mg）及重组人表皮细胞生长因子眼药水（商品名：易贝，桂林华诺威基因药业有限公司生产，5ml/瓶），1滴/次（约相当于0.03ml），每天于8:00、13:00、19:00给药3次。手术中术眼角膜穿孔，或在观察过程中观察眼出现角膜溃疡或穿孔等感染性表现时，应排除该观察对象，补充新的观察对象。

术后每日早8:00及晚19:00在裂隙灯下观察角膜混浊情况；术后约每12h对观察眼进行角膜荧光素染色，裂隙灯显微镜下蓝钴光观察角膜着染，以评估上皮及基质再生情况。共观察5天。

本实验通过大鼠角膜板层切除观察“LKKTETQ滴眼液”及其对照药对角膜创伤愈合的影响，结果显示LKKTETQ滴眼液组远期角膜愈合后清亮，易贝组早期清亮，远期较LKKTETQ滴眼液组差，其中有1只大鼠术后3天观察到角膜6点处长入角膜新生血管一支；术后36-48h，LKKTETQ滴眼液组的角膜着染率约降至0，角膜上皮损伤得以愈合，而易贝组在术后48-60h角膜着染率约降至0。

结果表明，该试验条件下，LKKTETQ滴眼液具有促进大鼠角膜上皮修复、减轻炎症反应的作用，其作用优于重组人表皮细胞生长因子眼药水。

实施例3、LKKTETQ对兔眼角膜修复作用的研究

白色健康家兔20只，雌雄各半，体重2±0.1kg/只，实验期间均单笼饲养。

用角膜表皮刮磨方法人工造成兔眼角膜创伤直径为10mm的圆形创面，该创面在荧光素钠溶液检查时，呈黄绿色荧光。

将动物随机分成5组，每组4只，雌雄各半。同一组动物用同一浓度LKKTETQ治疗，实验性的连续治疗在创面形成后l h开始。所有动物的右眼作对照，每日2次，每次l滴生理盐水；左眼作修复治疗，每日2次，每次1滴LKKTETQ溶液，直至眼角膜创面完全愈合为止。

每日测3次眼角膜创伤面积的变化，均匀量取大小不一的5个创面直径值，取平均值计算角膜创伤面积。

试验发现，5个浓度LKKTETQ(100、50、20、10和5μg／ml)治疗的试验组痊愈时间均比对照组提前，有非常显著的差异（P<0.01），但在这5个浓度组之间，痊愈时间无显著性差异。结果表明，LKKTETQ对兔眼角膜损伤具有促修复作用。

实施例4、LKKTETQ和胸腺肽β4促进兔角膜碱烧伤后修复的对照试验

健康新西兰白兔20只，体重1.5~2.0kg，雌雄兼有。实验前用裂隙灯显微镜检查眼前段无病变。

角膜碱烧伤模型的制作：氯胺酮（50mg／kg）和异丙嗪（25mg/kg）混合行肌肉注射麻醉，用1%丁卡因表麻，开睑器开睑暴露角膜，取直径为8mm的单层定量滤纸，浸入1mol／L的NaOH溶液中10s，将其贴于角膜中央60s，即用60ml生理盐水冲洗眼表及结膜囊。

20只白兔随机平均分为两组，将每只兔的左右眼随机计为试验眼和对照眼，试验眼使用LKKTETQ溶液（1ml:0.02mg，试验组1）或胸腺肽β4溶液（1ml:0.02mg，试验组2）治疗，对照眼则滴生理盐水（对照组），1滴/次，3次/天。各组同时滴用托百士眼水，4次/天，每晚涂托百士眼药膏1次。

分别于碱烧伤后的1、3、5、7、9、14天第一次滴眼时用裂隙灯显微镜观察眼前段的大体情况。分别于碱烧伤后的0、1、3、5、7、9、14天对各兔眼行荧光染色，用数码相机拍摄角膜着色的情况，测定角膜表面荧光染色的面积，计算角膜上皮愈合率（愈合率=(0天着色面积-观察时着色面积)/0天着色面积×100%）。

实验观察发现，试验组的球结膜充血在治疗后第一天起比对照组轻，角膜的透明性在第3天起比对照组明显提高；两试验组之间无明显肉眼可见的差异。试验组眼角膜荧光染色约在第5天起大部分转阴，试验组1的该效应较试验组2更为明显，而对照组仍存在明显的角膜荧光着色。

各组在各时间点的角膜平均愈合率情况：

可见，该实验条件下，自给药后的第二天起试验组的角膜上皮较对照组明显得以改善，以后差异的显著性逐渐增加，碱烧伤后的14天所有家兔的治疗眼基本恢复正常，LKKTETQ治疗组较胸腺肽β4治疗组的角膜修复作用更为明显，其差异具有统计学意义。

实施例5、LKKTETQ对准分子激光治疗性角膜切削术后角膜修复的作用

准分子激光治疗性角膜切削术（PTK）是治疗角膜浅层病变的一种新方法，以其切削的准确性、治疗的有效性被眼科界所接受。但PTK在治疗过程中对角膜造成一定的损伤，术后治疗的关键是促进角膜愈合及功能恢复。

健康新西兰白兔14只（中央角膜厚度380~400μm），无眼疾，雌雄兼用，体重2.25~2.50kg。

兔角膜浅层瘢痕的制作：氯胺酮（50mg·kg^-1)、氯丙嗪（10mg·kg^-1）和阿托品（0.04mg·kg^-1）混合药液肌肉注射麻醉实验兔。将兔侧放于手术台上，术眼向上，取直径8mm的8.17%硫酸浸湿滤纸盘，在手术显微镜下贴附于兔角膜中央5s，移去滤纸，立即用生理盐水冲洗结膜囊5min；术毕涂红霉素眼膏。

模型制作后2周，行PTK治疗。治疗参数：能量密度160~180J·cm^-2，脉冲能量每次脉冲0.25μm，切削频率10Hz，切削直径8.0mm，切削深度100μm，连续激光脉冲切削。

术后即刻由专人进行结膜囊分组滴药，右眼为实验组，滴用LKKTETQ滴眼液（1ml:0.02mg）；左眼为对照组，滴用人工泪液（1g·L^-1羟甲基纤维素）；每天6次，每次1滴。双眼被动闭合10s，常规用药相同。

每日观察眼前段情况，滴10g·L^-1荧光素钠染色后，裂隙灯检查角膜上皮，直至其完全愈合。于1周、2周、3周、4周、8周分别随机抽取典型实验兔5只，测定角膜透明度并记录。

两组均于术后3~7天角膜上皮全部愈合，差异无统计学意义（P>0.05）。术后8周，实验组角膜上皮细胞形态逐渐接近正常，角膜上皮细胞恢复5~6层，对照组仍可见角膜浅基质纤维排列紊乱。

综上，我们经多种试验发现LKKTETQ对于多种角膜损伤均具有优越的修复作用，在用药过程中未见不良反应发生而促进角膜创口愈合及透明度恢复。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (5)

1.氨基酸序列为LKKTETQ的肌动蛋白结合肽在制备治疗角膜损伤的药物中的用途。

2.治疗角膜损伤的药物制剂，由氨基酸序列为LKKTETQ的肌动蛋白结合肽与药学上可接受的赋形剂或载体组成。

3.根据权利要求2所述的药物制剂，其特征在于，所述肌动蛋白结合肽占药物制剂的重量百分比为0.001-1%。

4.根据权利要求3所述的药物制剂，其特征在于，所述肌动蛋白结合肽占药物制剂的重量百分比为0.01-0.1%。

5.根据权利要求2-4任一项所述的药物制剂，其特征在于，其为溶液、凝胶、乳膏、糊剂、洗剂、喷剂、悬浮液、分散剂形式。