CN114425033A - 一种含有间充质干细胞外泌体的眼用凝胶及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种含有间充质干细胞外泌体的眼用凝胶,由如下质量浓度的原料组成:间充质干细胞外泌体0.3‑5g/L,透明质酸钠1.2‑2.5g/L,牛磺酸1‑2g/L,卡波姆940 2g/L,采用等渗调节剂调节渗透压至280‑350mOsm/L;PH调节剂调节PH值至6‑7.5,溶剂为生理盐水。该药物不同于传统的滴眼液剂型,该新剂型药物比滴眼液在眼部作用时间长,经泪道排出少药物利用率高,相比滴眼液剂型,可以降低外泌体的用量而达到同样或者更优的使用效果,使用方便,患者用药依从性高。
Description
技术领域
本发明属于生物医药技术领域,具体涉及一种以透明质酸钠为基质的含有间充质干细胞外泌体的眼用凝胶。
背景技术
眼表是一种眼部特殊的组织结构,包括从上下眼睑皮肤和黏膜移行处到上下睑、球结膜返折处再到角巩膜缘和角膜的所有组织。多种原因可以导致眼表疾病的发生发展,如感染、眼表免疫因素、泪膜不稳定、化学烧伤、手术、角膜缘干细胞缺乏等。眼表疾病患者常常因为眼部不适感、疼痛、视力下降而影响生活质量。由于现代人的生活方式,干眼等眼表疾病患病率逐年上升。临床一些眼表疾病治疗相对棘手迁延,如干眼、持续性角膜上皮缺损、无菌性角膜溃疡、眼表烧伤、复发性角膜侵蚀、眼部移植物抗宿主病和角膜缘干细胞缺乏症等,这些疾病需要更多的新治疗方法及药物。由于电子产品的普及以及生活方式改变、环境污染、干眼等眼表疾病的患病率逐年上升,且呈现明显年轻化的趋势。。
眼表疾病常涉及到眼表组织的损伤及眼表炎症的过度激活,因此促进受损组织的再生和抑制过度炎症反应成为治疗这类疾病的关键机制。市售的治疗药物作用相对单一,且每日多次用药容易造成患者依从性下降,因此有必要开发一种使用简便、具有促进组织修复和炎症调控作用的药物。
间充质干细胞来源的外泌体(MSC-EV)是间充质干细胞分泌出的细胞外囊泡,不具有细胞结构,外膜由脂质双分子层构成,含有许多蛋白质、mRNA等生物活性物质,MSC-EV有可能通过这些具有生物活性的内容物发挥其治疗作用。研究发现,外泌体在间充质干细胞发挥免疫调节、组织修复中具有重要作用。分离提纯出来的外泌体同样具有免疫调节、组织修复等治疗作用。而且外泌体没有细胞结构,不会像干细胞一样增殖分化,在体内应用的安全性大大优于间充质干细胞的细胞疗法。同时MSC-EV比干细胞方便保存运输,因此外泌体治疗将是一项具有前景的生物疗法。
现有外泌体相关专利全部为滴眼液剂型。滴眼液剂型为眼部药物的常见剂型,但是也有很多缺点:滴眼后在眼表的停留时间短,药物作用时间和吸收率相对较差,使用时药物容易从泪道流出,停留在眼表的药物减少,因此造成造成珍贵的外泌体的浪费。外泌体滴眼液需要储存在4度冰箱内,滴眼液需要白天多次给药,许多患者因工作等原因不便使用,依从性较差。所以使用滴眼液制剂有诸多不便,甚至会造成治疗效果不理想。基于上述原因,本发明旨在开发一种新型干细胞眼用制剂——眼用凝胶来达到药物缓释、作用时间久、经鼻泪管排出少、患者使用方便以及经济实用的功能。
发明内容
为解决上述问题,本发明公开了一种以透明质酸钠为基质的含有间充质干细胞外泌体的眼用凝胶。
为达到上述目的,本发明的技术方案如下:
本发明将提供一种以透明质酸钠为基质的含有间充质干细胞外泌体的眼用凝胶。具体技术方案如下:
一种含有间充质干细胞外泌体的眼用凝胶,由如下质量浓度的原料组成:
间充质干细胞外泌体0.3-5g/L,透明质酸钠1.2-2.5g/L,牛磺酸1-2g/L,卡波姆940 2g/L,采用等渗调节剂调节渗透压至280-350mOsm/L;PH调节剂调节PH值至6-7.5,溶剂为生理盐水。
进一步地,所述的外泌体为从人脐带间充质干细胞中提取。
进一步地,PH调节剂为HCl和NaOH。
进一步地,等渗调节剂为NaCl。
一种所述的含有间充质干细胞外泌体的眼用凝胶的制备方法,包括如下步骤:
第一步,细胞培养收集培养液:选择3-7代的脐带间充质干细胞,将细胞培养至70%融合后,换为不含血清的纯培养基培养48小时,收集不含血清的纯培养基,进行梯度离心法获得外泌体;
第二步,使用超速离心法进行外泌体提取:取收集的细胞上清液为4℃,300g,5min离心,取上清继续4℃,3000g,15min离心,接着取上清4℃,10000g,60min离心,取上清通过22μm滤器过滤,过滤后液体4℃,100000g,70min离心,沉淀即为外泌体,用PBS悬浮沉淀,再次4℃,100000g,70min离心,PBS悬浮沉淀,获得外泌体溶液,-80℃长期保存,用于后续眼用凝胶制备;
第三步,外泌体鉴定:使用透射电镜观察外泌体形态,NTA检测外泌体粒径;
第四步,配置器具的准备:配置时使用的烧杯、玻璃棒、转子等使用灭菌锅灭菌,配置均在超净台内进行,使用前超净台紫外线灭菌30min;
第五步,辅料配置:用生理盐水溶解透明质酸钠,用生理盐水溶解牛磺酸和卡波姆940,将透明质酸钠溶液加入牛磺酸和卡波姆940溶液中,边加边搅拌,最后加入生理盐水配至50ml体系,测量PH,使用PH调节剂将PH调至6-7.5,100℃水浴灭菌,不停搅拌,加热到样品80℃,取出冷却;
第六步,眼用凝胶配置:在超净台内,将经第五步处理的溶液和含有外泌体的溶液混合,得到含有外泌体的眼用凝胶,将眼用凝胶每2ml分装,4℃保存。
本发明的有益效果为:本发明为膏状眼用凝胶,相比现有的滴眼液剂型,本眼用凝胶可以有效降低外泌体在产品中的浓度,达到与相对浓度较高的外泌体滴眼液相同甚至更优的治疗效果。本品每日使用次数少,用药一次能在眼部停留更长时间,一日使用1-2次即可达到治疗效果。由于间充质干细胞外泌体是生物制品,含有外泌体的产品需要保存在4℃冰箱内,相比于一日点眼多次的滴眼液,本发明更适合工作人群使用,间充质干细胞外泌体因细胞培养、外泌体提取工序较多,因此药物十分珍贵,膏状眼用凝胶比滴眼液浪费少,产品更加经济实惠,可减轻患者经济负担。
本发明以透明质酸钠为药物基质,透明质酸钠是一种眼科常用药物,其本身对干眼症有一定的治疗效果。目前市面上治疗干眼的人工泪液大多为透明质酸钠溶液。透明质酸钠为人体天然成分,易于吸收,无毒无刺激性具有良好的生物相容性。且其为高分子黏多糖,具有网状结构,外泌体可以进入其形成的网格内,给药后可以提高外泌体在眼部的作用时间,具有缓释的作用。由于透明质酸钠为治疗眼表疾病的主流药物,与外泌体一起给药,两者具有协同作用,两者针对眼表疾病的不同发病机制同时起作用,达到1+1>2的效果。
眼用凝胶,该药物不同于传统的滴眼液剂型,该新剂型药物比滴眼液在眼部作用时间长,经泪道排出少药物利用率高,相比滴眼液剂型,可以降低外泌体的用量而达到同样或者更优的使用效果,使用方便,患者用药依从性高。
本发明中的膏状眼用凝胶中不含苯扎溴铵等防腐剂,对眼表组织无损伤作用,有利治疗。
附图说明
图1、为本发明制备的外泌体眼膏微观结构示意图。
图2、为本发明在细胞实验中明外泌体修复角膜上皮细胞效果图,证明外泌体可以促进受损的角膜上皮细胞修复。
图3、为使用本发明治疗干眼小鼠的治疗效果图。相对浓度低的本发明表现了比相对浓度更高的滴眼液剂型更好的治疗效果。
图4、为使用本发明治疗干眼小鼠的治疗效果图。治疗后小鼠眼表炎症明显下降。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施方式,进一步阐明本发明,应理解下述具体实施方式仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
实施例1
一种含有间充质干细胞外泌体的眼用凝胶,由如下质量浓度的原料组成:
间充质干细胞外泌体0.3g/L,透明质酸钠2g/L,牛磺酸1g/L,卡波姆940 2g/L,等渗调节剂Nacl调节渗透压至280-350mOsm/L;PH调节剂NaOH调节PH值至6-7.5,溶剂为生理盐水。
进一步地,所述的外泌体为从人脐带间充质干细胞中提取。
进一步地,PH调节剂为NaOH。
进一步地,等渗调节剂为NaCl。
一种所述的含有间充质干细胞外泌体的眼用凝胶的制备方法,包括如下步骤:
第一步,细胞培养收集培养液:选择3-7代的脐带间充质干细胞,将细胞培养至70%融合后,换为不含血清的纯培养基培养48小时,收集不含血清的纯培养基,进行梯度离心法获得外泌体;
第二步,使用超速离心法进行外泌体提取:取收集的细胞上清液为4℃,300g,5min离心,取上清继续4℃,3000g,15min离心,接着取上清4℃,10000g,60min离心,取上清通过22μm滤器过滤,过滤后液体4℃,100000g,70min离心,沉淀即为外泌体,用PBS悬浮沉淀,再次4℃,100000g,70min离心,PBS悬浮沉淀,获得外泌体溶液,-80℃长期保存,用于后续眼用凝胶制备;
第三步,外泌体鉴定:使用透射电镜观察外泌体形态,NTA检测外泌体粒径;
第四步,配置器具的准备:配置时使用的烧杯、玻璃棒、转子等使用灭菌锅灭菌,配置均在超净台内进行,使用前超净台紫外线灭菌30min;
第五步,5. 辅料配置:用30ml生理盐水溶解透明质酸钠0.2g,10ml生理盐水溶解牛磺酸0.1g,卡波姆940 0.2g,将透明质酸钠溶液加入另一溶液中,边加边搅拌,最后加入生理盐水配至50ml体系,测量PH,使用PH调节剂将PH调至6-7.5,100℃水浴灭菌,不停搅拌,加热到样品80℃,取出冷却;
第六步,眼用凝胶配置:在超净台内,将50ml上述溶液和50ml含有100g外泌体的溶液混合,得到100ml含有100g外泌体的眼用凝胶。将凝胶每2ml分装,4℃保存。
实施例2
一种含有间充质干细胞外泌体的眼用凝胶的制备方法同实施例1,区别在于:
所述的眼用凝胶由如下质量浓度的原料组成:间充质干细胞外泌体0.5g/L,透明质酸钠1.3g/L,牛磺酸1g/L,卡波姆940 2g/L,溶剂为生理盐水,等渗调节剂Nacl调节渗透压至280-350mOsm/L;PH调节剂NaOH调节PH值至6-7.5。
实施例3
一种含有间充质干细胞外泌体的眼用凝胶的制备方法同实施例1,区别在于:
间充质干细胞外泌体1g/L,透明质酸钠2.5g/L。
实施例4
一种含有间充质干细胞外泌体的眼用凝胶及所述眼用凝胶的制备方法同实施例1,区别在于:
间充质干细胞外泌体5g/L,透明质酸钠1.2g/L。
实施例5
一种含有间充质干细胞外泌体的眼用凝胶的制备方法同实施例1,区别在于:
间充质干细胞外泌体2g/L,牛磺酸1.5g/L。
实施例6
为了验证实施例1的实际治疗效果,利用体外培养的角膜上皮细胞和小鼠的干眼模型对其进行验证:
培养角膜上皮细胞,待细胞长至80%密度时,换无血清纯培养基饥饿培养24小时,换70mmol/L NaCl的高渗培养基,体外模拟干眼中角膜上皮细胞的高渗环境。治疗组加入0.3mg/ml外泌体。3小时后收取细胞提取RNA,用RT-PCR法测定细胞中炎症因子表达。12小时后用CCK8法测定细胞活力。
C57BL6小鼠皮下注射0.5mg/0.2ml东莨菪碱溶液,每日四次,持续两周,造成小鼠干眼模型,干眼导致小鼠角膜上皮损伤,荧光素钠染色评分增高。造模开始7天后不同组小鼠眼部使用不同药物:干眼组小鼠不使用药物;玻璃酸钠治疗组小鼠使用市售0.1%玻璃酸钠滴眼液每日滴眼两次,每次2μl;外泌体滴眼液组小鼠使用1mg/ml外泌体溶于PBS的溶液,每日滴眼两次,每次2μl;眼用凝胶组使用本品,外泌体浓度0.3mg/ml,每日两次,每次2μl。
造模14天后处死小鼠,取小鼠结膜、角膜组织提取RNA,QPCR法测定组织炎症因子表达水平。
结果显示,本发明中的眼用凝胶对干眼具有较好治疗作用:在体外,用高渗透压的培养基培养角膜上皮细胞,模拟干眼发病时角膜上皮细胞所处的高渗环境,再加入外泌体治疗,观察外泌体对角膜上皮细胞的治疗作用,用CCK8法测定角膜上皮细胞活力,外泌体治疗组表现出了更好的细胞活力(图2);角膜荧光素钠评分代表了干眼导致角膜受损情况,荧光素钠评分越高,角膜损伤越严重。在小鼠干眼模型中外泌体可以促进破损的角膜上皮愈合(图3);炎症因子表达代表了组织的炎症水平,本发明可以抑制小鼠眼表的炎症反应(图4);结果显示使用外泌体凝胶后角膜、结膜炎症水平明显下降。
需要说明的是,以上内容仅仅说明了本发明的技术思想,不能以此限定本发明的保护范围,对于本技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明原理的前提下,还可以做出若干改进和润饰,这些改进和润饰均落入本发明权利要求书的保护范围之内。
Claims (5)
1.一种含有间充质干细胞外泌体的眼用凝胶,其特征在于,由如下质量浓度的原料组成:
间充质干细胞外泌体0.3-5g/L,透明质酸钠1.2-2.5g/L,牛磺酸1-2g/L,卡波姆9402g/L,采用等渗调节剂调节渗透压至280-350mOsm/L;PH调节剂调节PH值至6-7.5,溶剂为生理盐水。
2.根据权利要求1所述的含有间充质干细胞外泌体的眼用凝胶,其特征在于,所述的外泌体为从人脐带间充质干细胞中提取。
3.根据权利要求1所述的含有间充质干细胞外泌体的眼用凝胶,其特征在于,PH调节剂为HCl和NaOH。
4.根据权利要求1所述的含有间充质干细胞外泌体的眼用凝胶,其特征在于,等渗调节剂为NaCl。
5.一种如权利要求1-4所述的含有间充质干细胞外泌体的眼用凝胶的制备方法,其特征在于,包括如下步骤:
第一步,细胞培养收集培养液:选择3-7代的脐带间充质干细胞,将细胞培养至70%融合后,换为不含血清的纯培养基培养48小时,收集不含血清的纯培养基,进行梯度离心法获得外泌体;
第二步,使用超速离心法进行外泌体提取:取收集的细胞上清液为4℃,300g,5min离心,取上清继续4℃,3000g,15min离心,接着取上清4℃,10000g,60min离心,取上清通过22μm滤器过滤,过滤后液体4℃,100000g,70min离心,沉淀即为外泌体,用PBS悬浮沉淀,再次4℃,100000g,70min离心,PBS悬浮沉淀,获得外泌体溶液,-80℃长期保存,用于后续眼用凝胶制备;
第三步,外泌体鉴定:使用透射电镜观察外泌体形态,NTA检测外泌体粒径;
第四步,配置器具的准备:配置时使用的烧杯、玻璃棒、转子等使用灭菌锅灭菌,配置均在超净台内进行,使用前超净台紫外线灭菌30min;
第五步,辅料配置:用生理盐水溶解透明质酸钠,用生理盐水溶解牛磺酸和卡波姆940,将透明质酸钠溶液加入牛磺酸和卡波姆940溶液中,边加边搅拌,最后加入生理盐水配至50ml体系,测量PH,使用PH调节剂将PH调至6-7.5,100℃水浴灭菌,不停搅拌,加热到样品80℃,取出冷却;
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