CN115137754A - 含外泌体的眼科药物组合物 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物医药技术领域,具体而言,涉及一种含外泌体的眼科药物组合物。该眼科药物组合物包含活性成分、辅料以及脂质成分难溶的溶剂;所述活性成分包括间充质干细胞来源的外泌体;所述辅料包括0.5wt%~1wt%羧甲基纤维素、0.1wt%~0.5wt%泊洛沙姆以及4wt%~6wt%防沉降剂。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域,具体而言,涉及一种含外泌体的眼科药物组合物。
背景技术
眼表疾病是一种对角结膜正常结构和功能造成破坏的一种疾病,而干眼症就是其中的一种,近年来越来越受到眼科医生的关注。“干眼”这个术语最早起源于瑞典的一位眼科医生Honrid sioren,他提出了眼干、口干和关节疼痛的三联症状。根据国际泪膜与眼表学会工作小组发表的干眼系列第二次一致意见,认为干眼症是一种多因素性眼表疾病,其特点是泪膜不稳定、泪液渗透压升高、眼表炎症和损伤、神经感觉异常。由于生活环境的变化,生活方式的变化,工作强度的变化,电子产品的使用,使干眼的患病率在21-30%之间,而治疗的需要也在逐年增长。
最近,发表于2022年Science Advances的一项最新研究表明,外泌体能够改善由GVHD(移植性抗宿主疾病)引起的干眼不良反应。GVHD是一种常见的术后并发症,轻则会影响病人的生存,严重的会威胁到病人的远期生存。在一个前瞻性临床实验中,间充质干细胞外泌体(MSC-exo)可用于抑制炎瑞典症,提高上皮修复,对小鼠和人均有明显的疗效。使用药物后,眼睛刺痛、灼热、发红等症状都会减轻,而且比人工泪液更有效。
发明内容
本发明提供一种眼科药物组合物,其包含活性成分、辅料以及脂质成分难溶的溶剂;
所述活性成分包括间充质干细胞来源的外泌体;
所述辅料包括0.5wt%~1wt%羧甲基纤维素、0.1wt%~0.5wt%泊洛沙姆以及4wt%~6wt%防沉降剂。
本发明还涉及如上所述的眼科药物组合物在制备用于治疗干眼症的药物中的应用。
本发明提供了一种包含外泌体的新型眼科药物组合物,其在治疗干眼症方面具有更佳的药用效果,且性质稳定,易于保存。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案,下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍,显而易见地,下面描述中的附图是本发明的一些实施方式,对于本领域普通技术人员来讲,在不付出创造性劳动的前提下,还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明一个实施例所提供的外泌体的电镜图片;
图2为本发明一个实施例所提供的外泌体的粒径示意图;
图3为本发明一个实施例所提供的泪液分泌量检测结果;*p<0.05,vs空白对照;#p<0.05,vs对比例1;
图5为本发明一个实施例所提供的结膜杯状细胞数量检测结果;*p<0.05,vs空白对照;#p<0.05,vs实施例2;
图6为各组小鼠角膜荧光染色的代表图片。
具体实施方式
现将详细地提供本发明实施方式的参考,其一个或多个实例描述于下文。提供每一实例作为解释而非限制本发明。实际上,对本领域技术人员而言,显而易见的是,可以对本发明进行多种修改和变化而不背离本发明的范围或精神。例如,作为一个实施方式的部分而说明或描述的特征可以用于另一实施方式中,来产生更进一步的实施方式。
除非另有说明,用于披露本发明的所有术语(包括技术和科学术语)的意义与本发明所属领域普通技术人员所通常理解的相同。通过进一步的指导,随后的定义用于更好地理解本发明的教导。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的,不是旨在于限制本发明。
本发明中所使用的术语“含有”、“包含”和“包括”是同义词,其是包容性或开放式的,不排除额外的、未被引述的成员、元素或方法步骤。
本发明中用端点表示的数值范围包括该范围内所包含的所有数值及分数,以及所引述的端点。本发明中涉及浓度数值,其含义包括在一定范围内的波动。比如,可以在相应的精度范围内波动。比如2%,可以允许±0.1%范围内波动。对于数值较大或无需过于精细控制的数值,还允许其含义包括更大波动。比如100mM,可以允许±1%、±2%、±5%等范围内的波动。
本发明涉及眼科药物组合物,其包含活性成分、辅料以及脂质成分难溶的溶剂;
所述活性成分包括间充质干细胞来源的外泌体;
所述辅料包括0.5wt%~1wt%羧甲基纤维素、0.1wt%~0.5wt%泊洛沙姆以及4wt%~6wt%防沉降剂。
所述羧甲基纤维素的含量还可以选用0.6wt%、0.7wt%、0.8wt%、0.9wt%。
所述泊洛沙姆的含量还可以选用0.2wt%、0.3wt%、0.4wt%。
所述防沉降剂的含量还可以选用4.5wt%、5wt%、5.5wt%。
上述组分中,羧甲基纤维素和泊洛沙姆配合能增加组合物的粘度,从而增加活性成分在眼表的停留时间,促进药效的发挥;防沉降剂配合上述二者成分,能加强整个液体体系的稳定性,避免外泌体在羧甲基纤维素和泊洛沙姆的作用下发生聚集以及沉降。
术语“间充质干细胞”包括骨髓来源的间充质干细胞以及非骨髓来源的间充质干细胞,例如胎盘、脐带血、脂肪组织、成人肌肉、角膜基质、乳牙牙髓。
在一些实施方式中,所述外泌体的含量为(1~9)×1010particles/mL,例如2×1010particles/mL、3×1010particles/mL、4×1010particles/mL、5×1010particles/mL、6×1010particles/mL、7×1010particles/mL、8×1010particles/mL、9×1010particles/mL。
在一些实施方式中,所述脂质成分难溶的溶剂为水。优选的,水在所述组合物中的含量不低于50wt%,例如60wt%、70wt%、80wt%、90wt%、95wt%、96wt%、97wt%或更高。所述脂质成分难溶的溶剂还可以为药学上可接受的其他溶剂,例如乙醇、叔丁醇、乙二醇等。
在一些实施方式中,所述防沉降剂为糖。
在一些实施方式中,所述糖为蔗糖。
在一些实施方式中,所述眼科药物组合物还包含缓冲剂,所述缓冲剂使得所述眼科药物组合物的pH为6.5~8.5,例如7、7.5、8.0。
在一些实施方式中,所述缓冲剂选自硼酸及其盐、磷酸及其盐、醋酸及其盐、枸橼酸及其盐中的一种或数种。
在一些实施方式中,所述的眼科药物组合物还包含渗透压调节剂。
渗透压调节剂优选为药学上可接受的盐,例如氯化钠、氯化钾、氯化镁、氯化锌、依地酸二钠和依地酸钙钠中的一种或数种;或它们的组合。
在一些实施方式中,所述渗透压调节剂的浓度为0.01mg/mL~0.1mg/mL,例如0.03mg/mL、0.05mg/mL、0.07mg/mL。
在一些实施方式中,所述渗透压调节剂为氯化钠。
渗透压调节剂可配合其他组分维持外泌体的稳定性。
本发明还涉及如上所述的眼科药物组合物在制备用于治疗干眼症的药物中的应用。
在一些实施例中,所述药物为人工泪液。
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述。应理解,这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法,优先参考本发明中给出的指引,还可以按照本领域的实验手册或常规条件,还可以参考本领域已知的其它实验方法,或者按照制造厂商所建议的条件。
下述的具体实施例中,涉及原料组分的量度参数,如无特别说明,可能存在称量精度范围内的细微偏差。涉及温度和时间参数,允许仪器测试精度或操作精度导致的可接受的偏差。
实施例1 MSC外泌体制备
1.MSC培养
将4至6周大的C57BL/6J小鼠处死,收集它们的胫骨/腓骨和股骨,用22号针头挤出骨髓。将骨髓细胞重悬于含有10%FBS、青霉素(100U/ml)和链霉素(100mg/ml)的DMEM/F-12培养基中,并以1×106个细胞/ml的密度接种。24小时后更换培养基,之后每周更换两次。通过流式细胞术对扩增的细胞进行分选,CD11b-FTIC(553310,BD Pharmingen)、CD45-APC(559864,BD Pharmingen)和CD34-BV421(562608,BD Pharmingen)的阴性标记和CD44-PE的阳性标记(559864,BD Pharmingen)553134,BD Pharmingen)、CD29-FITC(11-0291-82,eBioscience)和SCA-1-BV421(108128,BioLegend)。将细胞扩增为三至五代以供使用。
2.外泌体制备
提前打开普通低温离心机和超速离心机,预冷至4℃。2000g,离心10min,去除死细胞和碎片。0.22μm滤膜过滤去除较大囊泡。上清转至超速离心管中,用PBS配平,120000g,离心3h。弃去上清,用无菌滤纸吸走管壁残留液体,管底即为MSC外泌体。制备的外泌体在-80℃下储存直至使用。
3.外泌体检测
3.1外泌体样品透射电镜观察
1)将外泌体取出10μL。
2)吸取样品10μL滴加于铜网上沉淀1min,滤纸吸去浮液。
3)醋酸双氧铀10μL滴加于铜网上沉淀1min,滤纸吸去浮液。
4)常温干燥数分钟。
5)100kV进行电镜检测成像。
6)获得透射电镜成像结果。
外泌体的电镜图如图1所示。
3.2外泌体样品粒径分析
1)将外泌体取出10μL,稀释至30μL。
2)先用标准品进行仪器性能测试合格后方可进行外泌体样品上样,注意需进行梯度稀释避免样本堵塞进样针。
3)待样本完成检测即可获得仪器检测外泌体的粒径和浓度信息。
外泌体粒径分析结果如下表所示:
外泌体粒径示意图如图2所示。
实施例2人工泪液的制备
1.将8ml无菌1×PBS水溶液加热至45℃~55℃,向其中加入0.07g羧甲基纤维素,0.03g泊洛沙姆,0.1g NaCl,0.5g蔗糖,混匀;
2.将上述溶液在搅拌下降温至4℃~6℃;
3.调节pH至近中性(6.5~8.5),在低温转速下,逐滴加入实施例1制备得到的外泌体,用1×PBS补足至终体积10ml,其中外泌体的终浓度为5×1010particles/mL;
4.将上述溶液暂存于4℃~6℃进行保存。
实施例3人工泪液的低温稳定性
羧甲基纤维素和泊洛沙姆的添加虽然会增加人工泪液的粘度,但由于高浓度的外泌体存在,在低温静置下,混合体系溶液呈不稳定的悬浊液状态。发明人采用不同的防沉降剂验证人工泪液的低温稳定性,实验为4℃放置5天的后观察样品外观。各组均为在实施例2的基础上添加不同的防沉降剂得到。其结果如表1所示。
表1
注:浑浊程度采用吸光度辅助判断,稳定性差的体系会因外泌体聚集导致内容物释放增多而变质。
其中,5wt%的甘油和蔗糖效果均较好。但经进一步的电镜观察,5wt%的甘油在长时间对外泌体保存后,会导致部分外泌体外膜破裂。这可能是由于部分粒径较大的甘油液滴与脂质体接触所导致的;但蔗糖提醒下外泌体整体稳定。因此本发明中防沉降剂选用5wt%蔗糖。
实施例4人工泪液的疗效验证
1.组别设置
空白对照:
只施用PBS溶液。
对比例1组:
与实施例2的区别在于,不添加羧甲基纤维素和泊洛沙姆。
对比例2组:
与实施例2的区别在于,加入0.1g羧甲基纤维素,0g泊洛沙姆。
对比例3组:
与实施例2的区别在于,加入0g羧甲基纤维素,0.1g泊洛沙姆。
2.机械阻止瞬目制备小鼠干眼模型的建立
机械阻止瞬目法可导致泪液无法到达眼表面,且泪膜中水分蒸发加快,使泪膜渗透压增加和角膜组织脱水,眼表上皮干燥失活。
本实验选取75只SPF级C57BL/6雄性小鼠(每组15只),22g~25g,鼠龄8周,恒温22℃,湿度55%环境下常规饲养。该实验严格遵循动物实验中对实验动物保护和伦理学要求。
给小鼠腹腔注射10%水合氯醛(3mL·kg-1),麻醉后将小鼠固定于固定板上,消毒眼睛周围皮肤,1号黑丝线分别褥式缝合上下眼睑并固定于眶周相应皮肤上,通过机械性阻止小鼠瞬目,持续暴露角结膜24h,小鼠干眼模型即可制备成功。该模型持续不少于14d。
各组给药方法:从第0d开始给药,持续给药14d。每只眼每次滴加药物5μL,每天两次。
有效控制环境湿度、温度及气体流量,造模完成后本实验分别于造模后的1天、7天、10天、14天检测小鼠眼表损害情况。
3.检测方法
3.1泪液分泌量
采用酚红棉线试验测量5组小鼠泪液的分泌量,于造模后的1天、7天、10天、14天进行测定。在裂隙灯下,用显微镊夹取酚红棉线,置于小鼠的下结膜囊中、外1/3,60秒后取出,显微镜采用游标卡尺观察棉线湿润长度,单位:毫米(mm),读数精确到0.2mm,泪液分泌<5.0mm为低分泌。每组检查后记录数据。
3.2泪膜破裂时间
根据泪膜破裂时间(tear film break-up time,BUT)评估泪膜稳定性,于造模后的第14天进行测定。取1%的荧光素钠1μL滴至小鼠结膜囊内,10秒后将其瞬目3次,用裂隙灯钴蓝光下观察,以最后一次瞬目至出现第1个黑斑时间为泪膜破裂时间:单位:秒(s)。筛选条件:BUT(2.5±0.5s)每眼重复3次,取平均值。
3.3结膜杯状细胞数量
于造模后的第14天进行测定。颈椎脱臼法处死小鼠,在显微镜下完整取下球结膜、穹窿结膜及睑结膜后,将其固定于4%的多聚甲醛溶液中,常温下对其酒精脱水、漫蜡、包埋及进行切片。切片进行过碘酸-雪夫(periodic acid-Schiff,PAS)染色,染色后在显微镜下观察结膜上皮细胞及杯状细胞改变情况,计数每高倍视野下杯状细胞的数量情况。
3.4角膜荧光素染色
于造模后的第14天进行测定。将1uL液态荧光素钠(10mg/ml)滴至结膜囊并协助小鼠瞬目数次后,在裂隙灯显微镜钻蓝光下观察角膜上皮完整性及荧光素钠着色情况。
3.5统计学方法
所有资料录入SPSS21.0统计软件,采用计量资料的单因素、多因素的方差分析进行统计学分析。所有数据以平均数及标准差表示,以P<0.05为差异具有统计学意义。
4.实验结果
4.1泪液分泌量
实验结果如表2和图3所示。相对于空白对照组,实施例所提供的人工泪液具有最佳的治疗效果;而对于单独使用外泌体组(对比例1),虽然其仍具有治疗相关,但效果明显较实施例组差。
表2 泪液分泌情况
4.2泪膜稳定性的改变
各组在第14天所检测的泪膜破裂时间结果如图4所示。
与泪液分泌量结果类似,实施例2、对比例1-3组相对于空白对照组的泪膜破裂时间均具有显著性差异,且实施例2组高于对比例各组。但是,对比例1和对比例3之间不具有显著性差异(p=0.12)。
4.3结膜杯状细胞计数
各组在第14天所检测的结膜杯状细胞数量如图5所示。
空白对照组、实施例2、对比例1-3各组的结膜杯状细胞数量分别为12.4±1.1、33.2±2.3、23.3±1.1、25.7±3.2以及25.0±1.1。可见,实施例2、对比例1-3组相对于空白对照组均具有显著性差异,对比例1-3比较差异无统计学意义。
4.4角膜荧光素钠染色
裂隙灯显微镜钻蓝光下观察大鼠角膜上皮荧光索钠染色情况。代表性结果如图6所示。可见与上述结果一致,实施例2组角膜表面光滑,仅有少量着色,其余各组均不同程度出现着色,其中空白对照组具有较多的片状着色,对比例1~3组具有较多点状着色。
从上述结果可以看出,本发明所采用的适当浓度的羧甲基纤维素和泊洛沙姆,能协同性地显著增加外泌体的药物活性,且防沉降剂的加入可明显改善药物的稳定性。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式,其描述较为具体和详细,但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是,对于本领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明构思的前提下,还可以做出若干变形和改进,这些都属于本发明的保护范围。因此,本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准,说明书及附图可以用于解释权利要求的内容。
Claims (10)
1.眼科药物组合物,其特征在于,包含活性成分、辅料以及脂质成分难溶的溶剂;
所述活性成分包括间充质干细胞来源的外泌体;
所述辅料包括0.5wt%~1wt%羧甲基纤维素、0.1wt%~0.5wt%泊洛沙姆以及4wt%~6wt%防沉降剂。
2.根据权利要求1所述的眼科药物组合物,其特征在于,所述外泌体的含量为(1~9)×1010particles/mL。
3.根据权利要求1所述的眼科药物组合物,其特征在于,所述脂质成分难溶的溶剂为水。
4.根据权利要求1~3任一项所述的眼科药物组合物,其特征在于,所述防沉降剂为糖。
5.根据权利要求4所述的眼科药物组合物,其特征在于,所述糖为蔗糖。
6.根据权利要求1~3、5任一项所述的眼科药物组合物,其特征在于,还包含缓冲剂,所述缓冲剂使得所述眼科药物组合物的pH为6.5~8.5。
7.根据权利要求6所述的眼科药物组合物,其特征在于,所述缓冲剂选自硼酸及其盐、磷酸及其盐、醋酸及其盐、枸橼酸及其盐中的一种或数种。
8.根据权利要求1~3、5、7任一项所述的眼科药物组合物,其特征在于,还包含渗透压调节剂。
9.根据权利要求8所述的眼科药物组合物,其特征在于,所述渗透压调节剂为0.01mg/mL~0.1mg/mL氯化钠。
10.权利要求1~9任一项所述的眼科药物组合物在制备用于治疗干眼症的药物中的应用。
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