CN115844907A - 包含柚皮素的药物组合物及其制备方法与用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种包含柚皮素的药物组合物，其包含柚皮素和药学上可接受的甘草酸盐；其中，柚皮素与甘草酸盐的质量比为1:2～50。本发明还提供了该药物组合物的制备方法，以及其在制备眼用制剂中的用途。本发明提供的包含柚皮素的药物组合物，具有良好的溶解性、存储稳定性以及抗氧化能力，安全、无刺激，而且，柚皮素和甘草酸盐组合，可以起到协同增效的作用，使得柚皮素药物在角膜的吸收得到显著增强，用作滴眼液能够明显改善干眼症眼表损伤，恢复泪液分泌与角膜敏感度，降低炎症因子的表达，在改善干眼症方面有显著优势。

Description

包含柚皮素的药物组合物及其制备方法与用途

技术领域

本发明属于眼用药物领域，具体涉及一种包含柚皮素的药物组合物及其制备方法与用途。

背景技术

干眼症，是指由多种因素所导致的、以眼睛干涩为主要症状的泪液分泌障碍性眼病，常伴有角膜敏感度降低、畏光、视物模糊等表现，给患者的生活和工作带来很大的不便。而且，随着社会的发展和科技的进步,干眼症的患者日益增多；流行病学调查显示,干眼症的患病率约为7.8％～33.78％，其防治工作越来越受到重视。

柚皮素，是一种固态的有机化合物，溶于乙醇、乙醚和苯等有机溶剂，几乎不溶于水，临床上主要用于治疗细菌感染，镇静、抗癌等，应用剂型主要有：栓剂、洗剂、注射液、片剂、胶囊等。

例如，

CN102872004A公开了柚皮素在制备治疗肺炎药物中的应用，通过兔红细胞溶血试验、肺上皮细胞(A549)损伤的保护试验以及小鼠金葡菌肺炎模型证实其治疗金葡菌感染作用；对比使用抗生素治疗，使用柚皮素具有无耐药性，治愈率高的特点。

CN111700889A提供了柚皮素在制备治疗癌症恶病质药物中的应用，该药物的有效成分为柚皮素、柚皮素的水合物等；它可以减轻化疗药物对骨骼肌分化的抑制作用，并且可以下调骨骼肌降解相关蛋白的表达，为制备治疗癌症恶病质药物提供了策略。

CN111714500A公开了一种含柚皮素的药物组合物及其在治疗大肠癌上的应用，所述的药物组合物包含柚皮素和5-氟尿嘧啶，且所述柚皮素和氟尿嘧啶的摩尔比为4:1，该组合物能够用于抑制结肠癌细胞增殖、迁移和侵袭，并促进结肠癌凋亡。

CN108057034A公开了柚皮素和积雪草酸组合治疗癌症，其组合使用产生了令人惊讶的协同效应，为治疗或预防癌症提供了新的方法和组合物。

CN107432874A公开了柚皮素的用途、柚皮素纳米脂质体，并将其应用于制备治疗非酒精性脂肪肝药物中；该柚皮素纳米脂质体能提高柚皮素的口服的生物利用度，并提高柚皮素对非酒精性脂肪肝的防治效果。

甘草酸二钾(DG)，为白色或类白色粉末，具有抗炎、抗过敏、保湿等功效，在医药行业主要用于镇咳祛痰、胃溃疡、急慢性胃炎、湿疹、皮肤瘙痒，以及用于治疗癌症和防治艾滋病等。

截止到目前为止，未检索到有将柚皮素或其与甘草酸二钾组合用于预防和/或治疗干眼症(或者，用于降低HMGB1和/或RAGE的表达水平)的相关文献报道。

发明内容

针对现有技术存在的问题和/或不足，本发明的目的在于提供一种包含柚皮素的药物组合物及其制备方法与用途。该药物组合物，具有良好的溶解性、存储稳定性以及抗氧化能力，安全、无刺激，用作滴眼液能够明显改善干眼症眼表损伤，恢复泪液分泌与角膜敏感度，降低炎症因子的表达，在改善干眼症方面有明显优势。

本发明提供了一种药物组合物，其包含：柚皮素和药学上可接受的甘草酸盐；其中，柚皮素与甘草酸盐的质量比为1:2～50(例如，1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9、1:10、1:12、1:15、1:16、1:18、1:20、1:22、1:25、1:30、1:35或1:45)。

进一步的，

根据本发明的药物组合物，其中，柚皮素与甘草酸盐的质量比为1:5～20(例如，1:6、1:9、1:12、1:15或1:18)；优选地，柚皮素与甘草酸盐的质量比为1:15～18。

进一步的，

根据本发明的药物组合物，其中，柚皮素的包封率至少为80％(例如，柚皮素的包封率为81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)；优选地，柚皮素的包封率≥90％或≥95％。

进一步的，

根据本发明的药物组合物，其中，所述的甘草酸盐选自甘草酸钠、甘草酸二钠、甘草酸钾、甘草酸二钾、甘草酸铵、甘草酸二铵中的一种或两种以上；优选地，所述的甘草酸盐为甘草酸二钾或甘草酸二钠。

进一步的，

根据本发明的药物组合物，其中，所述的药物组合物是由包括以下步骤的方法制成：将柚皮素和甘草酸盐一起分散或溶解于溶剂中，混匀，然后35～45℃旋转蒸发除去溶剂，即得；

优选地，所述的溶剂为醇类溶剂，更优选为甲醇或乙醇；

优选地，每克柚皮素对应所述溶剂的用量为20～300mL(例如，50mL、100mL、150mL、200mL等)，更优选为100～300mL。

进一步的，

根据本发明的药物组合物，其中，所述的药物组合物为固体制剂或液体制剂；

优选地，所述的药物组合物为液体制剂，所述液体制剂的溶剂选自药学上可接受的水、PBS缓冲液或羧甲基纤维素钠水溶液；

更优选地，所述液体制剂的pH值为6～8，进一步优选为6.5～7.2。

进一步的，

根据本发明的药物组合物，其中，当所述液体制剂中的柚皮素浓度为5mg/mL时，所述的液体制剂满足下述条件①～③中的一个或两个以上：

①、所述液体制剂的胶束平均直径为1～80nm；优选10～30nm；

②、所述液体制剂的多分散指数为≤0.5；优选≤0.4；

③、所述液体制剂的Zeta电位为-20～0mV；优选-5～0mV；

优选地，所述液体制剂同时满足条件①～③。

进一步的，

根据本发明的药物组合物，其中，所述药物组合物中的柚皮素为治疗有效量的，和/或，所述的药物组合物中还包括药学上可接受的辅料。

进一步的，

根据本发明的药物组合物，其中，所述的药物组合物为眼用制剂；

优选地，所述的眼用制剂为滴眼液，进一步优选为纳米胶束滴眼液；

优选地，所述的眼用制剂是用于治疗和/或预防干眼症的眼用制剂；或者，所述的眼用制剂是用于治疗和/或预防角膜上皮损伤的眼用制剂；或者，所述的眼用制剂是抑制角膜炎症因子表达、HMGB1表达或者RAGE表达的眼用制剂；更优选地，所述的角膜炎症因子为IL-6或IL-1β。

本发明还提供了上述任一所述的药物组合物的制备方法，包括以下步骤：将柚皮素和甘草酸盐一起分散或溶解于醇类溶剂中，混匀，然后35～45℃旋转蒸发除去溶剂，得到固体产物；之后可选择地包括：将所得的固体产物溶解或分散在液体制剂的溶剂中，调节所述液体制剂的pH值为6～8，过滤灭菌，即可；

优选地，

所述的醇类溶剂为甲醇或乙醇；

每克柚皮素对应所述醇类溶剂的用量为20～300mL，更优选为100～300mL；

所述液体制剂的溶剂选自药学上可接受的水、PBS缓冲液或羧甲基纤维素钠水溶液；

调节所述液体制剂的pH值为6.5～7.2；

调节所述液体制剂的pH值所使用的试剂为氢氧化钠和/或氢氧化钾。

本发明的另一目的还在于提供上述药物组合物的药物用途。

具体的，本发明还提供了一种上述药物组合物在制备眼用制剂中的用途；

优选地，所述的眼用制剂为滴眼液，进一步优选为纳米胶束滴眼液；

优选地，所述的眼用制剂是用于治疗和/或预防干眼症的眼用制剂；或者，所述的眼用制剂是用于治疗和/或预防角膜上皮损伤的眼用制剂；或者，所述的眼用制剂是抑制角膜炎症因子表达、HMGB1表达或者RAGE表达的眼用制剂；更优选地，所述的角膜炎症因子为IL-6或IL-1β。

有益效果

本发明提供的包含柚皮素的药物组合物，具有良好的溶解性、存储稳定性以及抗氧化能力，安全、无刺激，而且，柚皮素和甘草酸盐组合，可以起到协同增效的作用，使得柚皮素药物在角膜的吸收得到显著增强，用作滴眼液能够明显改善干眼症眼表损伤，恢复泪液分泌与角膜敏感度，降低炎症因子的表达，在改善干眼症方面有显著优势。

附图说明

图1是本发明甘草酸二钾-柚皮素(DG-Nar)滴眼液的外观图及其对照。

图2是Nar与DG不同质量比的包封率。

图3是甘草酸二钾-柚皮素(DG-Nar)滴眼液储存12周的包封率。

图4是兔眼刺激性观察图。

图5是兔眼组织病理学观察图。

图6是不同浓度下的抗氧化活性(ABTS法)。

图7是不同时间的抗氧化活性(ABTS法)。

图8是给药DG-Nar后的角膜荧光强度图。

图9是干眼症小鼠模型(荧光素钠染色)对比图。

图10是干眼症小鼠模型(虎红染色)对比图。

图11是干眼症小鼠模型(泪液分泌量)对比图。

图12是干眼症小鼠模型(角膜敏感度)对比图。

图13是不同给药组对干眼症眼表损伤的修复对照(荧光素钠染色)。

图14是不同给药组对干眼症眼表损伤的修复对照(虎红染色)。

图15是不同给药组的泪液分泌量。

图16是不同给药组的角膜敏感度。

图17是不同给药组的角膜上皮组织SEM图。

图18是不同给药组的角膜内皮组织SEM图。

图19是不同给药组的组织病理学观察图。

图20是不同给药组的IL-6水平。

图21是不同给药组的IL-1β水平。

图22是不同给药组的蛋白质印迹法检测结果。

图23是不同给药组的HMGB1水平。

图24是不同给药组的RAGE水平。

具体实施方案

以下实施例仅是对本发明予以解释说明，并未对本发明的保护范围进行任何限制。对于本领域技术人员而言，凡未脱离本发明技术精神所作的同等实施方式或变更均在本发明的保护范围之内。

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。

本发明中，未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行，所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

例如：

甘草酸二钾：陕西富捷药业有限公司

香豆素6：Sigma公司

PBS缓冲液(pH＝7.2～7.4)：青岛云山生物科技有限公司

雄性BALB/c小鼠(8周龄)：济南朋悦实验动物繁育有限公司

新西兰白兔：青岛康大生物科技有限公司

ABTS试剂盒：上海碧云天生物技术有限公司

BCA蛋白浓度测定试剂盒：上海碧云天生物技术有限公司

关于本发明中使用术语的定义，除非另有说明，本文中术语提供的初始定义适用于全文中的该术语；对于本文没有具体定义的术语，应当根据公开内容和/或上下文，给出本领域技术人员能够给予它们的含义。

实施例1

将25mg柚皮素(Nar)与不同质量的甘草酸二钾(DG)(Nar与DG的质量比分别为1:6、1:9、1:12、1:15、1:18)加入到茄型瓶中，超声，使柚皮素和甘草酸二钾溶解或均匀分散在甲醇(5mL)中。随后，将茄型瓶置于旋转蒸发仪，在40℃、减压条件下将甲醇挥干，直到茄型瓶的瓶壁上形成一层薄膜(DG-Nar)。取下茄型瓶，加入PBS缓冲液将瓶壁上的薄膜(DG-Nar)溶解，用氢氧化钠调节pH至6.5～7.2并定容(5mL)，0.22μm滤膜过滤，得到甘草酸二钾-柚皮素(DG-Nar)滴眼液，见图1：DG-Nar滴眼液(Nar与DG的质量比为1:15，其Nar的浓度为5mg/mL)，为澄清透明的无色液体；Nar在水中(每mL水中加入5mg柚皮素)；Nar在乙醇中(每mL乙醇中加入5mg柚皮素)；水作为对照。

1.1胶束尺寸、多分散指数和zeta电位

使用纳米粒度仪(英国马尔文仪器有限公司)进行测定，结果显示，DG-Nar滴眼液(Nar与DG的质量比为1:15，其Nar的浓度为5mg/mL)的平均直径为24.75±0.52nm，多分散指数(PDI：polydispersity index)为0.273±0.16，Zeta电位为-(3.632±0.48)mV。

1.2包封率

采用高效液相色谱法测定：将制备的DG-Nar滴眼液过0.22μm滤膜，过滤分离未包封的Nar。用适当溶剂(例如：甲醇或含甲醇的流动相)稀释DG-Nar过滤前和过滤后的溶液，以破坏胶束。采用高效液相色谱法测定Nar浓度。包封率，为过滤后检测到的Nar浓度与过滤前检测到的Nar浓度之比。

高效液相色谱法(HPLC)：日本岛津LC2010A高效液相色谱仪，C18反相色谱柱(250mm×4.6mm×5μm)，紫外检测器，检测波长288nm，流动相为甲醇：水＝60:40(v:v)，柱温30℃，流速1.0mL/min，进样量为10μL。

甘草酸二钾作为辅料，可在水溶液中自组装形成胶束，包封药物对药物起到增溶的作用。不同质量比的DG-Nar滴眼液，其包封率检测结果见图2：Nar与DG的质量比为1:6时，包封率为78.20％；Nar与DG的质量比为1:9或更高(例如，1:12、1:15等)时，包封率＞90％；Nar与DG的质量比为1:15时，包封率接近100％。

1.3储存稳定性

取1.5mL离心管进行灭菌处理，用于分装制备的DG-Nar滴眼液(Nar与DG的质量比为1:15，其Nar的浓度为5mg/mL)，然后密封，分别置于4℃和25℃避光储存。每隔两周对其进行包封率的检测，评价DG-Nar滴眼液的储存稳定性，检测结果见图3。

结果表明，在4℃和25℃下储存12周，包封率仍然能够稳定地保持在95％以上。

实施例2

在体眼局部刺激性试验(Draize-Test法)：

选用新西兰白兔作为实验动物，分别用DG-Nar滴眼液(Nar与DG的质量比为1:15，其Nar的浓度为5mg/mL)、Nar悬液(5mg/ml，溶剂为PBS缓冲液)、DG溶液(75mg/ml，溶剂为PBS缓冲液)、PBS缓冲液、0.5％的SDS溶液(溶剂为PBS缓冲液)对兔左眼进行点眼，右眼作为对照不做处理，每半个小时点眼一次，持续6h。最后一次点眼完成后，进行裂隙灯检查，并参照表1的评分标准对兔眼进行观察评分并拍照评分。

表1、评分标准表

将兔处死并摘眼，将摘取的眼球组织置于装有固定液的标本盒中浸泡24h，石蜡包埋，HE染色后，显微镜下观察和拍照。

结果显示(见图4和图5)，阳性对照组(SDS组)表现出严重的结膜充血，产生较多分泌物，甚至眼睑半闭合，角膜上皮明显变薄，大部分区域仅能观察到单层上皮细胞，且基质层存在水肿现象；而PBS组、DG-Nar滴眼液、Nar悬液组、DG溶液组，均未见结膜、角膜、虹膜、瞳孔区域组织损伤或临床异常迹象，也未见组织损伤和炎症反应，检测角膜结构正常，具有完整的上皮细胞、正常的板层间质和完整的内皮结构，未发现任何水肿和炎症，对应的各项症状体征评分总分均在0～2分，属于无刺激性。

实施例3

采用ABTS法(ABTS试剂盒)检测抗氧化活性：

配制ABTS工作母液，黑暗氧化12h。实验前将所配制工作母液稀释30～60倍得到工作液，测定其A₇₃₄在0.65～0.75范围内即可使用。

制备标准品：将10mM Trolox标准溶液按照规定比例稀释为各浓度梯度标准溶液备用。取96孔板，在实验所需孔中加入200μL/孔的工作液，设置实验所需标准曲线检测孔加入各浓度梯度Trolox标准溶液、样品检测孔中加入对应各浓度梯度待测样品、空白对照孔中加入PBS，每孔10μL，相应时间点时使用酶标仪测定各孔A₇₃₄。制备标准曲线，得到所求总抗氧化能力，结果见图6和图7。

如图6所示，同一时间点，随着浓度的增加，DG-NAR滴眼液组和NAR悬液组的抗氧化活性都逐渐增强，DG溶液组也表现出具有抗氧化能力，但远低于其他两组。如图7所示，同一浓度下，随着时间的延长DG-NAR滴眼液组和NAR悬液组的抗氧化能力都逐渐增强。由图6和图7还可知，DG-NAR滴眼液组抗氧化能力明显高于NAR悬液组。结果显示，同等条件下DG-Nar滴眼液组的抗氧化能力显著优于Nar悬液组和DG溶液组。

实施例4

小鼠角膜吸收对比试验

用香豆素6(Cou-6)分别对DG-Nar、Nar进行标记(香豆素6的浓度5μg/mL)，将小鼠随机分为两组：一组在小鼠眼表滴香豆素6标记的DG-Nar滴眼液(Nar与DG的质量比为1:15，其Nar的浓度为5mg/mL)；另一组滴香豆素6标记的Nar悬液(5mg/ml，溶剂为PBS缓冲液)；每10分钟一次，共三次；最后一次点眼结束后30、60和90分钟处死小鼠，用生理盐水冲洗眼球以去除滴眼液残留。将小鼠角膜剪瓣平铺在玻片上，使用荧光显微镜观察，两组的曝光时间、亮度、对比度等保持一致，曝光30min的结果见图8。

结果显示，Nar悬液组只能看到微弱的Cou-6绿色荧光，DG-Nar滴眼液组的绿色荧光强度明显强于Nar悬液组，这说明角膜对DG-Nar的吸收和利用优于Nar。

实施例5

建立干眼症小鼠模型：

挑选体重相近的雄性BALB/c小鼠，分为两组：一是造模组，二是空白对照组(正常组)。对造模组的小鼠进行点眼，每眼给予5μL苯扎氯铵水溶液(2mg/ml)，每天给予滴眼3次，连续给予10天。造模开始后，注意保持小鼠生活环境的干燥性，正常饮食饮水。10天后造模完成，荧光素钠染色、虎红染色并拍照，检测小鼠泪液分泌量、角膜敏感度等。

5.1小鼠眼表裂隙灯观察

荧光素钠染色：随机挑选造模组和空白对照组的小鼠，采用浓度为0.25％的荧光素钠溶液染色，眼表停留10秒后，生理盐水冲洗，擦干眼表，调整裂隙灯光源为钴蓝光，小鼠暴露眼球于裂隙灯下观察，拍照记录荧光素钠在不同组别的小鼠角膜着色情况，结果见图9。

虎红染色：随机挑选造模组和空白对照组的小鼠，用浓度为1％的虎红溶液染色，眼表停留10秒后，生理盐水冲洗，擦干眼表，调整裂隙灯光源为自然光，小鼠暴露眼球于裂隙灯下观察，拍照记录虎红在不同组别的小鼠角膜着色情况，结果见图10。

结果显示，空白对照组(正常组)的小鼠角膜无着色，而造模组的小鼠角膜有明显着色。

5.2小鼠泪液分泌量检测

随机挑选造模组和空白对照组的小鼠，酚红棉线检测小鼠造模前后泪液分泌量的变化情况。抓取小鼠，眼科镊夹取酚红棉线将棉线放置在小鼠下眼睑结膜上距离外眼角三分之一处，持续20s后取出固定，立即用毫米尺测量酚红棉线潮湿染色部分的长度并记录，结果见图11。

结果显示，与空白对照组(正常组)相比，造模组小鼠的泪液分泌量明显地减少(*：表示与正常组相比，P＜0.05)。

5.3小鼠角膜敏感度检测

使用Cochet-Bonnet角膜知觉仪(型号：WO-7760)检测：抓取小鼠，清理小鼠眼睑睫毛，轻轻暴露眼球，用触针轻触角膜，最开始将仪器触针长度调整为最大刻度6.0，然后依次递减0.5，直至小鼠眼部出现频繁的眨眼反射，记录此时触针的刻度即为小鼠角膜敏感度测量值。注意在测量过程中，角膜知觉仪的尼龙纤维触针要分别轻触小鼠角膜中央及四周共五个部位，测量实验需间断重复三次，所有检测由同一人完成，记录三次的平均值为小鼠角膜敏感度，结果见图12。

结果显示，与空白对照组(正常组)相比，造模组小鼠的角膜敏感度明显地下降(*：表示与正常组相比，P＜0.05)。

以上结果表明，成功建立干眼症小鼠模型。

实施例6

对于实施例5造模组的小鼠，随机进行分组，分别给予以下给药治疗：

①DG&Nar组：DG与Nar为物理混合，PBS为溶剂，每毫升中含75mg的DG和5mg的Nar；

②Nar组：PBS为分散溶剂，每毫升中含5mg的Nar；

③DG组：PBS为溶剂，75mg/mL；

④DG-Nar组：PBS为溶剂，DG-Nar滴眼液(Nar与DG的质量比为1:15，其Nar的浓度为5mg/mL)；

⑤PBS组；

⑥HA组：0.1％的透明质酸钠。

分组后，每天眼表给药3次，每次5μL/眼，连续给药10天。以正常组小鼠作为对照。

6.1小鼠眼表裂隙灯观察(对干眼症眼表损伤的修复)

荧光素钠染色：随机挑选给药组和正常组的小鼠(每组6只小鼠)，按照与实施例5相同方法处理，拍照记录荧光素钠在不同组别的小鼠角膜着色情况，评估各组药物对小鼠干眼症造成的眼表损伤的修复作用，结果见图13。

虎红染色：随机挑选给药组和正常组的小鼠(每组6只小鼠)，按照与实施例5相同方法处理，拍照记录虎红在不同组别的小鼠角膜着色情况，评估各组药物对小鼠干眼症造成的眼表损伤的修复作用，结果见图14。

荧光素钠染色和虎红染色的结果都显示，PBS组给药后仍有较为明显的着色，而DG-Nar组几乎无着色，接近正常对照组，这表明DG-Nar对干眼症眼表损伤具有良好的修复作用，且修复效果优于DG&Nar组、Nar组、DG组、HA组等其他组。

6.2小鼠泪液分泌量检测(调控改善泪液分泌量)

随机挑选给药组和正常组的小鼠，按照与实施例5相同方法处理，用毫米尺测量酚红棉线潮湿染色部分的长度并记录，以此评估各组药物对小鼠泪液分泌量的影响，结果见图15。

结果显示，与PBS组相比，DG-Nar组的泪液分泌量明显地得到改善提高，且改善效果优于DG&Nar组、Nar组、DG组、HA组等其他组(*：表示与PBS组相比，P＜0.05)。

6.3小鼠角膜敏感度检测(调控改善角膜敏感度)

随机挑选给药组和正常组的小鼠(每组6只小鼠)，按照与实施例5相同方法处理，记录触针的刻度即为小鼠角膜敏感度测量值，评估各组药物对小鼠角膜敏感度修复的影响，结果见图16。

结果显示，与PBS组相比，DG-Nar组的角膜敏感度明显地得到改善提高，且改善效果优于DG&Nar组、Nar组、DG组、HA组等其他组(*：表示与PBS组相比，P＜0.05)。

6.4小鼠角膜扫描电镜(SEM)观察

随机挑选给药组和正常组的小鼠(每组6只小鼠)，行脱颈处死，眼科镊摘取小鼠眼球，PBS冲洗，浸泡固定，光学显微镜下用无齿镊轻轻夹取角巩膜缘，用眼科剪沿着角膜缘剪取圆弧形角膜，脱水，干燥，在扫描电镜的不同倍数下观察角膜上皮组织与角膜内皮组织的超微结构，拍照记录，结果分别见图17(角膜上皮组织)和图18(角膜内皮组织)。

对各组小鼠角膜上皮进行扫描电镜观察，角膜上皮存在微绒毛等微结构，受损时可观察到暗色阴影，呈现暗色细胞。如图17所示，正常组的小鼠角膜上皮，可观察到上皮细胞覆盖着浓密的微绒毛，而PBS组则呈现明显的微绒毛严重破坏、大量暗色细胞、胞间连接异常以及上皮细胞弥漫性剥脱变形等；DG-Nar组角膜上皮基本与正常组无异，也能观察到明显的微绒毛排列紧密，HA阳性对照组、DG&Nar组也能观察到较好的微绒毛，但有轻微改变；而Nar组、DG组仍都存在着一定量的暗细胞、微绒毛数量减少、细胞剥落现象。

对各组小鼠角膜内皮进行扫描电镜观察，如图18所示：正常组的角膜内皮呈现规则的六边形结构，排列紧密，有明显的内皮微绒毛；而PBS组呈现明显的细胞弥漫性剥脱变形，无明显边界，几乎无微绒毛；Nar组的异常症状较PBS组轻，存在少量微绒毛以及严重细胞剥脱；DG组六边形不规则，微绒毛不均匀，并有轻微剥脱现象；DG-Nar组和HA组，均呈现规则六边形与紧密微绒毛；DG&Nar组微绒毛略有减少。

以上结果表明，DG-NAR对干眼所致的角膜细胞(例如，角膜上皮细胞、角膜内皮细胞)损伤具有较好的修复作用。

6.5组织病理学考察

随机挑选给药组和正常组的小鼠(每组6只小鼠)，行脱颈处死，眼科镊摘取小鼠眼球，PBS冲洗，浸泡固定，石蜡包埋，HE染色，置于显微镜下拍照，见图19。

结果显示，PBS组观察到明显的角膜上皮变薄，甚至在部分区域仅能观察到单层角膜上皮细胞，同时基质层变薄，表现出炎症反应，正常组和DG-Nar组都没有观察到组织损伤和炎症反应。

6.6 ELISA检测炎症因子

给药10天后，处死给药组和正常组的小鼠，显微镜下分角膜。角膜用4℃预冷的灭菌PBS清洗，角膜用液氮冷冻，使用眼科剪剪碎角膜。加入含有苯甲基磺酰氟(PMSF)的PBS，用超声破碎仪进行破碎处理，整个过程中在冰上进行。角膜破碎之后，在4℃和12000rpm条件下，离心10分钟，将上清液转移至新的离心管中。用BCA蛋白试剂盒测定各样品蛋白浓度。按照试剂盒说明书步骤进行后续操作，用样品蛋白浓度校正结果。

检测结果见图20和图21，与其他给药组相比，DG-Nar滴眼液在抑制IL-6、IL-1β等炎症因子表达方面显示出更好的效果，更接近于正常组。

6.7蛋白质印迹法(Western Blot法)

(1)小鼠角膜蛋白提取与处理

给药10天后，处死给药组和正常组的小鼠，摘取眼球，分离出小鼠角膜，用预冷的PBS冲洗，滤纸吸干水分，剪碎，两个角膜放在一个离心管中，加入100μL含有PMSF的RIPA裂解液，用超声破碎仪在冰上进行破碎；4℃离心上述样品，上清液转移至新的离心管中，将角膜蛋白样品稀释后，加入到96孔板中，同时设置PBS孔作为空白对照；接着按BCA试剂盒说明书操作并计算待测样品的蛋白浓度；充分混合蛋白样品与上样缓冲液后，金属浴95℃加热5分钟，冷却后放于-80℃冰箱冻存。

(2)制备聚丙烯酰胺凝胶

①按实验需求蛋白分子量选择配制10％分离胶，按表2的配方比例配制10％分离胶15ml，按顺序依次快速加入，充分混合。混匀后均匀加入到两个制胶玻璃板中间的空隙中，缓慢加入至指定位置；

表2、SDS-PAGE分离胶配方

②用移液枪沿玻璃板壁缓慢均匀的加入双蒸水将水平面压平，加满后在水平桌面静置30min左右至其完全凝固，弃去双蒸水，擦干；

③按实验需求蛋白分子量选择配制5％浓缩胶，按表3的配方比例配制5％浓缩胶6mL，按顺序依次快速加入，充分混合，将其均匀加入在分离胶顶部至空隙填满即可，迅速平整插入15孔齿梳，在水平桌面静置40min左右至其完全凝固，观察平整无气泡，即可备后续实验使用。

表3、SDS-PAGE浓缩胶配方

(3)电泳

取出制备好的胶板，将梳子轻轻平行拔出。将胶装在电泳槽上，加入电泳缓冲液(表4配方稀释至1/10)，缓冲液要没过上下电阻丝。用加样枪头按预定顺序加入待测样品，及预染Marker。电泳槽放在冰水中，80V电压用于浓缩胶电泳20-30分钟，120V电压用于分离胶电泳，溴酚蓝跑到底部边缘，结束电泳。

表4、电泳液配方(10×电泳液)

(4)转膜

将PVDF膜(0.45μm)先在甲醇中浸泡1分钟，将滤纸、PVDF膜和海绵放在转膜缓冲液(表5配方)中浸泡。电泳结束后，小心拆下凝胶，置于转膜缓冲液。打开转膜夹子，按照规定顺序将滤纸、海绵、胶、PVDF膜放好，排气泡。接通电源，在冰浴条件下进行，时间90分钟。

表5、转膜液配方

(5)免疫反应与化学发光

加入5％脱脂奶粉封闭，室温孵育；加入一抗(抗体稀释比例为HMGB1(1:1000)稀释、RAGE(1:2500)稀释、GAPDH(1:5000)稀释)，摇床孵育120min(也可以摇床孵育60min后置于4℃保存过夜)；吸出一抗孵育液，用TBST(表6配方)漂洗；加入二抗液(北京中杉金桥生物技术有限公司：HRP标记羊抗兔IgG抗体，1:5000稀释)，摇床孵育60分钟；弃去二抗，不回收，以TBST漂洗；将PVDF膜蛋白样品侧朝上至于保鲜膜上，取等量的化学发光剂和增强剂混合，滴在PVDF膜，显影。用image J软件分析图片中蛋白条带灰度值。

表6、TBST配方

结果见图22～24，与PBS组相比，DG-Nar滴眼液组的HMGB1表达降低了36.65±0.05％(n＝5)，DG-Nar滴眼液组的RAGE表达降低了22.08±0.07％(n＝5)，这表明DG-Nar能够有效抑制HMGB1、RAGE的表达，使其恢复到正常水平。因而，DG-Nar有望作为关键介质HMGB1的抑制剂，通过调控HMGB1信号通路有效预防和/或治疗干眼症。

Claims (10)

1.一种药物组合物，其包含：柚皮素和药学上可接受的甘草酸盐；其中，柚皮素与甘草酸盐的质量比为1:2～50。

2.根据权利要求1所述的药物组合物，其特征在于，柚皮素与甘草酸盐的质量比为1:5～20；优选地，柚皮素与甘草酸盐的质量比为1:15～18。

3.根据权利要求1所述的药物组合物，其特征在于，柚皮素的包封率至少为80％；优选地，柚皮素的包封率≥90％或≥95％。

4.根据权利要求1所述的药物组合物，其特征在于，所述的甘草酸盐选自甘草酸钠、甘草酸二钠、甘草酸钾、甘草酸二钾、甘草酸铵、甘草酸二铵中的一种或两种以上；优选地，所述的甘草酸盐为甘草酸二钾或甘草酸二钠。

5.根据权利要求1所述的药物组合物，其特征在于，所述的药物组合物是由包括以下步骤的方法制成：将柚皮素和甘草酸盐一起分散或溶解于溶剂中，混匀，然后35～45℃旋转蒸发除去溶剂，即得；

优选地，所述的溶剂为醇类溶剂，更优选为甲醇或乙醇；

优选地，每克柚皮素对应所述溶剂的用量为20～300mL，更优选为100～300mL。

6.根据权利要求1～5任意一项所述的药物组合物，其特征在于，所述的药物组合物为固体制剂或液体制剂；

优选地，所述的药物组合物为液体制剂，所述液体制剂的溶剂选自药学上可接受的水、PBS缓冲液或羧甲基纤维素钠水溶液；

更优选地，所述液体制剂的pH值为6～8，进一步优选为6.5～7.2。

7.根据权利要求6所述的药物组合物，其特征在于，当所述液体制剂中的柚皮素浓度为5mg/mL时，所述的液体制剂满足下述条件①～③中的一个或两个以上：

①、所述液体制剂的胶束平均直径为1～80nm；优选10～30nm；

②、所述液体制剂的多分散指数为≤0.5；优选≤0.4；

③、所述液体制剂的Zeta电位为-20～0mV；优选-5～0mV；

优选地，所述液体制剂同时满足条件①～③。

8.根据权利要求1～5任意一项所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物中的柚皮素为治疗有效量的；和/或，

所述的药物组合物为眼用制剂；

优选地，所述的眼用制剂为滴眼液，进一步优选为纳米胶束滴眼液；

优选地，所述的眼用制剂是用于治疗和/或预防干眼症的眼用制剂；或者，所述的眼用制剂是用于治疗和/或预防角膜上皮损伤的眼用制剂；或者，所述的眼用制剂是抑制角膜炎症因子表达、HMGB1表达或者RAGE表达的眼用制剂；更优选地，所述的角膜炎症因子为IL-6或IL-1β。

9.权利要求1～8任意一项所述的药物组合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：将柚皮素和甘草酸盐一起分散或溶解于醇类溶剂中，混匀，然后35～45℃旋转蒸发除去溶剂，得到固体产物；之后可选择地包括：将所得的固体产物溶解或分散在液体制剂的溶剂中，调节所述液体制剂的pH值为6～8，过滤灭菌，即可；

优选地，

所述的醇类溶剂为甲醇或乙醇；

每克柚皮素对应所述醇类溶剂的用量为20～300mL，更优选为100～300mL；

所述液体制剂的溶剂选自药学上可接受的水、PBS缓冲液或羧甲基纤维素钠水溶液；

调节所述液体制剂的pH值为6.5～7.2；

调节所述液体制剂的pH值所使用的试剂为氢氧化钠和/或氢氧化钾。

10.权利要求1～8任意一项所述的药物组合物在制备眼用制剂中的用途。

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