TWI481718B

TWI481718B - Preparation and Application of Seaweed Mannose Complex Polysaccharide Polymers

Info

Publication number: TWI481718B
Application number: TW100103590A
Authority: TW
Inventors: Shiu Nan Chen
Original assignee: Shiu Nan Chen
Priority date: 2011-01-31
Filing date: 2011-01-31
Publication date: 2015-04-21
Also published as: TW201231666A

Description

海藻甘露糖複合多醣體聚合物之製備方法及其應用

本發明係運用菇蕈菌絲體之液體發酵培養，成功地將海藻糖及甘露糖聚合而成海藻甘露糖複合多醣體，並將之運用於眼部保養及活化細胞修復。

海藻糖(trehalose)是一種非還原性雙糖，由兩個葡萄糖分子經由α-1,1糖苷鍵結所組成(Elbein et al.,2003)。正式化學名稱為α-D-吡喃葡萄糖基α-D-吡喃葡萄糖苷(α-D-glucopyranosyl α-D-glucopyranoside)，分子式為C₁₂H₂₂O₁₁。海藻糖廣泛發現於細菌、酵母菌、真菌、藻類及一些高等植物及無脊椎動物中。海藻糖能直接與生物細胞膜接觸來維持流動性，防止因乾燥而造成的膜融合與通透性的改變(Crowe & Crowe,2000；Richards et al.,2002)。海藻糖不易被酸及水解酵素α-glucosidase所水解，且溶於水中時性質穩定，溶解度及滲透壓與麥芽糖相似，同時具低吸濕值，在相對濕度92%，其水分含量仍可維持在9.54%，由此可知海藻糖是一個化性穩定的糖類(Birch et al.,1963；Richards et al.,2002)。

在生物體中海藻糖具有能量儲存之功能，如處於加熱、冷凍、乾燥或高滲透壓之情況下，海藻糖能有保護蛋白質和細胞膜的功能(Newman et al.,1993)；對許多種類的細菌中，海藻糖可穩定細胞壁組成的功能(Richards et al.,2002)；對動植物體有儲存能量的功能及保存劑的功能，並且可提高植物在乾燥環境的生長、能增加酵母菌對環境改變的適應性(Yoshida et al.,1998)，包括乾旱、滲透壓的變化、熱休克以及對酒精的耐受性等。此外，海藻糖對於食品、藥物(Higashiyama,2002)及生物科技上皆有貢獻(Spriess & Ivell,2002)，利用添加適當量的海藻糖，可提升動物細胞的存活率(Eroglu et al.,2000)。由於海藻糖之功能性與其作用特性，通過美國食品及藥物檢驗局認證為GRAS(Generally Regarded as Safe)之安全健康食品，所以目前已廣泛地應用於食品、化妝品與醫藥方面。以其安定性而言，已利用於酵素、蛋白質、生物量(biomass)、藥物製備與器官移植方面做為安定劑；疫苗與哺乳動物細胞中做為抗凍劑。以其保水性而言，與微脂粒結合做為化妝品保水劑(Schiraldi et al.,2002)。此外，於生物體中利用基因重組技術生成海藻糖，亦能有效發揮其作用。甘露糖(Mannose)參與許多基本細胞活動，缺乏會造成身體許多問題。甘露糖激發了抗發炎作用及組織再生，在活化巨噬細胞扮演一個積極角色，巨噬細胞可以清除造成發炎的碎物，巨噬細胞至少有四個可結合甘露糖的不同接受器，意味其在發炎碎物收集可發揮適當功能。甘露糖在傷口癒合時的具抗發炎力，其可刺激纖維母細胞製造更多的膠原和蛋白聚醣，讓癒合速度更快，減少疼痛。甘露糖被視為自然的抗發炎物質，可以修正過度活躍的中性白血球以減少被誤導的發炎。所有細胞都含有甘露糖，故其可影響身體所有器官和組織。甘露糖在視網膜的光接受器上亦有發現，其在視力上扮演重要角色，甘露糖的補充可以用在連接其他療法對糖尿病患者白內障的管理。甘露糖具有保存細胞膜新陳代謝物的能力，此代謝物對水晶體有保護作用。

綜觀上述，本發明培養複合海藻甘露糖多醣體的優點，如海藻糖可以讓多醣體聚合物更穩定，因為海藻糖耐高溫，且可以降低梅納反應、防止蛋白質變性、讓聚合多醣體維持安定、保水性高；且本發明每種菇蕈以最佳條件培養，可以產生純度高、品質佳之高分子多醣體成分；另甘露糖可激發抗發炎作用及組織再生，在活化巨噬細胞扮演一個積極角色，巨噬細胞可以清除造成發炎的碎物，巨噬細胞至少有四個可結合甘露糖的不同接受器，意味其在發炎碎物收集可發揮適當功能。甘露糖具有保存細胞膜新陳代謝物的能力，此代謝物對水晶體有保護作用。即甘露糖可輔助及強化多醣體在發炎碎物清除及水晶體保護之功能。

眼表層淚膜失衡、眼表細胞暴露於高滲或高張力環境、或眼瞼異常等情況均會引發淚液分泌減少，眼角膜上皮細胞乾燥，眼睛出現疼痛、搔癢、灼傷、異物感等症狀，即乾眼症之病症，是眼科臨床的主要疾病之一，目前業界已提出許多組合物成分應用於治療及處理乾眼症候群，如人工淚液、添加葡萄糖成分之滴眼液、或特定潤滑劑成分之組合物等。其中「海藻糖」(trehalose)之高保水特性，已將其應用至眼科臨床治療，如直接將海藻糖成分添加於眼藥水中，可治療乾眼症病人(Matsuo et al.,2002)；2003年5月8日公告之日本特許廳之專利公報第2003-128588號中揭露多醣組合物應用於眼科時，具有提高藥物的組織轉移性的效果，已知多醣類組合物作為滴眼劑的基質是有用的，其中以瓊脂(agar)作為滴眼劑的基質，可作為促進藥物向眼內轉移的滴眼劑；2001年9月11日公告之日本特許廳之專利公報第2001-247466號以離子性隱形眼鏡，吸附聚乙烯吡咯烷酮，中和離子電荷，來穩定淚液層的系統，該系統適用於隱形眼鏡用滴眼劑或配戴液。即過去之滴眼液多直接取用多醣類應用，雖然可保水但不持久，且此類小分子糖對眼部細胞並無免疫活化作用。但本發明之複合多醣體是海藻糖與甘露糖在最佳發酵培養天數下的菇蕈多醣體所聚合而成的安全、穩定、質優的複合多醣體聚合物，具持久保水性及因富含β-Glucan及活性胜肽，其可用於活化眼部吞噬細胞；消除眼部細胞殘渣及因自體免疫過高所產生的蛋白質沉澱物，促進細胞再生；也可經由抗氧化，而減少眼部細胞老化，這是一般小分子多醣類及其組合物所無之功效。

鑑於上述習知相關技術之缺失，本發明之主要目的係提供一種海藻甘露糖複合多醣體的製備方法，利用基本的培養基與分離純化步驟，以獲得海藻甘露糖複合多醣體供本發明所用。本發明之另一目的係提供一種能有效與眼部水分結合之安全、穩定之高分子多醣體聚合物，為達上述目的：

本發明物製備過程係將5%的甘露糖(mannose)加5%的海藻糖(trehalose)加入1%的酵母萃取物(yeast extract)混合均勻後，經高溫、高壓滅菌3min分鐘(Autoclave 121℃，1.5Ib)，於室溫下冷卻後、再將靈芝(Ganoderma lucidum)、樟芝(Antrodia comphorata)、巴西磨菇(Agaricus brazil)、雲芝(Coriolus versicolor)及裂褶菌(Schizophy11um commune)等五種菇蕈的菌絲體(Mycelium)、分別加入培養，且不同的菇蕈種類，其最佳的培養時間亦不同，各自最佳的培養時間如下所示：上述五種菇蕈菌絲體是以振盪培養方法將菌絲分別培養，使各種菇蕈菌絲能在培養液中，合成大量的多醣體，再將五種菇蕈菌絲培養液一同混合均勻後，含菌絲的培養液用Polytron PT6000(Switzerland)均質機，以30,000rmp的轉速擊碎、均勻混合3分鐘，將該混合液先經200網目/平方毫米的過濾網過濾後，再應用TAMI Industries(France)出品的50KD(0.30μm之孔隙)的橫掃式陶瓷過濾膜，充分的去除分子量在5萬以下的小分子後，則為菇蕈多醣體液，此液體再以1：4的量倒入純酒精中，於室溫下靜置2~3小時，待沉澱後，取出結晶狀沉澱物，再以CHRIST(Germany)LOC-1冷凍乾燥儀充分乾燥，之後將乾燥粉末回溶於水中，震盪混合均勻後，則可製成滴眼液所應用之海藻糖複合菇蕈多醣體原料。本海藻糖複合菇蕈多醣體原料可單獨製成滴眼液，亦可添加於各種現有滴眼液中，達到活化眼部細胞、促進細胞再生、保濕、抗氧化、減少乾眼症的不適感，對眼睛的保健上具有更大效果。

本發明之另一目的係提供一種能有效與眼部水分結合之安全、穩定之高分子多醣體聚合物，為達上述目的：本發明物製備過程係將5%的甘露糖(mannose)加5%的海藻糖(trehalose)加入1%的酵母萃取物(yeast extract)混合均勻後，經高溫、高壓滅菌3min分鐘(Autoclave 121℃，1.5Ib)，於室溫下冷卻後、再將靈芝(Ganoderma lucidum)、樟芝(Antrodia comphorata)、巴西磨菇(Agaricus brazil)、雲芝(Coriolus versicolor)及裂褶菌(Schizophy11um commune)等五種菇蕈的菌絲體(Mycelium)、分別加入培養，且不同的菇蕈種類，其最佳的培養時間亦不同，各自最佳的培養時間如下所示：上述五種菇蕈菌絲體是以振盪培養方法將菌絲分別培養，使各種菇蕈菌絲能在培養液中，合成大量的多醣體，再將五種菇蕈菌絲培養液以相同體積混合均勻後，經萃取純化後，形成複合海藻甘露糖多醣體聚合物之粉末。取得具免疫促進功效的海藻甘露糖複合多醣體，含β-Glucan及活性胜肽，其可用於活化眼部的吞噬細胞；消除眼部細胞殘渣及因自體免疫過高所產生的蛋白質沉澱物，促進細胞再生；也可經由抗氧化，而減少眼部細胞老化；且此高分子多醣體，可有效與眼部水分結合，達到保濕效果，減少乾眼症的不適感，對眼睛的保健上具有更大效果。

本海藻糖複合菇蕈多醣體原料可單獨製成滴眼液，達到活化眼部細胞、促進細胞再生、保濕、抗氧化、減少乾眼症的不適感，對眼睛的保健上具有更大效果。

實施例1：本海藻糖複合菇蕈多醣體原料可單獨製成滴眼液，本滴眼液之HPLC分析

一、樣品前處理：取1ml Eye Drop樣品溶液以0.45μm濾膜過濾後等待上機。

二、HPLC檢定條件

(一)檢測儀器：使用RI2000 detector曲折率檢知器，並以如表1所述之條件進行分析。

(二)標準品

(三)檢量線

請參閱第1圖，第1圖係本發明所使用之如表2所示之標準品製得之檢量線。

(四)分析結果

請參閱第2圖，如圖所示本發明之多醣體組成物於滯留時間25.69分鐘時流出，並經第1圖所示之檢量線換算可知，本發明之多醣體組成物所含多醣體之分子量介於2,488,857~38,637kDa之間，顯示本分析樣品含大量且高度穩定之多醣體聚合物。

實施例2：本海藻糖複合菇蕈多醣體原料亦可添加於各種現有滴眼液中。

以下係為一含有海藻糖複合菇蕈多醣體原料之眼用滴眼液實施例

第1圖係如表2所示之標準品製得之檢量線；以及第2圖係本發明之多醣體組成物之HPLC層析圖譜。

Claims

一種多醣體組成物，係包含含海藻糖及甘露糖聚合物之多醣體，以及該多醣體之分子量為2,488,857至38,637kDa。
如申請專利範圍第1項所述之多醣體組成物，係供為外用藥物。
如申請專利範圍第2項所述之多醣體組成物，係供為滴眼液。
一種製備如申請專利範圍第1項所述之多醣體組成物的方法，包括：(1)混合5%海藻糖(trehalose)、5%甘露糖(mannose)及1%酵母萃取物(yeast extract)，經滅菌、冷卻後，製得菇蕈菌絲體之培養液；(2)以(1)中所得之菇蕈菌絲體之培養液分別震盪培養菇蕈菌絲體，以聚合大量的多醣體；(3)將(2)中所得之含有多醣體之菇蕈菌絲體之培養液混合，打碎均質，過濾去除菇蕈菌絲體，得到經過濾之混合液；(4)將(3)中所得之混合液與純酒精以1：4容積比混合，於室溫下靜置沉澱；(5)將(4)中所得之沉澱物冷凍乾燥；以及(6)將(5)中所得之乾燥粉末回溶於水中，震盪混合均勻，得到多醣體組成物。
如申請專利範圍第4項所述之方法，其中，該菇蕈選自靈芝(Ganoderma lucidum)、樟芝(Antrodia comphorata)、巴西磨菇(Agaricus brazil)、雲芝(Coriolus versicolor)及裂褶菌(Schizophy11um commune)。
如申請專利範圍第5項所述之方法，其中，該靈芝係培養13至15天。
如申請專利範圍第5項所述之方法，其中，該樟芝係培養20至22天。
如申請專利範圍第5項所述之方法，其中，該巴西磨菇係培養13至15天。
如申請專利範圍第5項所述之方法，其中，該雲芝係培養20至22天。
如申請專利範圍第5項所述之方法，其中，該裂褶菌係培養4至6天。
如申請專利範圍第4項所述之方法，其中，該含有多醣體之菇蕈菌絲體之培養液係以相同體積比混合。
一種醫藥組成物，係包含如申請專利範圍第1項所述之多醣體組成物及選自液態、半固態及固態之載體。
如申請專利範圍第12項所述之醫藥組成物，其中，該載體為滴眼劑。