ES2604471T3 - Fracción de sacárido a partir de trigo, procedimiento de aislamiento y campo de uso de la invención - Google Patents

Fracción de sacárido a partir de trigo, procedimiento de aislamiento y campo de uso de la invención Download PDF

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Abstract

Procedimiento para preparar una fracción obtenida a partir de semillas de trigo germinadas que tiene un peso molecular dentro del intervalo de 3000 a 30000 dáltones, que prevé: a) la germinación de semillas de trigo en agua o en un soporte natural o artificial, hasta que se obtienen plantones; b) el tratamiento térmico de los plantones; c) la maceración del material obtenido en disolución acuosa; d) la eliminación del residuo sólido hasta que se obtiene una primera disolución clara, que se esteriliza; e) la eliminación de las fracciones con pesos moleculares inferiores a 3000 dáltones y superiores a 30000 dáltones, logrando la purificación de la fracción con peso molecular dentro del intervalo de 3000 a 30000.

Description

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Fraccion de sacarido a partir de trigo, procedimiento de aislamiento y campo de uso de la invencion Campo de la invencion
La invencion se refiere al campo de los extractos naturales, en concreto extractos de cereales, y a los procedimientos para su aislamiento.
Tecnica anterior
El uso clfnico y cosmetico de macromoleculas de tipo protefna (tales como, p. ej., los factores de crecimiento) o de tipo glicina (tales como, p. ej., acido hialuronico, almidon no tratado o almidon hidrolizado y fracciones del mismo, otros GAG, glicosaminoglicanos, etc.), asf como los extractos qufmicamente no definidos obtenidos de diversas plantas (por ejemplo, Aloe vera, Centella asiatica, etc.) se ha extendido actualmente, siendo estos productos usados ampliamente, por ejemplo, en enfermedades que implican al tejido epidermico (por ejemplo, heridas o ulceras) o con fines cosmeticos.
En el documento EP 743 323 (a nombre de los mismos solicitantes), por ejemplo, se describen fracciones de sacaridos obtenidas a partir de almidon.
En algunos estudios, veanse, por ejemplo, el documento de D'Agostino y col. "A fraction purified from Triticumvulgare has trophic effects on CaCO-2" [GASTROENTEROLOGY, ELSEVIER, PHILADELPHIA vol. 104, n°4, Suppl, 1 January 1993, p. 819] y en el documento de Fiore y col. "Differential activities of Triticumvulgare extract and its fractions in mouse fibroblasts" [ACTA THERAPEUTICA Vol. 19, n° 2, 1993 paginas 151-162], se describen fracciones de sacaridos que se obtienen sin especificar el procedimiento usado para germinar y crecer las plantas y que tambien contienen una fraccion de peptidos, hexosa y hexosamina.
Estos extractos se usan como agentes estimulantes de la fase de re-epitelizacion y, por tanto, de formacion de cicatriz, tales como agentes calmantes en casos de irritacion cutanea, por ejemplo emolientes, y genericamente en todo tipo de problemas no infecciosos de la piel y mucosas.
La investigacion todavfa se centra en el aislamiento de nuevos compuestos del tipo mencionado anteriormente, tanto para ampliar la disponibilidad de productos usados con los fines anteriormente mencionados, y para aislar compuestos con mayor actividad, como para obtener productos sin costes excesivos tales como, por ejemplo, los factores de crecimiento y diversos de los materiales de glucosa anteriormente indicados.
Sin embargo, tal como ya se ha dicho, todos los extractos naturales anteriormente descritos (incluyendo extractos de trigo) estan constituidos por un numero indeterminado y elevado de sustancias de diversos tipos y/o por macromoleculas, la mayorfa de las cuales no se han identificado; y aun asf no siempre es posible atribuir la actividad a ninguno de los componentes identificados.
Este es otro motivo por el cual los medios para obtener material vegetal y las fracciones que se pueden opcionalmente purificar a partir del mismo todavfa no se han descrito completamente de forma estandarizada.
Por el contrario, y sorprendentemente, la fraccion de la cual trata la presente invencion, ademas de ser identificada y qufmicamente caracterizada, exhibe todas las actividades del extracto total y representa, por tanto, la principal responsable de la accion del extracto total.
Breve descripcion de los dibuios
La Fig. 1 representa los cromatogramas obtenidos al analizar, respectivamente, un blanco de referencia (agua), la fraccion segun la invencion (denominada en el dibujo como la fraccion CP) y la fraccion de la cual se separa la fraccion obtenida en el parrafo (d) del procedimiento segun la invencion, designada TVE en el dibujo.
Resumen de la invencion
Se describen fracciones extrafdas de germenes de trigo macerados en agua, fracciones las cuales tienen un peso molecular dentro del intervalo de 3 a 30 kDalton.
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Descripcion detallada de la invencion
La presente invencion se refiere a una fraccion de un extracto obtenido a partir de germenes de trigo macerados en agua que tienen diversas caractensticas biologicas tfpicas de factores de crecimiento, excepto porque obviamente tiene un origen tanto vegetal como animal, y tiene la estructura qmmica de un polisacarido, no de una protema; dichas completamente inesperadas caractensticas hacen que esta fraccion sea especialmente interesante para la preparacion de farmacos y de productos utiles para el tratamiento de heridas y ulceras.
Mas concretamente, la presente invencion se refiere a una fraccion obtenida a partir de semillas de trigo germinado, en condiciones habitualmente usadas para obtener extractos analogos que ya se conocen, como se ha descrito anteriormente en lo que se dice sobre la tecnica anterior, que tienen una peso molecular dentro del intervalo de 3 a 30 kDalton.
Se debe tener en cuenta que la fraccion segun la invencion esta ausente en semillas no germinadas y que solo - o principalmente - esta fraccion (es dear, la que esta en el intervalo de 3-30 kDalton) tiene las propiedades anteriormente descritas.
Segun la presente invencion, el procedimiento preve la preparacion de un extracto crudo obtenido a partir de trigo germinado segun metodos conocidos y la posterior purificacion de la fraccion activa.
El procedimiento anteriormente mencionado comprende las etapas siguientes:
a) germinacion de semillas de trigo, en cualesquiera condiciones de luz (preferiblemente en oscuridad), humedad (preferiblemente con una humedad superior al 60%), temperatura (preferiblemente a 5-20°C), produciendo brotes preferiblemente crecidos hasta 3-15 cm de altura, en agua y/o en soportes de crecimiento inertes naturales o artificiales.
b) calentamiento del material vegetal obtenido (opcionalmente de forma preventiva triturado hasta un tamano pequeno y con agua anadida) a una temperatura dentro del intervalo de 85-125°C, opcionalmente con la adicion de agua, para preparar la siguiente etapa y para evitar crecimiento microbiano;
c) maceracion del material obtenido, que se coloca en agua (preferiblemente a pH 2-4) y opcionalmente se deja macerar a temperaturas bajas (maximo 10°C);
d) eliminacion del residuo solido mediante filtracion, prensado o prensado, o mediante otros sistemas equivalentes tales como extractores, para obtener una primera disolucion clara (conocida como extracto crudo) que se puede esteri lizar;
e) purificacion de la fraccion con peso molecular entre 3000 y 30000 daltones de la disolucion anteriormente mencionada, para dar, por tanto, una segunda disolucion que tiene un contenido en porcentaje elevado de fraccion activa
f) aislamiento de la fraccion activa purificada, caracterizada por un peso molecular dentro del intervalo de 3000 a 30000, a partir de la segunda disolucion anteriormente mencionada
si es necesario, las semillas se pueden humedecer con agua purificada antes de la etapa a).
La etapa b) y la esterilizacion mencionada en la etapa d) se llevan a cabo segun tecnicas convencionales, preferiblemente en un autoclave.
La etapa c) se lleva a cabo a un pH de entre 2 y 4, preferiblemente durante 1-72 horas.
La etapa c) y la eliminacion del residuo solido de la etapa d) se pueden llevar a cabo mediante un procedimiento de centrifugacion. En este caso se anade la disolucion obtenida en la etapa d) en vez del agua de la etapa c) a los nuevos plantones germinados segun la etapa b) y se repiten las etapas c-d. De esta forma es posible obtener rendimientos mas elevados.
La eliminacion de las fracciones con peso molecular inferior a 3000 y superior a 30000 (etapa e) se puede llevar a cabo mediante procedimientos convencionales conocidos por los expertos en la materia, por ejemplo por medio de filtracion en gel o ultrafiltracion.
Por analogfa, la fraccion de interes se afsla por medio de las tecnicas anteriormente mencionadas.
Los pesos moleculares mencionados hasta ahora pretenden referirse a las membranas de ultrafiltracion usadas para
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purificar la fraccion de la cual trata la presente invencion: tales valores se refieren a protefnas globulares y, por tanto, se deben considerar meramente indicatives del verdadero peso molecular de las fracciones separadas de la misma: razon de mas para seleccionar la fraccion objeto de discusion, que es del tipo sacarido y tiene una estructura lineal y ramificada, por tanto de cualquier tipo menos globular.
En su forma final, la fraccion de la cual trata la presente invencion se puede secar o liofilizar usando procedimientos convencionales o, preferiblemente, dejar en disolucion acuosa con una concentracion conocida y pre-establecida; opcionalmente con adicion de un conservante y/o esterilizada.
El procedimiento genericamente descrito anteriormente se ilustrara mas claramente mediante el siguiente ejemplo especffico:
EJ EMPLO
1. Germinacion
Se distribuyen 5 kg de celulosa de madera humeda en una serie de tanques de acero adecuados; sobre esto se distribuyen, a continuacion, 2,4 kg de semillas de trigo previamente mojadas con agua; las semillas se dejan germinar en oscuridad durante unos dfas (4-10 dfas) en una camara con aire acondicionado hasta que se obtienen plantones de 5-15 cm de altura. Durante el crecimiento, el soporte se humedece diariamente anadiendo una cantidad suficiente de agua.
La temperature de la camara se mantiene dentro del intervalo de 5-20°C; y la humedad relativa es > 60%.
2. Calentamiento
El contenido de los tanques se coloca en recipientes adecuados hermeticamente cerrados y, a continuacion, se trata en autoclave durante 1 hora a 1 atmosfera (“ 121°C).
3. Maceracion y extraccion
El material se transfiere entonces a un recipiente de acero de capacidad adecuada y se anaden 100 l de agua purificada que contiene 120 ml de acido sulfurico al 10% v/v y 60 ml de acido clorhfdrico al 10% v/v. La maceracion se puede llevar a cabo durante 1-72 horas. A continuacion se extrae la fase acuosa a una presion de 300 atmosferas y se elimina la fase solida agotada.
El lfquido asf obtenido (definido como "1er prensado") se suplementa con 120 ml de acido sulfurico al 10% v/v y 60 ml de acido clorhfdrico al 10% v/v y se mezcla con el contenido de un numero equivalente adicional de otros tanques. A continuacion se repite el procedimiento descrito como "1er prensado", obteniendo por tanto el "2° prensado".
Se repiten las mismas operaciones de nuevo, obteniendo por tanto el "3er prensado" y el "4° prensado".
Cuando se pone en contacto con el material vegetal para obtener la extraccion, la fase lfquida se mezcla energicamente y, a continuacion, se mantiene en un lugar frfo (5-9°C) durante aproximadamente 24-72 horas.
El lfquido final tambien se puede mantener en un lugar frfo (5-9°C) durante aproxmadamente de 24 a 72 horas.
4. Filtracion y esterilizacion
El lfquido del 4° prensado se filtra mediante procedimientos convencionales; a continuacion, en recipientes adecuados, se trata en autoclave mediante la aplicacion de un ciclo equivalente a 1 hora a 1 atmosfera.
5. Ultrafiltracion
Usando instrumentacion de ultrafiltracion adecuada con cartuchos que tengan un lfmite nominal de 3 kdaltones, el lfquido obtenido anteriormente se ultrafiltra hasta el maximo permitido por la instrumentacion; se anade agua al lfquido retenido y se repite la ultrafiltracion 2-3 veces para descartar los pesos moleculares inferiores contenidos en la fase elufda.
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A continuacion, usado el mismo procedimiento pero sustituyendo los cartuchos por otros que tengan un lfmite nominal de 30 kdaltones, se ultrafiltra adicionalmente el residuo que contiene los pesos moleculares superiores a 3000 daltones: sin embargo, en este caso el residuo retenido representa los pesos moleculares mayores a 30000 k daltones y se desecha, mientras que la fase elufda contiene la fraccion activa que tiene pesos moleculares dentro del intervalo de 3000 a 30000 daltones.
La disolucion que contiene la fraccion activa se liofiliza (o deseca) a continuacion tal como esta o sobre un soporte adecuado; o se esteriliza (tal como esta, con la adicion de un conservante, por ejemplo fenoxetanol al 2% v/v).
A DATOS QUIMICOS RELATIVOS A LA FRACCION ACTIVA
1. ANALISIS CROMATOGRAFICO DE LA FRACCION
Se selecciono un sistema cromatografico HPAE (de intercambio anionico de alta presion) acoplado a un detector PAD (detector de pulso amperometrico), especialmente indicado para el analisis de carbohidratos.
El sistema cromatografico tiene las siguientes caracterfsticas:
- Sistema de bombas con elucion lineal que tiene un gradiente binario
Eluyente 1: NaOH 0,5 M
Eluyente 2: acetato de sodio 1 M en NaOH 0,5 M
El gradiente se impone mediante el siguiente programa lineal (con flujo constante igual a 1,0 ml/min), donde % 2 indica el porcentaje de eluyente de la bomba 2 respecto a la mezcla total:
PROGRAMADE G
RADIENTE
ETAPA
TIEMPO % eluyente 2
0
0,0 5
1
0,1 5
2
5,0 5
3
15,0 15
4
30,0 15
5
30,1 20
6
40,1 20
7
40,2 30
8
50,2 30
9
50,3 35
10
60,3 35
11
75,0 100
12
76,0 5
13
85,0 5
- Columna cromatografica
Carbopac PA1 (4x250 mm) con pre-columna Carbopac PA1 Guard (10-32) o equivalente, mantenida a una temperatura de 35°C
- Detector PAD provisto de un electrodo de oro, con las siguientes condiciones de funcionamiento:
Programa de deteccion indicativo
Tiempo (seg)
E (volt)
0,00
+0,10
0,20
+0,10 comienzo de la integracion
0,40
+0,10 fin de la integracion
0,41
-2,00
0,42
-2,00
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0,43
+0,60
0,44
-0,10
0,50
-0,10
*Preparaci6n de la disolucion estandar
Se prepara una serie de disoluciones de fraccion activa con concentraciones dentro del intervalo de 4 a 12 mg en 100 ml de agua desionizada a partir de una disolucion de fraccion ACTIVA pura, que se considerara el estandar de referencia; o, alternativamente, usando un estandar de trabajo calibrado frente a un estandar de referenda.
*Procedimiento
Se inyectan 100 pl como el blanco, verificando que el cromatograma relaaonado sea planar con la exclusion de unos cuantos picos debidos a los saltos de gradiente del sistema de eluyente.
A continuacion se inyectan 100 pl de cada una de las disoluaones de ensayo.
El cromatograma de la muestra de fraccion activa purificada tiene un unico pico para Rt 44 minutos, que corresponde en concreto a la fraccion activa (vease Fig. 1, muestra denominada "fraccion CP").
El cromatograma de la muestra de extracto purificado o parcialmente purificado muestra una trayectoria con una serie de picos, entre los cuales el pico para Rt *44 minutos es el correspondiente a la fraccion activa.
2. anAlisis cromatogrAfico DE LA FRACCION DESPUES DE HIDROLISIS
Esta comprobacion de control se realiza para verificar la naturaleza de los monosacaridos individuales que constituyen la estructura del oligosacarido de la fraccion de ensayo. Se usa cromatograffa HPA (de intercambio ionico de alto rendimiento) sobre una muestra hidrolizada.
El tipo de instrumentacion es equivalente al menaonado anteriormente para la comprobadon la fraccion intacta, es decir, no hidrolizada.
Procedimiento
La hidrolisis se realiza anadiendo HCl al 0,35% (v/v) a la fraccion e hidrolizando a 100°, durante 20 horas, sobre una muestra con una concentracion de fraccion activa dentro del intervalo de 5-75 mg/100 ml.
Las condiciones analfticas de la HPA son las siguientes:
Carbopack PA1, columna de 4 x 250 mm Eluyente isocratico NaOH 0,017 N Flujo constante de 1 ml/min Deteccion PED
Volumen de inyeccion: 75 pl de la disolucion de muestra hidrolizada, diluida 1 a 100 con agua.
Se realiza un analisis equivalente usando los monosacaridos mas habituales como estandar.
La muestra que se investiga demostro tener una presencia masiva y predominante de glucosa, en la cual otros picos (correspondientes a otros monosacaridos o similares: manosa, galactosa, glucosamina, pentosa, etc.) estan ausentes o presentes solo como trazas.
Un analisis identico realizado antes de la hidrolis is conduce analogamente a la ausencia de cualquier monosacarido, demostrando que la fraccion esta constituida por una estructura de oligosacaridos.
B. ACTIVIDAD BIOLOGICA DE LA FRACCION
La fraccion segun la presente invencion ha demostrado presentar una actividad in vivo re-epitelizante y curativa pronunciada de heridas y/o ulceras de cualquier tipo, similar a la de los factores de crecimiento de origen animal, y,
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por tanto, se puede usar en la produccion de productos medicinales para el tratamiento de heridas y ulceras.
Tambien muestra, in vitro, una considerable activacion del crecimiento celular en fibroblastos y de la actividad de la ODC.
Tambien se ha demostrado la activacion del mecanismo de hidrolisis de fosfolfpidos con inositol, que es tfpica de factores de crecimiento.
La actividad terapeutica se ilustra a continuacion mediante diversos estudios farmacologicos.
1. ENSAYO DE ESTIMULACION DE CRECIMIENTO DE CELULAS FIBROBLASTOS
Los fibroblastos son celulas que juegan un papel fundamental en el mecanismo de reparacion tisular. El ensayo, por tanto, se realiza para verificar si el efecto curativo del producto se observa como resultado de un mecanismo de estimulacion de crecimiento celular de estos organismos.
Procedimiento
Se mantienen cultivos de fibroblastos 3T3 de raton en un medio DMV suplementado con suero bovino (CS) al 10% v/v, penicilina (10 U/ml). Estos cultivos se cultivan en frascos Falcon de 25 ml a 37°C en una atmosfera humeda que contiene un 5% de CO2 y se subcultivan cada 4-6 dfas. Los cultivos confluentes, por tanto, se lavan con 3 ml de PBS y se tripsinan con tripsina al 0,25% a 37° C. Para desactivar la tripsina se anaden 2 ml de DME y el granulo celular obtenido tras la centrifugacion se diluye con medio de cultivo fresco hasta que se alcanza una densidad adecuada para la diseminacion. El efecto estimulante del palato se ensaya en fibroblastos que se han dejado en un estado quiescente en un medio que contiene bajas concentraciones de CS. Las celulas se siembran con una densidad de aproximadamente 2000-4000 celulas por placa en DME suplementado con CS al 5%. El medio se renueva despues de 18 horas y se sustituye por medio fresco que contiene CS al 0,6% y las celulas se dejan crecer durante otras 48 horas antes de cada ensayo de actividad sucesivo. Para el ensayo en cuestion, el producto (diluido en agua con una concentracion de 20 mg/100 ml) se anade cada dfa con concentraciones crecientes entre el 2 y el 20% v/v a lo largo del periodo de crecimiento. Al final del quinto dfa, las diversas celulas se estimulan tripsinando los cultivos y haciendo un recuento celular en un contador Coulter.
Resultados
La adicion del producto en la dilucion indicada produce una estimulacion marcada dependiente de la dosis del crecimiento celular. El efecto comienza a ser significativo para un porcentaje del 5% del producto (diluido tal como se indico anteriormente) y es maxmo entre el 10 y el 20%, en una cantidad ligeramente inferior a la exhibida por el CS para igual concentracion, pero al menos cuatro veces mayor que la del control, en el punto maximo.
2. ENSAYO DE ACTIVACION DE LA ODC (ORNITINA DESCARBOXILASA)
La ornitina descarboxilasa es la enzima clave en la sfntesis de espermidina-poliamina, catalizando la conversion del amino acido ornitina en putrescina. Estas poliaminas estan co-implicadas en el control de los procesos de multiplicacion celular. El ensayo se lleva a cabo verificando si la accion de estimulacion del crecimiento de fibroblastos producida esta correlacionada con un aumento en la actividad de la ODC.
Procedimiento
La actividad de la ODC se ensaya en celulas 3T3 crecidas en un medio que contiene CS (suero bovino) al 0,6% y se prepara como se ha descrito anteriormente en el ensayo de estimulacion de crecimiento de fibroblastos.
La actividad de la ODC se mide usando el procedimiento descrito por Russell [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 601420 (1968)], 6 horas despues de la adicion del producto (diluido en agua con una concentracion de 20 mg/100 ml), en cantidades crecientes del 1% al 10% v/v.
Resultados
Para las concentraciones y en las condiciones de ensayo el producto muestra - 6 horas despues de la adicion y dependientemente de la dosis - una notable estimulacion de la ODC aproximadamente 4 veces superior a la del
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control y similar a la del CS para igual concentracion.
3. ENSAYO DE LA ESTIMULACION DE LA HIDROLISIS DE FOSFOLIPIDOS CON INOSITOL
Esta ampliamente documentado que uno de los principales mecanismos bioqufmicos por los cuales una sustancia es capaz de activar los procesos responsables de la activacion y de la multiplicacion celular consiste en la estimulacion especffica de la hidrolisis de los fosfolfpidos con inositol de la membrana, lo cual a su vez produce un aumento de mensajeros secundarios, inositol trifosfato (InsP3) y diacilglicerol. Este mecanismo esta fntimamente relacionado con, entre otros, otro sistema de transduccion de senales, la activacion de la tirosina quinasa responsable, por ejemplo, de la accion del EGF (factor de crecimiento epidermico), de la insulina y de los factores tipo-insulina.
Por tanto se considera ventajoso evaluar el efecto del producto sobre la acumulacion de inositol fosfato (como un fndice especffico de la hidrolis is de fosfoinosftidos) en celulas 3T3, tanto en condiciones de referencia como tras la estimulacion con suero CS, que es conocido por ser un activador del metabolismo de fosfolfpidos en fibroblastos.
Procedimiento
La hidrolis is de fosfolfpidos con inositol se ensaya en celulas 3T3 crecidas en un medio que contiene CS (suero bovino) al 0,6% y se prepara como se ha descrito anteriormente en el ensayo de estimulacion de crecimiento de fibroblastos.
Una vez que se logra la quiescencia, las celulas se lavan con medio Ham F-10 (con baja concentracion de inositol) e incuban a 37°C durante 24 horas con la adicion de CS al 0,6% y 0,6 pmol de 2-[3H]-mioinositol durante 24 horas, para marcar los fosfolfpidos con inositol de la membrana. Al final de esta incubacion las celulas se lavan con disolucion tampon Krebs-Henseleit que contiene 10 mmol de LiCl y BSA al 0,1%. A continuacion las celulas se incuban durante 24 horas con cantidades crecientes desde 0 al 20% (v/v) del producto (en disolucion acuosa con una concentracion de 4 mg/100 ml), con y sin un CS al 10%.
A continuacion, los fosfatos con inositol se cuantifican usando la tecnica: el medio de incubacion se aspira y se extraen las celulas con cloroformo/metanol/agua 1/1/1 (v/v), tras una centrifugacion, se toma la fase acuosa y se carga en columnas con 1 ml de Dowex-1 en forma de formiato, las columnas se lavan con 24 ml de agua para eliminar el inositol marcado que no se ha incorporado; los fosfatos con inositol se eluyen entonces mediante un lavado con formiato de amonio 0,2 m y acido formico 0,1 M. La radioactividad se determina entonces mediante espectrometrfa de centelleo.
Resultados
Para las concentraciones y en las condiciones de ensayo el producto muestra una estimulacion marcada y dependiente de la dosis de la hidrolisis de los fosfolfpidos con inositol, aproximadamente 4 veces superior a la del control, y similar a la del equivalente en concentracion de CS. Se debe senalar que la presencia simultanea del producto y de CS conduce a una mayor activacion que la de solo CS (y con solo el producto), lo que sugiere que hay un ventajoso efecto sinergico entre los dos componentes.
4. ENSAYO DE CURACION IN VIVO SOBRE HERIDAS EXPERIMENTALES
El ensayo de curacion in vivo, realizado en animales mediante aplicacion topica, demuestra la eficacia del producto en el tratamiento de heridas.
Procedimiento
El ensayo se realiza en ratas macho de la cepa Wistar con un peso dentro del intervalo de 220 a 250 g. Durante una semana antes del ensayo los animales se mantienen en condiciones controladas de temperatura, humedad y luz, con libre acceso a comida y agua. Los animales se subdividen en grupos experimentales homogeneos que comprenden 10 animales cada uno; un grupo se usa como el de control y se trata con un placebo, el otro grupo se trata con el producto.
La manana del primer dfa de ensayo todos los animales se someten a un procedimiento quirurgico para producir una herida estandar, obtenida de la siguiente manera: tras una anestesia suave (etil uretano al 10% en una dosis de 10
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ml/kg), la region dorso lumbar de cada animal se afeita cuidadosamente, tras ser desinfectada, la piel se corta en torno al borde de un disco de metal de 2,5 cm de diametro, 8,5 en caso de un tratamiento topico, y a continuacion se retira la piel y el tejido subcutaneo usando forceps curvados. Se obtienen heridas sustancialmente identicas en todos los animales. Despues de cada dfa de tratamiento la herida se cubre adecuadamente y los animales se mantienen en jaulas individuales.
La extension de la herida se mide con un plammetro (dibujando la herida en una hoja de papel transparente) cada dfa durante 9 dfas (5 dfas en caso de tratamiento topico).
Tratamiento diario usando aplicacion topica
Las heridas de los animales del grupo de control se tratan con gasa esteril impregnada con placebo, constituido por una solucion fisiologica (NaCl al 0,9%). Las heridas de los animales del otro grupo se tratan con gasa esteril impregnada con el producto, disuelto en agua con una concentracion de 20 mg/100 ml.
Resultados
En los animales tratados con el producto se observa una aceleracion del proceso de reparacion, manifestada mediante una notable reduccion de las areas con herida en comparacion con el grupo de control, de media aproximadamente el 20-30% al final del tratamiento.
PREPARACION DE PRODUCTOS FARMACEUTICOS Y/O COSMETICOS
La fraccion activa de la cual trata la presente invencion se puede usar para preparar productos que tienen actividad farmaceutica o cosmetica.
La dosis puede variar segun la patologfa y el tipo de tejido que se va a tratar, el grado de extension, los parametros del paciente (edad, sexo, peso) y el tipo de composicion farmaceutica o cosmetica. La dosificacion de fraccion activa puede variar tambien en funcion del grado de purificacion de la fraccion usada.
La fraccion de la cual trata la presente invencion se puede administrar en forma de composiciones que contienen una cantidad eficaz de dicha fraccion mezclada con excipientes y sustancias vehfculo convencionales conocidas por los expertos en la materia.
Las composiciones de la presente invencion se pueden preparar usando procedimientos conocidos y tecnicas convencionales.
Pueden estar presentes en la preparacion final otros componentes activos.
A modo de ejemplo de composiciones farmaceuticas y cosmeticas hay viales, lociones, cremas, pomadas, geles, disoluciones, medicaciones, supositorios, ovulos, jabones, espumas, comprimidos, polvos, leches.

Claims (12)

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    REIVINDICACI ONES
    1. Procedimiento para preparar una fracdon obtenida a partir de semillas de trigo germinadas que tiene un peso molecular dentro del intervalo de 3000 a 30000 daltones, que preve:
    a) la germinacion de semillas de trigo en agua o en un soporte natural o artificial, hasta que se obtienen plantones;
    b) el tratamiento termico de los plantones;
    c) la maceracion del material obtenido en disolucion acuosa;
    d) la eliminacion del residuo solido hasta que se obtiene una primera disolucion clara, que se esteriliza;
    e) la eliminacion de las fracciones con pesos moleculares inferiores a 3000 daltones y superiores a 30000 daltones, logrando la purificacion de la fraccion con peso molecular dentro del intervalo de 3000 a 30000.
  2. 2. Procedimiento segun la reivindicacion 1, caracterizado porque la fase a) se lleva a cabo en oscuridad, humedad superior al 60% H.R., temperatura de 5-20°C, produciendo plantones de hasta una altura de 315 cm, en agua o en un soporte de crecimiento artificial inerte.
  3. 3. Procedimiento segun las reivindicaciones 1-2, caracterizado porque la fase b) se lleva a cabo a temperaturas elevadas (85-150°C), opcionalmente con la adicion de agua, y durante 25-120 minutos; asf como porque esta fase se lleva a cabo con material vegetal tal como se obtiene o triturado hasta tamanos de dimensiones reducidas.
  4. 4. Procedimiento segun las reivindicaciones 1-3, caracterizado porque la fase c) se lleva a cabo a un pH de entre 2 y 7 y a baja temperatura (2-10°C).
  5. 5. Procedimiento segun las reivindicaciones 1-4, caracterizado porque la fase d) se lleva a cabo usando una membrana sintetica, un filtro de papel, una prensa o un extractor liquido-solido.
  6. 6. Fraccion de sacarosa que se puede obtener mediante el procedimiento segun las reivindicaciones 1-5, con cualquier grado de purificacion.
  7. 7. Fraccion obtenida segun la reivindicacion 5, como un principio activo o en cualquier proporcion como un componente para uso en el tratamiento de ulceras, heridas, sobre piel o sobre mucosas, o problemas de la piel.
  8. 8. Uso de la fraccion obtenida segun la reivindicacion 5, como un componente para la preparacion de cosmeticos en cualquier proporcion para tratar problemas de la piel.
  9. 9. Composiciones farmaceuticas que contienen una cantidad eficaz de la disolucion de la reivindicacion 5 y/o de la fraccion de la reivindicacion 6 mezcladas con excipientes y sustancias vehfculo convencionales.
  10. 10. Composiciones segun la reivindicacion 9, en forma de viales, lociones, cremas, pomadas, geles, disoluciones, medicaciones, supositorios, ovulos, jabones, espumas, comprimidos, polvos, leches.
  11. 11. Composiciones cosmeticas que contienen una cantidad eficaz del extracto total de la reivindicacion 5 y/o de la fraccion de la reivindicacion 6 mezcladas con excipientes y sustancias vehfculo convencionales.
  12. 12. Composiciones segun la reivindicacion 11 en forma de viales, lociones, cremas, pomadas, geles, disoluciones, medicaciones, supositorios, ovulos, jabones, espumas, comprimidos, polvos, leches.
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