JP6169170B2 - 小麦からのサッカリド画分、単離方法及び本発明の使用分野 - Google Patents
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Description
湿らせた木材セルロース5kgを一連の適したスチールタンク中に分布させる;この上に、次いで、予め水で刺激された小麦種子2.4kgを分布させる;高さが5〜15cmの実生が得られるまで、暗闇にて数日間(4〜10日)空調管理されたチャンバー内において、その種子を発芽させる。生長の間、その支持体は、十分な量の水を加えることにより毎日湿らされる。
タンクの内容物を、密閉された適切な容器に置いて、次に1気圧にて1時間オートクレーブ処理する(約121℃)。
次いで、その材料を適切な容量のあるスチール容器中に移し、10%v/v硫酸120ml及び10%v/v塩酸60mlを含有する精製水100lを加える。解離は1〜72時間進めることができる。次いで、その水相を300気圧の圧力下で抽出し、使い尽くされた固相を除去する。
第4プレスからの液体を通常の方法によりろ過する;次に、1気圧1時間と等しいサイクルを適用して、それを適切な容器中でオートクレーブ処理する。
カットオフが3kダルトンであるカートリッジを備える適切な限外ろ過器具を用いて、先に得た液体を、該器具が認める最大まで限外ろ過する;保持された液体に水を加え、限外ろ過を2〜3回繰り返し、溶出した相中に含まれる低分子量を処分する。
1.画分のクロマトグラフ分析
HPAE(高圧陰イオン交換)クロマトグラフシステムを選択し、特には炭水化物分析に使用されるPAD検出器(パルスアンペロメトリック検出器)と連結させた。
・バイナリ勾配を有する線形溶出のポンプシステム
溶離液1:0.5MのNaOH
溶離液2:0.5MのNaOH中における1Mの酢酸ナトリウム
Carbopac PA1 Guard プレカラム(10〜32)又は同等物付きCarbopac PA1(4×250mm)であり、35℃にて維持される。
・金電極を取り付けられたPAD検出器であり、以下に示す操作条件下にある:
脱イオン水100ml中における濃度が4〜12mgの範囲内にある一連の活性画分溶液を、参照基準として理解される、純粋な活性画分の濃縮溶液に基づいて調製する;又は参照基準に対して較正させた作業標準を用いる。
ブランクとして100μlを注入して、溶離液システムの勾配におけるジャンプによる数ピークを除き、関連クロマトグラムが平面的であることを確認する。
このコントロール検査は、試験画分の多糖構造を構成する個々の単糖の性質を確認するために行われる。
上記画分に0.35%(v/v)HClを加え、100°にて20時間加水分解させることにより、活性画分濃度が5〜75mg/100mlの範囲内にあるサンプルに対して、加水分解を行う。
Carbopack PA1,4×250mmカラム
定組成溶離液 0.017N NaOH
一定流量 1ml/min
PED検出
注入量:水で1〜100に希釈された、加水分解サンプルの溶液75μl
本発明に従う画分は、あらゆるタイプの創傷及び/又は潰瘍について、動物由来の成長因子と同様な、インビボでの顕著な再上皮形成及び治療的活性を持つことが分かった。それ故に、それは、創傷及び潰瘍を治療するための医薬品製造に使用できる。
線維芽細胞は、組織修復機構において基本的な役割を果たす細胞である。それ故に、上記テストは、本産物の治療的効果がこれら生物の細胞増殖刺激機構の結果として観察されるかどうかを確認するために行われる。
3T3マウス線維芽細胞の培養物を、10%v/v仔ウシ血清(CS)、ペニシリン(10U/ml)が補充されたDMV培地に置く。これら培養物を、25mlFalconボトル中、5%CO2を含有する湿潤雰囲気において37℃にて培養し、4〜6日毎に継代する。それ故に、集密的培養物をPBS3mlで洗浄し、0.25%のトリプシンを用いて37℃にてトリプシン処理する。そのトリプシンを不活性化させるため、DME2mlを加え、遠心分離後に得られる細胞ペレットを、播種に適している密度に達するまで、新鮮な培地で希釈する。
示された希釈度での本産物の添加は、細胞増殖の顕著で用量依存的な刺激を生じさせる。その効果は、本産物(先に示されたように希釈したもの)の5%の割合で有意なものになり始め、10〜20%で最大であり、濃度等価性のためのCSで示されたものよりわずかに低い量であるが、最高点ではコントロールと比べて少なくとも4倍大きい。
オルニチンデカルボキシラーゼは、スペルミデン−ポリアミンの合成における重要な酵素であり、オリニチンアミノ酸のプトレシンへの転換を触媒する。これらポリアミンは、細胞増殖の過程を制御する上で補助的にかかわる。上記テストは、作られた線維芽細胞の成長を刺激する作用がODC活性の増加と相関するかどうかを確認することによって行われる。
ODCの活性は、0.6%CS(仔ウシ血清)を含有する培地で成長した3T3細胞においてテストされ、線維芽細胞成長刺激テストにおいて上述したように用意される。
上記濃度で且つ上記テストされた条件下で、本産物は−添加の6時間後に及び用量依存的に−ODCの顕著な刺激を示し、コントロールより約4倍大きく、濃度等価性のためのCSと同程度である。
ある物質が活性化及び細胞増殖に関与する過程を活性化させることが可能である主要な生化学的機構の一つは膜イソシトールリン脂質の加水分解の特異的刺激にあり、それは、順に、第2メッセンジャー、イノシトール三リン酸(InsP3)及びジアシルグリセロールの増加を生じることが文書で広く証明されている。この機構は、とりわけ、シグナル伝達の他のシステムと、例えば、インスリン及びインスリン様の因子の、EGF(上皮増殖因子)の作用に関与するチロシンキナーゼの活性化と密接に関連がある。
イノシトールリン脂質の加水分解は、0.6%CS(仔ウシ血清)を含有する培地で成長した3T3細胞においてテストされ、線維芽細胞成長刺激テストにおいて上述したように用意される。
上記濃度で且つ上記テストされた条件下で、本産物は、イノシトールリン脂質の加水分解の顕著で且つ用量依存的な刺激を示し、コントロールより約4倍大きく、CS濃度等価物と同程度である。注目すべきは、本産物とCSの同時存在が、CS単独(及び本産物単独)よりも大きな活性化に導くことであり、2つの成分の間に有利な相乗効果があることが示唆される。
インビボでの治療テストが、動物に対して局所塗布により行われ、創傷の治療における本産物の有効性を実証する。
上記テストは、220〜250gの範囲の重さがあるウィスター系雄ラットに対して行われる。テスト前の1週間、動物は、温度、湿度及び明るさが制御された条件に置かれる。なお、餌及び水には自由にアクセスできる。動物は、それぞれが10匹の動物を含む同種の実験的グループに細分類される;一方のグループは、コントロールとして使用され、プラセボにより処置され、他方のグループは、本産物で処置される。
コントロールグループの動物の創傷は、生理溶液(0.9%NaCl)からなるプラセボが含浸した無菌ガーゼで処置される。
他方のグループの動物の創傷は、水中に溶解した濃度20mg/100mlである本産物が含浸した無菌ガーゼで処置される。
本産物で処置された動物は、修復過程の加速が観察され、コントロールグループと比較して、創傷領域において顕著な減少が示され、処置の終わりで平均約20〜30%の減少である。
本発明の主題である活性画分は、薬学的及び美容的活性のある製品を調製するために使用されてもよい。
Claims (9)
- 分子量が3,000〜30,000ダルトンの範囲内にある発芽した小麦種子から得られる画分を調製する方法であって、
a)水又は天然若しくは人工支持体上で、実生が得られるまでの、小麦種子の発芽
b)前記実生の加熱処理
c)水溶液中で得られる材料の解離
d)滅菌されている第1透明溶液が得られるまで固形残留物を除去すること
e)分子量が3,000ダルトン未満の画分と分子量が30,000ダルトンを超える画分とを除去し、分子量が3,000〜30,000ダルトンの範囲内にある画分の精製を達成すること
を提供し、
前記段階a)は、暗闇中、60%R.Hを超える湿度、温度5〜20℃で行われ、水又は不活性人工生長支持体上で、高さが3〜15cmにまで至る実生を得、
前記段階b)は、高温(85〜150℃)にて、任意には水を加えて、25〜120分間行われ;また、この段階は、得られたままの又は寸法を小さくしたサイズに粉砕した植物材料に関して行われ、
前記段階c)は、pH2〜7及び低温(2〜10℃)にて行われる、方法。 - 段階d)は、合成膜、ろ紙、プレス、又は液固抽出器を用いて行われる、請求項1に記載の方法。
- 請求項1又は2に記載の方法によって得られるサッカリド画分。
- 請求項1に従って得られる画分であって、皮膚上若しくは粘膜上の潰瘍、創傷又は皮膚の疾患の治療で用いるための活性成分としての、画分。
- 請求項4に記載の画分の使用であって、いずれにしても皮膚の疾患を治療する化粧品の調製のための成分としての使用。
- 賦形剤及び通常のキャリア物質と混合された請求項3に記載の画分を有効量で含有する医薬組成物。
- バイアル、ローション、クリーム、軟膏、ゲル、溶液、薬剤、坐薬、胚珠、せっけん、フォーム、錠剤、粉末、又はミルクの形態である請求項6に記載の組成物。
- 賦形剤及び通常のキャリア物質と混合された請求項3に記載の画分を有効量で含有する化粧品組成物。
- バイアル、ローション、クリーム、軟膏、ゲル、溶液、薬剤、坐薬、胚珠、せっけん、フォーム、錠剤、粉末、又はミルクの形態である請求項8に記載の組成物。
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