CN113244376A - 一种提高免疫促进伤口愈合的药物及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种提高免疫促进伤口愈合的药物及其制备方法。本发明从紫珠草中分离并制备得到的活力多糖具有提高免疫力的效果，与制备得到的多肽以及CX43蛋白的一起具有提高免疫的同时还能够有效治疗皮肤损伤的效果，具有较好的应用价值。

Description

一种提高免疫促进伤口愈合的药物及其制备方法

技术领域

本发明涉及生物领域，更具体的涉及一种提高免疫促进伤口愈合的药物及其制备方法。

背景技术

皮肤是人体最大的器官，更新快，位于体表，易于受伤；伤后机体出现非常协调的愈合过程，包括炎性细胞和组织修复细胞在内的多种细胞成分参与了皮肤伤口的愈合过程。皮肤损伤修复需要经过皮肤细胞严密的编排、整合及分化、迁移、增殖和凋亡过程，才能实现皮肤多层结构的再生。

研究发现，成纤维细胞是构成肉芽组织的主要成分之一，也是合成和分泌胶原、纤维连接蛋白和透明质酸等细胞外基质的主要细胞；成纤维细胞也可通过分泌多种细胞因子来参与创伤愈合；创伤愈合最后的过程是组织改建，包括旧胶原的降解和新胶原的重排和沉积，这是由基质金属蛋白酶及其组织抑制剂共同参与调控的，而成纤维细胞是MMPs和TIMPs的主要分泌细胞。因此，成纤维细胞是创伤愈合中非常重要的组织修复细胞。最近，Vishwanath等用cDNA微阵列(microarray)方法检测了成纤维细胞受血清刺激后8600种基因转录变化情况，发现有显著变化的多数基因都与创伤修复有关，这些基因卞要涉及到细胞周期、细胞增殖、凝血、止血、炎症反应、血管生成、组织改建、细胞骨架再生、重新上皮化、胆固醇生物合成及其他与创伤愈合有关的过程，这不仅证实了成纤维细胞在创伤愈合过程中的重要作用，而且提不成纤维细胞对创伤愈合过程中的诸多环节都有影响。创伤后成纤维细胞功能受多种因素影响，其中细胞因子对成纤维细胞的调控作用尤为重要。成纤维细胞也可通过产生细胞因子来进行自分泌调节。成纤维细胞受PDGF刺激后其超微结构可出现了显著变化，表现为线粒体体积密度和嵴表而积增加，这可能与伤口愈合过程中所需的高能量有关，这进一步证实了PDGF具有促进成纤维细胞功能及伤口愈合的作用。因此，促进纤维细胞功能是治疗皮肤损伤的一个重要方向。

近年来，干细胞与皮肤伤口修复之间的关系越来越受到关注。而在组织工程皮肤的构建中，筛选适宜的种子细胞被认为是最简单有效的方法之一。有研究表明，选择大量体外增殖能力强、细胞功能旺盛的种子细胞，可为皮肤伤口修复提供坚实的基拙。MSCs是中胚层发育的早期细胞，是一类体外易培养、增殖能力强，具有自我更新、多向分化潜能及独特免疫调节特性的异质细胞群。在适当条件下，MSCs可定向分化为中胚层、外胚层及内胚层细胞，如骨细胞、软骨细胞、内皮细胞、肌细胞、脂肪细胞等，广泛参与组织损伤修复的过程。脐带问充质干细胞(UC-MSCs)易获取，且不受伦理道德方面的限制，因此可广泛应用于研究。研究发现，脐带组织含有丰富的MSCs，并可在体外分化成不同的细胞系。脐带由羊膜、脐血管以及沃顿胶(Wharton～sjelly，WJ)组成。从脐带wJ中可分离获得大量具有自我复制、自我更新、高度增殖和多向分化潜能的MSCs(WJ－MSCs)。据文献l6]报告，wJ－MSCs和人汗腺细胞共培养后，可表达细胞角蛋白7(cytokeratin7，CK7)和CK19等汗腺特异性标志物，将其移植到裸鼠创面后，可促进创面受损汗腺结构与功能的修复。毛囊干细胞(hairfolliclestemcellsHFSCs)存在于毛囊外根鞘隆突部，是一种具有未分化性、自我更新和体外增殖能力强等特点的干细胞，与其他成体干细胞一样，又有多向分化的潜能，不仅能分化形成毛囊组织、神经细胞、黑色素细胞和表皮层细胞，还可以被诱导分化成具有一定生理功能的血管平滑肌细胞及结缔组织。毛囊干细胞来源于皮肤、毛发，数量极其可观，取材后无严重的并发症和免疫原性，可供自体移植，是最容易获取的干细胞来源之一。因此，采用干细胞进行皮肤损伤的治疗是研究的一个方向，但是由于干细胞分离制备复杂，保存困难，成本高昂，并不适宜大规模推广。

在研究也会发现，免疫低下的个体中皮肤损伤修复的难度都会相应的提高，因此在治疗皮肤损伤时，提高机体的免疫力的同时再治疗皮损损伤是研究的一个可供方向。植物多糖是广泛存在于植物根、茎、叶中的一种生物大分子，是由多个单糖分子通过糖苷键聚合、脱水形成的含酮基或醛基的多羟基聚合物。因植物多糖来源广泛，廉价易得，且具有促进伤口愈合、可被吸收、对机体无毒等作用，故在皮肤伤口愈合中的作用越来越受到重视。但是目前还没有发现一种能够提高机体免疫力的同时还能够治疗皮肤损伤的植物多糖。

发明内容

本发明的目的，是提供一种将植物多糖与活性肽一起用于治疗皮肤损伤的药物组合物中的用途。

本发明一方面，提供一种紫珠草活力多糖。该活力多糖提取自紫珠草。

一方面，本发明提供一种活力多糖的的提取方法，包括下述步骤：将烘干的紫珠草粉末采用液氮冷冻后研磨，然后置于圆底烧瓶中，用蒸馏水1：20，m/v 75℃回流20min后，提取温度35℃、超声波功率150W、提取时间15min的条件下，超声波辅助提取15min，提取液抽滤除杂，浓缩至原体积1/3，按体积比1∶5加入85％乙醇，冷冻离心10min，反复多次收集沉淀，得活力多糖与蛋白质混合物，沉淀用蒸馏水溶解，活性炭脱色后，用正丁醇∶氯仿＝4∶1，mL/mL，脱蛋白5次，将上清液定容至100mL容量瓶中，于透析袋中截留分子量3500Da透析72h；透析后的样品经冷冻干燥，即得紫珠草活力粗多糖；将粗多糖加入200mL蒸馏水搅拌溶解，离心，取上清，通过DEAE－52离子交换纤维素柱分离。依次用蒸馏水、0.1、0.2、0.2、0.4、0.5mol/L NaCl洗脱，采用硫酸苯酚法检测并合并糖含量多的洗脱部分，冷冻干燥后低温保存即得到活力精多糖。

进一步的，本发明还提供了一种能够促进成纤维细胞增殖的多肽，所述多肽通过文库筛选获得，其氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。

再进一步的，本发明提供一种能够治疗皮肤损伤的药物组合物，所述药物组合物包含活力多糖和多肽以及CX43蛋白；其中活力多糖为采用下述方法制备并获得：将烘干的紫珠草粉末采用液氮冷冻后研磨，然后置于圆底烧瓶中，用蒸馏水1：20，m/v 75℃回流20min后，提取温度35℃、超声波功率150W、提取时间15min的条件下，超声波辅助提取15min，提取液抽滤除杂，浓缩至原体积1/3，按体积比1∶5加入85％乙醇，冷冻离心10min，反复多次收集沉淀，得活力多糖与蛋白质混合物，沉淀用蒸馏水溶解，活性炭脱色后，用正丁醇∶氯仿＝4∶1，mL/mL，脱蛋白5次，将上清液定容至100mL容量瓶中，于透析袋中截留分子量3500Da透析72h；透析后的样品经冷冻干燥，即得紫珠草活力粗多糖；将粗多糖加入200mL蒸馏水搅拌溶解，离心，取上清，通过DEAE－52离子交换纤维素柱分离。依次用蒸馏水、0.1、0.2、0.2、0.4、0.5mol/L NaCl洗脱，采用硫酸苯酚法检测并合并糖含量多的洗脱部分，冷冻干燥后低温保存即得到活力精多糖；其中多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。

本发明进一步的还提供活力多糖和多肽以及CX43蛋白在制备用于治疗皮肤损伤的药物组合物中的用途；其中，活力多糖为采用下述方法制备并获得：将烘干的紫珠草粉末采用液氮冷冻后研磨，然后置于圆底烧瓶中，用蒸馏水1：20，m/v 75℃回流20min后，提取温度35℃、超声波功率150W、提取时间15min的条件下，超声波辅助提取15min，提取液抽滤除杂，浓缩至原体积1/3，按体积比1∶5加入85％乙醇，冷冻离心10min，反复多次收集沉淀，得活力多糖与蛋白质混合物，沉淀用蒸馏水溶解，活性炭脱色后，用正丁醇∶氯仿＝4∶1，mL/mL，脱蛋白5次，将上清液定容至100mL容量瓶中，于透析袋中截留分子量3500Da透析72h；透析后的样品经冷冻干燥，即得紫珠草活力粗多糖；将粗多糖加入200mL蒸馏水搅拌溶解，离心，取上清，通过DEAE－52离子交换纤维素柱分离。依次用蒸馏水、0.1、0.2、0.2、0.4、0.5mol/L NaCl洗脱，采用硫酸苯酚法检测并合并糖含量多的洗脱部分，冷冻干燥后低温保存即得到活力精多糖；其中多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。

本发明进一步的，所述活力多糖的用量为100mg活力多糖/kg，多肽的用量为100μg/kg，CX43蛋白的用量为1mg/kg。

进一步的，所述药物组合物还含有药学上可接受的载体。

有益效果

本发明从紫珠草中分离并制备得到的活力多糖具有提高免疫力的效果，与制备得到的多肽以及CX43蛋白的一起具有提高免疫的同时还能够有效治疗皮肤损伤的效果，具有较好的应用价值。

附图说明

图1活力多糖对脾淋巴细胞增殖的影响

图2脾脏(胸腺)指数结果图

具体实施方式

为了更进一步的说明本发明的目的、技术方案和优点，我们结合以下具体实施例来阐述本发明，这些实施例仅为了更好的说明本发明专利，而不用于限制本发明范围。基于本发明中的实施例，本领域的技术人员在没有做出创造性的情况下所得到的其他所有实施方式均属于本发明所保护的范围。

实施例1紫珠草活力多糖的制备

将烘干的紫珠草粉末10g采用液氮冷冻后研磨，然后置于圆底烧瓶中，用蒸馏水(1：20，m/v)75℃回流20min后，提取温度35℃、超声波功率150W、提取时间15min的条件下，超声波辅助提取15min，提取液抽滤除杂，浓缩至原体积1/3，按体积比1∶5加入85％乙醇，冷冻离心10min，反复多次收集沉淀，得活力多糖与蛋白质混合物，沉淀用蒸馏水溶解，活性炭脱色后，用正丁醇∶氯仿＝4∶1，mL/mL，脱蛋白5次，将上清液定容至100mL容量瓶中，于透析袋中(截留分子量3500Da)透析72h。透析后的样品经冷冻干燥，即得紫珠草活力粗多糖。将粗多糖加入200mL蒸馏水搅拌溶解，离心，取上清，通过DEAE－52离子交换纤维素柱分离。依次用蒸馏水、0.1、0.2、0.2、0.4、0.5mol、L NaCl洗脱，采用硫酸苯酚法检测并合并糖含量多的洗脱部分，冷冻干燥后低温保存即得到活力精多糖。对活力多糖中中性糖、木质素、蛋白质及糖醛酸的含量进行了测定，明确了该多糖物质的组成成分，测定结果如表1所示。

表1活力多糖的组成测定结果(％)

样品	中性糖	木质素	蛋白质	糖醛酸
					活力多糖	93.78±2.57	4.69±0.41	0.31±0.03	1.22±0.04

从表1的结果可以看出，制备得到的活力多糖较为纯净，比现有技术已知的方法制备得到的活力多糖在组成上有很大区别，而且纯度要提高300％以上。

实施例2活力多糖对于免疫力的影响

实验动物BALB/C小鼠，SPF级，60只，按照常规饲养方法进行饲养。实验分组随机分成5组(空白对照组、模型组、活力多糖低剂量组、活力多糖剂量组及阳性对照组)，适应性饲养1周后，以灌胃形式分组给药。空白组和模型组生理盐水灌胃，低、高剂量组分别灌胃100、500mg/kg活力多糖，阳性对照组灌胃盐酸左旋咪唑40mg/kg，灌胃体积均为0.2mL。除空白对照组外，其他各组每天腹腔注射环磷酰胺40mg/kg 1次(诱导免疫降低)，1h后再灌胃相应的供试物，连续喂养30d。

颈椎脱臼法处死小鼠，取小鼠脾脏一分为二，一半按照本领域常规方法制备脾淋巴细胞悬液，调整细胞浓度为5×10⁶个/mL；将细胞加入96孔板中，2000个/孔，适应性培养4h后，更换新鲜培养基，实验组加入刀豆球蛋白(ConA)，使最终质量浓度5μg/mL，对照组加入相同体积的培养基，共培养48h后，利用MTT试剂盒检测细胞增殖效果。具体步骤如下:每孔加入10μL MTT溶液，在细胞培养箱内继续孵育4h.每孔加入100μL Formanzan溶解液，在细胞培养箱内再继续孵育.直至Formanzan全部溶解，570nm测定吸光度.结果如图1所示。

淋巴细胞的增殖和分化是机体免疫应答过程的一个重要阶段.检测淋巴细胞增殖水平是细胞免疫研究和临床免疫功能检测的一种常见方法，ConA刺激T淋巴细胞，使其转化成淋巴母细胞，母细胞会发生增殖反应，因此，通过MTT法测定其光密度值能够体现T细胞的增殖情况。从图1的结果可以看出，与模型组比较，低、高剂量组的脾淋巴细胞增殖率均有显著增加，且呈量效关系(P＜0.01)，这充分说明，活力多糖能够有效的刺激淋巴细胞增殖，具有提高免疫能力的效果。

小鼠NK细胞活性测定：将前述的一半的小鼠脾脏，制备脾细胞悬浮液，调整细胞浓度为2×10⁵个/mL；调整靶细胞(YAC－1细胞)细胞浓度为1×107个/mL；靶细胞和脾淋巴细胞各取50μL(数量比50∶1)，加入准备好的96孔板中，混匀，37℃、CO₂体积分数5％培养4h；设立靶细胞自发释放组(不含效应细胞，用完全培养基代替)和靶细胞最大释放组(额外添加2.5％Triton).1000r/min离心5min，收集上清液，根据乳酸脱氢酶(LDH)释放法试剂盒说明书测定计算NK细胞活性。结果如表2所示。

表2NK细胞活性

由于正常情况下，LDH在胞浆内不能透过细胞膜，但是当细胞受到NK细胞杀伤后，LDH会透过细胞膜释放到细胞外，因此可以通过测定光密度值的变化进而测定NK细胞的杀伤活性。从表2可以看出，活力多肽能够剂量依赖性的提高NK细胞的活力，具有较强的提高免疫力效果。

实施例3多肽促进成纤维细胞增殖的研究

将皮肤成纤维细胞混悬液加入到96孔板中，每孔100μL；将96孔板放入细胞培养箱培养，当细胞贴壁且占90％或布满孔底时，换一次液并按实验设计梯度分别加入SEQ IDNO：1的多肽，使多肽的终浓度为0、10、20、50μg·L^-1，每个浓度至少设置3个复孔。药物作用时间72h后取出，将孔内的液体全部甩出，再向每孔加入100μL的DMSO，振荡器上震荡5min，使用紫外分光光度仪在490nm波长处测定吸光度(OD)值，依照公式计算细胞生长率，细胞生长率＝(OD药物/OD对照)×100％。结果如表3所示。

表3不同浓度多肽作用于皮肤成纤维细胞生长率比较x±s，％

多肽浓度μg·L<sup>-1</sup>	细胞生长率％
		0	85.88±0.44
10	122.43±2.53*
		20	144.56±3.02*
50	188.42±3.96*

从表3可以看出，本发明提供的多肽能够有效的促进皮肤成纤维细胞的增殖，具有较好的增殖效果。

实施例4免疫低下皮肤损伤修复实验

实验动物BALB/C小鼠，SPF级，适应性喂养7天后用戊巴比妥纳45mg/kg腹腔注射麻醉，背部用脱毛剂脱毛，在背部一侧做一个直径1.8cm圆形标记，用碘伏皮肤消毒后沿标记线将全层皮肤切除，创面按压止血，暴露治疗，单笼饲养。空白对照组后续不加环磷酰胺处理。随机分为4组：环磷酰胺模型组、活力多糖组(100mg/kg)，活力多糖加多肽组(100mg活力多糖+多肽100μg/kg)，多肽组(多肽100μg/kg)每组10只，各个组分均按生药量25g/(kg·d)的收率折算后灌胃给药，空白对照组和模型组灌胃等体积蒸馏水，每天1次，连续给药10d。同时，除了空白组腹腔注射生理盐水10ml/kg外，其余3组均在给药的第5，6，7，10天腹腔注射环磷酰胺80mg/kg，造成环磷酰胺免疫低下皮肤损伤小鼠模型。末次给药24h后量取皮肤伤口面积，并称量体重，取血，静置30min后，3500r/min低温离心10min，取上清，待测。脱颈椎处死小鼠后取脾和胸腺并称湿重，脾脏(胸腺)指数＝小鼠脾和胸腺重量/体重X100％。结果如图2所示。

多肽以及多糖对小鼠免疫器官的影响见图2。与空白组比较，模型组小鼠脾系数和胸腺系数均显著降低，表明环磷酰胺所致免疫低下小鼠模型造模成功。与模型组比较多糖组以及多肽+多糖组的脾系数明显升高；与模型组比较，多肽组单独升高有限，但是于多肽与多糖一起使用后却可以提高小鼠脾系数和胸腺系数具有较好的效果。

皮肤损伤的治疗效果见表4所示。

表4皮肤损伤愈合率％

从表4可以看出，小鼠经给药后，创面的绝对面积均显著性缩小，特别是多糖与多肽组合使用后，能够显著的提高创面愈合率，说明多糖和多肽协同作用能够更好的对皮肤损伤的促愈合作用。

实施例5药物的协同实验

间隙连接蛋白43(CX43)重组蛋白(鼠源，购买自上海联迈生物工程有限公司)。

实验动物BALB/C小鼠，SPF级，适应性喂养7天后用戊巴比妥纳45mg/kg腹腔注射麻醉，背部用脱毛剂脱毛，在背部一侧做一个直径1.8cm圆形标记，用碘伏皮肤消毒后沿标记线将全层皮肤切除，创面按压止血，暴露治疗，单笼饲养。空白对照组后续不加环磷酰胺处理。随机分为4组：环磷酰胺模型组，活力多糖加多肽组(100mg活力多糖+多肽100μg/kg)，活力多糖加多肽加CX43蛋白组(100mg活力多糖+多肽100μg+CX43蛋白1mg/kg)每组10只，各个组分均按生药量25g/(kg·d)的收率折算后灌胃给药，空白对照组和模型组灌胃等体积蒸馏水，每天1次，连续给药10d。同时，除了空白组腹腔注射生理盐水10ml/kg外，其余3组均在给药的第5，6，7，10天腹腔注射环磷酰胺80mg/kg，造成环磷酰胺免疫低下皮肤损伤小鼠模型。

皮肤损伤的治疗效果见表5所示。

表5皮肤损伤愈合率％

从表5可以看出，小鼠经给药后，创面的绝对面积均显著性缩小，特别是多糖与多肽组合使用后，能够显著的提高创面愈合率，说明多糖和多肽协同作用能够更好的对皮肤损伤的促愈合作用；而加入蛋白后，进一步的提高了创面愈合率，说明该蛋白同样可以具有较好的促进愈合的效果。

以上结合具体实施方式和范例性实例对本发明进行了详细说明，不过这些说明并不能理解为对本发明的限制。本领域技术人员理解，在不偏离本发明精神和范围的情况下，可以对本发明技术方案及其实施方式进行多种等价替换、修饰或改进，这些均落入本发明的范围内。本发明的保护范围以所附权利要求为准。

序列表

<110> 北京岳昊科技发展有限公司

<120> 一种提高免疫促进伤口愈合的药物组合物及其制备方法

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 25

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Arg Gln Gln Pro Asn Lys Arg Pro Met Phe Tyr Gln Gln Thr Ala Asp

1 5 10 15

Trp Leu Ser Leu Ser Gly Trp Pro Phe

20 25

Claims (5)

1.一种能够治疗皮肤损伤的药物组合物，所述药物组合物包含活力多糖和多肽以及CX43蛋白；其中活力多糖为采用下述方法制备并获得：将烘干的紫珠草粉末采用液氮冷冻后研磨，然后置于圆底烧瓶中，用蒸馏水1：20，m/v 75℃回流20min后，提取温度35℃、超声波功率150W、提取时间15min的条件下，超声波辅助提取15min，提取液抽滤除杂，浓缩至原体积1/3，按体积比1∶5加入85％乙醇，冷冻离心10min，反复多次收集沉淀，得活力多糖与蛋白质混合物，沉淀用蒸馏水溶解，活性炭脱色后，用正丁醇∶氯仿＝4∶1，mL/mL，脱蛋白5次，将上清液定容至100mL容量瓶中，于透析袋中截留分子量3500Da透析72h；透析后的样品经冷冻干燥，即得紫珠草活力粗多糖；将粗多糖加入200mL蒸馏水搅拌溶解，离心，取上清，通过DEAE－52离子交换纤维素柱分离。依次用蒸馏水、0.1、0.2、0.2、0.4、0.5mol/L NaCl洗脱，采用硫酸苯酚法检测并合并糖含量多的洗脱部分，冷冻干燥后低温保存即得到活力精多糖；其中多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示；其中CX43蛋白为重组人源CX43蛋白。

2.活力多糖和多肽以及CX43蛋白在制备用于治疗皮肤损伤的药物组合物中的用途；其中，活力多糖为采用下述方法制备并获得：将烘干的紫珠草粉末采用液氮冷冻后研磨，然后置于圆底烧瓶中，用蒸馏水1：20，m/v 75℃回流20min后，提取温度35℃、超声波功率150W、提取时间15min的条件下，超声波辅助提取15min，提取液抽滤除杂，浓缩至原体积1/3，按体积比1∶5加入85％乙醇，冷冻离心10min，反复多次收集沉淀，得活力多糖与蛋白质混合物，沉淀用蒸馏水溶解，活性炭脱色后，用正丁醇∶氯仿＝4∶1，mL/mL，脱蛋白5次，将上清液定容至100mL容量瓶中，于透析袋中截留分子量3500Da透析72h；透析后的样品经冷冻干燥，即得紫珠草活力粗多糖；将粗多糖加入200mL蒸馏水搅拌溶解，离心，取上清，通过DEAE－52离子交换纤维素柱分离。依次用蒸馏水、0.1、0.2、0.2、0.4、0.5mol/L NaCl洗脱，采用硫酸苯酚法检测并合并糖含量多的洗脱部分，冷冻干燥后低温保存即得到活力精多糖；其中多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示；其中CX43蛋白为重组人源CX43蛋白。

3.如权利要求2所述的用途，其中所述活力多糖的用量为100mg活力多糖/kg，多肽的用量为100μg/kg，CX43蛋白的用量为1mg/kg。

4.如权利要求3所述的用途，进一步的所述药物组合物还含有药学上可接受的载体。

5.如权利要求4所述的用途，其特征在于所述载体为糊精。

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