CN114504598B

CN114504598B - 脐带干细胞在制备抗衰老的药物中的应用

Info

Publication number: CN114504598B
Application number: CN202210166893.1A
Authority: CN
Inventors: 吕荣取; 杨国林
Original assignee: Frontline Exosomes Zhuhai Hengqin Biopharmaceutical R&d Co ltd
Current assignee: Frontline Exosomes Zhuhai Hengqin Biopharmaceutical R&d Co ltd
Priority date: 2022-02-23
Filing date: 2022-02-23
Publication date: 2023-08-22
Anticipated expiration: 2042-02-23
Also published as: CN114504598A

Abstract

本发明涉及脐带干细胞在制备抗衰老的药物中的应用。本发明提供了一种抑制脐带血干细胞衰老的多肽，所述多肽能够有效的抑制脐带血干细胞的衰老，采用该多肽培养的脐带血干细胞在动物模型中也证明了具有比不采用多肽培养的脐带血干细胞更好的抗衰老活性，具有很好的应用价值。

Description

脐带干细胞在制备抗衰老的药物中的应用

技术领域

本发明涉及生物领域，更具体的，涉及脐带血干细胞在抗衰老等方面的应用。

背景技术

干细胞凭借其多分化潜能及高度自我复制功能可以在一定的条件下分化的功能细胞，继而形成各种细胞及机体。因其可塑性，干胞在医学上有着重要的价值、广阔的前景和巨大的发展潜力。

干细胞在皮肤抗衰老等方面中都有较好的应用前景。衰老既是一种自发的必然的过程又是一种自然规律。但是，我们可以采取措施有效地延缓衰老。例如:食用延缓衰老的食物、服用延缓衰老的药物，以及适量的运动等。在科学技术高度发达的今天,采用干细胞抗衰老疗法，不仅可以使皮肤富有弹性和光泽，还能修复损伤组织，由内而外地延缓衰老。与传统保守方法不同，干细胞治疗可以显著延缓衰老。干细胞具有迅速增殖和不断分化的能力，以及能够分泌生长因子的特点。干细胞可以提升衰老机体的自我再生、修复能力,从而可以在一定程度上延缓衰老。

一方面，干细胞进入到人体内后，能够不断增殖。随着细胞数量的不断增长，细胞分化的不断进行，新生的细胞代替受损的细胞，同时激活体内休眠的细胞，逐渐恢复其相应的功能。另一方面，干细胞可以分泌一些生物活性物质和特殊蛋白成分，如VEGF、IGF等生长因子，促进损伤细胞的恢复，预防细胞的进一步衰老。同时干细胞自分泌的成分也被认为是维持干细胞微环境的必要成分。

皮肤中黑色素是由在表皮基底层的黑素细胞产生的。当黑素细胞受到了外界条件刺激时，黑素细胞分泌的酪氨酸在酪氨酸酶和氧化的作用下,经过一系列复杂的生理生化过程，最终生成吲哚聚合物（黑色素）。在细胞代谢的作用下，黑色素颗粒被转运至肌肤表层，使皮肤颜色加深。酪氨酸是黑素细胞产生黑色素的主要原料,在酪氨酸转变为黑素过程中，酪氨酸酶是主要限速酶。相关研究表明，干细胞分泌的生长因子能够抑制酪氨酸酶的生长活性，从而降低酪氨酸酶相关蛋白的表达，最终抑制黑色素的合成，起到美白皮肤的作用。将ADSCs生理氯化钠液注射到小鼠耳背部皮下，经光照射作为实验组。经过处理后，在组织切片中可观察到实验组比对照组皮肤黑色素含量更低，黑素细胞数量更少,黑色素合成沉着减少，从而验证了干细胞分泌的生长因子可使皮肤变白。

健康的皮肤光滑而富有弹性，新陈代谢功能旺盛,这也是很多女性梦寐以求的。但由于年龄逐渐增加，在自然老化和光老化作用下，皮肤中成纤维细胞的合成能力逐渐下降，胶原蛋白含量降低，引起皮肤老化。当胶原蛋白含量降低时，会引起胶原纤维交联固化，失去弹性，同时出现皱纹、皮肤松弛等老化现象。因此,在除皱过程中，提升纤维细胞合成速度和数量，是治疗皮肤皱纹的关键。有关实验发现,经过自体培养植入体内的干胞会分泌一些细胞因子，可以促进成纤维细胞增殖和迁移，并促进胶原纤维的合成，降低基质金属蛋白酶的含量，从而增加真皮胶原含量。干细胞是再造和恢复美丽容颜的根本细胞，它能使松弛下坠的皮肤收紧,恢复弹性，减少皱纹。

现有技术中也有将脐带血干细胞用于美容的研究，比如CN102552099A公开了一种用于皮肤美容修复的复合生物制剂及制备方法，其中从产妇自身脐带血干细胞中提取干细胞活性成分，从产妇自身娩出的胎盘中提取胎盘活性成分，配置成复合生物制剂，用于产妇自身使用，促进产妇表皮干细胞的代谢，从而实现美容修复，护肤祛疤祛斑的目的。但是，目前研究的还不是特别多，效果也不是特别显著，特别是分离的脐带血干细胞本身增殖以及衰老较快，需要进一步的提高脐带血干细胞自身的活性，来提高利用价值。

研究表明，雷帕霉素可以抑制人脐带间充质干细胞衰老，雷帕霉素的作用机制是PI (3) K家族相关丝氨酸苏氨酸蛋白激酶mTOR的活性，主要通过抑制mTOR复合体 1(mTORC1)，参与调控细胞生长以及代谢。研究表明雷帕霉素能增加生命年限。雷帕霉素可抑制BMSC体外培养时出现的衰老现象。但是雷帕霉素也有毒副作用，主要毒副作用包括：头痛，恶心，头晕，鼻出血，关节疼痛。实验室检查异常包括：血小板减少，白细胞减少，血色素降低，高甘油三酯血症，高胆固醇血症，高血糖，肝酶升高（SGOT，SGPT），乳酸脱氢酶升高，低钾，低镁血症等。也有报道称服用雷帕霉素可产生眼皮浮肿，而导致血浆磷酸盐水平较低的原因被认为是以雷帕霉素为基础的免疫抑制治疗延长了磷酸盐自移植肾脏的排泄。与其他免疫抑制剂一样，RAPA有增加感染的机会，有报道称特别有肺炎增加的倾向，因此，开发替代的药物用于提高抑制人脐带间充质干细胞衰老也是研究的重要方向。

发明内容

本发明克服现有技术缺陷，提供了一种有效抑制人脐带间充质干细胞衰老的方法以及将所述人脐带间充质干细胞用于抗衰老中的应用。

本发明一方面，提高了一种特异性抑制丝氨酸苏氨酸蛋白激酶mTOR的活性的药物筛选方法，采用构建靶向mTOR的分子水平药物筛选模型来筛选，具体的，利用昆虫细胞杆状病毒表达系统制备出具有能够磷酸化底物生物活性的 mTOR 截断突变体 mTOR-FKD，模型中各组分含量分别为 mTOR-FKD 4ng，ATP 0.6μM，底物多肽 2μM，使用 mTOR 抑制剂阳性化合物 PI-103作为阳性筛选对照，使用发明人构建的随机肽库作为筛选靶标，筛选获得的抑制活性的多肽TOR-4和TOR-6。其中, TOR-4的氨基酸序列如DWACETHLNEINSR所示（SEQ IDNO：1）。

本发明进一步的提供TOR-4多肽培养的脐带血干细胞的制备方法，将分离制备的脐带血干细胞加入含有100ng/mL 的TOR-4多肽以及10%胎牛血清的DMEM培养基中，在37℃，５％CO₂浓度的培养箱中培养后，收集脐带血干细胞，调整细胞浓度为1*10¹⁰/L备用。

本发明进一步的，还提供一种用于抗衰老的药物组合物，所述药物组合物由脐带血干细胞和黄芪多糖组成。

间充质干细胞可以制备成注射制剂，作为与黄芪多糖溶液分离的溶液使用。具体地，间充质干细胞溶液可以是通过将间充质干细胞悬浮在生理盐水，磷酸盐缓冲盐水，生物相容性盐水或培养基中而获得的溶液。另外，间充质干细胞溶液可以是在保存冷冻的间充质干细胞解冻后原样含有其冷冻液的状态下的溶液。根据给药目的，间充质干细胞溶液可通过加入稀释剂，分散剂，表面活性剂，粘合剂和润滑剂制备成注射制剂，例如水溶液，悬浮液或乳剂。

间充质干细胞的含量可以为1×10⁵细胞/ml至1×10¹⁰间充质干细胞溶液中的细胞/ml。具体地，间充质干细胞可以以1×10⁵的量包含至1×10⁶细胞/ml，2×10⁵细胞/ml至5×10⁷细胞/ml，5×10⁵细胞/ml至2×10⁸细胞/ml，1×10⁶细胞/ml至1×10⁹细胞/ml或2×10⁶细胞/ml至5×10¹⁰细胞/ml。

其中，所述药物组合物是细胞治疗剂，并且可以进一步包含药学上可接受的载体。载体通常用于制造药物，其例子包括乳糖，葡萄糖，蔗糖，山梨醇，甘露醇，淀粉，阿拉伯树胶，磷酸钙，藻酸盐，明胶，硅酸钙，微晶纤维素，聚乙烯吡咯烷酮，纤维素，水，糖浆，甲基纤维素，甲基羟基苯甲酸酯，羟基苯甲酸丙酯，滑石，硬脂酸镁，矿物油等。

此外，本发明的药物组合物还可包含选自润滑剂，润湿剂，甜味剂，调味剂，乳化剂，悬浮剂，防腐剂及其组合的药学上可接受的添加剂。

所述药物组合物可以通过按照常规方法与药学上可接受的载体和赋形剂配制而制备成单位剂型，或者所述制剂可以放置在多剂量容器中。这里，制剂可以是油或水介质中的溶液，悬浮液，糖浆或乳液的形式，或者是提取物，粉末，颗粒或胶囊的形式；并可进一步包含分散剂或稳定剂。

在药物组合物胃肠外给药的情况下，药物组合物可以例如通过皮下，眼部，腹膜内，肌内，口服，直肠，眼眶内，脑内，颅内，脊柱内，心室内，鞘内，鼻内或静脉内途径给药。

给药可以是一次或多次，或1-3次，其中特别提到3次。在重复给药的情况下，给药可以以7天，14天，21天或28天的间隔进行。优选地，给药可以间隔28天进行。在大剂量给药的情况下，可以每天多次给药。

如果需要，黄芪多糖和间充质干细胞可以根据本领域中使用的常规方法，给药途径和剂量适当地给予个体。作为给药途径的一个例子，可以提及注射给药。另外，可以根据本领域已知的方法选择合适的剂量和给药次数，实际给药量和给药量可由各种因素适当确定，如预防或治疗的症状类型，给药途径，性别，健康状况，饮食，个体年龄和体重以及疾病的严重程度。

进一步的，本发明还提供了SEQ ID NO：1的多肽在促进脐带血干细胞抗衰老中的应用。

进一步的，本发明的多肽通过小鼠实验也证实了具有安全性好，对小鼠无明显毒副作用。

有益效果

本发明提供了一种抑制脐带血干细胞衰老的多肽，所述多肽能够有效的抑制脐带血干细胞的衰老，采用该多肽培养的脐带血干细胞在动物模型中也证明了具有比不采用多肽培养的脐带血干细胞更好的抗衰老活性以及改善皮肤含水率的效果，具有很好的应用价值。

附图说明

图1 超氧化物歧化酶活性检测结果图

图2 羟脯氨酸含量检测结果图

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

实施例1 特异性抑制丝氨酸苏氨酸蛋白激酶mTOR的活性的药物筛选

按照现有技术“靶向蛋白激酶 IKKβ 和 mTOR 的抗肿瘤药物分子水平筛选模型的建立”中的方法，构建靶向mTOR的分子水平药物筛选模型，具体的，利用昆虫细胞杆状病毒表达系统制备出具有能够磷酸化底物生物活性的 mTOR 截断突变体 mTOR-FKD，模型中各组分含量分别为 mTOR-FKD 4ng，ATP 0.6μM，底物多肽 2μM，使用 mTOR 抑制剂阳性化合物PI-103作为阳性筛选对照，使用发明人构建的随机肽库作为筛选靶标，共计筛选获得7个有抑制活性的多肽，其中TOR-4和TOR-6多肽的抑制效果最强，与PI-103的IC50 值154.16±2.14nM相比，TOR-4的IC50 值为76.18±0.52nM，TOR-6的IC50 值为51.72±1.28nM。其中,TOR-4的氨基酸序列如DWACETHLNEINSR所示。

实施例2 脐带血干细胞的分离、鉴定

获取脐带，放入生理盐水中保湿，置于超净工作台中，用含有１％体积青链霉素的PBS对脐带进行清洗，用镊子去除脐带动静脉，小心剥出华通氏胶，用无菌组织剪剪成直径为1.5mm²大小组织块。D-Hanks缓冲液冲洗后，把组织块放置含有10%胎牛血清的DMEM培养基，在37℃，５％CO₂浓度的培养箱中培养。第30h半量换液，以后每隔３～４ｄ半量换液。组织块周围均有细胞出现时，移出组织块到新的培养皿继续培养，当每组细胞融合率达到80％－90％左右时，移除组织块并按1:2的比例传代，到第18天时收集细胞进行实验。

吸取培养液，0.01mol/L PBS缓冲液冲洗3次后，用0.25%胰酶和0.02%EDTA消化，消化结束后，收集细胞，500r/min离心收集细胞，弃上清，加入PBS缓冲液，吹打悬起细胞，重复2次。分装。分别加入小鼠抗人PE或FIFC标记的单抗CD29、CD34、CD44、CD105、CD106抗体，在4摄氏度下孵育30min，用PBS洗涤1次，1000r/min离心5min，用500微升的PBS重悬细胞，然后上流式细胞仪检测。结果显示，脐带血干细胞高表达CD29和CD44、CD105，几乎不表达CD34和CD106，表明制备了合格的脐带血干细胞。

实施例3 TOR-4多肽对脐带血干细胞的影响

取生长良好的细胞，胰蛋白酶消化后细胞染色确定活细胞计数在95%以上，以含10%FBS、VEGF(10ng／m1)的DMEM培养液调整细胞浓度为1×10⁵／ml，分别加入96孔细胞培养板，每孔0.1mL，置于5CO₂、37℃培养箱中培养24h，细胞贴壁后加入含TOR-4多肽的上述培养液0.1ml。实验分6组加样，浓度分别为0.1，1，10，l00，1000ng／ml，对照组加培养液，阳性对照为雷帕霉素，浓度分别为0.1，1，10，l00，1000ng／ml，每组设6个复孔，培养96h后，常规操作，按测量波长492nm应用酶标仪测定各孔吸光度(A)值；以对照组细胞吸光度为基准，添加药物的增殖促进效率的结果如表1所示。

表1 不同浓度TOR-4多肽对干细胞增殖的影响

从表1可以看出，TOR-4多肽对于脐带血干细胞具有一定的促进增殖的作用，其增殖效果比雷帕霉素的效果稍有提高，*表示P<0.05有统计学意义。

实施例4 TOR-4多肽对于脐带血干细胞凋亡的影响

脐带血干细胞单细胞悬液接种后，无血清DMEM培养液培养24h使细胞周期同步化，培养细胞分对照组和实验组，对照组加入培养液，实验组加入含不同浓度TOR-4多肽的培养液(10、100、1000ng／m1)，继续培养72h，消化收集细胞处理后经流式细胞仪检测，实验重复三次。结果如表2所示。

表2 不同浓度TOR-4多肽对干细胞凋亡的影响

从表2可以看出，相比于对照，TOR-4多肽能够有效的降低脐带血干细胞的凋亡率，具有较好的抑制凋亡效果。

实施例5 TOR-4多肽培养的脐带血干细胞的制备

将实施例2分离制备的脐带血干细胞加入含有100ng/mL 的TOR-4多肽以及10%胎牛血清的DMEM培养基中，在37℃，５％CO₂浓度的培养箱中培养后，收集脐带血干细胞，调整细胞浓度为1*10¹⁰/L备用。

实施例6 对照的脐带血干细胞的制备

将实施例2分离制备的脐带血干细胞加入到含有10%胎牛血清的DMEM培养基中，在37℃，５％CO₂浓度的培养箱中培养后，收集脐带血干细胞，调整细胞浓度为1*10¹⁰/L备用。

实施例7 黄芪多糖的制备

称取干燥粉碎黄芪300g，加入蒸馏水（10倍量），于80℃条件下提取3次，过滤，滤过液浓缩至约500mL，加入无水乙醇使乙醇质量浓度为800mL/L，放置过夜，沉淀物加水溶解，过滤，应用Sevag法除去蛋白5次，用氨水调整pH值至8.0，加入30／L过氧化氢溶液，于37℃水浴中放置12h，过滤，滤过液置透析袋中流水透析12h，液体浓缩后再用乙醇沉淀，放置过夜，用无水乙醇及丙酮洗涤沉淀物，干燥，得白色粉末状粗多糖，即为黄芪多糖。

实施例8TOR-4多肽培养的脐带血干细胞的抗衰老实验

将ICR小鼠（SPF级别，重量25g左右，雌雄各半）适应性饲养1周。除对照组之外，实验组和模型组每天颈背部皮下注射5%D-半乳糖，给药量为500mg/kg，连续8周，对照组则给予相同体积生理盐水。

造模第1周后，干细胞治疗组经小鼠尾静脉输注脐带血干细胞悬液0.2mL/只，以后每2周1次，共4次，阳性对照黄芪多糖治疗组：每日腹腔注射200mg/kg黄芪多糖，注射体积为0.2mL；联合治疗组：干细胞+黄芪多糖组：小鼠尾静脉输注脐带血干细胞悬液0.1mL/只，以后每2周1次，共4次，同时每日腹腔注射100mg/kg黄芪多糖，注射体积为0.1mL；对照组是尾静脉给予等量空白细胞培养液。

样本采集：将小鼠背部剃毛，于末次给药12h后摘取眼球，取血1.5mL放入EP管中，以3500r/min离心15min，分离血清，待测。取血后，取小鼠皮肤分别用预冷的4摄氏度生理盐水冲洗表面残血，滤纸吸干水分。

衰老指标检测：超氧化物歧化酶活性检测，采用WST-1法检测，按照试剂盒说明进行，酶标仪450nm波长处测定。结果如图1所示。

从图1的结果可以看出，在血清中，TOR-4多肽培养的脐带血干细胞治疗组、对照的脐带血干细胞治疗组、黄芪多糖阳性对照组以及联合治疗组均可以显著改善衰老小鼠的抗氧化能力，提高超氧化物歧化酶的活性，与模型组之间的差异具有显著性意义，P<0.05。其中联合治疗组的超氧化物歧化酶的活性达到了83.2±4.0U/mg，效果显著。

羟脯氨酸含量检测：组织样本酸水解法，按照试剂盒说明进行，半自动生化仪550nm处检测。结果如图2所示。

从图2的结果可以看出，模型组小鼠皮肤中的羟脯氨酸含量显著低于对照组。TOR-4多肽培养的脐带血干细胞治疗组、对照的脐带血干细胞治疗组、黄芪多糖阳性对照组以及联合治疗组均可以显著提高衰老小鼠的羟脯氨酸含量，延缓皮肤衰老。，组间比较差异有显著性意义，P<0.05。联合治疗组的羟脯氨酸含量达到了3.51±0.02mg/g，比对照组的含量还有所提高。

序列表

<110> 北京岳淘生物科技有限公司

<120> 脐带干细胞在制备抗衰老的药物及相关美容产品中的应用

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Asp Trp Ala Cys Glu Thr His Leu Asn Glu Ile Asn Ser Arg

1 5 10

Claims

1. 活化的脐带干细胞联合黄芪多糖在制备抗衰老药物中的应用；其中，活化的脐带干细胞是将脐带干细胞在含有SEQ ID NO：1所述的TOR-4多肽的干细胞培养基中培养后获得的。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述药物中进一步含有药学上可接受的载体。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述药学上可接受的载体包括乳糖，葡萄糖，蔗糖，山梨醇，甘露醇，淀粉，阿拉伯树胶，磷酸钙，藻酸盐，明胶，硅酸钙，微晶纤维素，聚乙烯吡咯烷酮，纤维素，糖浆，甲基纤维素，甲基羟基苯甲酸酯，羟基苯甲酸丙酯，硬脂酸镁或矿物油。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于药物还包含润滑剂，润湿剂，调味剂，乳化剂，防腐剂及其组合的药学上可接受的添加剂。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于所述药物通过常规方法与药学上可接受的载体和赋形剂配制而制备成单位剂型。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于所述剂型是油或水介质中的溶液，悬浮液或乳液的形式，或者是粉末，颗粒或胶囊的形式。