WO2024057970A1

WO2024057970A1 - 緑茶エキスを含んでなる、ｃｃｎ２の発現を促進するための組成物

Info

Publication number: WO2024057970A1
Application number: PCT/JP2023/032054
Authority: WO
Inventors: 早織米田; 重良藤原
Original assignee: 株式会社資生堂
Priority date: 2022-09-14
Filing date: 2023-09-01
Publication date: 2024-03-21

Abstract

ＣＣＮ２の発現を促進させるための組成物が開示される。この組成物は、緑茶エキスを含んでなる。

Description

緑茶エキスを含んでなる、ＣＣＮ２の発現を促進するための組成物

関連出願の参照

　本特許出願は、先に出願された日本国における特許出願である特願２０２２－１４６４０９号（出願日：２０２２年９月１４日）に基づく優先権の主張を伴うものである。この先の特許出願における全開示内容は、引用することにより本明細書の一部とされる。

　本発明は、緑茶エキスを含んでなる、ＣＣＮ２の発現を促進するための組成物に関する。

　ＣＣＮファミリーは、基本的な生物学的プロセス（例えば、細胞の増殖、接着、遊走、分化、創傷治癒、血管新生等）に関与するタンパク質である。このＣＣＮファミリーには６種の異なるサブタイプ（ＣＣＮ１～６）が存在することが知られており、各サブタイプの生理的意義や疾患との関連について様々な研究がなされている。

　その中でもＣＣＮ２は、結合組織成長因子（ｃｏｎｎｅｃｔｉｖｅ　ｔｉｓｓｕｅ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ：ＣＴＧＦ）として知られる因子であり、例えば、線維芽細胞の増殖促進、細胞外基質産生促進、結合組織増殖促進、軟骨細胞の増殖、細胞分化の促進、創傷治癒、および線維性疾患に関与することが報告されている（特許文献１）。また、この他にも、ＣＣＮ２は腎疾患や癌に関与することも報告されている（特許文献２）。したがって、ＣＣＮ２を適切に制御することにより、様々な疾患の治療や身体機能の改善につながることが期待される。

　このようなＣＣＮ２を制御する例として、例えば、チョウマメの抽出物、およびニオイタコノキの抽出物が、ヒト皮膚線維芽細胞において、ＣＣＮ１およびＣＣＮ２の発現を促進させることが報告されている（特許文献１）。また、ＣＣＮ３遺伝子発現またはＣＣＮ３活性レベルを調節することにより、ＣＣＮ２の活性を調節する方法も報告されている（特許文献２）。

特開２０２２－０２２５９０号公報特表２００８－５２６８９０号公報

　本発明は、ＣＣＮ２の発現を促進させるための組成物を提供する。

　本発明者らは、緑茶エキスがＣＣＮ２の発現を促進させることを見出した。本発明はこれらの知見に基づくものである。

　本発明によれば、以下の発明が提供される。
（１）緑茶エキスを含んでなる、ＣＣＮ２の発現を促進するための組成物。
（２）ヒドロキシプロリンおよび／またはＮアセチルグルコサミンの産生を促進するための、（１）に記載の組成物。
（３）クエン酸回路の機能を活性化するための、（１）に記載の組成物。
（４）ＡＴＰの産生を促進するための、（１）に記載の組成物。
（５）皮膚のハリを改善するための、（１）に記載の組成物。
（６）局所用組成物である、（１）～（５）のいずれかに記載の組成物。
（７）溶液、懸濁液、分散液、エマルジョン、クリーム、軟膏、ゲル、ローション、フォーム、ペースト、またはスプレーの形態である、（６）に記載の組成物。
（８）化粧用組成物である、（１）～（７）のいずれかに記載の組成物。
（９）ＣＣＮ２の発現の促進を目的とする薬剤の製造のための、緑茶エキスの使用。
（１０）ヒドロキシプロリンおよび／またはＮアセチルグルコサミンの産生の促進を目的とする薬剤の製造のための、（９）に記載の使用。
（１１）クエン酸回路の機能の活性化を目的とする薬剤の製造のための、（９）に記載の使用。
（１２）ＡＴＰの産生の促進を目的とする薬剤の製造のための、（９）に記載の使用。
（１３）皮膚のハリの改善を目的とする薬剤の製造のための、（９）に記載の使用。
（１４）緑茶エキスを含んでなる組成物の、ＣＣＮ２の発現を促進するための使用。
（１５）ヒドロキシプロリンおよび／またはＮアセチルグルコサミンの産生を促進するための、（１４）に記載の使用。
（１６）クエン酸回路の機能を活性化するための、（１４）に記載の使用。
（１７）ＡＴＰの産生を促進するための、（１４）に記載の使用。
（１８）皮膚のハリを改善するための、（１４）に記載の使用。
（１９）前記組成物が局所用組成物である、（１４）～（１８）のいずれかに記載の使用。
（２０）前記組成物が溶液、懸濁液、分散液、エマルジョン、クリーム、軟膏、ゲル、ローション、フォーム、ペースト、またはスプレーの形態である、（１９）に記載の使用。
（２１）前記組成物が化粧用組成物である、（１４）～（２０）のいずれかに記載の使用。
（２２）ＣＣＮ２の発現を促進するための、緑茶エキス。
（２３）ヒドロキシプロリンおよび／またはＮアセチルグルコサミンの産生を促進するための、（２２）に記載の緑茶エキス。
（２４）クエン酸回路の機能を活性化するための、（２２）に記載の緑茶エキス。
（２５）ＡＴＰの産生を促進するための、（２２）に記載の緑茶エキス。
（２６）皮膚のハリを改善するための、（２２）に記載の緑茶エキス。
（２７）被験体において、ＣＣＮ２の発現を促進するための方法であって、緑茶エキスを含んでなる組成物の有効量を投与することを含む、方法。
（２８）ヒドロキシプロリンおよび／またはＮアセチルグルコサミンの産生を促進するための、（２７）に記載の方法。
（２９）クエン酸回路の機能を活性化するための、（２７）に記載の方法。
（３０）ＡＴＰの産生を促進するための、（２７）に記載の方法。
（３１）皮膚のハリを改善するための、（２７）に記載の方法。
（３２）前記組成物が局所用組成物である、（２７）～（３１）のいずれかに記載の方法。
（３３）前記組成物が溶液、懸濁液、分散液、エマルジョン、クリーム、軟膏、ゲル、ローション、フォーム、ペースト、またはスプレーの形態である、（３２）に記載の方法。
（３４）前記組成物が化粧用組成物である、（２７）～（３３）のいずれかに記載の方法。
（３５）ヒドロキシプロリンおよび／またはＮアセチルグルコサミンの産生を促進するための、ＣＣＮ２発現促進剤を含んでなる、組成物。
（３６）クエン酸回路の機能を活性化するための、ＣＣＮ２発現促進剤を含んでなる、組成物。
（３７）ＡＴＰの産生を促進するための、ＣＣＮ２発現促進剤を含んでなる、組成物。
（３８）皮膚のハリを改善するための、ＣＣＮ２発現促進剤を含んでなる、組成物。
（３９）ＣＣＮ２発現促進剤が緑茶エキスである、（３５）～（３８）のいずれかに記載の組成物。
（４０）局所用組成物である、（３５）～（３９）のいずれかに記載の組成物。
（４１）溶液、懸濁液、分散液、エマルジョン、クリーム、軟膏、ゲル、ローション、フォーム、ペースト、またはスプレーの形態である、（４０）に記載の組成物。
（４２）化粧用組成物である、（３５）～（４１）のいずれかに記載の組成物。
（４３）ヒドロキシプロリンおよび／またはＮアセチルグルコサミンの産生の促進を目的とする薬剤の製造のための、ＣＣＮ２発現促進剤の使用。
（４４）クエン酸回路の機能の活性化を目的とする薬剤の製造のための、ＣＣＮ２発現促進剤の使用。
（４５）ＡＴＰの産生の促進を目的とする薬剤の製造のための、ＣＣＮ２発現促進剤の使用。
（４６）皮膚のハリの改善を目的とする薬剤の製造のための、ＣＣＮ２発現促進剤の使用。
（４７）ＣＣＮ２発現促進剤が緑茶エキスである、（４３）～（４６）のいずれかに記載の使用。
（４８）ＣＣＮ２発現促進剤を含んでなる組成物の、ヒドロキシプロリンおよび／またはＮアセチルグルコサミンの産生を促進するための使用。
（４９）ＣＣＮ２発現促進剤を含んでなる組成物の、クエン酸回路の機能を活性化するための使用。
（５０）ＣＣＮ２発現促進剤を含んでなる組成物の、ＡＴＰの産生を促進するための使用。
（５１）ＣＣＮ２発現促進剤を含んでなる組成物の、皮膚のハリを改善するための使用。
（５２）ＣＣＮ２発現促進剤が緑茶エキスである、（４８）～（５１）のいずれかに記載の使用。
（５３）前記組成物が局所用組成物である、（４８）～（５２）のいずれかに記載の使用。
（５４）前記組成物が溶液、懸濁液、分散液、エマルジョン、クリーム、軟膏、ゲル、ローション、フォーム、ペースト、またはスプレーの形態である、（５３）に記載の使用。
（５５）前記組成物が化粧用組成物である、（４８）～（５４）のいずれかに記載の使用。
（５６）ヒドロキシプロリンおよび／またはＮアセチルグルコサミンの産生を促進するための、ＣＣＮ２発現促進剤。
（５７）クエン酸回路の機能を活性化するための、ＣＣＮ２発現促進剤。
（５８）ＡＴＰの産生を促進するための、ＣＣＮ２発現促進剤。
（５９）皮膚のハリを改善するための、ＣＣＮ２発現促進剤。
（６０）被験体において、ヒドロキシプロリンおよび／またはＮアセチルグルコサミンの産生を促進する方法であって、ＣＣＮ２発現促進剤を含んでなる組成物の有効量を投与することを含む、方法。
（６１）被験体において、クエン酸回路の機能を活性化する方法であって、ＣＣＮ２発現促進剤を含んでなる組成物の有効量を投与することを含む、方法。
（６２）被験体において、ＡＴＰの産生を促進する方法であって、ＣＣＮ２発現促進剤を含んでなる組成物の有効量を投与することを含む、方法。
（６３）被験体において、皮膚のハリを改善する方法であり、ＣＣＮ２発現促進剤を含んでなる組成物の有効量を投与することを含む、方法。
（６４）ＣＣＮ２発現促進剤が緑茶エキスである、（６０）～（６３）のいずれかに記載の方法。
（６５）前記組成物が局所用組成物である、（６０）～（６４）のいずれかに記載の方法。
（６６）前記組成物が溶液、懸濁液、分散液、エマルジョン、クリーム、軟膏、ゲル、ローション、フォーム、ペースト、またはスプレーの形態である、（６５）に記載の方法。
（６７）前記組成物が化粧用組成物である、（６０）～（６６）のいずれかに記載の方法。

　本発明によれば、ＣＣＮ２の発現を促進させるための組成物が提供される。本発明の組成物により、ヒドロキシプロリンおよび／またはＮアセチルグルコサミンの産生を促進することも可能である。また、本発明の組成物により、クエン酸回路の機能を活性化することも可能である。また、本発明の組成物により、ＡＴＰの産生を促進することも可能である。また、本発明の組成物により、ミオイノシトール１－リン酸またはミオイノシトール３－リン酸等の産生を促進することも可能である。また、本発明の組成物により、皮膚のハリを改善することも可能である。

図１は、リコンビナントＣＣＮ２タンパク質が血管周皮細胞におけるクエン酸の量に与える影響を評価した結果を表す。図２は、リコンビナントＣＣＮ２タンパク質が血管周皮細胞におけるイソクエン酸の量に与える影響を評価した結果を表す。図３は、リコンビナントＣＣＮ２タンパク質が血管周皮細胞におけるコハク酸の量に与える影響を評価した結果を表す。図４は、リコンビナントＣＣＮ２タンパク質が血管周皮細胞におけるフマル酸の量に与える影響を評価した結果を表す。図５は、リコンビナントＣＣＮ２タンパク質が血管周皮細胞におけるリンゴ酸の量に与える影響を評価した結果を表す。図６は、リコンビナントＣＣＮ２タンパク質が血管周皮細胞におけるＮＡＤＨの量に与える影響を評価した結果を表す。図７は、リコンビナントＣＣＮ２タンパク質が血管周皮細胞におけるＡＭＰの量に与える影響を評価した結果を表す。図８は、リコンビナントＣＣＮ２タンパク質が血管周皮細胞におけるＡＴＰの量に与える影響を評価した結果を表す。図９は、リコンビナントＣＣＮ２タンパク質が血管周皮細胞におけるミオイノシトール１-リン酸の量に与える影響を評価した結果を表す。図１０は、リコンビナントＣＣＮ２タンパク質が血管周皮細胞におけるミオイノシトール３-リン酸の量に与える影響を評価した結果を表す。図１１は、リコンビナントＣＣＮ２タンパク質が血管周皮細胞におけるヒドロキシプロリンの量に与える影響を評価した結果を表す。図１２は、リコンビナントＣＣＮ２タンパク質が血管周皮細胞におけるＮ－アセチルグルコサミン６－リン酸の量に与える影響を評価した結果を表す。図１３は、緑茶エキスが表皮角化細胞におけるＣＣＮ２遺伝子発現量に与える影響を評価した結果を表す。

発明の具体的説明

　本発明によれば、ＣＣＮ２の発現を促進させるための組成物が提供され、該組成物は、緑茶エキスを含んでなる。また、本発明によれば、治療上有効な量の緑茶エキスを含んでなる組成物を、それを必要とする被験体に投与することを含んでなる、ＣＣＮ２の発現を促進させるための方法が提供される。さらに、本発明によれば、ＣＣＮ２の発現の促進を目的とする薬剤の製造における、緑茶エキスの使用が提供される。さらに、本発明によれば、緑茶エキスを含んでなる組成物の、ＣＣＮ２の発現を促進するための使用が提供される。さらに、本発明によれば、ＣＣＮ２の発現を促進するための、緑茶エキスが提供される。

　ＣＣＮ２は、結合組織成長因子（ｃｏｎｎｅｃｔｉｖｅ　ｔｉｓｓｕｅ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ：ＣＴＧＦ）として知られる因子であり、したがって、本発明の、ＣＣＮ２の発現を促進させるための組成物は、特に限定されるわけではないが、結合組織に直接的または間接的に作用してもよい。したがって、本発明の組成物は、結合組織に作用する薬剤として用いることもできる。このような薬剤は、特に限定されるわけではないが、美肌効果（例えば、ハリがある肌の維持、しわ・たるみの予防・改善、血管安定化等）、アトピー性皮膚炎の改善、創傷治癒促進、発毛促進、軟骨再生、軟骨の減少が原因で発症する疾患（例えば、変形性関節症、関節リウマチ等）の改善等の様々な効果が期待できる。このような薬剤は、医師等により行われる治療目的で用いてもよく、美容目的で用いてもよく、保健機能食品等の食品として用いてもよい。

　本発明の別の態様によれば、クエン酸回路の機能を活性化するための組成物が提供される。

　一般に、クエン酸回路は、トリカルボン酸回路、ＴＣＡ回路、クレブス回路等ともよばれ、ほとんどの生物の酸化的代謝に共通する経路である。本発明におけるクエン酸回路の機能の活性化とは、クエン酸回路全体または一部の活性を高める作用を意味し、このようなクエン酸回路の機能の活性化は、特に限定されるわけではないが、例えば、クエン酸回路に直接的または間接的に関与する酵素を活性化させることにより達成されてもよい。本発明におけるクエン酸回路の機能の活性化は、単位時間当たりに生成される生成物の量が増加した場合のすべてを含む。このような生成物としては、特に限定されるわけではないが、好ましくは、クエン酸、イソクエン酸、コハク酸、フマル酸、リンゴ酸、ＮＡＤＨ、ＡＭＰ、ＡＴＰから選択される１種以上である。本発明の特に好ましい態様によれば、このような生成物はＡＴＰである。

　また、本発明の別の態様によれば、ＡＴＰの産生を促進するための組成物が提供される。本発明におけるＡＴＰの産生の促進は、特に限定されるわけではないが、例えば、直接的または間接的な、解糖系の機能の活性化、クエン酸回路の機能の活性化、ミトコンドリア内の電子伝達系に共役して起こる、酸化的リン酸化反応の活性化等により達成され得るがこれに限定されない。本発明におけるＡＴＰの産生の促進は、単位時間当たりにこれらが生成される量が増加した場合のすべてを含む。

　また、本発明の別の態様によれば、ミオイノシトール１－リン酸および／またはミオイノシトール３－リン酸の産生を促進するための組成物が提供される。

　一般に、リン脂質（グリセロリン脂質ともいわれる）は、自然界に遍在し、細胞膜の脂質二重層の重要な成分であり、代謝および細胞シグナル伝達にも関与している。リン脂質としては、具体的には、例えば、ホスファチジルコリン（ＰＣ）、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）、ホスホイノシチド（例えば、イノシトール１－リン酸（ＰＩ）、ホスファチジルイノシトール２－リン酸（ＰＩＰ２）、イノシトール３－リン酸（ＩＰ３））およびスフィンゴミエリン（ＳＭ）等がよく知られている。

　一般に、イノシトールは、ミオイノシトール、Ｄ－キロイノシトール、Ｌ－キロイノシトール、ムコイノシトール、シロイノシトール、アロイノシトール、エピイノシトール、シスイノシトールおよびネオイノシトールが存在することが知られており、特に、ミオイノシトールは生物活性を有することから、生体において重要な役割を担っている。

　本発明におけるミオイノシトール１－リン酸およびミオイノシトール３－リン酸は細胞膜において、その産生が促進されていてもよいがこれに限定されない。本発明におけるミオイノシトール１－リン酸および／またはミオイノシトール３－リン酸の産生の促進は、単位時間当たりにこれらが生成される量が増加した場合のすべてを含む。

　また、本発明の別の態様によれば、ヒドロキシプロリンおよび／またはＮアセチルグルコサミンの産生を促進するための組成物が提供される。

　一般に、細胞外マトリックスとは細胞の外に存在する超分子構造体であり、この細胞外マトリックスは、例えば、コラーゲン、プロテオグリカン、フィブロネクチン、ヒアルロン酸、テネイシン、エンタクチン、エラスチン、フィブリリン、ラミニン等の成分により構成されている。本発明におけるヒドロキシプロリンおよびＮアセチルグルコサミンは細胞外マトリックスにおいて、その産生が促進されていてもよいが、これに限定されない。本発明におけるヒドロキシプロリンおよび／またはＮアセチルグルコサミンの産生の促進は、単位時間当たりにこれらが生成される量が増加した場合のすべてを含む。

　また、本発明の別の態様によれば、ヒドロキシプロリンの産生を促進するための、Ｎ－アセチルグルコサミン６－リン酸の産生を促進するための、ミオイノシトール１－リン酸の産生を促進するための、またはミオイノシトール３－リン酸の産生を促進するための組成物が提供され、該組成物は皮膚のハリを改善するために用いてもよい。本発明のさらに別の態様によれば、皮膚のハリを改善するための組成物が提供される。

　本発明におけるハリとは、皮膚、特に限定されるわけではないが、好ましくは、顔の皮膚における柔らかさや弾性を意味する。皮膚における弾力は、例えば、キュートメーター、ダーマトルクメーター等により計測することができ、この計測結果に基づいて皮膚のハリを評価してもよい。皮膚のハリは、真皮層におけるコラーゲンやエラスチン等の弾性線維量に影響され得るが、これに限定されない。

　一般に、ＣＣＮ２は、結合組織成長因子（ｃｏｎｎｅｃｔｉｖｅ　ｔｉｓｓｕｅ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ：ＣＴＧＦ）としても知られているタンパク質で、ＣＣＮファミリーに属する分泌性の増殖促進因子である。ＣＣＮファミリーの生物学的機能としては、細胞の増殖・分化・遊走・接着および細胞外マトリックス形成の刺激や、血管形成への関与等が挙げられる。ＣＣＮ２は細胞表面のアグリカン、フィブロネクチン、インテグリンと結合可能であり、マトリックスメタロプロテアーゼと協働して、細胞外マトリックスタンパク質の発現を促進し、細胞接着活性を調節するほか、血管新生因子としても働いていることが知られている。なお、本発明におけるＣＣＮ２には、その機能を損なわない範囲において、アミノ酸配列の一部に欠失、置換、挿入等の変異を有するものも含まれる。

　本発明によれば、ＣＣＮ２の発現を促進させるための組成物が提供される。ＣＣＮ２の発現の促進は、ＣＣＮ２遺伝子の発現の促進、またはＣＣＮ２タンパク質の発現の促進のいずれか、またはこの両方であってもよい。

　本発明の一つの実施態様によれば、本発明の組成物は、ＣＣＮ２遺伝子の発現を促進する能力を有していてもよい。このような能力としては、特に限定されるわけではないが、例えば、ＣＣＮ２遺伝子のｍＲＮＡへの転写開始を促進する能力、ＣＣＮ２遺伝子のｍＲＮＡの発現を促進する能力、ＣＣＮ２遺伝子のｍＲＮＡの分解を阻害する能力等が挙げられる。

　本発明の一つの実施態様によれば、本発明の組成物は、ＣＣＮ２タンパク質の発現を促進する能力を有していてもよい。このような能力としては、特に限定されるわけではないが、例えば、ＣＣＮ２遺伝子のｍＲＮＡからタンパク質への翻訳を促進する能力、ＣＣＮ２タンパク質の細胞外分泌を促進する能力、シグナル伝達機能を促進する能力等が挙げられる。

　本発明における緑茶エキスは、茶科チァグァに属する常緑樹である茶木（カメリア・シネンシス；Ｃａｍｅｌｌｉａ　ｓｉｎｅｎｓｉｓ）から抽出したもの、またはバチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔｉｌｉｓ　ｓｐｐ．）を接種し醗酵させた茶葉等から抽出したものを含んでなり、前記抽出したものを特定の溶媒で分画して得た分画物を含んでいてもよい。本発明における緑茶エキスは、本発明の目的効果を有するエキスが得られるのであれば、抽出方法、抽出溶媒、抽出された成分または抽出物の形態を問わない。

　本発明における緑茶エキスの抽出原料としては、特に限定されるわけではないが、茶木の葉、花、幹、実、根、幹、根の芯材等が挙げられ、好ましくは、葉である。

　本発明における緑茶エキスの形態は、特に限定されるわけではないが、好ましくは、粉末状である。

　本発明における緑茶エキスの抽出または分画には、水、有機溶媒、またはこれらの混合溶媒を用いてよい。このような有機溶媒としては、特に限定されるわけではないが、例えば、アルコール、イソプロパノール、アセトン、ヘキサン、エチルアセテート、二酸化炭素、またはこれらの二種以上の混合溶媒等が挙げられるが、緑茶の有効成分を本発明の目的効果を有する程度に残存させることが可能な条件下、室温でまたは加温して抽出または分画を行ってもよい。前記アルコールは、特に限定されるわけではないが、Ｃ_１～Ｃ_５の低級アルコールであってよい。抽出または分画の回数や方法は、本発明の目的効果を有するエキスが得られるのであれば、特に限定されるわけではないが、例えば、冷浸抽出、超音波抽出、還流冷却抽出、熱水抽出等の方法を用いてもよい。

　本発明における緑茶エキスが商業的に販売されている場合、本発明の目的効果を有するエキスが得られるのであれば、それを使用してもよい。

　本発明の組成物に含まれる緑茶エキスの配合量は、用途に応じて適宜決定できる。

　本発明の別の態様によれば、ＣＣＮ２発現促進剤を含んでなる組成物が提供され、該組成物は、ヒドロキシプロリンおよび／またはＮアセチルグルコサミンの産生を促進するための、クエン酸回路の機能を活性化するための、ＡＴＰの産生を促進するための、または皮膚のハリを改善するための組成物である。また、本発明によれば、治療上有効な量のＣＣＮ２発現促進剤を含んでなる組成物を、それを必要とする被験体に投与することを含んでなる、ヒドロキシプロリンおよび／またはＮアセチルグルコサミンの産生を促進するための、クエン酸回路の機能を活性化するための、ＡＴＰの産生を促進するための、または皮膚のハリを改善するための方法が提供される。さらに、本発明によれば、ヒドロキシプロリンおよび／またはＮアセチルグルコサミンの産生の促進、クエン酸回路の機能の活性化、ＡＴＰの産生の促進、または皮膚のハリの改善を目的とする薬剤の製造における、ＣＣＮ２発現促進剤の使用が提供される。さらに、本発明によれば、ＣＣＮ２発現促進剤を含んでなる組成物の、ヒドロキシプロリンおよび／またはＮアセチルグルコサミンの産生を促進するための、クエン酸回路の機能を活性化するための、ＡＴＰの産生を促進するための、または皮膚のハリを改善するための使用が提供される。さらに、本発明によれば、ヒドロキシプロリンおよび／またはＮアセチルグルコサミンの産生を促進するための、クエン酸回路の機能を活性化するための、ＡＴＰの産生を促進するための、または皮膚のハリを改善するためのＣＣＮ２発現促進剤が提供される。

　本発明におけるＣＣＮ２発現促進剤は、有効成分としてＣＣＮ２の発現を促進するものであれば特に限定されず、ＣＣＮ２の発現の促進は、ＣＣＮ２遺伝子の発現の促進、またはＣＣＮ２タンパク質の発現の促進のいずれか、またはこの両方であってもよい。

　本発明の一つの実施態様によれば、本発明におけるＣＣＮ２発現促進剤は、ＣＣＮ２遺伝子の発現を促進する能力を有していてもよい。このような能力としては、特に限定されるわけではないが、例えば、ＣＣＮ２遺伝子のｍＲＮＡへの転写開始を促進する能力、ＣＣＮ２遺伝子のｍＲＮＡの発現を促進する能力、ＣＣＮ２遺伝子のｍＲＮＡの分解を阻害する能力等が挙げられる。

　本発明の一つの実施態様によれば、本発明におけるＣＣＮ２発現促進剤は、ＣＣＮ２タンパク質の発現を促進する能力を有していてもよい。このような能力としては、特に限定されるわけではないが、例えば、ＣＣＮ２遺伝子のｍＲＮＡからタンパク質への翻訳を促進する能力、ＣＣＮ２タンパク質の細胞外分泌を促進する能力、シグナル伝達機能を促進する能力等が挙げられる。

　ＣＣＮ２の発現を促進させるために、本発明の組成物が作用する細胞は、特に限定されるわけではないが、好ましくは表皮角化細胞である。

　本発明における表皮角化細胞としては、特に限定されるわけではないが、例えば、生体から取得された細胞、その継代された細胞、または株化された細胞を使用してもよく、必要に応じてこれらの細胞を分化させて使用してもよい。本発明における表皮角化細胞としては、特に限定されるわけではないが、具体的には、正常ヒト新生児表皮角化細胞（ＮＨＥＫ）等が挙げられる。

　本発明における表皮角化細胞は、いかなる動植物に由来する細胞であってもよく、限定されるわけではないが、好ましくは動物細胞であり、好ましくはヒト細胞である。

　本発明の組成物は、経口用組成物、局所用組成物のいずれであってもよいが、好ましくは、局所用組成物である。

　本発明の組成物を経口用組成物とする場合、経口用組成物に配合される公知の成分（添加剤）をさらに配合することができる。このような成分としては、特に限定されるわけではないが、例えば、乳化剤、水和剤、溶媒、エモリエント、安定剤、増粘剤、保存剤、滑沢剤、キレート剤、充填剤、賦形剤、粉末、芳香剤、香料、吸収剤、染料、乳白剤、抗酸化剤、防腐剤、ビタミン、アミノ酸、栄養剤、鉱物（電解質）、合成風味剤および天然風味剤等の風味剤、ペクチン酸及びその塩、アルギン酸及びその塩、有機酸、ｐＨ調節剤、グリセリン、アルコール、炭酸飲料に用いられる炭酸化剤等が挙げられる。

　本発明における経口用組成物は、液体、半固体、固体のいずれであってもよく、特に限定されるわけではないが、好ましくは、錠剤、顆粒剤、丸剤、粉末剤、ドリンク剤といった液剤、キャラメル、またはゲルの形態である。

　本発明の組成物を局所用組成物とする場合、局所用組成物に配合される公知の成分（添加剤）をさらに配合することができる。このような成分としては、限定されるわけではないが、例えば、乳化剤、水和剤、溶媒、エモリエント、安定剤、増粘剤、保存剤、滑沢剤、キレート剤、充填剤、賦形剤、粉末、芳香剤、香料、吸収剤、染料、乳白剤、抗酸化剤、ビタミン、アミノ酸等が挙げられる。

　本発明における局所用組成物は、液体、半固体、固体のいずれであってもよく、限定されるわけではないが、好ましくは、溶液、懸濁液、分散液、エマルジョン、クリーム、軟膏、ゲル、ローション、フォーム、ペースト、またはスプレーの形態である。

　本発明の組成物は、特に限定されるわけではないが、医薬組成物、化粧用組成物、食品組成物のいずれかとしてもよく、好ましくは化粧用組成物である。本発明における化粧用組成物とは、化粧をすることを目的に使用される組成物のことを意味し、経口用組成物、局所用組成物のいずれであってもよい。

　本発明における食品組成物は、栄養機能食品、特定保健用食品、機能性表示食品等の保健機能食品であってもよく、また治療食（すなわち、治療の目的を果たすもの、または、医師が食事箋を出し、それに従い栄養士等が作成した献立に基づいて調理されたもの）、食事療法食、介護食等として、製造されてもよい。

　以下の例に基づいて本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの例に限定されるものではない。含有量は特記しない限り、質量％で示す。

ＣＣＮ２が、血管周皮細胞におけるクエン酸回路および細胞外マトリックス等の代謝物に与える影響の評価
（試料の調製）
　市販されているリコンビナントＣＣＮ２タンパク質（ＣＴＧＦ　ｈｕｍａｎ、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社製）を滅菌水にて、５００μｇ／ｍｌになるよう希釈し、試料を調製した。

（血管周皮細胞の培養）
　市販されているヒト胎盤由来血管周皮細胞（ｈＰＣ－ＰＬ、ＰｒｏｍｏＣｅｌｌ社製）を３．３×１０^４ｃｅｌｌｓ／シャーレとなるように１００ｍｍシャーレに接種し、血管周皮細胞用培地（Ｐｅｒｉｃｙｔｅ　Ｇｒｏｗｔｈ　Ｍｅｄｉｕｍ　２、ＰｒｏｍｏＣｅｌｌ社製）中で３７℃、５％のＣＯ_２雰囲気下でセミコンフルエントに達するまで培養した。

（試料の添加）
　試料を添加する前日に培地を血管周皮細胞用培地９ｍＬに置換し、３７℃、５％のＣＯ_２雰囲気下で培養した。その翌日、最終濃度が１５０ｎｇ／ｍＬになるよう血管周皮細胞用培地で希釈した１５００ｎｇ／ｍＬのリコンビナントＣＣＮ２タンパク質を１ｍＬ、培地に添加した。なお、コントロールは、リコンビナントＣＣＮ２タンパク質を含まない血管周皮細胞用培地１ｍＬとした。

（メタボロームサンプルの回収と定量分析）
　リコンビナントＣＣＮ２タンパク質を添加して６時間後、シャーレから培地を除去し、ヒューマン・メタボローム・テクノロジーズ社のプロトコルに沿ってサンプルを調整した。その後、回収したサンプルをヒューマン・メタボローム・テクノロジーズ社に送付し、メタボローム解析を実施した。得られた結果に対して、ウェルチのt検定による検定（Ｐ＜０．００１の場合、＊＊＊と記載、Ｐ＜０．０１の場合、＊＊と記載）を行った。

（結果）
　結果を図に示す。リコンビナントＣＣＮ２タンパク質処理することにより、クエン酸回路およびエネルギーに関連する１０種（クエン酸、イソクエン酸、コハク酸、フマル酸、リンゴ酸、ＮＡＤＨ、ＡＭＰ、ＡＴＰ）、リン脂質（細胞膜）の合成・再合成に関連する２種（ミオイノシトール－１－リン酸、ミオイノシトール－３－リン酸）および細胞外マトリクスに関連する２種（ヒドロキシプロリン、Ｎ－アセチルグルコサミン６－リン酸）を含む２５７種の代謝物が、コントロールと比較して、有意に上昇することが示された。

緑茶エキスが、ＣＣＮ２遺伝子の発現に与える影響の評価
（表皮角化細胞の培養）
　市販されている正常ヒト新生児表皮角化細胞（ＮＨＥＫ（ＮＢ）、クラボウ社製）を５×１０^５ｃｅｌｌｓ／フラスコとなるようにＴ７５フラスコに接種し、角化細胞用培地（Ｈｕｍｅｄｉａ－ＫＧ２、クラボウ社製）中で３７℃、５％のＣＯ_２雰囲気下でセミコンフルエントに達するまで培養し、種細胞とした。この角化細胞をトリプシン処理により回収し、２４ウェルプレートに１０×１０^４ｃｅｌｌｓ／ウェルもしくは、１２×１０^４ｃｅｌｌｓ／ウェルとなるように接種し、角化細胞用培地（Ｈｕｍｅｄｉａ－ＫＧ２、クラボウ社製）中で３７℃、５％のＣＯ_２雰囲気下で培養した。翌日、１０×１０^４ｃｅｌｌｓ／ウェルに接種した細胞は、添加剤フリー角化細胞用培地（Ｈｕｍｅｄｉａ－ＫＢ２、クラボウ社製）に培地を置換し、翌日まで培養した。一方、１２×１０^４ｃｅｌｌｓ／ウェルに接種した細胞は、１．８ｍＭのＣａＣｌ_２を含む角化細胞用培地に交換し、３７℃、５％のＣＯ_２雰囲気下で２日間培養し、細胞分化を誘導した。

（試料の添加）
　添加剤フリー角化細胞用培地に培地を置換した表皮角化細胞（未分化細胞）、および分化誘導を実施した表皮角化細胞（分化細胞）に、緑茶エキスを１／１０００量（ｖ／ｖ）、それぞれ添加剤フリー角化細胞用培地および１．８ｍＭのＣａＣｌ_２を含む角化細胞用培地培地に加え、培地中濃度が０．１％となるように添加して、３７℃、５％のＣＯ_２雰囲気下で培養を続けた。未分化細胞および分化細胞のそれぞれについて、緑茶エキス未処理のコントロール群を用意した。

（細胞からのＲＮＡの抽出）
　緑茶エキス処理２４時間後に培地を除去し、市販のＲＮＡ抽出試薬（ＲＮｅａｓｙ　Ｍｉｎｉ　Ｋｉｔ、Ｑｉａｇｅｎ社製）を用いて、細胞の溶解とＲＮＡの抽出を行った。

（定量ＰＣＲ法によるＣＣＮ２発現量の評価）
　抽出したＲＮＡを鋳型として、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ^（Ｒ）ＶＩＬＯ^TM　ｃＤＮＡ　Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ　Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ^TM）を用いてｃＤＮＡを合成した。その後、ＰＣＲ試薬Ｐｌａｔｉｎｕｍ^TM　ＳＹＢＲ^TM　Ｇｒｅｅｎ　ｑＰＣＲ　ＳｕｐｅｒＭｉｘ－ＵＤＧ　ｗ／ＲＯＸ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ^TM）と定量ＰＣＲ装置ＳｔｅｐＯｎｅＰｌｕｓ^TM、リアルタイムＰＣＲシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ^（Ｒ））を用いて定量ＰＣＲを実施し、ＣＣＮ２遺伝子の発現量を測定した。内部標準としてＧＡＰＤＨ遺伝子の発現量も同時に測定した。ＰＣＲ用プライマーの配列は以下の通りである。

　ＣＣＮ２：
　フォワードプライマー：５’－CGCACAAGGGCCTATTCTGT－３’（配列番号１）
　リバースプライマー：５’－GAGCACCATCTTTGGCGGT－３’（配列番号２）
　ＧＡＰＤＨ：
　フォワードプライマー：５’－GAGTCAACGGATTTGGTCGT－３’（配列番号３）
　リバースプライマー：５’－TTGATTTTGGAGGGATCTCG－３’（配列番号４）

統計処理
　得られた結果に対して、スチューデントのｔ検定（両側検定）による検定（Ｐ＜０．００１の場合、＊＊＊と記載、Ｐ＜０．０１の場合、＊＊と記載）を行った。

　結果を図１３に示す。図１３の結果から、緑茶エキスが、未分化および分化表皮角化細胞のいずれにおいてもＣＣＮ２遺伝子の発現を有意に上昇させることが示された。

Claims

　緑茶エキスを含んでなる、ＣＣＮ２の発現を促進するための組成物。
　ヒドロキシプロリンおよび／またはＮアセチルグルコサミンの産生を促進するための、請求項１に記載の組成物。
　クエン酸回路の機能を活性化するための、請求項１に記載の組成物。
　ＡＴＰの産生を促進するための、請求項１に記載の組成物。
　皮膚のハリを改善するための、請求項１に記載の組成物。
　局所用組成物である、請求項１～５のいずれか一項に記載の組成物。
　溶液、懸濁液、分散液、エマルジョン、クリーム、軟膏、ゲル、ローション、フォーム、ペースト、またはスプレーの形態である、請求項６に記載の組成物。
　化粧用組成物である、請求項１～５のいずれか一項に記載の組成物。
　ヒドロキシプロリンおよび／またはＮアセチルグルコサミンの産生を促進するための、ＣＣＮ２発現促進剤を含んでなる、組成物。
　クエン酸回路の機能を活性化するための、ＣＣＮ２発現促進剤を含んでなる、組成物。
　ＡＴＰの産生を促進するための、ＣＣＮ２発現促進剤を含んでなる、組成物。
　皮膚のハリを改善するための、ＣＣＮ２発現促進剤を含んでなる、組成物。
　ＣＣＮ２発現促進剤が緑茶エキスである、請求項９～１２のいずれか一項に記載の組成物。
　局所用組成物である、請求項９～１２のいずれか一項に記載の組成物。
　溶液、懸濁液、分散液、エマルジョン、クリーム、軟膏、ゲル、ローション、フォーム、ペースト、またはスプレーの形態である、請求項１４に記載の組成物。
　化粧用組成物である、請求項９～１２のいずれか一項に記載の組成物。