CN110573138B - 皮肤抗衰老剂以及抗衰老相关基因表达调节剂 - Google Patents

Abstract

本发明的课题在于提供安全性高、可长期安心使用的皮肤抗衰老剂、抗衰老相关基因表达调节剂以及含有该抗衰老剂或抗衰老相关基因表达调节剂而成的化妆品。本发明的皮肤抗衰老剂、抗衰老相关基因表达调节剂以及含有该抗衰老剂或抗衰老相关基因表达调节剂而成的化妆品含有特殊低分子量DNA和大豆提取物作为有效成分，优选含有大豆芽提炼物作为有效成分。该有效成分具有真皮成纤维细胞的功能活化作用，因此可期待预防或改善肌肤张力、弹力降低、皱纹、松弛等皮肤的衰老。

Description

皮肤抗衰老剂以及抗衰老相关基因表达调节剂

技术领域

本发明涉及一种皮肤抗衰老剂或抗衰老相关基因表达调节剂，更详细而言，涉及含有特殊低分子量DNA和大豆提取物作为有效成分的皮肤抗衰老剂、抗衰老相关基因表达调节剂、以及含有该抗衰老剂或抗衰老相关基因表达调节剂而成的化妆品。

背景技术

皮肤可以大致分为与外界接触的表皮、位于表皮的内侧并以强力与表皮粘附的真皮、以及位于真皮的内侧且位于真皮与肌肉之间的皮下脂肪组织。位于表皮与皮下脂肪组织之间的真皮由乳头层、真皮网状层、结缔纤维组织构成。胶原蛋白占该真皮的约70％，此外由弹性纤维(弹性蛋白)、透明质酸等细胞外基质成分构成。构成上述真皮的胶原蛋白、弹性蛋白、透明质酸等由存在于真皮网状层的真皮成纤维细胞生成。

一般而言，由于紫外线、干燥、年龄增加等，上述纤维受到破坏，发生老化而使弹力降低，并且使细胞外基质成分的产生功能降低，这被认为是肌肤张力、弹力降低、皱纹、松弛等肌肤老化的原因。这样，真皮的细胞外基质成分、尤其是胶原蛋白、透明质酸的减少与皮肤弹性降低、皱纹形成等衰老现象有关。

因而，认为如果活化真皮成纤维细胞的功能而增加上述细胞外基质成分的产生，则能够预防或改善肌肤的衰老。特别是，形成于面部的皱纹作为衰老标志对人的外观产生较大的影响。因此，作为保持年轻的手段，对具有皱纹的预防或改善效果的化妆品(抗衰老、抗皱化妆品)的需求越来越高(非专利文献1)。

在此，报告了作为安全且效果优异的功能性食品使用的脱氧核糖核酸(DNA)具有肌肤状态(水分量、皮脂量、皮沟密度、皱纹、斑点、雀斑等)的改善效果(专利文献1、2)。

另外，报告了大豆的种子、胚芽(胚)或芽的提取物含有大量多胺，具有对支撑皮肤结构的弹性蛋白、胶原蛋白、透明质酸等细胞外基质成分的产生促进作用(专利文献3)。

但是，就本发明的发明人所知，并没有关于上述脱氧核糖核酸(DNA)与大豆提取物之间的相互作用的报告。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：日本特开2007-291062号公报

专利文献2：日本特开2008-63315号公报

专利文献3：日本特开2012-46544号公报

非专利文献

非专利文献1：铃木正人监修“抗衰老·美白·保湿化妆品的技术开发”(普及版)株式会社CMC出版2007年8月23日第1次印刷发行

发明内容

发明所要解决的问题

如果活化真皮成纤维细胞的功能而增加细胞外基质成分、尤其是胶原蛋白、透明质酸的产生，则如上所述，能够期待预防或改善肌肤的衰老。因此，本发明的课题在于提供具有更优异的真皮成纤维细胞的活化效果，且安全性高，能够长期安心使用的皮肤抗衰老剂、抗衰老相关基因表达调节剂、以及含有该抗衰老剂或抗衰老相关基因表达调节剂而成的化妆品。

用于解决问题的方法

本发明的发明人对上述课题进行深入研究的结果是，发现即便长期服用也很安全的特殊低分子量DNA和大豆提取物对真皮成纤维细胞具有协同的活化作用即细胞增殖作用、对于胶原蛋白产生促进作用以及透明质酸产生促进作用的协同的效果(协同效果)，并发现该特殊低分子量DNA和大豆提取物协同地促进与透明质酸合成有关的基因的表达并且减少与透明质酸分解有关的基因的表达。本发明是基于上述见解而完成的。即，本发明如下所述。

(1)一种皮肤抗衰老剂，其特征在于，含有特殊低分子量DNA和大豆提取物作为有效成分，所述特殊低分子量DNA为从动植物中提取的DNA的水解处理物，所述大豆提取物为选自由大豆的种子、胚芽以及芽组成的群组的至少一种的提取物。

(2)根据(1)所述的抗衰老剂，其中，抗衰老是指真皮成纤维细胞的功能活化，该功能活化是选自由真皮成纤维细胞的增殖促进作用、I型胶原蛋白产生促进作用以及透明质酸产生促进作用组成的群组的至少一种的作用。

(3)根据(1)或(2)所述的抗衰老剂，其中，特殊低分子量DNA的含量为0.001～1质量％，大豆提取物的含量为0.001～1质量％。

(4)一种皮肤抗衰老相关基因表达调节剂，其特征在于，含有特殊低分子量DNA和大豆提取物作为有效成分，所述特殊低分子量DNA为从动植物中提取的DNA的水解处理物，所述大豆提取物为选自由大豆的种子、胚芽以及芽组成的群组的至少一种的提取物。

(5)根据(4)所述的抗衰老相关基因表达调节剂，其中，所述抗衰老相关基因表达调节为选自由I型胶原蛋白合成酶基因、透明质酸合成酶1基因以及透明质酸合成酶2基因组成的群组的至少一种基因的基因表达促进、或胶原蛋白分解酶基因和/或透明质酸分解酶基因的基因表达减少。

(6)根据(4)或(5)所述的抗衰老相关基因表达调节剂，其中，特殊低分子量DNA的含量为0.001～1质量％，大豆提取物的含量为0.001～1质量％。

(7)一种化妆品，其含有(1)～(3)中任一项所述的抗衰老剂、或(4)～(6)中任一项所述的抗衰老相关基因表达调节剂而成。

发明效果

根据本发明，作为有效成分的特殊低分子量DNA和大豆提取物对真皮成纤维细胞具有协同的活化作用，因此能够期待皮肤的抗衰老、即预防或改善肌肤张力、弹力的降低、皱纹、松弛等肌肤的衰老等的效果。

附图说明

图1是表示实施例中使用的水解DNA-Na的基于凝胶渗透色谱(Gel PermeationChromatography：GPC)的分析结果的图。图中的横轴为保持时间(分钟)，纵轴为紫外区域(波长为260nm)的吸光度。

具体实施方式

以下对本发明的实施方式进行详细说明，但以下的说明为本发明的实施方式的一个例子，本发明并不限定于以下的记载内容。此外，在本说明书中，在使用“～”这样的表述的情况下，作为包含其前后的数值或物性值的表述来使用。另外，只要没有特别明记，则有效成分的含量(％)为重量百分比(wt％)。

本发明的皮肤抗衰老剂的特征在于，含有特殊低分子量DNA和大豆提取物作为有效成分，特殊低分子量DNA是能够通过对从动植物中提取的DNA进行水解处理而制备的成分，大豆提取物是选自由大豆的种子、胚芽以及芽组成的群组的至少一种的提取物。

在此，皮肤的抗衰老是指真皮成纤维细胞的功能活化，该功能活化是指选自由真皮成纤维细胞的增殖促进作用、I型胶原蛋白产生促进作用以及透明质酸产生促进作用组成的群组的至少一种的作用。

另外，本发明的皮肤抗衰老相关基因表达调节剂的特征在于，含有上述特殊低分子量DNA和大豆提取物作为有效成分，特殊低分子量DNA是能够通过对从动植物中提取的DNA进行水解处理而制备的成分，大豆提取物是选自由大豆的种子、胚芽以及芽组成的群组的至少一种的提取物。

在此，在本发明中，皮肤抗衰老相关基因是指以下所示的、对参与真皮成纤维细胞中的胶原蛋白或透明质酸的合成或分解的任一种酶进行编码的基因。

·I型胶原蛋白合成酶基因(Human Collagen Type1 Alpha 1；COL1A1)

·胶原蛋白分解酶基因(Human Matrix Metallopeptidase 1；MMP1)

·透明质酸合成酶1基因(Human Hyaluronan Synthase 1；HAS1)

·透明质酸合成酶2基因(Human Hyaluronan Synthase 2；HAS2)

·透明质酸分解酶基因(Human Hyaluronidase 1；HYAL1)

另外，基因表达调节是指上述合成酶基因的表达促进(表达量的增加)和/或分解酶基因的表达减少(表达量的减少)。作为上述皮肤抗衰老相关基因表达调节，优选为选自由I型胶原蛋白合成酶基因(COL1A1)、透明质酸合成酶1基因(HAS1)以及透明质酸合成酶2基因(HAS2)组成的群组的至少一种基因的基因表达促进、或者胶原蛋白分解酶基因(MMP1)和/或透明质酸分解酶基因(HYAL1)的基因表达减少。

进一步地，上述真皮成纤维细胞的功能活化也可以是真皮成纤维细胞中的上述基因表达促进或上述基因表达减少。

本发明的皮肤抗衰老剂或皮肤抗衰老相关基因表达调节剂含有特殊低分子量DNA和大豆提取物作为有效成分，根据需要，还可以含有其他任意成分。

本发明中的特殊低分子量DNA是能够通过对从动植物中提取的DNA进行水解处理而制备的成分。DNA的供给源可以是动物、植物、微生物等各种生物，另外，作为DNA也可以使用合成DNA。其中，特别是从含有大量DNA、可有效利用水产加工的废弃物这样的观点出发，优选使用来自鲑鱼、鳟鱼、鳕鱼这样的鱼类的精巢(白子)的DNA。

来自鱼类的精巢的DNA的提取以及纯化可以通过常规方法(例如依据日本特开2005-245394号公报的记载)来进行。例如，将鱼类的精巢进行粗碎，对粗碎后的鱼类的精巢在DNA未分解的条件下进行蛋白质分解酶(蛋白酶)处理，在进行了酶处理的溶液中加入醇(甲醇、乙醇、异丙醇等)，使DNA作为DNA盐(DNA钠盐)沉淀，回收该沉淀物。或者在进行了酶处理的溶液中加入酸(盐酸、磷酸、柠檬酸等)，使DNA沉淀，回收该沉淀物，用氢氧化钠中和并干燥，由此可以得到DNA盐(DNA钠盐)。

通过使用核酸酶等核酸分解酶对得到的DNA盐进行水解，能够得到特殊低分子量DNA。作为水解处理中使用的核酸酶，例如可以使用来自青霉的核酸酶。

水解，例如可以通过在调整为65℃左右的温水中投入上述DNA盐(DNA钠盐)作为原料，搅拌后进一步加热至70℃，加入核酸酶使其反应来进行。作为水解处理时的温度，优选为60～75℃，更优选为70℃。

例如通过使得到的水解产物冷冻干燥，可以得到粉末状的特殊低分子量DNA。由上述方法得到的特殊低分子量DNA通常可以以钠盐的状态获得。此外，盐并不限于钠盐，例如也可以是钾盐或钙盐。另外，特殊低分子量DNA也可以不是盐而是游离态。

特殊低分子量DNA优选含有10～80％的分子量为12,000以下的组分，更优选含有10～80％的分子量为5,000以下的组分。此外，可以通过GPC在基于分子量对试样进行区分之后通过UV检测器进行定量来进行分子量分布的测定。

本发明中的大豆提取物是选自由大豆的种子、胚芽以及芽组成的群组的至少一种的提取物。提取条件没有特别限定，优选为得到含有多胺的植物提取物的方法，例如专利文献3所记载的那样的在适当的介质中将大豆的种子、胚芽(胚)或芽粉碎并在酸性条件下进行提取的方法。此外，关于作为原料使用的胚芽，收集从种子中分离的胚芽即可，关于大豆的芽，收集在适当的条件下使大豆种子发芽而得到的芽部分即可。

在此，大豆提取物含有大量多胺。多胺是具有2个以上伯氨基的直链脂肪族烃的总称，存在于所有生物体中，作为参与细胞分裂、蛋白合成的生长因子而为人所知。

大豆提取物中的多胺含量没有特别限制，优选为0.05％以上，更优选为0.1％以上，进一步优选为0.15％以上，特别优选为0.2％以上。此外，可以通过高效液相色谱法来测定多胺含量。

在大豆提取物中，其中在大豆芽部分的提取物(以下，有时称为“大豆芽提炼物(extract)”)中，含有大量多胺(腐胺、尸胺、亚精胺、精胺等)(专利文献3)。通过使用含有大量多胺的大豆芽提炼物，能够期待多胺所发挥的效果。

作为大豆提取物，可以使用市售品。具体而言，例如可列举为东洋纺公司制造的大豆芽提炼物(PHYTOPOLYAMINE(注册商标)-S(产品编号：SPA-301)、PHYTOPOLYAMINE-SP(产品编号：SPA-308))、Combi株式会社制造的大豆提取物原材料(SOYPOLYA(注册商标))等。

抗衰老剂中的有效成分的含量根据制剂的种类、形态、使用目的、使用频率等而不同，难以统一规定，但各成分的含量、含量比优选为对真皮成纤维细胞的活化作用发挥协同效果的含量、含量比。

例如将抗衰老剂应用于皮肤(抗衰老剂为化妆品)的情况如下所述。特殊低分子量DNA的含量优选为0.01～10mg/mL(约为0.001～1％)，更优选为0.01～5mg/mL(约为0.001～0.5％)，进一步优选为0.01～2mg/mL(约为0.001～0.2％)。另外，大豆提取物的含量优选为0.01～10mg/mL(0.001～1％)，更优选为0.1～5mg/mL(0.01～0.5％)，进一步优选为0.1～2mg/mL(0.01～0.2％)。

另外，特殊低分子量DNA与大豆提取物的含量比没有特别限制，以质量比计，优选为特殊低分子量DNA：大豆提取物＝1∶50～50∶1，更优选为1∶20～10∶1，进一步优选为1∶10～5∶1。

进一步，抗衰老剂中的多胺浓度由制剂的种类、产品形态、使用目的、使用频率等决定，没有特别限定，通常为0.00001～100mM，优选为0.00005～75mM，更优选为0.0001～50mM是适当的。

若特殊低分子量DNA、大豆提取物的含量、含量比在优选的范围内，则如后述的实施例中具体所示，在对真皮成纤维细胞的活化作用(细胞增殖、促进产生胶原蛋白、促进产生透明质酸、促进透明质酸合成酶基因表达、减少透明质酸分解酶基因表达)起到协同效果或显著效果方面是有利的。

在此，真皮成纤维细胞的活化作用中的协同效果是指，在对真皮成纤维细胞并用特殊低分子量DNA和大豆提取物时，与将分别单独使用特殊低分子量DNA和大豆提取物时的程度相加而得到的值相比，细胞增殖率、胶原蛋白产生率、透明质酸产生率中的任一项更大(显著较大)，或者，在对真皮成纤维细胞并用特殊低分子量DNA和大豆提取物时，与将分别单独使用特殊低分子量DNA和大豆提取物时的程度相加而得到的值相比，胶原蛋白或透明质酸合成酶基因的表达量、优选为透明质酸合成酶基因的表达量、胶原蛋白或透明质酸分解酶基因的表达减少量、优选为透明质酸分解酶表达减少量中的任一项更大(显著较大)。另外，显著效果是指与阴性对照相比具有显著差异的效果。

本发明的抗衰老剂或抗衰老相关基因表达调节剂可以通过利用常规方法将特殊低分子量DNA和大豆提取物、根据需要的其他成分混合而制造为期望的剂型。在此，作为其他成分，可列举与后述的本发明的化妆品可含有的任意成分同样的成分。

本发明的化妆品是包含皮肤抗衰老剂或抗衰老相关基因表达调节剂而成的化妆品。在此，“包含……而成”是指可以包含与所期望的产品形态相应的生理学上可容许的载体、可并用的其他辅助成分等任意成分。

本发明的化妆品例如可以提供为基础化妆品、用于涂布使用在头皮以及毛发上的头发用化妆品等。此外，在本发明中，化妆品除了药事法上的化妆品以外，还包括准药品。

将本发明的抗衰老剂或抗衰老相关基因表达调节剂作为化妆品提供时，只要是可适用于皮肤的剂型，就对可采用的剂型没有特别限制。具体而言，可以是液状、乳剂状、凝胶状、霜状、软膏状、泡沫状、雾沫状、气雾剂等剂型，可以提供为化妆水、乳液、乳霜、凝胶、啫喱、精华、唇膏、面膜(pack)、护肤膜(mask)等。

作为这些化妆品可以含有的其他任意成分，没有特别限制，可以使用通常的化妆品中可以配合的添加剂等。作为所述添加剂，例如可列举水、油脂类、蜡类、烃类、脂肪酸类、醇类、酯类、表面活性剂、香料、收敛剂、杀菌-抗菌剂、美白剂、紫外线吸收剂、保湿剂、细胞活化剂、消炎-抗过敏剂、抗氧化剂、维生素剂、天然提取物等。对这些其他任意成分的含量也没有特别限制，可以根据所期望的剂型等适当选择。

另外，本发明的抗衰老剂或抗衰老相关基因表达调节剂可以提供为用于经口摄取来使用的饮食品。在饮食品中，除了健康食品(例如，功能性食品、营养辅助食品、健康辅助食品、营养强化食品、营养调整食品、营养补充剂等)、保健功能食品(例如，特定保健用食品、营养功能食品、功能性标示食品等)、特别用途食品(例如，病人用食品、婴幼儿用调整奶粉、孕产妇或哺乳期妇女用奶粉等)之外，还包括附有降低、预防或改善由真皮成纤维细胞的功能降低引起的疾病或状态(症状)的风险的标示的饮食品这样的分类。

作为这些饮食品可含有的其他任意成分，没有特别限制，可以使用在通常的饮食品中可以配合的添加剂等。

实施例

以下，通过实施例对本发明进行更具体的说明，但本发明的技术范围并不限定于这些示例。

[实施例1]细胞增殖作用、胶原蛋白/透明质酸产生促进作用

1试验的目的以及概要

认为皮肤内的胶原蛋白、透明质酸对于皮肤的张力、皮肤的柔软性、滋润度发挥着重要作用。因此，通过真皮成纤维细胞的增殖作用、胶原蛋白/透明质酸产生促进作用来评价受试物质(特殊低分子量DNA和大豆提取物)的协同效果。

2材料和试验方法

2-1细胞

使用来自人新生儿的真皮成纤维细胞株NB1RGB细胞(RIKEN BRC,Japan)，在CO₂温育器(CO₂浓度为5％、37℃)内进行培养。

2-2培养基

使用含有0.1％(v/v)胎牛血清Fetal Bovine Serum(FBS,Hyclone,UK)以及1.0％(v/v)抗真菌剂(Invitrogen,USA)的Eagle最低基础培养基Eagle’s Minimal EssentialMedium(EMEM,Wako,Japan)。

2-3受试物质

(1)特殊低分子量DNA

使用日生生物株式会社制造的水解DNA-Na(粉末)。本物质是通过上述方法从鲑鱼科鱼类的精巢(白子)中提取DNA的Na盐并对其进行水解而制备的。

此外，将所使用的日生生物株式会社制造的水解DNA-Na的基于凝胶渗透色谱法(GPC)的分析结果示于图1，将保持时间与分子量的关系示于表1。分子量目标的12,000以细胞色素c(MW为12,400)的保持时间为基础。

表1

根据上述分析结果，日生生物(株)公司制造的水解DNA-Na的基于分子量的组分如下。

分子量为12,000～5,000的组分(洗脱时间为20分钟～小于25分钟)：32.0％

分子量为5,000以下的组分(洗脱时间为25分钟以上)：32.4％

由以上可知，日生生物(株)公司制造的水解DNA-Na的分子量为12,000以下的组分为64.4％。

利用含有30μM的L-抗坏血酸(CAS No.50-81-7,Wako,Japan)以及0.1％FBS的EMEM，对调整为3.0mg/mL的受试物质(水解DNA-Na)以公比10进行连续稀释，使用时制备为共计两种浓度(0.03mg/mL、0.3mg/mL)(终浓度为0.01mg/mL、0.1mg/mL)。

(2)大豆提取物

使用东洋纺公司制造的PHYTOPOLYAMINE(注册商标)-SP(产品编号：SPA-308，配合比例：大豆芽提炼物约为70％，柠檬酸钠约为30％)。

利用含有30μM的L-抗坏血酸(CAS No.50-81-7,Wako,Japan)以及0.1％FBS的EMEM，使用时制备为0.39mg/mL、0.81mg/mL以及1.53mg/mL的受试物质(SPA-308)(终浓度为0.13mg/mL、0.27mg/mL以及0.51mg/mL)。

(3)混合溶液(并用)

使用上述两种受试物质。

利用含有30μM的L-抗坏血酸(CAS No.50-81-7,Wako,Japan)以及0.1％FBS的EMEM，并利用含有调整为0.81mg/mL的SPA-308的EMEM，对调整为3.0mg/mL的水解DNA-Na以公比10进行连续稀释，使用时制备为共计两种浓度(0.03mg/mL、0.3mg/mL)[SPA-308的终浓度为0.27mg/mL，水解DNA-Na的终浓度为0.01mg/mL、0.1mg/mL]。

2-4试验构成

在细胞增殖、胶原蛋白产生以及透明质酸产生的计算中，对于每一个处理组使用3孔的平均值。另外，对于每个板分别设置1组受试物质给药组、操作对照组来实施试验。只要没有特别记载，包括受试物质制备在内，在室温下实施与试验相关的操作。

2-5试验操作

(1)细胞培养

在96孔板(Lot.3595,Corning,USA)上，在每个孔中接种2.0×10⁴cells/200μL的NB1RGB细胞，在CO₂温育器内培养24小时。另外，为了防止培养时的干燥，在未用于试验的孔中加入200μL的Phosphate buffer saline(PBS(-),Lot.198601,Nissui,Japan)。

24小时后，在96孔板中添加100μL的受试物质以及阴性对照，在CO₂温育器内培养48小时。阴性对照使用含有30μM的L-抗坏血酸以及0.1％FBS的EMEM。

48小时后，将培养上清液分注、冷冻保存(-20℃)在新的96孔板中。使用2-5(3)以及(4)所示的ELISA(Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay)测定该培养上清液中的胶原蛋白量以及透明质酸量，评价受试物质的胶原蛋白/透明质酸产生促进作用。另外，通过2-5(2)所示的方法测定去除培养上清液后的96孔板的细胞数，评价受试物质的细胞增殖作用。

(2)细胞增殖作用

按照如下方式评价受试物质对真皮成纤维细胞的增殖带来的效果。

用300μL的加热至37℃的PBS(-)，对去除培养基后的96孔板的各个孔轻轻地清洗2次。接着，在每个孔中添加100μL的0.5mg/mL的3-(4,5-dimethylthiazol-2-ul)-2,5-diphenyltetrazolium bromide(MTT,CAS No.298-93-1,Sigma-Aldrich,USA)溶液，在CO₂温育器内培养2小时。

培养结束后，去除MTT溶液，用200μL的PBS(-)进行清洗。为了使生成的不溶性的甲臜可溶，加入200μL的含有0.04N盐酸(CAS No.7647-01-0,Kanto Chemical,Japan)的2-丙醇(CAS No.67-63-0,Kanto Chemical,Japan)，在遮光下静置1小时。

将96孔板以270rpm振荡10秒钟，使孔内的色素均匀地分散之后，使用微孔板酶标仪(SPARK^TM 10M,TECAN,Switzerland)测定570nm的吸光度(OD₅₇₀)。

计算以阴性对照的OD₅₇₀为100％的受试物质给药组的OD₅₇₀作为细胞增殖率(％)。利用未配对的两组检验(Student's t-test)对阴性对照和受试物质给药组的细胞增殖率(％)进行差异显著性检验。设定双侧检验的显著性水平为小于5％(p<0.05，p<0.01，p<0.001)。

(3)胶原蛋白产生促进作用

利用竞争ELISA按照如下方式评价受试物质对被认为会给肌肤带来张力、弹力的I型胶原蛋白产生量的效果。

在培养上清液中的胶原蛋白量的测定中使用Human Collagen typeI ELISA kit(Lot.EC1-E105,ACEL,Japan)。

用稀释缓冲液(Dilution buffer)对胶原蛋白标准液以公比2进行连续稀释，制备共计7种浓度。另外，用稀释缓冲液对培养上清液进行2倍稀释。

向126μL的胶原蛋白标准液以及2倍稀释的培养上清液中添加14μL的生物素标记胶原蛋白抗体溶液，通过敲击进行混合。

用200μL的洗涤缓冲液(Wash buffer)将胶原蛋白固相化微量滴定板清洗3次，加入50μL的含有生物素标记胶原蛋白抗体的标准液和培养上清液，以约270rpm振荡1小时。

1小时后，用200μL的洗涤缓冲液清洗3次，加入50μL的过氧化物酶标记抗生物素蛋白(Avidin)溶液，以约270rpm振荡1小时。1小时后，用200μL的洗涤缓冲液清洗3次，在每个孔中加入50μL的3,3',5,5'-四甲基联苯胺底物溶液，静置15分钟。

接着，在每个孔中添加50μL的反应终止液(Stop solution)，对微量滴定板以270rpm振荡1分钟，使孔内的色素变得均匀之后，使用微孔板酶标仪测定450nm的吸光度(OD₄₅₀)。

根据胶原蛋白标准液的OD₄₅₀，通过四参数逻辑模型(4-Parameter logisticmodel)回归得到校准曲线。在由回归方程得到的值上乘以稀释倍率，计算出阴性对照以及受试物质的胶原蛋白产生量(μg/mL)。

将阴性对照的胶原蛋白产生量设为100％，计算出受试物质的胶原蛋白产生率(％)。利用未配对的两组检验(Student's t-test)对阴性对照和受试物质添加组的胶原蛋白产生率(％)进行差异显著性检验。设定双侧检验的显著性水平为小于5％(p<0.05，p<0.01，p<0.001)。

(4)透明质酸产生促进作用

利用夹心ELISA按照如下方式评价受试物质对被认为在胶原蛋白、弹性蛋白之间保持水分的透明质酸产生量的效果。

在培养上清液中的透明质酸量的测定中使用Hyaluronan Quantikine ELISA kit(Lot.DHYAL0,R&D Systems,USA)。

用稀释缓冲液对透明质酸标准液以公比2进行连续稀释，制备共计7种浓度。另外，用稀释缓冲液对培养上清液进行8倍稀释。

在聚蛋白多糖固相化微量滴定板上，在每个孔中加入50μL的生物素标记透明质酸抗体溶液。进一步地，添加50μL的稀释后的培养上清液，以约270rpm振荡1小时。

1小时后，用400μL的洗涤缓冲液清洗5次，加入100μL的过氧化物酶标记抗生物素蛋白溶液，以约270rpm振荡1小时。1小时后，用400μL的洗涤缓冲液清洗5次，在每个孔中加入100μL的3,3',5,5'-四甲基联苯胺底物溶液，在遮光下静置30分钟。

接着，在每个孔中添加100μL的反应终止液，对微量滴定板以270rpm振荡1分钟，使孔内的色素变得均匀之后，使用微孔板酶标仪测定450nm的吸光度(OD₄₅₀)。

根据透明质酸标准液的OD₄₅₀，通过四参数逻辑模型，回归得到校准曲线。在由回归方程得到的值上乘以稀释倍率，计算出阴性对照以及受试物质的透明质酸产生量(ng/mL)。

将阴性对照的透明质酸产生量设为100％，计算出受试物质的透明质酸产生率(％)。利用未配对的两组检验(Student's t-test)对阴性对照和受试物质添加组的透明质酸产生率(％)进行差异显著性检测。设定双侧检验的显著性水平为小于5％(p<0.05，p<0.01，p<0.001)。

3试验结果

3-1特殊低分子量DNA

(1)细胞增殖作用

将阴性对照的细胞增殖量(OD₅₇₀)设为100％来进行计算时的受试物质(水解DNA-Na)0.01mg/mL以及0.1mg/mL的细胞增殖率±标准偏差分别为101.3±6.8％以及102.6±3.3％。

(2)I型胶原蛋白产生促进作用

将阴性对照的胶原蛋白产生量设为100％来进行计算时的受试物质(水解DNA-Na)0.01mg/mL以及0.1mg/mL的胶原蛋白产生率±标准偏差分别为126.4±7.9％(p＜0.01)以及134.0±3.6％(p＜0.01)。

(3)透明质酸产生促进作用

将阴性对照的透明质酸产生量设为100％来进行计算时的受试物质(水解DNA-Na)0.01mg/mL以及0.1mg/mL的透明质酸产生率±标准偏差分别为102.2±5.0％以及102.9±7.5％。

3-2大豆提取物

(1)细胞增殖作用

将阴性对照的细胞增殖量(OD₅₇₀)设为100％时的受试物质(SPA-308)0.13mg/mL、0.27mg/mL以及0.51mg/mL的细胞增殖率±标准偏差分别为111.6±1.0％(p＜0.01)、123.7±2.4％(p＜0.01)以及137.0±6.9％(p＜0.01)。

(2)I型胶原蛋白产生促进作用

将阴性对照的胶原蛋白产生促进作用设为100％来进行计算时的受试物质(SPA-308)0.13mg/mL、0.27mg/mL以及0.51mg/mL的胶原蛋白产生促进率±标准偏差分别为135.1±1.3％(p＜0.01)、174.1±6.3％(p＜0.01)以及199.9±11.8％(p＜0.01)。

(3)透明质酸产生促进作用

将阴性对照的透明质酸产生量设为100％来进行计算时的受试物质(SPA-308)0.13mg/mL、0.27mg/mL以及0.51mg/mL的透明质酸产生率±标准偏差分别为113.1±4.7％(p＜0.01)、123.3±3.8％(p＜0.01)以及137.8±10.3％(p＜0.01)。

3-3特殊低分子量DNA和大豆提取物的并用

(1)细胞增殖作用

将阴性对照的细胞增殖量(OD₅₇₀)设为100％而计算出的受试物质(水解DNA-Na+SPA-308)0.01mg/mL+0.27mg/mL以及0.1mg/mL+0.27mg/mL的细胞增殖率±标准偏差分别为133.0±4.8％(p＜0.01)以及140.8±5.7％(p＜0.01)。

(2)I型胶原蛋白产生促进作用

将阴性对照的胶原蛋白产生量设为100％来进行计算时的受试物质(水解DNA-Na+SPA-308)0.01mg/mL+0.27mg/mL以及0.1mg/mL+0.27mg/mL的胶原蛋白产生率±标准偏差分别为178.1±5.5％(p＜0.01)以及230.6±9.9％(p＜0.01)。

(3)透明质酸产生促进作用

将阴性对照的透明质酸产生量设为100％来进行计算时的受试物质(水解DNA-Na+SPA-308)0.01mg/mL+0.27mg/mL以及0.1mg/mL+0.27mg/mL的透明质酸产生率±标准偏差分别为132.7±7.6％(p＜0.01)以及139.8±2.9％(p＜0.01)。

将上述结果示于表2。在表2中，“DNA-Na”为“水解DNA-Na”。由表2可知，并用特殊低分子量DNA(水解DNA-Na)和大豆提取物(SPA-308)的情况下的细胞增殖率、胶原蛋白产生率、透明质酸产生率与分别单独使用特殊低分子量DNA(水解DNA-Na)和大豆提取物(SPA-308)的情况下的程度(率)相加得到的值相比显著较大。由此，可确认特殊低分子量DNA和大豆提取物对真皮成纤维细胞的功能活化作用(细胞增殖作用、胶原蛋白产生促进作用以及透明质酸产生促进作用)的协同效果。

表2

n＝3，**P＜0.01

(并用)浓度；上段:DNA-Na、下段:SPA-308

[实施例2]透明质酸合成或分解酶基因表达调节

1试验目的以及概要

已知皮肤内的胶原蛋白、透明质酸对皮肤的张力、柔软性、滋润度发挥着重要作用，尤其是真皮内的透明质酸量的减少与皮肤弹力的降低、皱纹形成有关。因此，在本实施例中，通过实时PCR(Real-time PCR)法评价受试物质(特殊低分子量DNA和大豆提取物)对由真皮成纤维细胞进行的透明质酸的合成、分解等与抗衰老相关的基因的表达的效果。

2材料和试验方法

2-1细胞

在同样的条件下培养并使用与实施例1的2-1同样的细胞。

2-2培养基

除了将FBS(Fetal Bovine Serum)的含量变为10.0％(v/v)以外，使用与实施例1的2-2相同组成的培养基(EMEM)。

2-3受试物质

(1)特殊低分子量DNA溶液

使用与实施例1的2-3(1)同样的特殊低分子量DNA(水解DNA-Na)。

利用含有10％FBS的EMEM，对调整为1mg/mL的受试物质(水解DNA-Na)以公比10进行连续稀释，使用时制备为共计两种浓度(终浓度为0.01mg/mL、0.1mg/mL)。

(2)大豆提取物溶液

使用与实施例1的2-3(2)同样的大豆提取物(SPA-308)。

利用含有10％FBS的EMEM，对调整为2.7mg/mL的受试物质(SPA-308)以公比10进行连续稀释，使用时制备为共计两种浓度(终浓度为0.027mg/mL、0.27mg/mL)。

(3)混合溶液(并用)

使用上述两种受试物质。

利用含有10％FBS的EMEM，并利用含有调整为0.27mg/mL的SPA-308的EMEM，对调整为1mg/mL的水解DNA-Na以公比10进行连续稀释，使用时制备为共计两种浓度(SPA-308的终浓度为0.27mg/mL，水解DNA-Na的终浓度为0.01mg/mL、0.1mg/mL)。

2-4基因表达分析

使用TaqMan Assay(Applied Biosystems,USA)对编码以下酶的基因实施表达分析。

·透明质酸合成酶1(Human Hyaluronan Synthase 1(HAS1),AssayID.Hs00758053_m1)

·透明质酸合成酶2(Human Hyaluronan Synthase 2(HAS2),AssayID.Hs00193435_m1)

·透明质酸分解酶(Human Hyaluronidase 1(HYAL1),Assay ID.Hs00201046_m1)

作为内部标准基因，使用甘油醛-3-磷酸脱氢酶(Human Glyceraldehyde-3-PhosphateDehydrogenase(GAPDH),Assay ID.Hs02786624_g1)基因。

2-5试验构成

在基因表达量的分析中，对一个处理组使用三个35mm培养皿(Cat No.150318,Thermo Scientific,USA)的平均值。只要没有特别记载，则包括受试物质制备在内，在室温下实施与试验相关的操作。

2-6试验方法

(1)细胞培养以及受试物质添加

在35mm培养皿中接种5.0×10⁵cells/2mL的NB1RGB细胞，在CO₂温育器内培养24小时。24小时后，去除35mm培养皿中的培养基，加入含有受试物质以及阴性对照的培养基，在CO₂温育器内培养24小时。

(2)RNA提取、纯化以及定量

使用PureLink^TM RNA Mini Kit(Cat No.12183018A,Invitrogen,USA)，按照如下方式进行RNA的提取、纯化。

培养24小时后，用2mL的加热至37℃的PBS(-)清洗去除培养基后的35mm的培养皿两次。向其中加入600μL的含有2M二硫苏糖醇(CAS No.27565-41-9,Invitrogen,USA)的裂解缓冲液(Lysis Buffer)，将细胞溶解，并回收溶解产物。

进一步地，使用均质机(Cat No.12183-026,Invitrogen,USA)，将回收的溶解产物中的细胞破碎。

向细胞破碎液中加入600μL的70％乙醇(CAS No.64-17-5,Japan Alcohol,Japan)溶液后，转移至带有硅胶模(silica membrane)的柱中之后，以12,000×g，在室温下离心15秒，并将滤液废弃。

在硅胶模中加入700μL的含有异硫氰酸胍的洗涤缓冲液I以及500μL的含有乙醇的洗涤缓冲液II并进行清洗之后，以12,000×g，在室温下离心15秒，并进行干燥。向其中加入30μL的去RNA酶水(RNase-Free Water)，在室温下静置1分钟后，以12,000×g，在室温下离心15秒。重复该操作两次，使RNA从膜中溶出。

将溶出的RNA的一部分分取到UV透过性96孔板(Cat No.8404,ThermoScientific,USA)中，用Tris-EDTA缓冲液(TE(pH8.0),Cat No.310-90023,NIPPON GENE,Japan)稀释25倍，使用微孔板酶标仪(SPARK^TM10M TECAN,Switzerland)测定260nm的吸光度(OD₂₆₀)。

利用OD₂₆₀通过下式算出阴性对照以及受试物质的RNA浓度，用TE缓冲液进行稀释，将RNA浓度调整为10μg/mL。

RNA浓度(μg/mL)＝A×K×0.3(光程长度：cm)×25(稀释倍率)

A：阴性对照或受试物质的OD₂₆₀

K：K＝40，RNA的吸光系数

(3)基于实时PCR法的基因表达分析

使用SuperScript^TM IV VILO^TM Master Mix with ezDNase(Cat No.11766050,Invitrogen,USA)按照如下方式进行RNA的逆转录。

在八连管(AB1182,Thermo Scientific,USA)中，在每个孔中加入1μL的10×ezDNase缓冲液、1μL的ezDNase酶、6μL的去核酸酶水(Nuclease-free Water)以及2μL的10μg/mL RNA，在37℃下温育2分钟。2分钟后，在八连管中在每个孔中添加4μL的SuperScript^TMIV VILO^TM Master Mix以及6μL的去核酸酶水，使用实时PCR(QuantStudio^TM3,AppliedBiosystems,USA)在25℃下加热10分钟，在50℃下加热10分钟，在85℃下加热5分钟，合成cDNA。

在PCR板(Cat No.N8010560,Thermo Scientific,USA)上，在每个孔中加入10μL的TaqMan^TM Fast Advanced Master Mix(Cat No.4444557,Applied Biosystems,USA)、1μL的TaqMan Gene Expressior、7μL的UltraPure^TMDistilled Water(Invitrogen,CatNo.10977-015,USA)以及2μL的cDNA，利用封板膜(Cat No.4360954,Thermo Scientific,USA)进行密封。

使用板式离心机使溶液消旋(spin down)，去除起泡后，使用实时PCR系统进行Real-Time qPCR，算出阴性对照以及受试物质中的各基因的荧光信号达到任意的阈值时的循环数即Threshold Cycle(Ct)值。通过内部标准基因校正Ct值，作为ΔCt值。通过阴性对照的ΔCt值的平均来校正ΔCt值，将其作为ΔΔCt值。通过ΔΔCt法，假定以每个循环的检测的差为2倍量的差，并代入2^-ΔΔCt，分析将阴性对照的基因表达量设为1时的受试物质的基因表达量。用配对的两组检验(paired t-test)对阴性对照和受试物质添加组的基因表达量进行差异显著性检验。设定双侧检验的显著性水平为小于5％(p＜0.05，p＜0.01，p＜0.001)。

3测试结果

3-1特殊低分子量DNA

(1)透明质酸合成酶1基因(HAS1)表达

将阴性对照的HAS1表达量设为1时的受试物质(水解DNA-Na)0.01mg/mL以及0.1mg/mL的HAS1表达量±标准偏差分别为1.11±0.04以及1.02±0.07。

(2)透明质酸合成酶2基因(HAS2)表达

将阴性对照的HAS2表达量设为1时的受试物质(水解DNA-Na)0.01mg/mL以及0.1mg/mL的HAS2表达量±标准偏差分别为1.25±0.09(p＜0.05)以及1.49±0.05(p＜0.001)。

(3)透明质酸分解酶基因(HYAL1)表达

将阴性对照的HYAL1表达量设为1时的受试物质(水解DNA-Na)0.01mg/mL以及0.1mg/mL的HYAL1表达量±标准偏差分别为1.06±0.12以及1.34±0.14。

3-2大豆提取物

(1)透明质酸合成酶1基因(HAS1)表达

将阴性对照的HAS1表达量设为1时的受试物质(SPA-308)0.027mg/mL以及0.27mg/mL的HAS1表达量±标准偏差分别为1.03±1.2以及0.99±0.16。

(2)透明质酸合成酶2基因(HAS2)表达

将阴性对照的HAS2表达量设为1时的受试物质(SPA-308)0.027mg/mL以及0.27mg/mL的HAS2表达量±标准偏差分别为1.88±0.46(p＜0.05)以及1.50±0.11(p＜0.01)。

(3)透明质酸分解酶基因(HYAL1)表达

将阴性对照的HYAL1表达量设为1时的受试物质(SPA-308)0.027mg/mL以及0.27mg/mL的HYAL1表达量±标准偏差分别为0.97±0.08以及0.84±0.06。

3-3特殊低分子量DNA和大豆提取物的并用

(1)透明质酸合成酶1基因(HAS1)表达

将阴性对照的HAS1表达量设为1时的受试物质(水解DNA-Na+SPA-308)0.01mg/mL+0.27mg/mL以及0.1mg/mL+0.27mg/mL的HAS1表达量±标准偏差分别为0.99±0.08以及1.51±0.26(p＜0.05)。

(2)透明质酸合成酶2基因(HAS2)表达

将阴性对照的(HAS2)表达量设为1时的受试物质(水解DNA-Na+SPA-308)0.01mg/mL+0.27mg/mL以及0.1mg/mL+0.27mg/mL的(HAS2)表达量±标准偏差分别为1.41±0.10(p＜0.01)以及1.54±0.07(p＜0.001)。

(3)透明质酸分解酶基因(HYAL1)表达

将阴性对照的(HYAL1)表达量设为1时的受试物质(水解DNA-Na+SPA-308)0.01mg/mL+0.27mg/mL以及0.1mg/mL+0.27mg/mL的(HYAL1)表达量±标准偏差分别为0.58±0.11(p＜0.01)以及0.93±0.05。

将上述结果示于表3。在表3中，“DNA-Na”为“水解DNA-Na”。由表3可知，并用特殊低分子量DNA(水解DNA-Na)和大豆提取物(SPA-308)的情况下，透明质酸合成酶-1基因(HAS1)的表达量协同地增加，透明质酸合成酶-2基因(HAS2)的表达量与阴性对照相比显著增加。进一步地，可知透明质酸分解酶基因(HYAL1)表达量协同地减少。由此可以确认，通过并用特殊低分子量DNA(水解DNA-Na)和大豆提取物(SPA-308)，同时发生与透明质酸合成相关的基因表达的促进和与分解相关的基因表达的减少。

表3

n＝3，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001

(并用)浓度；上段:DNA-Na、下段:SPA-308

由以上结果推测，并用实施例1所示的特殊低分子量DNA(水解DNA-Na)和大豆提取物(SPA-308)的情况下的胶原蛋白与透明质酸的协同的产生增加，是由同时发生了与胶原蛋白和透明质酸的合成相关的基因表达的促进和与分解相关的基因表达的减少带来的。

产业上的可利用性

本发明的皮肤抗衰老剂具有与以往的抗衰老剂不同的作用、功能，能够比以往的抗衰老剂更有效地预防和/或改善肌肤的衰老，因此尤其在化妆品领域是有用的。

Claims (2)

1.一种真皮成纤维细胞的功能活化剂，其特征在于，是仅由特殊低分子量DNA和大豆提取物构成的真皮成纤维细胞的功能活化剂，

所述特殊低分子量DNA为从鱼类的精巢(白子)中提取的DNA的水解处理物，且含有10～80％的分子量为12,000以下的组分，

所述大豆提取物含有0.15质量％以上的多胺，且为选自由大豆的种子、胚芽以及芽组成的群组的至少一种的提取物，

所述特殊低分子量DNA的含量为0.001～0.5质量％，所述大豆提取物的含量为0.01～0.5质量％，所述特殊低分子量DNA与所述大豆提取物的含量比以质量比计为1∶10～5∶1，

所述功能活化是选自由真皮成纤维细胞的增殖促进作用、I型胶原蛋白产生促进作用以及透明质酸产生促进作用组成的群组的至少一种的作用。

2.一种真皮成纤维细胞的基因表达调节剂，其特征在于，是仅由特殊低分子量DNA和大豆提取物构成的真皮成纤维细胞的基因表达调节剂，

所述特殊低分子量DNA为从鱼类的精巢(白子)中提取的DNA的水解处理物，且含有10～80％的分子量为12,000以下的组分，

所述大豆提取物含有0.15质量％以上的多胺，且为选自由大豆的种子、胚芽以及芽组成的群组的至少一种的提取物，

所述特殊低分子量DNA的含量为0.001～0.5质量％，所述大豆提取物的含量为0.01～0.5质量％，所述特殊低分子量DNA与所述大豆提取物的含量比以质量比计为1∶10～5∶1，

所述基因表达调节为真皮成纤维细胞的透明质酸合成酶1基因以及透明质酸合成酶2基因的任一方或两方的基因表达促进、或透明质酸分解酶基因的基因表达减少。

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