WO2020022131A1 - 皮膚の抗老化用剤及び抗老化関連遺伝子発現調節用剤 - Google Patents

皮膚の抗老化用剤及び抗老化関連遺伝子発現調節用剤 Download PDF

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義久 山田
祐也 多田
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Definitions

  • the present invention relates to a skin anti-aging agent or an anti-aging-related gene expression regulating agent, and more particularly, to a skin anti-aging agent, an anti-aging-related gene comprising a special low-molecular-weight DNA and a soybean extract as active ingredients.
  • the present invention relates to an agent for regulating expression and a cosmetic comprising the agent for regulating anti-aging or the agent for regulating expression of an anti-aging-related gene.
  • the skin can be broadly divided into the epidermis that is in contact with the outside world, the dermis that is located inside and adheres to the epidermis with strong force, and the subcutaneous adipose tissue that is inside and is located between the dermis and muscles. it can.
  • the dermis located between the epidermis and the subcutaneous adipose tissue, is composed of a papillary layer, a reticular dermis layer, and connective fibrous tissue. About 70% of this dermis is occupied by collagen, and is composed of extracellular matrix components such as elastic fibers (elastin) and hyaluronic acid. Collagen, elastin, hyaluronic acid, and the like constituting the dermis are produced by dermal fibroblasts present in the reticular dermis.
  • these fibers are destroyed by ultraviolet rays, drying, aging, etc., and as they age, their elasticity is reduced, and the production function of extracellular matrix components is reduced. It is considered to be a cause of skin aging such as sagging. As described above, aging phenomena such as a decrease in skin elasticity and wrinkle formation involve a decrease in extracellular matrix components of the dermis, particularly collagen and hyaluronic acid.
  • Non-Patent Document 1 Non-Patent Document 1
  • deoxyribonucleic acid used as a safe and effective functional food should have the effect of improving skin conditions (water content, sebum content, skin groove density, wrinkles, spots, freckles, etc.).
  • Patent Documents 1 and 2 are reported (Patent Documents 1 and 2).
  • soybean seed, germ (embryo) or bud extract contains a large amount of polyamine and has an effect of promoting the production of extracellular matrix components such as elastin, collagen, and hyaluronic acid that support the skin structure. (Patent Document 3).
  • an object of the present invention is to provide a skin anti-aging agent and an anti-aging-related gene expression regulating agent which have a more excellent dermal fibroblast activation effect, are highly safe, and can be used safely over a long period of time. And a cosmetic comprising the anti-aging agent or the anti-aging-related gene expression regulating agent.
  • the present inventors have conducted intensive studies on the above problems, and as a result, it has been found that special low-molecular-weight DNA and soybean extract, which are safe even if taken for a long period of time, have a synergistic activation effect on dermal fibroblasts, that is, cell proliferation.
  • the present invention has been accomplished based on these findings. That is, the present invention is as follows.
  • the anti-aging is a function activation of dermal fibroblasts, and the function activation is at least one selected from the group consisting of a dermal fibroblast proliferation promoting action, a type I collagen production promoting action, and a hyaluronic acid production promoting action.
  • the anti-aging agent according to (1) which is a kind of action.
  • the expression of at least one gene selected from the group consisting of a type I collagen synthase gene, a hyaluronic acid synthase 1 gene and a hyaluronic acid synthase 2 gene is promoted, or a collagen-degrading enzyme
  • a cosmetic comprising the anti-aging agent according to any of (1) to (3) or the anti-aging-related gene expression controlling agent according to any of (4) to (6).
  • the anti-aging agent for skin of the present invention contains a special low-molecular-weight DNA and a soybean extract as active ingredients, and the special low-molecular-weight DNA can be prepared by hydrolyzing DNA extracted from animals and plants. And a soybean extract, characterized in that the soybean extract is at least one extract selected from the group consisting of soybean seeds, embryos and buds.
  • the anti-aging of the skin means the activation of the function of dermal fibroblasts
  • the activation of the function consists of the promotion of the proliferation of dermal fibroblasts, the promotion of type I collagen production, and the promotion of hyaluronic acid production. It means at least one kind of action selected from the group.
  • the agent for regulating the expression of an anti-aging related gene of the skin of the present invention contains the above special low molecular weight DNA and soybean extract as active ingredients, and the special low molecular weight DNA hydrolyzes DNA extracted from animals and plants.
  • the soybean extract is characterized by being at least one extract selected from the group consisting of soybean seeds, germs and buds.
  • the skin anti-aging-related gene means a gene encoding any of the following enzymes involved in the synthesis or degradation of collagen or hyaluronic acid in dermal fibroblasts.
  • Type I collagen synthase gene Human Collagen Type1 Alpha 1; COL1A1
  • Collagenase gene Human Matrix Metallopeptidase 1; MMP1
  • HAS1 Human Hyaluronan Synthase 1
  • HAS2 Hyaluronan synthase 2
  • Hyaluronic acid degrading enzyme gene Human Hyaluronidase 1; HYAL1
  • Regulation of gene expression means promotion of the expression of the synthase gene (increase in expression level) and / or decrease in expression of the degrading enzyme gene (decrease in expression level).
  • These skin anti-aging related gene expression regulation is preferably selected from the group consisting of type I collagen synthase gene (COL1A1), hyaluronic acid synthase 1 gene (HAS1) and hyaluronic acid synthase 2 gene (HAS2). It means that the expression of at least one gene is promoted or the gene expression of a collagenase gene (MMP1) and / or a hyaluronanase gene (HYAL1) is decreased. Further, the function activation of the dermal fibroblast may be promotion of the gene expression or reduction of the gene expression in the dermal fibroblast.
  • the anti-aging agent for skin or the anti-aging related gene expression controlling agent for skin of the present invention contains special low-molecular-weight DNA and soybean extract as active ingredients, and further contains other optional components as necessary. May be.
  • the special low-molecular-weight DNA in the present invention is a component that can be prepared by hydrolyzing DNA extracted from animals and plants.
  • the source of the DNA may be various organisms such as animals, plants, and microorganisms, and the DNA may be synthetic DNA. Among them, it is particularly preferable to use DNA derived from the testis of a fish, such as salmon, trout, and cod, from the viewpoint that a large amount of DNA is contained and waste from processing of marine products can be effectively used.
  • DNA Extraction and purification of DNA from fish testes can be performed by a conventional method (for example, according to the description in JP-A-2005-245394). For example, fish testes are crushed, and the crushed fish testes are treated with a protease (protease) under conditions that do not degrade DNA, and alcohol (methanol, ethanol, isopropyl alcohol, etc.) is added to the enzyme-treated solution. In addition, the DNA is precipitated as a DNA salt (DNA sodium salt), and the precipitate is collected.
  • a protease protease
  • alcohol methanol, ethanol, isopropyl alcohol, etc.
  • DNA sodium salt DNA sodium salt
  • nuclease such as nuclease
  • a nuclease derived from blue mold can be used.
  • the hydrolysis is performed, for example, by putting the above-mentioned DNA salt (DNA sodium salt) as a raw material into warm water adjusted to about 65 ° C., stirring, heating the mixture to 70 ° C., and adding nuclease to react. Can be.
  • the temperature during the hydrolysis treatment is preferably from 60 to 75 ° C, more preferably 70 ° C.
  • the obtained hydrolysis product is freeze-dried, for example, to obtain a powdered special low-molecular-weight DNA.
  • the special low-molecular-weight DNA obtained by the above method can be usually obtained in a sodium salt state.
  • the salt is not limited to a sodium salt, and may be, for example, a potassium salt or a calcium salt.
  • the special low-molecular-weight DNA may be a free form instead of a salt.
  • the special low-molecular-weight DNA preferably contains 10 to 80% of a fraction having a molecular weight of 12,000 or less, and more preferably 10 to 80% of a fraction having a molecular weight of 5,000 or less.
  • the molecular weight distribution can be measured by fractionating the sample based on the molecular weight by GPC and then quantifying the sample by a UV detector.
  • the soybean extract in the present invention is at least one kind of extract selected from the group consisting of soybean seeds, embryos and buds.
  • the extraction conditions are not particularly limited, but a method for obtaining a plant extract containing a polyamine, for example, as described in Patent Document 3, crushing soybean seeds, germs (embryos) or buds in a suitable medium, Extraction under conditions is preferred.
  • the germ used as a raw material may be collected from those separated from the seeds, and the soybean sprouts may be collected from the sprouts of germinated soybean seeds under appropriate conditions.
  • the soybean extract contains a large amount of polyamine.
  • Polyamine is a general term for linear aliphatic hydrocarbons having two or more primary amino groups, and is known as a growth factor that exists in all living organisms and is involved in cell division and protein synthesis.
  • the polyamine content in the soybean extract is not particularly limited, but is preferably 0.05% or more, more preferably 0.1% or more, further preferably 0.15% or more, and particularly preferably 0.2% or more.
  • the polyamine content can be measured by a high performance liquid chromatography method.
  • a soybean extract especially an extract of a soybean bud portion (hereinafter sometimes referred to as “soybean bud extract”) contains a large amount of polyamines (putrescine, cadaverine, spermidine, permine, etc.) (Patent Document 3).
  • polyamines putrescine, cadaverine, spermidine, permine, etc.
  • soybean extract (Phytopolyamine (registered trademark) -S (part number: SPA-301), phytopolyamine-SP (part number: SPA-308)) manufactured by Toyobo, and soybean extract manufactured by Combi Corporation Material (Soiporia (registered trademark)).
  • soybean bud extract (Phytopolyamine (registered trademark) -S (part number: SPA-301), phytopolyamine-SP (part number: SPA-308)) manufactured by Toyobo, and soybean extract manufactured by Combi Corporation Material (Soiporia (registered trademark)).
  • the content of the active ingredient in the anti-aging agent varies depending on the type and form of the preparation, the purpose of use, the frequency of use, etc., and it is difficult to uniformly define the content, and the content and the content ratio of each component are as follows: It is preferable that the content and the content ratio have a synergistic effect on the activation of dermal fibroblasts.
  • the operation is as follows.
  • the content of the special low-molecular-weight DNA is preferably 0.01 to 10 mg / mL (about 0.001 to 1%), more preferably 0.01 to 5 mg / mL (about 0.001 to 0.5%). , 0.01 to 2 mg / mL (about 0.001 to 0.2%).
  • the content of the soybean extract is preferably 0.01 to 10 mg / mL (0.001 to 1%), more preferably 0.1 to 5 mg / mL (0.01 to 0.5%), .1 to 2 mg / mL (0.01 to 0.2%) is more preferable.
  • the special low-molecular-weight DNA: soybean extract is preferably 1:50 to 50: 1, and 1:20 by mass ratio. 1010: 1 is more preferred, and 1: 10-5: 1 is even more preferred.
  • the concentration of polyamine in the anti-aging agent is determined by the type of the preparation, the product form, the purpose of use, the frequency of use, and the like, and is not particularly limited, but is usually 0.00001 to 100 mM, preferably 0 to 100 mM. 0.0005 to 75 mM, more preferably 0.0001 to 50 mM.
  • the activation of dermal fibroblasts in that it has a synergistic effect or a significant effect.
  • the synergistic effect in the activation action of dermal fibroblasts refers to the cell growth rate, collagen production rate, and hyaluronic acid production rate when special low molecular weight DNA and soybean extract are used in combination with dermal fibroblasts.
  • the expression level of the hyaluronan synthase gene preferably the expression level of the hyaluronan synthase gene, the expression reduction level of the collagen or hyaluronan degrading enzyme gene, preferably the hyaluronan degrading enzyme expression reduction level, each alone is Means larger (significantly larger) than the sum of the degrees when used in. Also, a significant effect means an effect that has a significant difference when compared to a negative control.
  • the anti-aging agent or the anti-aging-related gene expression regulating agent of the present invention is prepared by mixing a special low-molecular-weight DNA with a soybean extract, and other components, if necessary, in a conventional manner to obtain a desired dosage form. Can be manufactured.
  • examples of the other components include the same components as the optional components that can be contained in the cosmetic of the present invention described later.
  • the cosmetic of the present invention comprises a skin anti-aging agent or an anti-aging-related gene expression regulating agent.
  • “comprising” means that it may contain optional components such as a physiologically acceptable carrier and other auxiliary components that can be used in combination depending on the desired product form.
  • the cosmetic of the present invention can be provided as, for example, a basic cosmetic or a cosmetic for hair to be applied to and used on the scalp and hair.
  • cosmetics include quasi-drugs in addition to cosmetics of the Pharmaceutical Affairs Law.
  • the dosage form that can be employed is not particularly limited as long as it can be applied to the skin. Specifically, in the form of liquid, emulsion, gel, cream, ointment, foam, mist, aerosol, etc., lotion, emulsion, cream, gel, jelly, essence, lip balm, pack, It can be provided as a mask or the like.
  • the other optional components that can be contained in these cosmetics are not particularly limited, and additives and the like that can be blended into ordinary cosmetics can be used.
  • additives include water, oils and fats, waxes, hydrocarbons, fatty acids, alcohols, esters, surfactants, fragrances, astringents, bactericidal / antibacterial agents, whitening agents, ultraviolet absorbers, Examples include humectants, cell activators, anti-inflammatory and anti-allergic agents, antioxidants, vitamins, natural extracts and the like.
  • the content of these other optional components is also not particularly limited, and can be appropriately selected depending on the desired dosage form and the like.
  • the anti-aging agent or the anti-aging-related gene expression regulating agent of the present invention can be provided as a food or drink for ingestion and use.
  • Foods and drinks include health foods (for example, functional foods, dietary supplements, health supplements, fortified foods, nutritionally adjusted foods, supplements, etc.), health foods (for example, specified health foods, nutritional foods, functional foods, etc.). Sex-labeled foods, etc.), special-purpose foods (eg, foods for the sick, infant formula, milk powder for pregnant and nursing women, etc.), as well as diseases or conditions (symptoms) caused by reduced dermal fibroblast function. Classifications such as foods and drinks with risk reduction, prevention or improvement indications are also included.
  • the other optional components that can be contained in these foods and drinks are not particularly limited, and additives and the like that can be added to ordinary foods and drinks can be used.
  • Example 1 Cell proliferation action and collagen / hyaluronic acid production promoting action 1
  • Purpose and outline of the test Collagen and hyaluronic acid in the skin are considered to play an important role in skin tension, skin flexibility and moisture. ing. Therefore, the synergistic effect of the test substance (special low molecular weight DNA and soybean extract) was evaluated by the proliferation action of dermal fibroblasts and the promotion action of collagen / hyaluronic acid production.
  • EMEM Medium Eagle's Minimal Essential Medium
  • Test substance (1) Special low molecular weight DNA Hydrolyzed DNA-Na (powder) manufactured by Nissei Bio Co., Ltd. was used. This product is prepared by extracting a Na salt of DNA from testis (albino) of salmonid fish and hydrolyzing it by the method described above.
  • FIG. 1 shows the results of gel permeation chromatography (GPC) analysis of the hydrolyzed DNA-Na manufactured by Nissei Bio Co., Ltd., and Table 1 shows the relationship between the retention time and the molecular weight. The estimated molecular weight of 12,000 was based on the retention time of Cytochrome c (MW 12,400).
  • the fractions by molecular weight of the hydrolyzed DNA-Na manufactured by Nissei Bio Co., Ltd. are as follows. Fraction having a molecular weight of 12,000 to 5,000 (elution time: less than 20 minutes to 25 minutes): 32.0% Fraction with a molecular weight of 5,000 or less (elution time after 25 minutes): 32.4% From the above, the fraction having a molecular weight of 12,000 or less of hydrolyzed DNA-Na manufactured by Nissei Bio Co., Ltd. is 64.4%.
  • test substance hydrolyzed DNA-Na adjusted to 3.0 mg / mL with 30 ⁇ M @ L-ascorbic acid (CAS # 50-81-7, @Wako, @Japan) and EMEM containing 0.1% FBS, was compared with a common ratio. It was serially diluted with 10 and adjusted to a total of two concentrations (0.03 mg / mL, 0.3 mg / mL) at the time of use (final concentrations: 0.01 mg / mL, 0.1 mg / mL).
  • Soybean extract Phytopolyamine (registered trademark) -SP product number: SPA-308, compounding ratio: about 70% soybean bud extract, about 30% Na citrate
  • EMEM containing 30 ⁇ M L-ascorbic acid (CAS No. 50-81-7, Wako, Japan) and 0.1% FBS) SPA-308) was prepared fresh (final concentrations 0.13 mg / mL, 0.27 mg / mL and 0.51 mg / mL).
  • Test Configuration The average value of three wells per treatment group was used for calculation of cell proliferation, collagen production and hyaluronic acid production.
  • the test was carried out by providing one test substance administration group and one operation control group for each plate.
  • the operations related to the test, including the preparation of the test substance, were performed at room temperature unless otherwise specified.
  • the culture supernatant was dispensed into a new 96-well plate and stored frozen ( ⁇ 20 ° C.).
  • the amount of collagen and the amount of hyaluronic acid in the culture supernatant were measured using ELISA (Enzyme-Linked Immuno-Sorbent Assay) shown in 2-5 (3) and (4) to promote the production of collagen-hyaluronic acid by the test substance. The effect was evaluated. Further, the number of cells in the 96-well plate from which the culture supernatant was removed was measured by the method described in 2-5 (2) to evaluate the cell proliferation effect of the test substance.
  • the absorbance at 570 nm was measured using a microplate reader (SPARK TM 10M, TECAN, Switzerland).
  • the OD 570 of the OD 570 of the negative control 100% the test substance administration group was calculated as a cell growth rate (%).
  • the cell proliferation rate (%) between the negative control and the test substance-administered group was tested for significance using two unpaired groups (Student's t-test). In each test, the significance level was less than 5% on both sides (p ⁇ 0.05, p ⁇ 0.01, p ⁇ 0.001).
  • the collagen standard solution was serially diluted with a Dilution buffer at a common ratio of 2 to prepare a total of 7 concentrations.
  • the culture supernatant was diluted 2-fold with Dilutionilbuffer.
  • the plate was washed three times with 200 ⁇ L of Wash buffer, 50 ⁇ L of a peroxidase-labeled avidin solution was added, and the mixture was shaken at about 270 rpm for 1 hour.
  • the wells were washed three times with 200 ⁇ L of Wash buffer, and 50 ⁇ L of a 3,3 ′, 5,5′-tetramethylbenzidine substrate solution was added per well, followed by standing for 15 minutes.
  • Stop Solution 50 ⁇ L was added per well, and the microtiter plate was shaken at 270 rpm for 1 minute to make the dye in the well uniform, and then the absorbance at 450 nm (OD450) was measured using a microplate reader. .
  • Hyaluronic acid production promoting effect The effect of the test substance on the production of hyaluronic acid, which is said to hold water between collagen and elastin, was evaluated by sandwich ELISA as follows.
  • Hyaluronan Quantikine ELISA kit Lit. DHYAL0, R & D Systems, USA was used to measure the amount of hyaluronic acid in the culture supernatant.
  • the hyaluronic acid standard solution was serially diluted at a common ratio of 2 with a Dilution buffer to prepare a total of 7 concentrations.
  • the culture supernatant was diluted 8-fold with Dilutionilbuffer.
  • 50 50 ⁇ L of a biotin-labeled hyaluronic acid antibody solution was added per well to an aggrecan-immobilized microtiter plate. Further, 50 ⁇ L of the diluted culture supernatant was added and shaken at about 270 rpm for 1 hour.
  • the plate was washed 5 times with 400 ⁇ L of Wash buffer, 100 ⁇ L of a peroxidase-labeled avidin solution was added, and the mixture was shaken at about 270 rpm for 1 hour.
  • the plate was washed five times with 400 ⁇ L of Wash buffer, 100 ⁇ L of 3,3 ′, 5,5′-tetramethylbenzidine substrate solution was added per well, and the plate was allowed to stand for 30 minutes under light shielding.
  • hyaluronic acid production rate (%) of the test substance was calculated with the hyaluronic acid production amount of the negative control as 100%.
  • the significance of the hyaluronic acid production rate (%) of the negative control and the addition of the test substance was determined by a two-group unpaired test (Student's t-test). In each test, the significance level was less than 5% on both sides (p ⁇ 0.05, p ⁇ 0.01, p ⁇ 0.001).
  • Test results 3-1 Special low-molecular-weight DNA (1) Cell Proliferation Action The cell proliferation rate of the test substance (hydrolyzed DNA-Na) 0.01 mg / mL and 0.1 mg / mL ⁇ standard when the cell proliferation amount (OD 570 ) of the negative control was calculated as 100%. Deviations were 101.3 ⁇ 6.8% and 102.6 ⁇ 3.3%, respectively.
  • Collagen I production promotion action Collagen production rate ⁇ standard deviation of 0.01 mg / mL and 0.1 mg / mL of the test substance (hydrolyzed DNA-Na) when the collagen production amount of the negative control was calculated as 100% Was 126.4 ⁇ 7.9% (p ⁇ 0.01) and 134.0 ⁇ 3.6% (p ⁇ 0.01), respectively.
  • Hyaluronic acid production promoting action Hyaluronic acid production rate of test substance (hydrolyzed DNA-Na) 0.01 mg / mL and 0.1 mg / mL ⁇ standard, calculated assuming that the amount of hyaluronic acid production of the negative control is 100% Deviations were 102.2 ⁇ 5.0% and 102.9 ⁇ 7.5%, respectively.
  • Type I collagen production promoting action 0.13 mg / mL, 0.27 mg / mL and 0.51 mg / mL collagen of the test substance (SPA-308) calculated assuming the collagen production promoting action of the negative control as 100%
  • the production promotion rate ⁇ standard deviation was 135.1 ⁇ 1.3% (p ⁇ 0.01), 174.1 ⁇ 6.3% (p ⁇ 0.01) and 199.9 ⁇ 11.8% (p ⁇ 0.01, respectively). )Met.
  • Hyaluronic acid production promoting action Hyaluronic acid of 0.13 mg / mL, 0.27 mg / mL and 0.51 mg / mL of the test substance (SPA-308) when the amount of hyaluronic acid production of the negative control was calculated as 100%
  • the production rate ⁇ standard deviation was 113.1 ⁇ 4.7% (p ⁇ 0.01), 123.3 ⁇ 3.8% (p ⁇ 0.01) and 137.8 ⁇ 10.3% (p ⁇ 0.01), respectively. Met.
  • Test substance (hydrolysis DNA-Na + SPA-308) was calculated cell growth of cell growth effect negative control (OD 570) as 100% 0.01 mg / ML + 0.27 mg / mL and 0.1 mg / mL + 0.27 mg / mL, the cell proliferation rate ⁇ standard deviation is 133.0 ⁇ 4.8% (p ⁇ 0.01) and 140.8 ⁇ 5.7% ( p ⁇ 0.01).
  • Type I collagen production promoting action The test substance (hydrolyzed DNA-Na + SPA-308) 0.01 mg / mL + 0.27 mg / mL and 0.1 mg / mL + 0.1 when the amount of collagen production of the negative control was calculated as 100%.
  • the collagen production rate ⁇ standard deviation of 27 mg / mL was 178.1 ⁇ 5.5% (p ⁇ 0.01) and 230.6 ⁇ 9.9% (p ⁇ 0.01), respectively.
  • Hyaluronic acid production promoting action The test substance (hydrolyzed DNA-Na + SPA-308) 0.01 mg / mL + 0.27 mg / mL and 0.1 mg / mL + 0.1% when the hyaluronic acid production amount of the negative control was calculated as 100%.
  • the hyaluronic acid production rate ⁇ standard deviation of 27 mg / mL was 132.7 ⁇ 7.6% (p ⁇ 0.01) and 139.8 ⁇ 2.9% (p ⁇ 0.01), respectively.
  • DNA-Na is “hydrolyzed DNA-Na”. From Table 2, the cell growth rate, collagen production rate, and hyaluronic acid production rate when the special low-molecular-weight DNA (hydrolyzed DNA-Na) and soybean extract (SPA-308) were used in combination were used alone. It can be seen that the degree (rate) of the case is significantly larger than the sum of the cases. As a result, a synergistic effect of the special low molecular weight DNA and the soybean extract on the function activating action (cell proliferation action, collagen production promoting action and hyaluronic acid production promoting action) of dermal fibroblasts can be confirmed.
  • Example 2 Regulation of hyaluronic acid synthesis or degrading enzyme gene expression 1
  • Purpose and outline of the test Collagen and hyaluronic acid in skin play an important role in the firmness, flexibility and moisturization of skin, and especially hyaluronic acid in dermis It is known that a decrease in the amount is related to a decrease in skin elasticity and wrinkle formation.
  • test substances special low molecular weight DNA and soybean extract
  • the effects of test substances on the expression of genes related to anti-aging, such as synthesis and degradation of hyaluronic acid by dermal fibroblasts, were evaluated by real-time PCR. .
  • EMEM Medium A medium having the same composition as 2-2 of Example 1 was used except that the content of FBS (Fetal Bovine Serum) was changed to 10.0% (v / v).
  • Test substance (1) Special low molecular weight DNA solution The same special low molecular weight DNA (hydrolyzed DNA-Na) as in 2-3 (1) of Example 1 was used. The test substance (hydrolyzed DNA-Na) adjusted to 1 mg / mL with EMEM containing 10% FBS was serially diluted at a common ratio of 10 to prepare a total of 2 concentrations (when the final concentration was 0.01 mg / mL, 0 mg / mL). .1 mg / mL).
  • Soybean extract solution The same soybean extract (SPA-308) as in 2-3 (2) of Example 1 was used.
  • Hs00201046_m1 Hyaluronan Synthase 1
  • Hs00758053_m1 Hyaluronan Synthase 2
  • Hs00193435_m1 Hyaluronic acid degrading enzyme (Human Hyaluronidase 1 (HYAL1), Assay ID. Hs00201046_m1)
  • the glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (Human Glyceraldehyde-3-Phosphate Dehydrogenase (GAPDH), Assay ID. Hs02786624_g1) gene was used as the internal standard gene.
  • Test Configuration The average value of three 35 mm dishes (Cat No. 150318, Thermo Scientific, USA) per treatment group was used for the analysis of the gene expression level.
  • Test Method (1) Cell Culture and Addition of Test Substance 5.0 ⁇ 10 5 cells / 2 mL of NB1RGB cells were seeded on a 35 mm dish, and cultured in a CO 2 incubator for 24 hours. Twenty-four hours later, the medium in the 35-mm dish was removed, a test substance and a negative control-containing medium were added, and the cells were cultured in a CO 2 incubator for 24 hours.
  • RNA extraction / purification and quantification RNA extraction / purification was performed as follows using PureLink TM RNA Mini Kit (Cat No. 12183018A, Invitrogen, USA).
  • the 35 mm dish from which the medium was removed was washed twice with 2 mL of PBS (-) heated to 37 ° C.
  • 600 ⁇ L of Lysis Buffer containing 2 M Dithiothreitol was added to lyse the cells, and the lysate was recovered. Furthermore, the cells in the recovered lysate were disrupted using a Homogenizer (Cat No. 12183-026, Invitrogen, USA).
  • RNA A part of the eluted RNA is fractionated into a UV-permeable 96-well plate (Cat No. 8404, Thermo Scientific, USA), and Tris-EDTA Buffer (TE (pH 8.0), Cat No. 310-90023, NIPPON) GENE, Japan), and the absorbance at 260 nm (OD 260 ) was measured using a microplate reader (SPARK TM 10M TECAN, Switzerland).
  • RNA concentration of the negative control and the test substance was calculated by the following formula, and diluted with TE Buffer to adjust the RNA concentration to 10 ⁇ g / mL.
  • RNA concentration ( ⁇ g / mL) A x K x 0.3 (optical path length: cm) x 25 (dilution factor)
  • K: K 40, extinction coefficient of RNA
  • HAS1 hyaluronic acid synthase 1 gene
  • HAS2 hyaluronic acid synthase 2 gene
  • Soybean extract (1) Expression of hyaluronic acid synthase 1 gene (HAS1) 0.027 mg / mL and 0.27 mg / mL of the test substance (SPA-308) when the HAS1 expression level of the negative control was set to 1 HAS1 expression level ⁇ standard deviation was 1.03 ⁇ 1.2 and 0.99 ⁇ 0.16, respectively.
  • HAS1 hyaluronic acid synthase 1 gene
  • HAS2 hyaluronic acid synthase 2 gene
  • HAS1 hyaluronic acid synthase 1 gene
  • Test substance HAS1-hydrolyzed DNA-Na + SPA-308 when HAS1 expression level of negative control is set to 1 HAS1 expression levels ⁇ 0.01 standard deviation of 0.01 mg / mL + 0.27 mg / mL and 0.1 mg / mL + 0.27 mg / mL are 0.99 ⁇ 0.08 and 1.51 ⁇ 0.26 (p ⁇ 0.05), respectively.
  • HAS2 hyaluronic acid synthase 2 gene
  • DNA-Na is “hydrolyzed DNA-Na”. From Table 3, it can be seen that when the special low-molecular-weight DNA (hydrolyzed DNA-Na) and soybean extract (SPA-308) are used in combination, the expression level of the hyaluronic acid synthase-1 gene (HAS1) increases synergistically, It can be seen that the expression level of the hyaluronic acid synthase-2 gene (HAS2) is significantly increased as compared with the negative control. Furthermore, it turns out that the expression level of the hyaluronan degrading enzyme gene (HYAL1) is synergistically reduced.
  • HAS1 hyaluronic acid synthase-1 gene
  • HAS2 hyaluronic acid synthase-2 gene
  • the anti-aging agent for skin of the present invention has a different action and function from conventional anti-aging agents, and can prevent and / or improve skin aging more efficiently than conventional anti-aging agents. Especially useful in the cosmetics field.

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Abstract

本発明は、安全性が高く、長期間にわたって安心して使用できる皮膚の抗老化用剤、抗老化関連遺伝子発現調節用剤及び該抗老化用剤又は抗老化関連遺伝子発現調節用剤を含んでなる化粧品を提供することを課題とする。　本発明の皮膚の抗老化用剤、抗老化関連遺伝子発現調節用剤及び該抗老化用剤又は抗老化関連遺伝子発現調節用剤を含んでなる化粧品は、特殊低分子化ＤＮＡと大豆抽出物、好ましくは大豆芽エキスとを有効成分として含む。この有効成分は、真皮線維芽細胞の機能賦活作用を有するので、肌の張りや弾力の低下、しわやたるみ等の皮膚の老化の予防又は改善が期待される。

Description

皮膚の抗老化用剤及び抗老化関連遺伝子発現調節用剤
　本発明は、皮膚の抗老化用剤又は抗老化関連遺伝子発現調節用剤に関し、さらに詳しくは、特殊低分子化ＤＮＡと大豆抽出物を有効成分として含む皮膚の抗老化用剤、抗老化関連遺伝子発現調節用剤、及び該抗老化用剤又は抗老化関連遺伝子発現調節用剤を含んでなる化粧品に関する。
　皮膚は、外界と接している表皮、その内側に位置し表皮と強い力で接着している真皮、さらにその内側にあり真皮と筋肉の間に位置している皮下脂肪組織に、大きく分けることができる。表皮と皮下脂肪組織の間に位置する真皮は、乳頭層と真皮網状層、結合性繊維組織から構成される。この真皮の約７０％はコラーゲンが占め、他に弾性線維（エラスチン）、ヒアルロン酸等の細胞外マトリックス成分により構成される。これら真皮を構成するコラーゲン、エラスチン、ヒアルロン酸等は、真皮網状層に存在する真皮線維芽細胞により生成される。
　一般的に、紫外線、乾燥、加齢等により、これら繊維が破壊され、古くなって弾力が低下するとともに、細胞外マトリックス成分の産生機能が低下することが、肌の張りや弾力の低下、シワやたるみ等の肌の老化原因と考えられている。このように、皮膚の弾力性の低下やシワ形成などの老化現象には、真皮の細胞外マトリックス成分、特にコラーゲンやヒアルロン酸の減少が関与している。
　したがって、真皮線維芽細胞の機能を賦活させ、前記した細胞外マトリックス成分の産生を増加させれば、肌の老化を予防又は改善できると考えられる。特に、顔面に形成されるしわは老化マーカーとしてヒトの外観に大きな影響を及ぼす。それゆえ、若さを保つ手段として、しわの予防又は改善効果を有する化粧品（抗老化・抗しわ化粧品）に対するニーズがますます高まっている（非特許文献１）。
　ここで、安全で効果の優れた機能性食品として用いられているデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）は、肌状態（水分量、皮脂量、皮溝密度、しわ、しみ、そばかす等）の改善効果を有することが報告されている（特許文献１、２）。
　また、大豆の種子、胚芽（胚）又は芽の抽出物はポリアミンを多く含み、皮膚構造を支持するエラスチン、コラーゲン、ヒアルロン酸等の細胞外マトリックス成分の産生促進作用を有することが報告されている（特許文献３）。
　しかしながら、これらデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）と大豆抽出物との相互作用について、本発明者の知る限り、報告はなされていない。
特開２００７－２９１０６２号公報 特開２００８－６３３１５号公報 特開２０１２－４６５４４号公報
鈴木正人監修「老化防止・美白・保湿化粧品の技術開発」（普及版）株式会社シーエムシー出版　２００７年８月２３日　第１刷発行
　真皮線維芽細胞の機能を賦活させて細胞外マトリックス成分、特にコラーゲンやヒアルロン酸の産生を増加させれば、前記のとおり、肌の老化の予防又は改善が期待できる。そこで、本発明の課題は、より優れた真皮線維芽細胞の賦活効果を有し、かつ安全性が高く、長期間にわたって安心して使用できる皮膚の抗老化用剤、抗老化関連遺伝子発現調節用剤、及び該抗老化用剤又は抗老化関連遺伝子発現調節用剤を含んでなる化粧品を提供することにある。
　本発明者らは、上記課題について鋭意検討した結果、長期間服用しても安全である特殊低分子化ＤＮＡと大豆抽出物が、真皮線維芽細胞に対して相乗的な賦活作用、すなわち細胞増殖作用、コラーゲン産生促進作用及びヒアルロン酸産生促進作用に対する相乗的な効果（相乗効果）を有すること、ヒアルロン酸合成に関連する遺伝子発現を相乗的に促進するとともに、ヒアルロン酸分解に関連する遺伝子発現を減少させることを見出した。本発明はこれらの知見に基づいて成し遂げられたものである。すなわち、本発明は以下のとおりである。
（１）特殊低分子化ＤＮＡと大豆抽出物とを有効成分として含み、前記特殊低分子化ＤＮＡが、動植物から抽出したＤＮＡの加水分解処理物であり、前記大豆抽出物が大豆の種子、胚芽及び芽からなる群より選ばれる少なくとも１種の抽出物であることを特徴とする皮膚の抗老化用剤。
（２）抗老化が真皮線維芽細胞の機能賦活であって、該機能賦活が真皮線維芽細胞の増殖促進作用、Ｉ型コラーゲン産生促進作用及びヒアルロン酸産生促進作用からなる群より選ばれる少なくとも１種の作用である、（１）に記載の抗老化用剤。
（３）特殊低分子化ＤＮＡの含有量が０．００１～１質量％であり、大豆抽出物の含有量が０．００１～１質量％である、（１）又は（２）に記載の抗老化用剤。
（４）特殊低分子化ＤＮＡと大豆抽出物とを有効成分として含み、前記特殊低分子化ＤＮＡが、動植物から抽出したＤＮＡの加水分解処理物であり、前記大豆抽出物が大豆の種子、胚芽及び芽からなる群より選ばれる少なくとも１種の抽出物であることを特徴とする皮膚の抗老化関連遺伝子発現調節用剤。
（５）抗老化関連遺伝子発現調節が、Ｉ型コラーゲン合成酵素遺伝子、ヒアルロン酸合成酵素１遺伝子及びヒアルロン酸合成酵素２遺伝子からなる群より選ばれる少なくとも１種の遺伝子発現促進、又は、コラーゲン分解酵素遺伝子及び／若しくはヒアルロン酸分解酵素遺伝子の遺伝子発現減少である、（４）に記載の抗老化関連遺伝子発現調節用剤。
（６）特殊低分子化ＤＮＡの含有量が０．００１～１質量％であり、大豆抽出物の含有量が０．００１～１質量％である、（４）又は（５）に記載の抗老化関連遺伝子発現調節用剤。
（７）（１）～（３）のいずれかに記載の抗老化用剤、又は（４）～（６）のいずれかに記載の抗老化関連遺伝子発現調節用剤を含んでなる化粧品。
　本発明によれば、有効成分である特殊低分子化ＤＮＡと大豆抽出物が、真皮線維芽細胞に対して相乗的な賦活作用を有するので、皮膚の抗老化、すなわち肌の張りや弾力の低下、シワやたるみ等の肌の老化の予防又は改善等の効果が期待できる。
実施例で用いた加水分解ＤＮＡ－Ｎａのゲル浸透クロマトグラフィー(Gel Permeation Chromatography：ＧＰＣ)による分析結果を示す図である。図の横軸は保持時間（分）、縦軸は紫外領域（波長２６０ｎｍ）の吸光度である。
　以下に本発明の実施の形態を詳細に説明するが、以下の説明は、本発明の実施の形態の一例であり、本発明は、以下の記載内容に限定されるものではない。なお、本明細書において「～」という表現を用いる場合、その前後の数値又は物性値を含む表現として用いるものとする。また、有効成分の含有量（％）は特に明記しない限り質量パーセント（ｗｔ％）である。
　本発明の皮膚の抗老化用剤は、特殊低分子化ＤＮＡと大豆抽出物とを有効成分として含み、特殊低分子化ＤＮＡが、動植物から抽出したＤＮＡを加水分解処理することにより調製することができる成分であり、大豆抽出物が大豆の種子、胚芽及び芽からなる群より選ばれる少なくとも１種の抽出物であることに特徴を有するものである。
　ここで、皮膚の抗老化とは、真皮線維芽細胞の機能賦活を意味し、該機能賦活とは、真皮線維芽細胞の増殖促進作用、Ｉ型コラーゲン産生促進作用及びヒアルロン酸産生促進作用よりなる群から選ばれる少なくとも１種の作用であることを意味する。
　また、本発明の皮膚の抗老化関連遺伝子発現調節用剤は、上記特殊低分子化ＤＮＡと大豆抽出物とを有効成分として含み、特殊低分子化ＤＮＡが、動植物から抽出したＤＮＡを加水分解処理することにより調製することができる成分であり、大豆抽出物が大豆の種子、胚芽及び芽からなる群より選ばれる少なくとも１種の抽出物であることに特徴を有するものである。
　ここで、本発明において、皮膚の抗老化関連遺伝子とは、次に示す、真皮線維芽細胞におけるコラーゲン又はヒアルロン酸の合成又は分解に関与するいずれかの酵素をコードする遺伝子を意味する。
・Ｉ型コラーゲン合成酵素遺伝子（Human Collagen Type1 Alpha 1；ＣＯＬ１Ａ１）
・コラーゲン分解酵素遺伝子（Human Matrix Metallopeptidase 1；ＭＭＰ１）
・ヒアルロン酸合成酵素１遺伝子（Human Hyaluronan Synthase 1；ＨＡＳ１）
・ヒアルロン酸合成酵素２遺伝子（Human Hyaluronan Synthase 2；ＨＡＳ２）
・ヒアルロン酸分解酵素遺伝子（Human Hyaluronidase 1；ＨＹＡＬ１）
　また、遺伝子発現調節とは、上記した合成酵素遺伝子の発現促進（発現量の増加）及び／又は分解酵素遺伝子の発現減少（発現量の減少）を意味する。これら皮膚の抗老化関連遺伝子発現調節としては、好ましくは、Ｉ型コラーゲン合成酵素遺伝子（ＣＯＬ１Ａ１）、ヒアルロン酸合成酵素１遺伝子（ＨＡＳ１）及びヒアルロン酸合成酵素２遺伝子（ＨＡＳ２）よりなる群から選ばれる少なくとも１種の遺伝子発現促進、又はコラーゲン分解酵素遺伝子（ＭＭＰ１）及び／若しくはヒアルロン酸分解酵素遺伝子（ＨＹＡＬ１）の遺伝子発現減少であることを意味する。
　さらに、前記した真皮線維芽細胞の機能賦活とは、真皮線維芽細胞における上記遺伝子発現促進又は上記遺伝子発現減少であってもよい。
　本発明の皮膚の抗老化用剤又は皮膚の抗老化関連遺伝子発現調節用剤は、特殊低分子化ＤＮＡと大豆抽出物を有効成分として含み、必要に応じて、その他の任意成分をさらに含んでいてもよい。
　本発明における特殊低分子化ＤＮＡは、動植物から抽出したＤＮＡを加水分解処理することにより調製することができる成分である。ＤＮＡの供給源は、動物、植物、微生物等の様々な生物であってよく、また、ＤＮＡとしては合成ＤＮＡを使用してもよい。これらの中で特に、ＤＮＡを多く含むことや水産加工上の廃棄物を有効利用できるといった観点から、鮭、鱒、鱈といった魚類の精巣（白子）由来のＤＮＡを使用することが好ましい。
　魚類の精巣からのＤＮＡの抽出及び精製は常法により（例えば特開２００５－２４５３９４号公報の記載に準じて）行うことができる。例えば、魚類の精巣を粗砕し、粗砕した魚類の精巣にＤＮＡが分解しない条件下でタンパク質分解酵素（プロテアーゼ）処理を行い、酵素処理した溶液にアルコール（メタノール、エタノール、イソプロピルアルコールなど）を加えて、ＤＮＡをＤＮＡ塩（ＤＮＡナトリウム塩）として沈殿させ、この沈殿物を回収する。もしくは酵素処理した溶液に酸（塩酸、りん酸、クエン酸など）を加え、ＤＮＡを沈殿させ、この沈殿物を回収し、水酸化ナトリウムで中和して乾燥することでＤＮＡ塩（ＤＮＡナトリウム塩）を得ることができる。
　得られたＤＮＡ塩を、ヌクレアーゼ等の核酸分解酵素を用いて加水分解することにより、特殊低分子化ＤＮＡを得ることができる。加水分解処理に使用するヌクレアーゼとしては、例えば、アオカビ由来のヌクレアーゼを使用することができる。
　加水分解は、例えば、６５℃前後に調整した温水に、上記ＤＮＡ塩（ＤＮＡナトリウム塩）を原料として投入し、撹拌後、さらに７０℃に加温し、ヌクレアーゼを加えて反応させることで行うことができる。加水分解処理時の温度としては、６０～７５℃が好ましく、７０℃がより好ましい。
　得られた加水分解生成物を、例えば凍結乾燥させることで、粉末状の特殊低分子化ＤＮＡを得ることができる。上記の手法による特殊低分子化ＤＮＡは、通常、ナトリウム塩の状態で得ることができる。なお、塩は、ナトリウム塩に限られるものではなく、例えばカリウム塩、又はカルシウム塩であってもよい。また、特殊低分子化ＤＮＡは塩ではなく、遊離体であってもよい。
　特殊低分子化ＤＮＡは、分子量が１２，０００以下である画分を１０～８０％含有することが好ましく、分子量が５，０００以下である画分を１０～８０％含有することがより好ましい。なお、分子量分布の測定は、ＧＰＣで試料を分子量に基づいて分別した後にＵＶ検出器によって定量することにより行うことができる。
　本発明における大豆抽出物は、大豆の種子、胚芽及び芽からなる群より選ばれる少なくとも１種の抽出物である。抽出条件は特に限定されないが、ポリアミンを含む植物抽出物を得る方法、例えば特許文献３に記載されているとおり、大豆の種子、胚芽（胚）又は芽を、適当な媒体中で粉砕し、酸性条件下で抽出する方法が好ましい。なお、原料として用いる胚芽は種子から分離したものを集めればよく、大豆の芽は大豆種子を適当な条件で発芽させた芽部分を集めればよい。
　ここで、大豆抽出物にはポリアミンが多く含まれる。ポリアミンは、第１級アミノ基を２つ以上もつ直鎖脂肪族炭化水素の総称であり、あらゆる生体中に存在し、細胞分裂や蛋白合成に関与している成長因子として知られている。
　大豆抽出物中のポリアミン含有量は特に制限されないが、０．０５％以上が好ましく、０．１％以上がより好ましく、０．１５％以上がさらに好ましく、０．２％以上が特に好ましい。なお、ポリアミン含量は高速液体クロマトグラフ法で測定することができる。
　大豆抽出物、中でも大豆芽部分の抽出物（以下、「大豆芽エキス」ということがある。）には、ポリアミン（プトレシン、カダベリン、スペルミジン、ペルミン等）が多く含まれる（特許文献３）。ポリアミンを多く含む大豆芽エキスを用いることにより、ポリアミンの奏する効果が期待できる。
　大豆抽出物としては市販品を用いることができる。具体的には、例えば東洋紡社製の大豆芽エキス（ファイトポリアミン（登録商標）－Ｓ（品番：ＳＰＡ－３０１）、ファイトポリアミン－ＳＰ（品番：ＳＰＡ－３０8））、コンビ株式会社製の大豆抽出物素材（ソイポリア（登録商標））等が挙げられる。
　抗老化用剤中の有効成分の含有量は、製剤の種類や形態、使用目的、使用頻度等により異なり、一律に規定するのは困難であるが、各成分の含有量や含有量比は、真皮線維芽細胞の賦活作用に対して相乗効果を奏する含有量や含有量比であることが好ましい。
　例えば抗老化用剤を皮膚へ適用する（抗老化用剤が化粧品である）場合は次のとおりである。特殊低分子化ＤＮＡの含有量は、０．０１～１０ｍｇ／ｍＬ（約０．００１～１％）が好ましく、０．０１～５ｍｇ／ｍＬ（約０．００１～０．５％）がより好ましく、０．０１～２ｍｇ／ｍＬ（約０．００１～０．２％）がさらに好ましい。また、大豆抽出物の含有量は、０．０１～１０ｍｇ／ｍＬ（０．００１～１％）が好ましく、０．１～５ｍｇ／ｍＬ（０．０１～０．５％）がより好ましく、０．１～２ｍｇ／ｍＬ（０．０１～０．２％）がさらに好ましい。
　また、特殊低分子化ＤＮＡと大豆抽出物との含有量比に特に制限はないが、質量比で、特殊低分子化ＤＮＡ：大豆抽出物＝１：５０～５０：１が好ましく、１：２０～１０：１がより好ましく、１：１０～５：１がさらに好ましい。
　さらに、抗老化用剤中のポリアミン濃度は、製剤の種類や製品形態、使用目的、使用頻度などによって決められ、特に限定されるのもではないが、通常は０．００００１～１００ｍＭ、好ましくは０．００００５～７５ｍＭ、より好ましくは０．０００１～５０ｍＭが適当である。
　特殊低分子化ＤＮＡや大豆抽出物の含有量や含有量比が好ましい範囲内であると、後述する実施例で具体的に示されているとおり、真皮線維芽細胞の賦活作用（細胞増殖、コラーゲン産生促進、ヒアルロン酸産生促進、ヒアルロン酸合成酵素遺伝子発現促進、ヒアルロン酸分解酵素遺伝子発現減少）に対して相乗効果又は有意な効果を奏する点で有利である。
　ここで、真皮線維芽細胞の賦活作用における相乗効果とは、真皮線維芽細胞に対して特殊低分子化ＤＮＡと大豆抽出物を併用したとき、細胞増殖率、コラーゲン産生率、ヒアルロン酸産生率のいずれかが、各々を単独で使用したときの程度を足し合わせたよりも大きい（有意に大きい）こと、又は、真皮線維芽細胞に対して特殊低分子化ＤＮＡと大豆抽出物を併用したとき、コラーゲン若しくはヒアルロン酸合成酵素遺伝子の発現量、好ましくはヒアルロン酸合成酵素遺伝子の発現量、コラーゲン若しくはヒアルロン酸分解酵素遺伝子の発現減少量、好ましくはヒアルロン酸分解酵素発現減少量のいずれかが、各々を単独で使用したときの程度を足し合わせたよりも大きい（有意に大きい）ことを意味する。また、有意な効果とは、陰性対照と比較した場合に有意差のある効果を意味する。
　本発明の抗老化用剤又は抗老化関連遺伝子発現調節用剤は、特殊低分子化ＤＮＡと大豆抽出物、必要に応じてその他の成分とを常法により混合することにより、所望の剤型に製造することができる。ここで、その他の成分としては、後述する本発明の化粧品が含有し得る任意成分と同様の成分が挙げられる。
　本発明の化粧品は、皮膚の抗老化用剤又は抗老化関連遺伝子発現調節用剤を含んでなるものである。ここで「含んでなる」とは、所望する製品形態に応じた生理学的に許容されうる担体や併用可能な他の補助成分などの任意成分を含んでいてもよいことを意味する。
　本発明の化粧品は、例えば基礎化粧品や頭皮及び毛髪に塗布して使用するための頭髪用化粧品等として提供することができる。なお、本発明において化粧品とは薬事法の化粧品に加え、医薬部外品も包含される。
　本発明の抗老化用剤又は抗老化関連遺伝子発現調節用剤を化粧品として提供する場合、採り得る剤型は、皮膚に適用可能なものであれば特に制限はない。具体的には、液状、乳剤状、ゲル状、クリーム状、軟膏状、フォーム状、ミスト状、エアロゾル状等の剤型で、ローション、乳液、クリーム、ジェル、ゼリー、エッセンス、リップクリーム、パック、マスク等として提供することができる。
　これら化粧品が含有し得るその他の任意成分としては、特に制限はなく、通常の化粧品に配合され得る添加剤等を使用することができる。かかる添加剤としては、例えば、水、油脂類、ロウ類、炭化水素類、脂肪酸類、アルコール類、エステル類、界面活性剤、香料、収斂剤、殺菌・抗菌剤、美白剤、紫外線吸収剤、保湿剤、細胞賦活剤、消炎・抗アレルギー剤、酸化防止剤、ビタミン剤、天然抽出物等が挙げられる。これらその他の任意成分の含有量にも、特に制限はなく、所望の剤型等に応じて適宜選択することができる。
　また、本発明の抗老化用剤又は抗老化関連遺伝子発現調節用剤は、経口摂取して使用するための飲食品として提供することができる。飲食品には、健康食品（例えば、機能性食品、栄養補助食品、健康補助食品、栄養強化食品、栄養調整食品、サプリメント等）、保健機能食品（例えば、特定保健用食品、栄養機能食品、機能性表示食品等）、特別用途食品（例えば、病者用食品、乳幼児用調整粉乳、妊産婦又は授乳婦用粉乳等）の他、真皮線維芽細胞の機能低下に起因する疾患又は状態（症状）のリスク低減、予防又は改善の表示を付した飲食品のような分類のものも包含される。
　これら飲食品が含有し得るその他任意成分としては、特に制限がなく、通常の飲食品に配合され得る添加剤等を使用することができる。
　以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。
［実施例１］細胞増殖作用、コラーゲン・ヒアルロン酸産生促進作用
１　試験の目的及び概要
　皮膚内のコラーゲンやヒアルロン酸は皮膚の張り、皮膚の柔軟性や潤いに重要な役割を果たしていると考えられている。そこで、真皮線維芽細胞の増殖作用やコラーゲン・ヒアルロン酸産生促進作用により、被験物質（特殊低分子化ＤＮＡと大豆抽出物）の相乗効果を評価した。
２　材料と試験方法
２－１　細胞
　ヒト新生児由来の真皮線維芽細胞株ＮＢ１ＲＧＢ細胞（RIKEN BRC, Japan）を用い、ＣＯ２インキュベータ（ＣＯ２濃度５％、３７℃）内で培養した。
２－２　培地
　０．１％（v/v） Fetal Bovine Serum（FBS, Hyclone, UK）及び１．０％（v/v）抗真菌剤（Invitrogen, USA）を含むEagle’s Minimal Essential Medium（EMEM, Wako, Japan）を用いた。
２－３　被験物質
（１）特殊低分子化ＤＮＡ
　日生バイオ株式会社製の加水分解ＤＮＡ－Ｎａ（粉末）を用いた。本品は、前記した方法により、サケ科魚類の精巣（白子）からＤＮＡのＮａ塩を抽出し、それを加水分解することにより調製したものである。
　なお、使用した日生バイオ株式会社製の加水分解ＤＮＡ－Ｎａのゲルパーミエーションクロマトグラフィー（ＧＰＣ）による分析結果を図１に、保持時間と分子量の関係は、表１に示す。分子量目安の１２，０００はCytochrome c (ＭＷ　１２，４００)の保持時間を基とした。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　上記分析結果より、日生バイオ（株）社製の加水分解ＤＮＡ－Ｎａの分子量による画分は以下のとおりである。
　分子量１２，０００～５，０００の画分（溶出時間２０分～２５分未満）：３２．０％
　分子量５，０００以下の画分（溶出時間２５分以降）：３２．４％
　以上のことから、日生バイオ（株）社製の加水分解ＤＮＡ－Ｎａの分子量１２，０００以下である画分は６４．４％である。
　３０μＭ　Ｌ－アスコルビン酸（CAS No.50-81-7, Wako, Japan）及び０．１％ＦＢＳ含有ＥＭＥＭによって、３．０ｍｇ／ｍＬに調整した被験物質（加水分解ＤＮＡ－Ｎａ）を、公比１０で連続希釈して計２濃度（０．０３ｍｇ／ｍＬ、０．３ｍｇ／ｍＬ）に用時調製した（終濃度は０．０１ｍｇ／ｍＬ、０．１ｍｇ／ｍＬ）。
（２）大豆抽出物
　東洋紡社製のファイトポリアミン（登録商標）－ＳＰ（品番：ＳＰＡ－３０８、配合割合：大豆芽エキス約７０％、クエン酸Ｎａ約３０％）を用いた。
　３０μＭ　Ｌ－アスコルビン酸（CAS No.50-81-7, Wako, Japan）及び０．１％ＦＢＳ含有ＥＭＥＭによって、０．３９ｍｇ／ｍＬ、０．８１ｍｇ／ｍＬ及び１．５３ｍｇ／ｍＬの被験物質（ＳＰＡ－３０８）を用時調製した（終濃度は０．１３ｍｇ／ｍＬ、０．２７ｍｇ／ｍＬ及び０．５１ｍｇ／ｍＬ）。
（３）混合溶液（併用）
　上記した２種の被験物質を用いた。
　３０μＭ　Ｌ－アスコルビン酸（CAS No.50-81-7, Wako, Japan）及び０．１％ＦＢＳ含有ＥＭＥＭによって、０．８１ｍｇ／ｍＬに調整したＳＰＡ－３０８含有ＥＭＥＭにより、３．０ｍｇ／ｍＬに調整した加水分解ＤＮＡ－Ｎａを公比１０で連続希釈して計２濃度（０．０３ｍｇ／ｍＬ，０．３ｍｇ／ｍＬ）に用時調製した［ＳＰＡ－３０８の終濃度は０．２７ｍｇ／ｍＬ、加水分解ＤＮＡ－Ｎａの終濃度は０．０１ｍｇ／ｍＬ、０．１ｍｇ／ｍＬ］。
２－４　試験構成
　細胞増殖、コラーゲン産生及びヒアルロン酸産生の算出には１つの処理群につき３ウェルの平均値を用いた。また、１プレートにつき被験物質投与群、操作対照群をそれぞれ１群設けて試験を実施した。被験物質調製を含め、試験に関わる操作は特に記載のないかぎり室温で実施した。
２－５　試験操作
（１）細胞培養
　９６ウェルプレート（Lot.3595, Corning, USA）に１ウェルあたり２．０×１０４ｃｅｌｌｓ／２００μＬのＮＢ１ＲＧＢ細胞を播種し、ＣＯ２インキュベータ内で２４時間培養した。また、培養時の乾燥を防ぐため、試験に用いないウェルにPhosphate buffer saline（PBS(-), Lot.198601, Nissui, Japan）を２００μＬ加えた。
　２４時間後、９６ウェルプレートに被験物質及び陰性対照を１００μＬ添加し、ＣＯ２インキュベータ内で４８時間培養した。陰性対照には３０μＭ　Ｌ－アスコルビン酸及び０．１％ＦＢＳ含有ＥＭＥＭを用いた。
　４８時間後、培養上清を新しい９６ウェルプレートに分注・冷凍保存（－２０℃）した。この培養上清中のコラーゲン量及びヒアルロン酸量を、２－５（３）及び（４）に示すＥＬＩＳＡ（Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay）を用いて測定し、被験物質のコラーゲン・ヒアルロン酸産生促進作用を評価した。また、培養上清を除去した９６ウェルプレートの細胞数を２－５（２）に示す方法により測定し、被験物質の細胞増殖作用を評価した。
（２）細胞増殖作用
　真皮線維芽細胞の増殖に及ぼす被験物質の効果を次のとおり評価した。
　培地を除去した９６ウェルプレートの各ウェルを３７℃に加温したＰＢＳ（－）３００μＬで静かに２回洗浄した。続いて、０．５ｍｇ／ｍＬの3-(4,5-dimethylthiazol-2-ul)-2,5-diphenyltetrazolium bromide（MTT, CAS No.298-93-1, Sigma-Aldrich, USA）溶液を１ウェルあたり１００μＬ加え、ＣＯ２インキュベータ内で２時間培養した。
　培養終了後、ＭＴＴ溶液を除去し、２００μＬのＰＢＳ（－）で洗浄した。生成された不溶性のホルマザンを可溶化するため、０．０４Ｎ塩酸（CAS No.7647-01-0, Kanto Chemical, Japan）を含む２－プロパノール（CAS No.67-63-0, Kanto Chemical, Japan）を２００μＬ加え、遮光下で１時間静置した。
　９６ウェルプレートを２７０ｒｐｍで１０秒間振盪し、ウェル内の色素を均一に分散した後、マイクロプレートリーダー（SPARKTM  10M, TECAN, Switzerland）を用いて５７０ｎｍの吸光度（ＯＤ５７０）を測定した。
　陰性対照のＯＤ５７０を１００％とした被験物質投与群のＯＤ５７０を細胞増殖率（％）として算出した。陰性対照と被験物質投与群の細胞増殖率（％）を対応のない２群の検定（Student's t-test）で有意差検定を行った。検定はいずれも両側で有意水準を５％未満とした（p<0.05, p<0.01, p<0.001）。
（３）コラーゲン産生促進作用
　肌に張りや弾力を与えると言われているＩ型コラーゲンの産生量に対する被験物質の効果を競合ＥＬＩＳＡで次のとおり評価した。
　培養上清中のコラーゲン量の測定にはHuman Collagen typeＩ ELISA kit（Lot. EC1-E105, ACEL, Japan）を用いた。
　Dilution bufferによってコラーゲン標準液を公比２で連続希釈して、計７濃度調製した。また、Dilution bufferによって培養上清を２倍希釈した。
　１２６μＬのコラーゲン標準液及び２倍希釈した培養上清に１４μＬのビオチン標識コラーゲン抗体溶液を添加し、タッピングにより混合した。
　２００μＬのWash bufferによりコラーゲン固相化マイクロタイタープレートを３回洗浄し、５０μＬのビオチン標識コラーゲン抗体を含有した標準液と培養上清を加え、約２７０ｒｐｍで１時間振とうした。
　１時間後、２００μＬのWash bufferにて３回洗浄し、５０μＬのペルオキシダーゼ標識アビジン溶液を加え、約２７０ｒｐｍで１時間振とうした。１時間後、２００μＬのWash bufferにて３回洗浄し、3,3’,5,5'-tetramethylbenzidine基質溶液を１ウェルあたり５０μＬ加え、１５分間静置した。
　次に、Stop solutionを１ウェルあたり５０μＬ添加し、マイクロタイタープレートを２７０ｒｐｍで１分間振とうしてウェル内の色素を均一にした後、マイクロプレートリーダーを用いて４５０ｎｍの吸光度（ＯＤ４５０）を測定した。
　コラーゲン標準液のＯＤ４５０から検量線を4-Parameter logistic modelにより回帰した。回帰式から得られた値に希釈倍率を乗じて陰性対照及び被験物質のコラーゲン産生量（μｇ／ｍＬ）を算出した。
　陰性対照のコラーゲン産生量を１００％として、被験物質のコラーゲン産生率（％）を算出した。陰性対照と被験物質添加のコラーゲン産生率（％）を対応のない２群の検定(Student's t-test)で有意差検定を行った。検定はいずれも両側で有意水準を５％未満とした（p<0.05, p<0.01, p<0.001）。
（４）ヒアルロン酸産生促進作用
　コラーゲンやエラスチンの間で水分を抱え込むと言われているヒアルロン酸の産生量に対する被験物質の効果をサンドイッチＥＬＩＳＡで次のとおり評価した。
　培養上清中のヒアルロン酸量の測定にはHyaluronan Quantikine ELISA kit（Lot.DHYAL0, R&D Systems, USA）を用いた。
　Dilution bufferによってヒアルロン酸標準液を公比２で連続希釈して、計７濃度調製した。また、Dilution bufferにより培養上清を８倍希釈した。
　アグリカン固相化マイクロタイタープレートに、ビオチン標識ヒアルロン酸抗体溶液を１ウェルあたり５０μＬ加えた。さらに、希釈した培養上清を５０μＬ添加し、約２７０ｒｐｍで１時間振とうした。
　１時間後、４００μＬのWash bufferにて５回洗浄し、１００μＬのペルオキシダーゼ標識アビジン溶液を加え、約２７０ｒｐｍで１時間振とうした。１時間後、４００μＬのWash bufferにて５回洗浄し、１ウェルあたり１００μＬの3,3’,5,5'-tetramethylbenzidine基質溶液を加え、遮光下で３０分間静置した。
　次に、Stop solutionを１ウェルあたり１００μＬ添加し、マイクロタイタープレートを２７０ｒｐｍで１分間振とうしてウェル内の色素を均一にした後、マイクロプレートリーダーを用いて４５０ｎｍの吸光度（ＯＤ４５０）を測定した。
　ヒアルロン酸標準液のＯＤ４５０から検量線を4-Parameter logistic modelにより回帰した。回帰式から得られた値に希釈倍率を乗じて、陰性対照及び被験物質のヒアルロン酸産生量（ｎｇ／ｍＬ）を算出した。
　陰性対照のヒアルロン酸産生量を１００％として、被験物質のヒアルロン酸産生率（％）を算出した。陰性対照と被験物質添加のヒアルロン酸産生率（％）を対応のない２群の検定(Student's t-test)で有意差検定を行った。検定はいずれも両側で有意水準を５％未満とした（p<0.05, p<0.01, p<0.001）。
３　試験結果
３－１　特殊低分子化ＤＮＡ
（１）細胞増殖作用
　陰性対照の細胞増殖量(ＯＤ５７０)を１００％として算出したときの被験物質（加水分解ＤＮＡ－Ｎａ）０．０１ｍｇ／ｍＬ及び０．１ｍｇ／ｍＬの細胞増殖率±標準偏差は、それぞれ、１０１．３±６．８％及び１０２．６±３．３％であった。
（２）Ｉ型コラーゲン産生促進作用
　陰性対照のコラーゲン産生量を１００％として算出したときの被験物質（加水分解ＤＮＡ－Ｎａ）０．０１ｍｇ／ｍＬ及び０．１ｍｇ／ｍＬのコラーゲン産生率±標準偏差は、それぞれ、１２６．４±７．９％（p<0.01）及び１３４．０±３．６％（p<0.01）であった。
（３）ヒアルロン酸産生促進作用
　陰性対照のヒアルロン酸産生量を１００％として算出したときの被験物質（加水分解ＤＮＡ－Ｎａ）０．０１ｍｇ／ｍＬ及び０．１ｍｇ／ｍＬのヒアルロン酸産生率±標準偏差は、それぞれ、１０２．２±５．０％及び１０２．９±７．５％であった。
３－２　大豆抽出物
（１）細胞増殖作用
　陰性対照の細胞増殖量（ＯＤ５７０）を１００％としたときの被験物質（ＳＰＡ－３０８）０．１３ｍｇ／ｍＬ、０．２７ｍｇ／ｍＬ及び０．５１ｍｇ／ｍＬの細胞増殖率±標準偏差は、それぞれ、１１１．６±１．０％（p<0.01）、１２３．７±２．４％（p<0.01）及び１３７．０±６．９％（p<0.01）であった。
（２）Ｉ型コラーゲン産生促進作用
　陰性対照のコラーゲン産生促進作用を１００％として算出したときの被験物質（ＳＰＡ－３０８）０．１３ｍｇ／ｍＬ、０．２７ｍｇ／ｍＬ及び０．５１ｍｇ／ｍＬのコラーゲン産生促進率±標準偏差は、それぞれ、１３５．１±１．３％（p<0.01）、１７４．１±６．３％（p<0.01）及び１９９．９±１１．８％（p<0.01）であった。
（３）ヒアルロン酸産生促進作用
　陰性対照のヒアルロン酸産生量を１００％として算出したときの被験物質（ＳＰＡ－３０８）０．１３ｍｇ／ｍＬ、０．２７ｍｇ／ｍＬ及び０．５１ｍｇ／ｍＬのヒアルロン酸産生率±標準偏差は、それぞれ、１１３．１±４．７％（p<0.01）、１２３．３±３．８％（p<0.01）及び１３７．８±１０．３％（p<0.01）であった。
３－３　特殊低分子化ＤＮＡと大豆抽出物の併用
（１）細胞増殖作用
　陰性対照の細胞増殖量（ＯＤ５７０）を１００％として算出した被験物質（加水分解ＤＮＡ－Ｎａ＋ＳＰＡ－３０８）０．０１ｍｇ／ｍＬ＋０．２７ｍｇ／ｍＬ及び０．１ｍｇ／ｍＬ＋０．２７ｍｇ／ｍＬの細胞増殖率±標準偏差は、それぞれ、１３３．０±４．８％（p<0.01）及び１４０．８±５．７％（p<0.01）であった。
（２）Ｉ型コラーゲン産生促進作用
　陰性対照のコラーゲン産生量を１００％として算出したときの被験物質（加水分解ＤＮＡ－Ｎａ＋ＳＰＡ－３０８）０．０１ｍｇ／ｍＬ＋０．２７ｍｇ／ｍＬ及び０．１ｍｇ／ｍＬ＋０．２７ｍｇ／ｍＬのコラーゲン産生率±標準偏差は、それぞれ、１７８．１±５．５％（p<0.01）及び２３０．６±９．９％（p<0.01）であった。
（３）ヒアルロン酸産生促進作用
　陰性対照のヒアルロン酸産生量を１００％として算出したときの被験物質（加水分解ＤＮＡ－Ｎａ＋ＳＰＡ－３０８）０．０１ｍｇ／ｍＬ＋０．２７ｍｇ／ｍＬ及び０．１ｍｇ／ｍＬ＋０．２７ｍｇ／ｍＬのヒアルロン酸産生率±標準偏差は、それぞれ、１３２．７±７．６％（p<0.01）及び１３９．８±２．９％（p<0.01）であった。
　上記の結果を表２に示す。表２中、「ＤＮＡ－Ｎａ」は「加水分解ＤＮＡ－Ｎａ」である。表２から、特殊低分子化ＤＮＡ（加水分解ＤＮＡ－Ｎａ）と大豆抽出物（ＳＰＡ－３０８）を併用した場合の細胞増殖率、コラーゲン産生率、ヒアルロン酸産生率は、各々を単独で使用した場合の程度（率）を足し合わせたよりも顕著に大きいことがわかる。これにより、真皮線維芽細胞の機能賦活作用（細胞増殖作用、コラーゲン産生促進作用及びヒアルロン酸産生促進作用）に対する特殊低分子化ＤＮＡと大豆抽出物の相乗効果が確認できる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
［実施例２］ヒアルロン酸合成又は分解酵素遺伝子発現調節
１　試験の目的及び概要
　皮膚内のコラーゲンやヒアルロン酸は皮膚の張り、柔軟性や潤いに重要な役割を果たしており、特に真皮内のヒアルロン酸量の減少が皮膚の弾力の低下やシワ形成に関与していることが知られている。そこで本実施例では、真皮線維芽細胞によるヒアルロン酸の合成や分解など、抗老化に関わる遺伝子の発現に対する被験物質（特殊低分子化ＤＮＡと大豆抽出物）の効果を、リアルタイムＰＣＲ法により評価した。
２　材料と試験方法
２－１　細胞
　実施例１の２－１と同様の細胞を同様の条件で培養して用いた。
２－２　培地
　ＦＢＳ（Fetal Bovine Serum）の含有量を１０．０％（ｖ／ｖ）に変えた以外は、実施例１の２－２と同じ組成の培地（ＥＭＥＭ）を用いた。
２－３　被験物質
（１）特殊低分子化ＤＮＡ溶液
　実施例１の２－３　（１）と同様の特殊低分子化ＤＮＡ（加水分解ＤＮＡ－Ｎａ）を用いた。
　１０％ＦＢＳ含有ＥＭＥＭによって、１ｍｇ／ｍＬに調整した被験物質（加水分解ＤＮＡ－Ｎａ）を公比１０で連続希釈して計２濃度に用時調製した（終濃度は０．０１ｍｇ／ｍＬ、０．１ｍｇ／ｍＬ）。
（２）大豆抽出物溶液
　実施例１の２－３　（２）と同様の大豆抽出物（ＳＰＡ－３０８）を用いた。
　１０％ＦＢＳ含有ＥＭＥＭによって、２．７ｍｇ／ｍＬに調整した被験物質（ＳＰＡ－３０８）を公比１０で連続希釈して計２濃度に用時調製した（終濃度は０．０２７ｍｇ／ｍＬ、０．２７ｍｇ／ｍＬ）。
（３）混合溶液（併用）
　上記した２種の被験物質を用いた。
　１０％ＦＢＳ含有ＥＭＥＭによって、０．２７ｍｇ／ｍＬに調整したＳＰＡ－３０８含有ＥＭＥＭにより、１ｍｇ／ｍＬに調整した加水分解ＤＮＡ－Ｎａを、公比１０で連続希釈して計２濃度に用時調製した（ＳＰＡ－３０８の終濃度は０．２７ｍｇ／ｍＬ、加水分解ＤＮＡ－Ｎａの終濃度は０．０１ｍｇ／ｍＬ、０．１ｍｇ／ｍＬ）。
２－４　遺伝子発現解析
　TaqMan Assay（Applied Biosystems, USA）を用いて次の酵素をコードする遺伝子について発現解析を実施した。
・ヒアルロン酸合成酵素１（Human Hyaluronan Synthase 1(HAS1), Assay ID. Hs00758053_m1）
・ヒアルロン酸合成酵素２（Human Hyaluronan Synthase 2(HAS2), Assay ID. Hs00193435_m1）
・ヒアルロン酸分解酵素（Human Hyaluronidase 1(HYAL1), Assay ID. Hs00201046_m1）
　内部標準遺伝子として、グリセルアルデヒド－３－リン酸デヒドロゲナーゼ（Human Glyceraldehyde-3-PhosphateDehydrogenase(GAPDH), Assay ID. Hs02786624_g1）遺伝子を用いた。
２－５　試験構成
　遺伝子発現量の解析には、１つの処理群につき３枚の３５ｍｍディッシュ（Cat No. 150318, Thermo Scientific, USA）の平均値を用いた。被験物質調製を含め、試験に関わる操作は特に記載のないかぎり室温で実施した。
２－６　試験方法
（１）細胞培養及び被験物質添加
　３５ｍｍディッシュに５．０×１０５ｃｅｌｌｓ／２ｍＬのＮＢ１ＲＧＢ細胞を播種し、ＣＯ２インキュベータ内で２４時間培養した。２４時間後、３５ｍｍディッシュの培地を除去して被験物質及び陰性対照含有培地を加え、ＣＯ２インキュベータ内で２４時間培養した。
（２）ＲＮＡ抽出・精製及び定量
　PureLinkTM RNA Mini Kit（Cat No.12183018A, Invitrogen, USA）を用いて、ＲＮＡ抽出・精製を次の通り行った。
　２４時間培養後、培地を除去した３５ｍｍディッシュを３７℃に加温したＰＢＳ（－）２ｍＬで２回洗浄した。これに、６００μＬの２Ｍ　Dithiothreitol（CAS No.27565-41-9, Invitrogen, USA）含有Lysis Bufferを加えて細胞を溶解し、ライセートを回収した。
さらに、Homogenizer（Cat No.12183-026, Invitrogen, USA）を用いて、回収したライセート中の細胞を破砕した。
　細胞破砕液に６００μＬの７０％エタノール（CAS No.64-17-5, Japan Alcohol, Japan）溶液を加えた後、シリカメンブレン付きカラムに移した後、１２，０００×ｇ、室温で１５秒間遠心し、ろ液は廃棄した。
　シリカメンブレンに７００μＬのグアニジンイソチオシアネート含有Wash BufferＩ及び５００μＬのエタノール含有Wash Buffer IIを加え、洗浄した後、１２，０００×ｇ、室温で１５秒間遠心し、乾燥させた。これに、RNase-Free Waterを３０μＬ加え、室温で１分間静置した後、１２，０００×ｇ、室温で１５秒間遠心した。これを２回繰り返し、メンブレンからＲＮＡを溶出させた。
　溶出させたＲＮＡの一部をＵＶ透過性９６ウェルプレート（Cat No.8404, Thermo Scientific, USA）に分取してTris-EDTA Buffer（TE(pH8.0), Cat No.310-90023, NIPPON GENE, Japan）により２５倍希釈し、マイクロプレートリーダー（SPARKTM10M TECAN, Switzerland）を用いて２６０ｎｍの吸光度（ＯＤ２６０）を測定した。
　ＯＤ２６０を用いて陰性対照及び被験物質のＲＮＡ濃度を次式により算出し、TE Bufferにより希釈してＲＮＡ濃度を１０μｇ／ｍＬに調整した。
　ＲＮＡ濃度（μｇ／ｍＬ）＝Ａ×Ｋ×０．３（光路長：ｃｍ）×２５（希釈倍率）
　　Ａ：陰性対照又は被験物質のＯＤ２６０
　　Ｋ：Ｋ＝４０、ＲＮＡの吸光係数
（３）リアルタイムＰＣＲ法による遺伝子発現解析
　SuperScriptTM IV VILOTM Master Mix with ezDNase（Cat No.11766050, Invitrogen, USA）を用いて、ＲＮＡの逆転写を次の通り行った。
　８連チューブ（AB1182, Thermo Scientific, USA）に１ウェルあたり１μＬの１０×ezDNase Buffer、１μＬのezDNase enzyme、６μＬのNuclease-free Water及び２μＬの１０μｇ／ｍＬ　ＲＮＡを加え、３７℃で２分間インキュベートした。２分後、８連チューブに１ウェルあたり４μＬのSuperScriptTM IV VILOTM Master Mix及び６μＬのNuclease-free Waterを添加し、リアルタイムＰＣＲ（QuantStudioTM3, Applied Biosystems, USA）を用いて２５℃で１０分間、５０℃で１０分間、８５℃で５分間加熱して、ｃＤＮＡを合成した。
　ＰＣＲプレート（Cat No.N8010560, Thermo Scientific, USA）に１ウェルあたり１０μＬの TaqManTM Fast Advanced Master Mix（Cat No.4444557, Applied Biosystems, USA）、１μＬのTaqMan Gene Expressior、７μＬのUltraPureTMDistilled Water（Invitrogen, Cat No.10977-015, USA）及び２μＬのｃＤＮＡを加え、プレートシール（Cat No.4360954, Thermo Scientific, USA）により密封した。
　プレート遠心機を用いて溶液をスピンダウンし、起泡を除去した後、リアルタイムＰＣＲシステムを用いて、Real-Time ｑＰＣＲを行い、陰性対照及び被験物質における各遺伝子の蛍光シグナルが任意の閾値に達する時のサイクル数であるThreshold Cycle（Ｃｔ）値を算出した。内部標準遺伝子によりＣｔ値を補正し、ΔＣｔ値とした。陰性対照のΔＣｔ値の平均によりΔＣｔ値を補正し、これをΔΔＣｔ値とした。ΔΔＣｔ法によって１サイクルあたりの検出の差で２倍量の差となると仮定し、２－ΔΔＣｔに代入して陰性対照の遺伝子発現量を１とした場合の被験物質の遺伝子発現量を解析した。陰性対照と被験物質添加の遺伝子発現量を対応のある２群の検定（paired t-test）で有意差検定を行った
。検定はいずれも両側で有意水準を５％未満とした（p<0.05, p<0.01, p<0.001）。
３　試験結果
３－１　特殊低分子化ＤＮＡ
（１）ヒアルロン酸合成酵素１遺伝子（ＨＡＳ１）発現
　陰性対照のＨＡＳ１発現量を１としたときの被験物質（加水分解ＤＮＡ－Ｎａ）０．０１ｍｇ／ｍＬ及び０．１ｍｇ／ｍＬのＨＡＳ１発現量±標準偏差は、それぞれ、１．１１±０．０４及び１．０２±０．０７であった。
（２）ヒアルロン酸合成酵素２遺伝子（ＨＡＳ２）発現
　陰性対照のＨＡＳ２発現量を１としたときの被験物質（加水分解ＤＮＡ－Ｎａ）０．０１ｍｇ／ｍＬ及び０．１ｍｇ／ｍＬのＨＡＳ２発現量±標準偏差は、それぞれ、１．２５±０．０９（p<0.05）及び１．４９±０．０５（p<0.001）であった。
（３）ヒアルロン酸分解酵素遺伝子（ＨＹＡＬ１）発現
　陰性対照のＨＹＡＬ１発現量を１としたときの被験物質（加水分解ＤＮＡ－Ｎａ）０．０１ｍｇ／ｍＬ及び０．１ｍｇ／ｍＬのＨＹＡＬ１発現量±標準偏差は、それぞれ、１．０６±０．１２及び１．３４±０．１４であった。
３－２　大豆抽出物
（１）ヒアルロン酸合成酵素１遺伝子（ＨＡＳ１）発現
　陰性対照のＨＡＳ１発現量を１としたときの被験物質（ＳＰＡ－３０８）０．０２７ｍｇ／ｍＬ及び０．２７ｍｇ／ｍＬのＨＡＳ１発現量±標準偏差は、それぞれ、１．０３±１．２及び０．９９±０．１６であった。
（２）ヒアルロン酸合成酵素２遺伝子（ＨＡＳ２）発現
　陰性対照のＨＡＳ２発現量を１としたときの被験物質（ＳＰＡ－３０８）０．０２７ｍｇ／ｍＬ及び０．２７ｍｇ／ｍＬのＨＡＳ２発現量±標準偏差は、それぞれ、１．８８±０．４６（p<0.05）及び１．５０±０．１１（p<0.01）であった。
（３）ヒアルロン酸分解酵素遺伝子（ＨＹＡＬ１）発現
　陰性対照のＨＹＡＬ１発現量を１としたときの被験物質（ＳＰＡ－３０８）０．０２７ｍｇ／ｍＬ及び０．２７ｍｇ／ｍＬのＨＹＡＬ１発現量±標準偏差は、それぞれ、０．９７±０．０８及び０．８４±０．０６であった。
３－３　特殊低分子化ＤＮＡと大豆抽出物の併用
（１）ヒアルロン酸合成酵素１遺伝子（ＨＡＳ１）発現
　陰性対照のＨＡＳ１発現量を１としたときの被験物質（加水分解ＤＮＡ－Ｎａ＋ＳＰＡ－３０８）０．０１ｍｇ／ｍＬ＋０．２７ｍｇ／ｍＬ及び０．１ｍｇ／ｍＬ＋０．２７ｍｇ／ｍＬのＨＡＳ１発現量±標準偏差は、それぞれ、０．９９±０．０８及び１．５１±０．２６（p<0.05）であった。
（２）ヒアルロン酸合成酵素２遺伝子（ＨＡＳ２）発現
　陰性対照の（ＨＡＳ２）発現量を１としたときの被験物質（加水分解ＤＮＡ－Ｎａ＋ＳＰＡ－３０８）０．０１ｍｇ／ｍＬ＋０．２７ｍｇ／ｍＬ及び０．１ｍｇ／ｍＬ＋０．２７ｍｇ／ｍＬの（ＨＡＳ２）発現量±標準偏差は、それぞれ、１．４１±０．１０（p<0.01）及び１．５４±０．０７（p<0.001）であった。
（３）ヒアルロン酸分解酵素遺伝子（ＨＹＡＬ１）発現
　陰性対照の（ＨＹＡＬ１）発現量を１としたときの被験物質（加水分解ＤＮＡ－Ｎａ＋ＳＰＡ－３０８）０．０１ｍｇ／ｍＬ＋０．２７ｍｇ／ｍＬ及び０．１ｍｇ／ｍＬ＋０．２７ｍｇ／ｍＬの（ＨＹＡＬ１）発現量±標準偏差は、それぞれ、０．５８±０．１１（p<0.01）及び０．９３±０．０５であった。
　上記した結果を表３に示す。表３中、「ＤＮＡ－Ｎａ」は「加水分解ＤＮＡ－Ｎａ」である。表３から、特殊低分子化ＤＮＡ（加水分解ＤＮＡ－Ｎａ）と大豆抽出物（ＳＰＡ－３０８）を併用した場合、ヒアルロン酸合成酵素－１遺伝子（ＨＡＳ１）の発現量が相乗的に増加し、ヒアルロン酸合成酵素－２遺伝子（ＨＡＳ２）の発現量は陰性対照と比較し有意に増加することがわかる。さらに、ヒアルロン酸分解酵素遺伝子（ＨＹＡＬ１）発現量は相乗的に減少していることがわかる。このことから、特殊低分子化ＤＮＡ（加水分解ＤＮＡ－Ｎａ）と大豆抽出物（ＳＰＡ－３０８）を併用することにより、ヒアルロン酸合成に関連する遺伝子発現の促進と分解に関連する遺伝子発現の減少が同時に起こることが確認できる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　以上の結果から、実施例１で示された特殊低分子化ＤＮＡ（加水分解ＤＮＡ－Ｎａ）と大豆抽出物（ＳＰＡ－３０８）を併用した場合のコラーゲンとヒアルロン酸の相乗的な産生増加は、コラーゲンとヒアルロン酸の合成に関連する遺伝子発現の促進と分解に関連する遺伝子発現の減少が同時に生じたことによるものと推察される。
　本発明の皮膚の抗老化用剤は、従来の抗老化剤とは、異なる作用・機能を有しており、従来の抗老化剤よりも効率的に肌の老化を予防及び／又は改善できるため、特に化粧品の分野で有用である。

Claims (7)

  1. 　特殊低分子化ＤＮＡと大豆抽出物とを有効成分として含み、
    前記特殊低分子化ＤＮＡが、動植物から抽出したＤＮＡの加水分解処理物であり、
    前記大豆抽出物が大豆の種子、胚芽及び芽からなる群より選ばれる少なくとも１種の抽出物である
    ことを特徴とする皮膚の抗老化用剤。
  2. 　抗老化が真皮線維芽細胞の機能賦活であって、該機能賦活が真皮線維芽細胞の増殖促進作用、Ｉ型コラーゲン産生促進作用及びヒアルロン酸産生促進作用からなる群より選ばれる少なくとも１種の作用である、請求項１に記載の抗老化用剤。
  3. 　特殊低分子化ＤＮＡの含有量が０．００１～１質量％であり、大豆抽出物の含有量が０．００１～１質量％である、請求項１又は２に記載の抗老化用剤。
  4. 　特殊低分子化ＤＮＡと大豆抽出物とを有効成分として含み、
    前記特殊低分子化ＤＮＡが、動植物から抽出したＤＮＡの加水分解処理物であり、
    前記大豆抽出物が大豆の種子、胚芽及び芽からなる群より選ばれる少なくとも１種の抽出物である
    ことを特徴とする皮膚の抗老化関連遺伝子発現調節用剤。
  5. 　抗老化関連遺伝子発現調節が、Ｉ型コラーゲン合成酵素遺伝子、ヒアルロン酸合成酵素１遺伝子及びヒアルロン酸合成酵素２遺伝子からなる群より選ばれる少なくとも１種の遺伝子発現促進、又は、コラーゲン分解酵素遺伝子及び／若しくはヒアルロン酸分解酵素遺伝子の遺伝子発現減少である、請求項４に記載の抗老化関連遺伝子発現調節用剤。
  6. 　特殊低分子化ＤＮＡの含有量が０．００１～１質量％であり、大豆抽出物の含有量が０．００１～１質量％である、請求項４又は５に記載の抗老化関連遺伝子発現調節用剤。
  7. 　請求項１～３のいずれかに記載の抗老化用剤、又は請求項４～６のいずれかに記載の抗老化関連遺伝子発現調節用剤を含んでなる化粧品。

     
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