CN101371918B - 鱼精多肽中的抗氧化二肽的新用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种鱼精多肽中的抗氧化二肽的新用途，深入拓展其在制备抗氧化、抗疲劳、增强免疫功能等药物、保健品或化妆品中的新用途，用以开发新品适应市场需求，充分利用天然资源造福于人类。通过凝胶色谱、离子交换色谱和反相HPLC等色谱分离方法，将获得的一系列抗氧化性的多肽组分，根据液质联用和NCBI数据库搜寻，具有最高抗氧化活性的多肽被鉴定为Pro-Arg，处于鱼精蛋白序列中1-2和16-17残基部位。这个合成的新二肽不仅具有强的清除羟自由基活性，而且能明显降低胞内氧自由基的产生，从而保护人二倍体成纤维细胞免受氧化损伤。这些结果为鱼精多肽作为药品、保健食品及化妆品原料提供理论基础，同时也为广泛利用鱼白提供科学依据。

Description

鱼精多肽中的抗氧化二肽的新用途

技术领域

本发明涉及一种鱼精多肽成分的用途，特别涉及一种鱼精多肽中的抗氧化二肽的新用途。

背景技术

鱼精蛋白(Protamine)也称精蛋白，是一种碱性蛋白质，主要存在于鱼类(鲑鱼、鲱鱼、鳟鱼)的成熟精子细胞中。其分子量较小，一般在10KDa左右。人们已将它作为天然防腐剂应用于食品保鲜和储藏。同时，鱼精蛋白是目前体外循环心脏手术中唯一用于拮抗肝素的药物，对其作用机理和手术中的不良反应都有大量的报道。另外，发现鱼精蛋白对肿瘤血管的形成有抑制作用，通过阻止毛细血管内皮细胞的移动从而影响血管形成；也能抑制血管炎症的发生。

紫外线，离子辐射，化学反应等过程产生的活性氧自由基能引起一系列的病理反应，如DNA损伤，癌变和细胞降解等。在需氧生物体内，自由基的产生不可避免。其中超氧阴离子自由基和羟自由基是两种最具代表性的自由基。它们很不稳定，能与体内的各种物质发生反应，从而导致细胞或组织损伤和死亡。抗氧化剂具有清除自由基和延缓脂质过氧化反应的发生。另外，抗氧化剂也能通过保护脂质成分的氧化降解来保留食物的质量。因此，寻找抗氧化剂，特别是食物来源的天然氧化剂具有非常重要的意义。

近些年来，来源于食物蛋白酶解产物的生物活性肽受到越来越多的关注。目前许多来自食物蛋白酶解产物的自然活性肽具有抗氧化作用。Chen等人发现大豆多肽能有效延缓脂质过氧化反应，且这些多肽的一级结构与它们的活性间有重要的联系。Li等人从猪胶原酶解产物中获得了具有抗氧化和自由基清除活性的多肽序列。另外，人们从鱼业加工副产品中提取获得很多具有抗氧化活性的多肽，如黄鳍金枪鱼鱼皮明胶酶解产物，黄鳍金枪鱼骨架蛋白酶解产物，阿拉斯加雪鱼鱼皮明胶酶解产物以及cod frame蛋白酶解产物。鱼精是一种主要由鱼精蛋白和DNA组成的混合物，在渔业加工过程中一般作为副产物而丢弃。其中鱼精蛋白是一种阳离子多肽，在医学中可用作注射用胰岛素的载体，肝素拮抗剂等。近来，鱼精蛋白经常被用作食品的抗菌成分。随着经济的发展和资源的不断匮乏，鱼精蛋白和鱼精蛋白酶解产物受到越来越多的重视。

由于鱼精蛋白(Protamine)来源于鱼白--这种渔业加工过程中通常被抛弃的副产物，被胰酶酶解后形成鱼精多肽(Protamine hydrolysate)。目前，对于酶解形成的多肽及其多肽产品，其中大多有效成分不明确，作用机理不清楚，包括其特定的生物学功能、水解后各种多肽片断的分子量和氨基酸残基数等。相关的研究报道都非常少。因此，如何深入研究其机理及其新用途，用以开发新品适应市场需求，充分利用天然资源造福于人类，是该领域科研技术人员不断研究开发的新课题之一。

发明内容

本发明涉及鱼精多肽中的抗氧化二肽在制备药物、保健品或化妆品中的新用途。

实际上，本发明涉及鱼精多肽中的抗氧化二肽在制备抗氧化、抗疲劳、增强免疫功能药物中的应用；可将鱼精多肽中的抗氧化二肽作为主要有效成分并配以其它辅料。

涉及鱼精多肽中的抗氧化二肽在制备治疗或预防性功能障碍药物中的应用；可将鱼精多肽中的抗氧化二肽作为主要有效成分并配以其它辅料。

涉及鱼精多肽中的抗氧化二肽在制备抗氧化、抗疲劳、增强免疫功能保健食品中的应用；可将鱼精多肽中的抗氧化二肽作为主要有效成分并配以其它辅料。

还涉及鱼精多肽中的抗氧化二肽在制备抗氧化、抗衰老和美白化妆品中的应用；可将鱼精多肽中的抗氧化二肽作为主要有效成分并配以其它辅料。

通过凝胶色谱、离子交换色谱和反相HPLC等色谱分离方法，将获得的一系列抗氧化性的多肽组分，根据液质联用和NCBI数据库搜寻，具有最高抗氧化活性的多肽被鉴定为Pro-Arg，处于鱼精蛋白序列中1-2和16-17残基部位。这个合成的新二肽不仅具有强的清除羟自由基活性，而且能明显降低胞内氧自由基的产生，从而保护人二倍体成纤维细胞免受氧化损伤。

本发明的有益效果是：经研究，鱼精多肽(Protamine hydrolysate)是鱼精蛋白由酶水解作用后形成的多肽片段，其氨基酸组成的最大特点就是碱性氨基酸占有较大比例，因此其碱性很强，可溶于水和稀酸，热稳定性较好。同时还具有低抗原性和免疫原性等特点。鱼精多肽不仅具有鱼精蛋白中和肝素等作用，还具有很高的营养价值和多种生理功能，易消化吸收，在抗氧化、抗疲劳、性功能都有明显作用。

鱼精多肽不仅在体外具有较强的羟自由基、DPPH和超氧阴离子清除活性，而且也能明显提高Wistar大鼠的抗疲劳和抗氧化能力。通过凝胶色谱、离子交换色谱和反相HPLC等色谱分离方法，我们最终获得了一系列抗氧化性的多肽组分。根据液质联用和NCBI数据库搜寻，具有最高抗氧化活性的多肽被鉴定为Pro-Arg，处于鱼精蛋白序列中1-2和16-17残基部位。这个合成的新二肽不仅具有强的清除羟自由基活性，而且能明显降低胞内氧自由基(ROS)的产生，从而保护人二倍体成纤维细胞免受氧化损伤。通过体内体外抗氧化模型，筛选活性多肽有效组分或成分，揭示其作用机理。

其目的意义在于：

(1)为开发新产品打下坚实的基础，为开发一系列新的多肽产品提供思路和方法，同时为研究和开发多肽的新功效作用提供数据；

(2)通过其作用机理的研究，不仅在研究理论角度揭示了活性多肽的作用机理，而且也为宣传和推销公司产品提供理论依据，将为市场营销带来明显的经济效应；

(3)也将为活性肽的研究提供数据和理论依据，推动多肽产品的研究和开发，有助于满足人们日益提高的生活水平需要。

通过D-gal诱导的亚急性衰老的大鼠模型，我们研究发现鱼精多肽除具有基本营养功能外，在体内具有明显的抗氧化活性。鱼精多肽能明显提高大鼠血清，脑和肝组织中的SOD活力，并明显降低MDA的含量。在这项研究中，我们研究了鱼精多肽在对于羟自由基，DPPH自由基和超氧阴离子自由基的清除活性，并通过层析方法并主要以羟自由基作为筛选指标分离获得具有抗氧化活性的多肽，通过液质联用、NCBI数据库搜索和蛋白序列分析，对其一级结构进行了分析和鉴定。

总之，本发明对今后开发利用鱼精多肽中的抗氧化二肽提纯物质进行药品、保健品及化妆品等各种产品的大规模生产奠定了基础。

具体实施方式

以下结合较佳实施例，对依据本发明提供的具体实施方式详述如下：

实施例1

本发明涉及鱼精多肽中的抗氧化二肽在制备药物、保健品或化妆品中的新用途。

实际上，本发明涉及鱼精多肽中的抗氧化二肽在制备抗氧化、抗疲劳、增强免疫功能药物中的应用。

易吸收消化性和营养功能

蛋白质在小肠内经过各种消化酶的作用形成水解产物包括游离氨基酸(free amino acid，FAA)和大量的寡肽(Oligopeptide，OP)。寡肽进入小肠绒毛刷状缘，在氨基肽酶作用下以二肽、三肽(Small Peptide，SP)的形式完整地进入血液循环而被组织利用。Newey等研究证实了完整双甘肽的转运过程，并首次提出蛋白质消化产物中的二肽、三肽可被完整吸收的观点。Bamba等研究发现小肽作为肠腔的吸收底物，不仅增加刷状缘氨基肽酶的活性，而且提高二肽酶和氨基酸载体的活性及数目。

鱼精多肽是鱼精蛋白的水解产物，是由许多寡肽和游离氨基酸组成，其氨基酸的组成几乎完全与鱼精蛋白一样。不仅具有良好的溶解性，而且在受热或在偏酸偏碱的条件下，都有较强的稳定性；即使在高浓度条件下，仍有较好的流动性；并具有良好的保湿性。因此，直接补充多肽可加速体内氨基酸的吸收、提高机体对氮的利用率，提供人体生长、发育所需要的营养物质。同时，鱼精多肽具有低的抗原性和免疫原性，这一性质不仅在临床上有实用价值，而且可以给易引起食物过敏的人们提供一种比较安全的蛋白食品。

抗疲劳功能

Loon等在实验中发现男性自行车运动员运动后补充小麦蛋白水解物及其与碳水化合物(CHO)的混合物后，血液胰岛素分别增加了52％和107％(与只补充CHO比较)，并发现血浆中可利用的氨基酸水平明显提高。Nikawa等研究发现，对跑台运动大鼠补充大豆蛋白水解物(SPI)可显著提高运动能力，减轻肌肉蛋白降解，明显抑制血清肌酸激酶(CK)活性的升高。我们利用Wistar大鼠D—半乳糖衰老模型来研究鱼精多肽的抗疲劳功能。把Wistar大鼠分为四组(对照组、投药组、衰老模型对照组和衰老模型保护组)，投药组和衰老模型保护组分别用鱼精多肽灌胃56天后，进行爬杆实验，结果发现，大鼠的爬杆时间投药组是对照组的1.8倍，衰老模型保护组是衰老模型对照组的2.23倍，这说明鱼精多肽能明显提高了Wistar大鼠的抗疲劳能力。

运动员在剧烈运动初期，首先消耗体内储存的三磷酸腺苷(ATP)和肌酸磷酸(CP)，然后分解糖原，经苯丙酸至乳酸，在这期间还产生ATP又可作为能源。ATP、CP糖原在体内的储存量与肌肉的产能量成比例关系，而我们的结果也证明鱼精多肽的确能明显提高肌糖原的含量。运动员剧烈运动后，需要加强恢复，尤其需要修复运动所致的骨骼肌细胞微细损伤。这时需要将大量的氮转运进入肌肉细胞，而补充多肽不仅吸收快，而且保氮力强，能促进肌肉合成代谢。

抗氧化功能

Chen等^[10]发现大豆蛋白酶解物具有抗亚油酸脂质过氧化作用，并且从中分离得到了6种抗氧化活性肽，其中分子量最小的是一个5肽(Leu-Leu-Pro-His-His)。我们以甘露醇为对照^[9]，进行鱼精多肽对Fenton体系产生·OH的清除试验，多肽在试验浓度(1-80mg/ml)范围内对·OH均有较强的清除作用，并随着浓度增加清除率增大。在1-20mg/ml浓度范围内，随着浓度增加，清除率增加很快，呈剂量线性关系，其对·OH的半数抑制浓度(IC₅₀)值为11.79mg/ml，研究发现鱼精多肽对·OH的清除效果明显比对照甘露醇好。

鱼精多肽富含供氢体，具有提供氢质子的能力，使具有高度氧化性的自由基还原，从而达到终止自由基连锁反应，起到清除或抑制自由基的目的。许多天然抗氧化剂的抗氧化活性与加入量不呈线性关系，加入量过大或过小之后，可能变为助氧化剂。如α-生育酚和γ-生育酚在浓度超过500mg/kg，δ-生育酚在浓度超过1000mg/kg时，都将产生助氧化效果；维生素C和半胱氨酸在低浓度时也表现出助氧化效果。在鱼精多肽所试验的各个浓度下，均没有出现助氧化作用。

体外的抗氧化实验

我们进行了鱼精多肽对Fenton体系产生·OH的清除试验，DPPH自由基的清除试验，PMS-NADH体系产生超氧阴离子的清除试验，结果如表6，鱼精多肽在体外反应体系均表现出明显的抗氧化活性；同时我们进一步把鱼精多肽这一酶解得到的不同分子片段的多肽混合物，通过凝胶柱G-35分离纯化，收集得到三个组分G1、G2和G3(254nm下不同吸收峰收集)，·OH清除实验等的结果显示，在较低的浓度下，组分G3仍然表现出高的清除活性，远远高于对照的清除活性。

在清除羟自由基的反应体系中以甘露醇为对照，D-甘露醇是自然界中广泛存在的一种活性物质，具有良好的抗氧化活性，有报道表明不同剂量的D-甘露醇对组织具有很好的保护作用。而鱼精多肽粗品对·OH清除作用比阳性对照甘露醇的效果好，这表明鱼精多肽具有良好的抗氧化活性。许多天然抗氧化剂的抗氧化活性与加入量不呈线性关系，加入量过大或过小之后，可能变为助氧化剂。如α-生育酚和γ-生育酚在浓度超过500mg/kg，δ-生育酚在浓度超过1000mg/kg时，都将产生助氧化效果；维生素C和半胱氨酸在低浓度时也表现出助氧化效果。在鱼精多肽所试验的各个浓度(1-80mg/ml范围)下，没有出现助氧化作用。

正常生理条件下，机体内自由基的产生与消除处于动态平衡，这种平衡一旦被破坏，会导致过量自由基产生。因此，造成组织细胞中生物大分子化学结构的破坏性变化，包括损害生物膜，导致衰老，基因突变与癌变。鱼精多肽的抗氧化机理可能类似于肌肽、大豆肽和玉米肽，富含供氢体，具有提供氢质子的能力，使具有高度氧化性的自由基还原，终止自由基连锁反应，从而起到清除或抑制自由基的目的。

本实验采用较高剂量的多肽灌胃Wistar大鼠，以考察鱼精多肽对大鼠体力的影响。结果发现(表1)，药物组大鼠的爬杆时间是对照组的1.8倍，而且有统计学上的极显著差异(P<0.001)；药物组的肌糖原含量是对照组的2倍，结果也有显著差异；而肝糖原的含量结果表明对照组和药物组没有明显差异。

在运动中，机体运动能力的降低是由于体力性疲劳的出现所致，因而延缓体力性疲劳的出现有助于机体运动能力的保持。在剧烈运动初期，首先消耗体内储存的三磷酸苷(ATP)和肌酸磷酸(CP)，然后分解糖原，经苯丙酸至乳酸，在这期间还产生ATP又可作为能源，ATP、CP糖原在体内的储存量与肌肉的产能量成正比关系，而鱼精多肽被吸收进入体内有助于肌糖原的积累。

另一方面，在剧烈运动后，需要加强恢复，尤其需要修复运动所致的骨骼肌细胞微细损伤。这时需要将大量的氮转运进入肌肉细胞，而快速吸收的多肽能提供大量氮源，从而促进肌肉的合成代谢。Newey等^[24]的研究证实了完整双甘肽的转运过程，并首次提出蛋白质消化产物中的二肽，三肽可被完整吸收的观点。鱼精多肽不仅吸收快，而且保氮力强，吸收进入体内后，能促进肌肉合成代谢，具有调整体内代谢和快速加强体质恢复的作用，从而延缓体力性疲劳的出现，增强大鼠的体能。

表1.爬杆实验数据

与对照组相比，^*(P<0.05)，^**(P<0.01)，^***(P<0.001)。

本实验通过考察药物组大鼠SOD活性和MDA含量的变化，研究鱼精多肽在体内的抗氧化作用。结果如表2、表3，结果表明药物组大鼠的血清SOD活性较对照组有明显升高，上升了14％；而MDA含量则下降了30％。药物组肝组织的SOD活力较对照组有明显升高，约为对照组的1.5倍，而MDA含量则略有下降，这与血清SOD活力和MDA含量结果相似；药物组脑组织的MDA含量较对照组明显降低，而SOD活力基本没有明显变化。

表2.血清中SOD活力和MDA含量

与对照组相比，^*(P<0.05)，^**(P<0.01)，^***(P<0.001)。

表3.组织匀浆SOD活性和MDA含量

与对照组相比，^*(P<0.05)，^**(P<0.01)，^***(P<0.001)。

大鼠在补充鱼精多肽后，血清、脑组织和肝组织MDA含量都明显降低，丙二醛(MDA)作为一种脂质过氧化产物，它的高低反应了机体内脂质过氧化的程度，从而间接反应了细胞受损伤的程度。这说明鱼精多肽在体内能有效的抵抗自由基对于机体的损伤，而SOD活力的升高也可能是防止机体损伤的一个重要原因。鱼精多肽富含精氨酸---NO的前体物，大量的精氨酸的吸收易导致机体内NO水平的升高；同时，我们测定了血清中NO含量和一氧化氮合酶(NOS)活性，结果发现药物组的NO含量和NOS活性明显高于对照组。而NO作为体内传递信息的第二信使，广泛地参与各种免疫反应，可通过与细胞内外的靶部位结合，产生不同的生物学效应。NO不仅可激活多种保护性蛋白的作用；也可抑制中性粒细胞的超氧阴离子产生，并与其结合形成无毒的代谢产物NO₃，从而使机体避免反应性氧中间产物的损害。

实施例2

涉及鱼精多肽中的抗氧化二肽在制备治疗或预防性功能障碍药物中的应用。

通过分析迄今发现的各类鱼精多肽的氨基酸序列，精氨酸一般占三分之二以上，这是一种碱性非必需氨基酸，是Kossel最早在1896年从鱼精蛋白的水解液中发现的。鱼精多肽在体内起生理作用的主要是L-精氨酸，精氨酸在人体多个器官系统中都具有重要作用。

1944年Holt和Albanesi证实了精氨酸的缺乏和睾丸功能的损伤有关，精氨酸不仅提高附睾精子的发生，并以磷酸精氨酸的形式作为精子运动的能源。Patel等通过对精氨酸刺激山羊附睾精子糖酵解的NMR研究，探讨了精氨酸在精子代谢活动中的机制，证实其具有催化剂的作用。在对比实验中，精氨酸在适宜浓度下使代谢率提高了2～3倍。同时，精氨酸不仅能提高精子的发生和代谢，而且也能提高ATP水平，这对精子的运动是必须的。Funahashi对精氨酸和一氧化氮合酶诱导公猪精子获能和顶体反应的机制进行了研究，发现精氨酸可诱导精子获能和顶体反应，并提高细胞外的一氧化氮(NO)的量。精氨酸在治疗男性不育症方面的临床应用在国外尝试较多。Aydin等用精氨酸、消炎痛、激肽释放酶治疗45例少精子症和弱精子症者，其中15例接受精氨酸治疗，连续服用3个月。结果证实这些药均可在一定程度上提高精子的数目和运动性。我们的实验结果显示，用鱼精多肽灌胃大鼠(56天)，其组织和血清中的NO含量和一氧化氮合酶(NOS)活性比对照生理盐水组都有明显的提高。这都说明鱼精多肽对性保健方面有一定的作用。

精氨酸参与精子的形成，也是精子各种核蛋白的基本成分：在精子形成阶段伴随着核的浓集和核蛋白类型的转变，即从赖氨酸型的组蛋白转变为精氨酸型的鱼精蛋白。精氨酸与男性不育的关系主要是与鱼精蛋白发生异常有关联，当富含赖氨酸的组蛋白转型变成富含精氨酸的鱼精蛋白时，出现的转换异常或缺陷均可引起男性不育。人体内精氨酸缺乏或体内含量不足时可以引起精子蛋白质的改变，使DNA不稳定，不易受精或造成早期胚胎发育终止。精氨酸可逆转糖酵解抑制剂对细胞的影响，保持细胞ATP的正常水平，提高精子的发生和代谢。精氨酸延缓精子细胞膜的脂质氧化，维持胞膜结构的稳定性和通透性，使精子具有良好的活动力。NO是在NOS的作用下，由精氨酸和分子氧反应产生的，NO在体内生成后直接扩散进入邻近细胞，与鸟苷酸环化酶中亚铁血红素分子的铁离子结合并激活该酶，致使环磷酸鸟苷(cGMP)生成增加。cGMP作为体内重要的第二信使之一，激活多种cGMP特异依赖性蛋白激酶而发挥各种生理功能，包括对平滑肌舒张调节和前列腺分泌的调节，从而对男性的生殖系统具有重要作用。

交配实验和性激素都是性功能主要评价指标，实验结果如表4和表5。结果显示，雄性大鼠在交配过程中对照组和药物组没有表现显著差异，而血清中睾酮含量略有下降，但也没有显著差异，这和行为实验的结果基本一致。这说明鱼精多肽在性功能方面没有明显作用。然而鱼精蛋白以含大量精氨基的碱性蛋白，其酶解产物中的大量精氨酸是精子形成的重要成分，大量研究结果也表明了精氨酸在性功能特别是在男性不育症和弱精症等方面有明显作用；同时我们研究显示鱼精多肽在抗疲劳抗氧化方面表现出明显的作用，而交配能力和抗疲劳能力紧密相关。因此，鱼精多肽可能在性功能的某一些方面有一定作用，而不仅仅局限于交配能力方面。

表4.血清中睾酮和雌二醇的含量

与对照组相比，^*(P<0.05)

表5.交配实验数据

与对照组相比，^*(P<0.05)

实施例3

涉及鱼精多肽中的抗氧化二肽在制备抗氧化、抗疲劳、增强免疫功能保健食品中的应用。应用机理同实施例1。

实施例4

还涉及鱼精多肽中的抗氧化二肽在制备抗氧化、抗疲劳、增强免疫功能化妆品中的应用。应用机理同实施例1。

总之，通过体内、体外实验研究表明，鱼精多肽具有较强的抗氧化活性，也能明显提高Wistar大鼠的抗疲劳能力。

鱼精多肽不仅是一种具有较强的抗氧化活性的物质，而且可加速体内氨基酸的吸收、提高机体对氮的利用率，提供肌体生长、发育所需要的营养物质。合成的新的二肽在体外不仅有明显的清除羟自由基活性，而且明显降低MRC-5胞内自由基的含量，从而保护细胞避免氧化损伤。因此我们正进一步从鱼精多肽中分离具有较强活性的功效成分，系统地研究其作用机理，为鱼精多肽的广泛应用打下基础。

体内和体外研究都证明鱼精多肽都具有明显的抗氧化活性，因此我们基于抗氧化功能，进行进一步分离纯化的研究。

自由基的存在可以破坏有机体内细胞膜、DNA、酶和蛋白的结构，从而导致一些疾病。氧化应激反应在许多衰老疾病中具有重要作用，如动脉粥样硬化等，造成这些疾病的因素包括脂质过氧化反应及氧化反应后期产生的一些小分子物质。从大豆、鸡蛋清蛋白和鱼蛋白酶解产物中得到的天然抗氧化剂不仅具有丰富的营养功能，而且能有效抑制和清除体内的自由基。这些天然抗氧化剂目前正成为食品和医学领域的研究热点。我们的研究表明，来源于鱼业副产品的鱼精蛋白酶解产物(Protamine hydrolysate)，在体内和体外都具有良好的抗氧化活性。这项研究为鱼精多肽在食品和保健食品中应用提供了科学而详细的证据，也为鱼精的广泛利用提供了支持。

增殖细胞如人二倍体成纤维细胞(HDFs)，通常表现典型的复制衰老(replicative senescence，RS)。自1961年Haylick提出人胚肺二倍体成纤维细胞体外培养有限增殖实验，可以作为研究细胞衰老的模型以来，细胞衰老研究多采用人二倍体成纤维细胞。而且，人二倍体成纤维细胞(HDFs)如MRC-5，在遭遇各种不到致死量的胁迫如氧化胁迫等，表现出胁迫诱导的过早衰老特征(stress-induced premature senescence，SIPS)，SIPS通常和RS的表型一致。许多研究表明二倍体成纤维细胞在过氧化氢诱导的氧化胁迫下，显示出衰老、RS的典型变化和氧化损伤。因此我们采用人二倍体成纤维细胞来研究药物的抗衰老和抗氧化功能。

鱼精多肽对自由基的清除试验结果如表6，多肽在试验浓度(1-80mg/ml)范围内对·OH均有较强的清除作用，并随着浓度增加清除率增大。在1-20mg/ml浓度范围内，随着浓度增加，清除率增加很快，呈剂量线性关系；但鱼精多肽在高浓度(20-80mg/ml)的情况下，随浓度的增大，清除率上升趋势缓慢，这可能是鱼精多肽已趋于饱和的原因。同时，不同浓度点的鱼精多肽对·OH的清除效果都明显比对照甘露醇好，鱼精多肽对·OH的半数抑制浓度(IC₅₀)值为11.79mg/ml，而甘露醇的IC₅₀值为20.48mg/ml。而鱼精多肽对DPPH自由基的清除活性在6mg/ml范围内，其清除率具有明显的剂量依赖性。超过6mg/ml后，清除率不随剂量增加而升高，其IC₅₀值为2.79mg/ml。但是，研究发现甘露醇在DPPH系统基本没有清除率，即使在高浓度，也未表现任何清除率。因此，甘露醇不适合DPPH系统；而Vitamin C作为对照，则表现出高清除活性，IC₅₀值为0.0127mg/ml。在PMS-NADH体系中，鱼精多肽对超氧阴离子的清除活性明显比对照Vitamin C高，在5mg/ml时其清除活性是Vitamin C的2.11倍。因此，多肽在不同反应体系中活性表现并不完全一致，但总的说来鱼精多肽表现出明显清除自由基的能力。

表6.鱼精多肽和分离组分在反应体系中清除自由基的抗氧化活性

注：protamine hydrolysate，G1，G2，G3组分和甘露醇清除羟自由基的IC₅₀值分别为11.79，2.3，3.47，0.86and20.48mg/ml，而PHP的IC₅₀值为91.35μg/ml。

对合成二肽清除羟自由基的活性分析

基于筛选的新的二肽具有较强的抗氧化性，根据其多肽序列合成了二肽，进一步研究其体外的抗氧化活性，结果如表7。在20ug/ml的低浓度下，合成二肽的羟自由基的清除活性达到37.29％，远远高于筛选二肽在20ug/ml时的清除活性21.04％，甚至在5ug/ml非常低的浓度时，也表现出较高的清除活性。这一结果不仅表明筛选和分离纯化得到抗氧化性的活性多肽是成功的，所得到的组分在抗氧化活性组分中起着重要作用；而且预示筛选得到的新的二肽在抗氧化方面包括抗氧化机理、抗氧化疾病和抗氧化产品等研究，可能将发挥一定的作用。

表7.合成二肽清除羟自由基的活性分析

对合成多肽清除胞内自由基的活性分析

胞内氧自由基(Reactive oxygen species，ROS)是有氧代谢过程中不可避免的副产物，在化学和生物系统中可以通过各种途径而产生，一般来说是通过键的断裂反应或是电子的转移反应而产生，如果机体暴露于能量即UV和γ射线下主要发生键的断裂反应，正常情况下生物系统中还是以电子的转移反应占主导地位。

和NO是最早生成的自由基，接着它们在线粒体内生成稳定的非自由基形式的活性氧：H₂O₂和ONOO^-，最终又均裂为HO·，再经过自由基传递反应，生成了ROO·和¹O₂。ROS包括：羟基自由基(HO·)、超氧自由基阴离子

一氧化氮(NO)、过氧化物自由基(ROO·)、过氧化氮自由基(ONOO^-)、单氧(¹O₂)、次氯酸(HOCl)、过氧化氢(H₂O₂)。ROS不仅参与脂质过氧化、蛋白质修饰变性及影响细胞内信号转导和基因表达，也可以直接损伤DNA分子的嘌呤、嘧啶碱基及脱氧核糖的作用，造成DNA分子单链或双链断裂和碱基缺失，从而改变抑制或触发细胞凋亡的蛋白表达。近年来，抗氧化剂特别是食品来源的天然抗氧化剂越来越收到关注，L-肌肽(β-丙氨酸-L-组氨酸)不仅有强的抗氧化抗衰老的作用，而且有神经保护剂、抗癌等作用。McFarland和Holliday首次研究了L-肌肽对胎儿肺二倍体成纤维细胞(MRC-5)和其它细胞系生长的影响，结果发现肌肽使细胞的实际群体倍增数(PD)显著升高，细胞的寿命也显著延长；肌肽培养的细胞即使进入老年，也未出现衰老表型，而且更换肌肽培养基培养衰老细胞能使其年轻化。

在这个实验中，我们利用DCFH-DA作为细胞内的氧化状态的指示剂，进入细胞后经细胞内酶的作用，加水分解为非膜通透性的DCFH，该物质被氧化后变为DCF会发出荧光，从而检测细胞内的自由基变化；同时建立MRC-5的过氧化氢(H₂O₂)氧化损伤模型，研究合成的新的二肽对胞内氧自由基清除作用。结果显示，无论在100uM H₂O₂组或300uM H₂O₂组，随着二肽浓度的增加，胞内ROS含量都明显降低。当二肽浓度达到250ug/ml时和不加二肽组(0ug/ml二肽组)相比，胞内ROS含量明显降低，并出现极显著差异，其含量几乎和不加H₂O₂的对照组相当。而不加H₂O₂的对照组和不加二肽组相比较，胞内ROS含量明显降低，也说明实验模型是成功的；同时300uM H₂O₂组比100uM H₂O₂组的ROS含量普遍高，也说明H₂O₂诱导产生胞内ROS，模型非常成功。

合成多肽在细胞周期方面的作用

流式细胞术(Flow cytometry，FCM)是20世纪70年代发展起来的一种对细胞的物理性质及化学性质，如细胞大小、内部结构、DNA、RNA、蛋白质、抗原等进行快速测定并可分类收集的技术。我们通过PI标记DNA，由流式细胞仪进行分析，可以得到细胞各个时期的分布状态，计算出G₀/G₁期％、S期％、G₂/M期％，以判断细胞周期状态的指标，结果如表8。我们用300uM H₂O₂分别作用MRC-53h和6h，结果发现细胞S期％由28.07％变为33.49％和41.17％，相对的G₂/M期细胞比例下降，说明H₂O₂作用后细胞周期被明显阻断在S期。通过二肽25ug/ml、125ug/ml作用24h后，细胞S期％由模型组41.17％下降为37.72％和30.57％，而G₂/M期细胞则有所上升，并有明显的剂量效应，这结果和空白对照组非常接近，说明二肽有明显的氧化保护作用。

从细胞周期的代谢过程看，细胞周期各时相的DNA含量不同，G₁期为DNA合成前期，此期为过渡至S期做准备，S期为DNA合成期，S期％可反映细胞的分裂活力，增值旺盛的细胞处于S期的比例较高；G₂为DNA合成后期，M期为有丝分裂期，(S+G₂M)％为增殖指数PI，代表了该细胞群体中增殖期细胞的数量，在一定程度上可反映细胞的增殖状态，这个实验中(S+G₂M)％没有明显的变化，可能表示二肽没有明显的促进细胞增殖作用。

表8：合成二肽对细胞周期的作用

与对照组(None)相比，^*P<0.05；与模型组H₂O₂(300uM)相比，^#P<0.05

合成的新的二肽在体外不仅有明显的清除羟自由基活性，而且明显降低MRC-5胞内自由基的含量，从而保护细胞避免氧化损伤。

上述参照实施例对该鱼精多肽中的抗氧化二肽的新用途进行的详细描述，是说明性的而不是限定性的，因此在不脱离本发明总体构思下的变化和修改，应属本发明的保护范围之内。

Claims (3)

1.鱼精多肽中的合成二肽Pro-Arg在制备抗氧化、抗疲劳、增强免疫功能药物中的应用。

2.鱼精多肽中的合成二肽Pro-Arg在制备抗氧化、抗疲劳、增强免疫功能保健食品中的应用。

3.鱼精多肽中的合成二肽Pro-Arg在制备抗氧化、抗衰老和美白化妆品中的应用。