KR20230098055A - 난각막 미세분말을 포함하는 피부 상태 개선용 조성물 - Google Patents

난각막 미세분말을 포함하는 피부 상태 개선용 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 난각막 미세분말을 포함하는 피부 상태 개선용 조성물에 관한 것으로, 구체적으로 입자크기를 최적화한 난각막 미세분말이 자외선 조사로 유도한 피부 손상 동물모델에서 피부표면의 수분을 증가시키고, 경피수분손실을 억제하며, 표피 주름을 개선하는 효과를 보다 향상시키고, 피부 손상 개선, 항염증 및 항산화 효과를 나타내는 것을 확인하였으므로, 상기 난각막 미세분말은 피부 상태 개선용 조성물의 유효성분으로 이용될 수 있다.

Description

난각막 미세분말을 포함하는 피부 상태 개선용 조성물{Composition for improving skin condition comprising eggshell membrane micropowder}
본 발명은 난각막 미세분말을 포함하는 피부 상태 개선용 조성물에 관한 것이다.
최근 환경의 변화나 생활 패턴의 변화에 따른 냉/난방의 인위적인 온도 조절, 사회생활에서 발생되는 각종 스트레스와 환경오염, 예컨대 미세먼지 또는 자외선으로 인한 피부 스트레스, 화장 습관에 따른 잦은 세안 및 연령 증가에 따른 자연적인 피부 노화 등의 여러 가지 원인으로 인하여 각질층의 수분이 감소하여 피부가 건조해지고 표면이 거칠게 되며 피부가 푸석거리고 촉촉함을 잃어 생기가 없어 보이는 등의 현상이 발생한다. 특히, 자외선 노출은 피부 표피 및 진피를 구성하고 있는 주요성분의 파괴와 생성 저하로 인한 피부 보습력 저하 및 주름 증가, 산화적 스트레스에 의한 면역 과활성화 및 염증 등으로 피부 노화의 주원인으로 작용한다.
피부는 조직학적으로 표피(epidermis), 진피(dermis), 피하지방(subcutis)의 3개의 층으로 구성되어 있는데, 이중 가장 외부에 존재하는 표피는 피부노화의 측면에서 가장 중요한 역할을 하며 피부미용면에서도 가장 집중적인 연구의 대상이 되고 있다. 표피에서도 최외각층인 각질층을 구성하는 성분은 각질세포와 피부지질이다. 피부지질은 피부의 장벽 기능을 담당하며 유해물질로부터 피부를 보호, 체내 물질의 유출 방지 및 피부 수분 증발을 방지하는 중요한 기능을 한다.
피부지질은 각질세포(corneocytes) 간의 공간을 채우고 있으며 주로 세라마이드(40~65%), 콜레스테롤(10%) 및 유리지방산(25%)으로 구성되어 있다. 이러한 지질들은 각질세포 사이에 존재하여 수분의 증발을 방지하고, 외부 자극이나 오염으로부터 피부를 보호하는 피부장벽의 기능을 수행한다.
한편, 난각막은 계란과 같은 조류(鳥類) 알의 속껍질로서 주로 알의 내용물인 난백과 난황을 사용하는 과정에서 부산물로 발생한다. 이때 발생한 부산물은 겉껍질(난각)과 속껍질(난각막 또는 난막)이 붙은 상태로 이전에는 부가가치가 거의 없어 가공 비용을 충당하면서 산업적으로 폐기하였다. 최근 칼슘이 주성분인 겉껍질은 분리하여 식품용이나 사료용으로 사용한다. 이때 겉껍질에서 약 4~5%를 차지하는 분리된 속껍질이 난각막이다.
일반적으로 난각막은 수분을 일정량 함유하고 있으며, 수분을 제외한 순수한 고형분의 함량은 5 내지 30 중량%를 차지한다. 이 난각막은 생체형성으로 두께 0.01 내지 0.02 mm의 해면체 구조의 섬유상으로 구성되며, 주요 아미노산은 히스티딘(Histidine)과 시스테인(Cysteine), 프롤린 (Proline) 등의 케라틴과 콜라겐 등으로 분자량이 약 10만 이상의 섬유상 구조 단백질 또는 경단백질이다. 이처럼 난각막 성분에 대해 연구가 이루어지면서 최근 난각막을 다양한 산업에 적용하려는 시도가 이루어지고 있다.
이에, 본 발명자들은 부작용 문제를 유발하지 않고 원료 확보가 용이하며, 자외선과 같은 피부 자극으로부터 피부를 보호할 수 있는 천연 소재를 개발하기 위해 노력한 결과, 입자크기를 최적화한 난각막 미세분말이 자외선 조사로 유도한 피부 손상 동물모델에서 피부표면의 수분 증가, 경피수분손실 억제, 표피 주름 개선 효과를 보다 향상시키고, 피부 손상 개선, 항염증 및 항산화 효과를 나타내는 것을 확인하여, 상기 난각막 미세분말을 피부 상태 개선용 조성물의 유효성분으로 이용할 수 있음을 밝힘으로써, 본 출원에 이르게 되었다.
대한민국 공개특허 제10-2021-0119680호
Huan Skin-identical Ceramides 2000; 한국미용학회지, 2002 Canty-Laird E, Kadler K (2005) Procollagen trafcking, processing and fbrillogenesis. J Cell Sci 118:1341-1353 Quan T et al (2004) Solar ultraviolet irradiation reduces collagen in photoaged human skin by blocking transforming growth factorbeta type II receptor/Smad signaling. Am J Pathol 165:741-751 Nelson KK, Melendez JA (2004) Mitochondrial redox control of matrix metalloproteinases. Free Radic Biol Med 37:768-784 Yang D et al (2007) Pro-infammatory cytokines increase reactive oxygen species through mitochondria and NADPH oxidase in cultured RPE cells. Exp Eye Res 85:462-472 Hanel KH, Cornelissen C, Luscher B, Baron JM (2013) Cytokines and the skin barrier. Int J Mol Sci 14:6720-6745
본 발명의 목적은 입자크기를 최적화하여 효능이 향상된 난각막 미세분말을 포함하는, 피부 상태 개선용 조성물을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 평균입자경이 20 내지 40 ㎛인 난각막 미세분말을 유효성분으로 함유하는, 피부 상태 개선용 건강기능식품 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 평균입자경이 20 내지 40 ㎛인 난각막 미세분말을 유효성분으로 함유하는, 피부 상태 개선용 화장료 조성물을 제공한다.
아울러, 본 발명은 평균입자경이 20 내지 40 ㎛인 난각막 미세분말을 유효성분으로 함유하는, 피부 상태 개선용 피부외용제 조성물을 제공한다.
본 발명에서는 난각막 미세분말의 입자크기를 최적화하여 자외선 조사로 유도한 피부 손상 동물모델에서 피부표면의 수분 증가, 경피수분손실 억제, 표피 주름 개선 효과가 보다 향상되고, 피부 손상 개선, 항염증 및 항산화 효과가 나타나는 것을 확인하였으므로, 상기 난각막 미세분말은 피부 상태 개선용 조성물의 유효성분으로 이용될 수 있다.
도 1은 자외선 조사로 유도한 피부 손상 동물모델에서 본 발명의 일 실시예에 따라 제조한 난각막 미세분말의 경구투여 12주 차에 피부표면 수분함량을 확인한 도이다.
도 2는 자외선 조사로 유도한 피부 손상 동물모델에서 본 발명의 일 실시예에 따라 제조한 난각막 미세분말의 경구투여 12주 차에 피부 경피수분증발량을 확인한 도이다.
도 3은 자외선 조사로 유도한 피부 손상 동물모델에서 본 발명의 일 실시예에 따라 제조한 난각막 미세분말의 경구투여 12주 차에 피부 표피 주름을 확인한 도이다.
도 4는 자외선 조사로 유도한 피부 손상 동물모델에 본 발명의 일 실시예에 따라 제조한 난각막 미세분말의 경구투여하는 방법을 모식화한 도이다.
도 5는 자외선 조사로 유도한 피부 손상 동물모델에서 본 발명의 일 실시예에 따라 제조한 난각막 미세분말의 농도별 경구투여 12주 차에 체중 및 음식섭취량을 확인한 도이다.
도 6a는 자외선 조사로 유도한 피부 손상 동물모델에서 본 발명의 일 실시예에 따라 제조한 난각막 미세분말의 농도별 경구투여 12주 차에 피부표면 수분함량을 확인한 도이다.
도 6b는 자외선 조사로 유도한 피부 손상 동물모델에서 본 발명의 일 실시예에 따라 제조한 난각막 미세분말의 농도별 경구투여 12주 차에 피부 경피수분증발량을 확인한 도이다.
도 6c는 자외선 조사로 유도한 피부 손상 동물모델 피부 조직에서 본 발명의 일 실시예에 따라 제조한 난각막 미세분말의 농도별 경구투여 12주 차에 HAS1, HAS2 및 HAS3 mRNA 발현을 확인한 도이다.
도 7a는 자외선 조사로 유도한 피부 손상 동물모델 피부 조직에서 본 발명의 일 실시예에 따라 제조한 난각막 미세분말의 농도별 경구투여 12주 차에 콜라겐 함량을 확인한 도이다.
도 7b는 자외선 조사로 유도한 피부 손상 동물모델 피부 조직에서 본 발명의 일 실시예에 따라 제조한 난각막 미세분말의 농도별 경구투여 12주 차에 프로콜라겐 수준을 확인한 도이다.
도 7c는 자외선 조사로 유도한 피부 손상 동물모델 피부 조직에서 본 발명의 일 실시예에 따라 제조한 난각막 미세분말의 농도별 경구투여 12주 차에 COL1A1 및 COL3A1 mRNA 발현을 확인한 도이다.
도 7d는 자외선 조사로 유도한 피부 손상 동물모델에서 본 발명의 일 실시예에 따라 제조한 난각막 미세분말의 농도별 경구투여 12주 차에 피부 탄력도를 확인한 도이다.
도 8a는 자외선 조사로 유도한 피부 손상 동물모델 피부 조직에서 본 발명의 일 실시예에 따라 제조한 난각막 미세분말의 농도별 경구투여 12주 차에 MMP-1 함량을 확인한 도이다.
도 8b는 자외선 조사로 유도한 피부 손상 동물모델 피부 조직에서 본 발명의 일 실시예에 따라 제조한 난각막 미세분말의 농도별 경구투여 12주 차에 MMP-2 mRNA 발현을 확인한 도이다.
도 8c는 자외선 조사로 유도한 피부 손상 동물모델에서 본 발명의 일 실시예에 따라 제조한 난각막 미세분말의 농도별 경구투여 12주 차에 피부 표피 두께를 확인한 도이다.
도 8d는 자외선 조사로 유도한 피부 손상 동물모델에서 본 발명의 일 실시예에 따라 제조한 난각막 미세분말의 농도별 경구투여 12주 차에 피부 거칠기 및 피부 주름 깊이를 확인한 도이다.
도 9a는 자외선 조사로 유도한 피부 손상 동물모델 피부 조직에서 본 발명의 일 실시예에 따라 제조한 난각막 미세분말의 농도별 경구투여 12주 차에 MEK1/2 및 MEK4 인산화를 확인한 도이다.
도 9b는 자외선 조사로 유도한 피부 손상 동물모델 피부 조직에서 본 발명의 일 실시예에 따라 제조한 난각막 미세분말의 농도별 경구투여 12주 차에 ERK 및 JNK 인산화를 확인하 도이다.
도 10a는 자외선 조사로 유도한 피부 손상 동물모델 피부 조직에서 본 발명의 일 실시예에 따라 제조한 난각막 미세분말의 농도별 경구투여 12주 차에 IL-1β, TNF-α, IL-6 및 COX-2 mRNA 발현을 확인한 도이다.
도 10b는 자외선 조사로 유도한 피부 손상 동물모델 피부 조직에서 본 발명의 일 실시예에 따라 제조한 난각막 미세분말의 농도별 경구투여 12주 차에 SOD1 mRNA 발현을 확인한 도이다.
이하 본 발명을 보다 상세히 설명한다.
본 발명은 평균입자경이 20 내지 40 ㎛인 난각막 미세분말을 유효성분으로 함유하는, 피부 상태 개선용 건강기능식품 조성물을 제공한다.
본 발명에서, 상기 평균입자경이 20 내지 40 ㎛인 난각막 미세분말은 하기의 단계를 거쳐 제조될 수 있다:
1) 난각막을 세척한 후 건조하는 단계;
2) 건조한 난각막을 살균하는 단계; 및
3) 살균한 난각막을 분쇄하고 균질화하여 평균입자경이 20 내지 40 ㎛인 난각막 미세분말을 획득하는 단계.
상기 난각막은 인공적 처리를 가하지 않고 폐기되는 상태 그대로가 사용될 수 있고, 또는 인공적 처리를 가한 것이 사용될 수도 있다.
또한, 상기 난각막은 하기의 단계를 거쳐 획득될 수 있다:
a) 조류의 알 껍질과 물을 1 : 15 내지 35의 중량비로 혼합하고 물로 세척한 후 분쇄하여 분쇄물을 획득하는 단계;
b) 획득한 분쇄물에 물을 첨가하고 교반하여 난각막을 획득하는 단계.
상기 단계 a)는 조류의 알 껍질을 물로 세척한 후 분쇄하여 분쇄물을 획득하는 단계로, 상기 세척을 통해 조류의 알 껍질을 물로 세척하여 껍질에 존재하는 분변 미생물을 제거할 수 있다. 상기 세척은 구체적으로 조류의 알 껍질과 물을 1 : 15 내지 35의 중량비로 혼합하고 물로 세척할 수 있고, 보다 구체적으로 1 : 20 내지 30의 중량비로 혼합하고 물로 세척할 수 있다.
또한, 상기 분쇄를 통해 세척한 조류의 알 껍질을 작은 조각으로 분할하고 알 껍질로부터 난각과 난각막이 분리되도록 함으로써, 난각과 난각으로부터 분리된 난각막으로 구성된 분쇄물을 획득할 수 있다. 상기 분쇄는 구체적으로 햄머밀(Hammer mill) 또는 햄머크러셔(Hammer crusher)를 이용하여 10 내지 30분 동안 수행할 수 있고, 보다 구체적으로 15 내지 25분 동안 수행할 수 있다. 분쇄 시간이 상기 범위를 벗어난 경우에는 난각으로부터 분리되지 않은 난각막이 다량 존재하여 난각막의 수득율이 떨어질 수 있다.
또한, 상기 조류의 알 껍질은 가금류, 예컨대 닭, 메추리, 오리 또는 거위의 알 껍질일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 상기 단계 b)는 단계 a)에서 획득한 분쇄물에 물을 첨가하고 교반하여 난각막을 획득하는 단계로, 난각과 난각으로부터 분리된 난각막으로 구성된 분쇄물에서 난각막을 획득하는 단계이다. 구체적으로 분쇄물에 물을 1 : 15 내지 35의 중량비, 보다 더 구체적으로 1 : 20 내지 30의 중량비로 첨가하고 교반하면 분쇄물에 포함된 난각은 바닥으로 가라앉고, 난각막은 물 위로 떠오르게 되어 떠오른 난각막을 획득할 수 있다.
상기 단계 1)은 난각막을 세척하고 건조하는 단계로, 상기 세척은 구체적으로 난각막과 물을 1 : 15 내지 35의 중량비로 혼합하고 물로 세척할 수 있고, 보다 구체적으로 1 : 20 내지 30의 중량비로 혼합하고 물로 세척할 수 있다. 세척한 난각막은 50 내지 70℃에서 10 내지 30분 동안 건조할 수 있고, 보다 구체적으로 55 내지 65℃에서 15 내지 25분 동안 건조할 수 있다.
상기 단계 2)는 건조한 난각막을 살균하는 단계로, 구체적으로 건조한 난각막을 70 내지 90℃에서 25 내지 45분 동안 살균할 수 있고, 보다 구체적으로 75 내지 85℃에서 30 내지 40분 동안 살균할 수 있다. 살균의 온도 및 시간이 상기 하한치 미만인 경우에는 난각막에 일부 존재하는 미생물이 완전히 멸균되지 않을 수 있다. 또한 상기 상한치 초과인 경우에는 난각막에 포함된 구성 성분, 예컨대 단백질, 콜라겐 등이 변성 또는 파괴되어 효능이 떨어질 수 있다.
상기 단계 3)은 살균한 난각막을 분쇄하고 균질화하여 난각막 미세분말을 획득하는 단계로, 구체적으로 햄머밀(Hammer mill)을 이용하여 초미세 분쇄하고 균질화하여 체적평균입자경이 20 내지 40 ㎛, 보다 구체적으로 25 내지 35 ㎛인 난각막 미세분말을 획득할 수 있다. 난각막 미세분말의 평균입자경이 상한치 초과인 경우 피부 상태 개선 효능이 떨어지고/거나 효능이 미미할 수 있다.
본 발명에서, 상기 피부 상태 개선은 자외선에 의한 피부 노화, 피부 손상, 피부 탄력 저하 또는 피부 주름 개선, 또는 자외선으로부터 피부 장벽 강화, 피부 보습, 항염증 또는 항산화일 수 있다.
또한, 상기 자외선은 자외선 B(ultraviolet-B, UVB)일 수 있다.
본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명자들은 본 발명에 따라 닭의 알 껍질을 이용하여 체적평균입자경이 30 ㎛인 난각막 미세분말을 제조하였다.
또한, 본 발명자들은 상기 난각막 미세분말을 부형제를 이용하여 경구 투여용 조성물로 제조하고 이를 자외선 조사로 유도된 피부 손상 마우스 모델에 투여하였다. 그 결과, 자외선 조사로 유도된 피부 손상 마우스 모델에서는 지속적인 자외선 조사로 피부표면의 수분 감소, 경피수분증발량 증가가 나타나고, 콜라겐 생성 저하, 콜라겐 분해 효소 발현 증가 및 피부 탄력 저하로 인한 피부 표피 주름 생성이 나타나는 반면, 상기 난각막 미세분말을 투여한 경우에서는 피부표면의 수분이 증가하고 경피수분증발량이 감소하며, 콜라겐 생성, 콜라겐 분해 효소 발현 감소 및 피부 탄력 향상을 통한 피부 표피 주름이 개선되는 것을 확인하였다. 특히, 체적평균입자경이 300 ㎛인 난각막 미세분말을 투여한 마우스군에 비해서도 우수한 피부 상태 개선 효과가 나타남을 확인하였다.
또한, 본 발명자들은 자외선 조사로 유도된 피부 손상 마우스 모델에서는 지속적인 자외선 조사로 MAPK 신호전달 경로가 활성화 되고, 산화적 스트레스에 의한 항산화 효소 발현 감소 및 염증성 사이토카인 발현 증가가 나타나는 반면, 상기 난각막 미세분말을 투여한 경우에서는 MAPK 신호전달 경로 활성화가 억제되고, 항산화 효소의 발현이 증가하며, 염증성 사이토카인의 발현이 감소하는 것을 확인하였다.
따라서, 본 발명의 난각막 미세분말은 자외선 조사로 유도한 피부 손상 동물모델에서 피부표면의 수분 증가, 경피수분손실 억제, 피부 주름 및 피부 손상 개선, 항염증 및 항산화 효과가 우수하므로, 상기 난각막 미세분말을 피부 상태 개선용 건강기능식품 조성물 또는 식품 첨가제를 포함한 식품 조성물의 유효성분으로 유용하게 이용할 수 있다.
본 발명에 따른 건강기능식품 조성물은 분말, 과립, 환, 정제, 캡슐, 캔디, 시럽 및, 차, 쥬스 및 드링크 형태의 음료 등의 제형으로 제조될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 따른 식품 조성물은 기능성 식품(functional food), 영양 보조제(nutritional supplement), 건강식품(health food) 및 식품 첨가제(food additives) 등의 모든 형태를 포함한다. 상기 유형의 식품 조성물은 당 업계에 공지된 통상적인 방법에 따라 다양한 형태로 제조할 수 있다.
또한, 기능성 식품으로는 음료(알콜성 음료 포함), 과실 및 그의 가공식품(예: 과일통조림, 병조림, 잼, 마아말레이드 등), 어류, 육류 및 그 가공식품(예: 햄, 소시지콘비이프 등), 빵류 및 면류(예: 우동, 메밀국수, 라면, 스파게티, 마카로니 등), 과즙, 각종 드링크, 쿠키, 엿, 유제품(예: 버터, 치이즈 등), 식용식물유지, 마아가린, 식물성 단백질, 레토르트 식품, 냉동식품, 각종 조미료(예: 된장, 간장, 소스 등) 등을 들 수 있고, 통상적인 의미에서의 기능성 식품을 모두 포함한다.
본 발명에 따른 식품 조성물이 음료 조성물인 경우, 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물은 포도당, 과당과 같은 모노사카라이드, 말토오스, 슈크로오스와 같은 디사카라이드, 및 덱스트린, 사이클로덱스트린과 같은 폴리사카라이드, 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알코올이다. 감미제로서는 타우마틴, 스테비아 추출물과 같은 천연 감미제나 사카린, 아스파르탐과 같은 합성 감미제 등을 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 건강식품 100중량부당 0.01 ~ 0.04중량부, 보다 구체적으로 0.02 ~ 0.03중량부의 범위에서 선택하는 것이 바람직하다.
상기 외의 본 발명의 난각막 미세분말은 여러 가지 부형제, 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그 밖에 본 발명의 추출물은 천연 과일 주스, 과일 주스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 크게 중요하지 않지만 본 발명의 식품 조성물 100 중량부 당 0.001 내지 0.1 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.
본 발명의 난각막 미세분말을 식품 첨가제로 사용할 경우, 상기 난각막 미세분말을 그대로 첨가하거나 농축액 형태로 제조할 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다.
본 발명에 식품 조성물은 난각막 미세분말을 조성물 총 중량에 대하여 0.01 ~ 90 중량%, 보다 구체적으로 0.1 ~ 50 중량%로 함유할 수 있다.
또한, 본 발명은 평균입자경이 20 내지 40 ㎛인 난각막 미세분말을 유효성분으로 함유하는, 피부 상태 개선용 화장료 조성물을 제공한다.
상기 난각막 미세분말 및 이의 제조방법, 피부 상태 개선에 대해서는 상기에서 설명한 바와 같다.
또한, 본 발명의 난각막 미세분말은 자외선 조사로 유도한 피부 손상 동물모델에서 피부표면의 수분 증가, 경피수분손실 억제, 피부 주름 및 피부 손상 개선, 항염증 및 항산화 효과가 우수하므로, 상기 난각막 미세분말을 피부 상태 개선용 화장료 조성물의 유효성분으로 유용하게 이용할 수 있다.
본 발명의 화장료 조성물은 상기 유효성분 이외에 통상적으로 허용되는 성분들을 제한없이 포함할 수 있으며, 예컨대 항산화제, 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제, 그리고 담체를 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 화장료 조성물은 용액, 외용연고, 크림, 폼, 영양화장수, 유연화장수, 팩, 유연수, 유액, 메이크업베이스, 에센스, 비누, 액체 세정료, 입욕제, 선 스크린크림, 선오일, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클렌징, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션, 패치 및 스프레이로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 제형으로 제조할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명의 화장료 조성물은 일반 피부 화장료에 배합되는 화장품학적으로 허용 가능한 담체를 1 종 이상 추가로 포함할 수 있으며, 통상의 성분으로 예를 들면 유분, 물, 계면활성제, 보습제, 저급 알콜, 증점제, 킬레이트제, 색소, 방부제, 향료 등을 적절히 배합할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 화장료 조성물에 포함되는 화장품학적으로 허용가능한 담체는 제형에 따라 다양하다.
본 발명의 제형이 연고, 페이스트, 크림 또는 젤인 경우에는, 담체성분으로서 동물성 유, 식물성 유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크, 산화아연 또는 이들의 혼합물이 이용될 수 있다.
본 발명의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는, 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록사이드, 칼슘 실케이트, 폴리아미드 파우더 또는 이들의 혼합물이 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진제를 포함할 수 있다.
본 발명의 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는, 담체 성분으로서 용매, 용해화제 또는 유탁화제가 이용되며, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알콜, 벤질 벤조에이트, 프로필렌글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일이 이용될 수 있으며, 특히, 목화씨 오일, 땅콩 오일, 옥수수 배종 오일, 올리브 오일, 피마자 오일 및 참깨 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 이용될 수 있다.
본 발명의 제형이 현탁액인 경우에는, 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알콜, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있다.
본 발명의 제형이 비누인 경우에는 담체 성분으로서 지방산의 알칼리 금속 염, 지방산 헤미에스테르 염, 지방산 단백질 히드롤리제이트, 이세티오네이트, 라놀린 유도체, 지방족 알콜, 식물성 유, 글리세롤, 당 등이 이용될 수 있다.
본 발명의 제형이 계면-활성제 함유 클렌징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르 설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시테이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성 오일, 라놀린 유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.
아울러, 본 발명은 평균입자경이 20 내지 40 ㎛인 난각막 미세분말을 유효성분으로 함유하는, 피부 상태 개선용 피부외용제 조성물을 제공한다.
상기 난각막 미세분말 및 이의 제조방법, 피부 상태 개선에 대해서는 상기에서 설명한 바와 같다.
또한, 본 발명의 난각막 미세분말은 자외선 조사로 유도한 피부 손상 동물모델에서 피부표면의 수분 증가, 경피수분손실 억제, 피부 주름 및 피부 손상 개선, 항염증 및 항산화 효과가 우수하므로, 상기 난각막 미세분말을 피부 상태 개선용 피부외용제 조성물의 유효성분으로 유용하게 이용할 수 있다.
본 발명에 의한 피부외용제 조성물은, 예를 들어, 연고, 로션, 가용화상, 현탁액, 에멀젼, 크림, 젤, 스프레이, 파프제, 경고제, 패치제 또는 물파스 등을 들 수 있지만, 이들에만 한정되지 않고, 당업계에 주지된 어떠한 기제에도 배합될 수 있다. 본 발명에 의한 피부 외용제 조성물은 난각막 미세분말을 조성물 총 중량에 대하여 0.01 ~ 90 중량%, 보다 구체적으로 0.1 ~ 50 중량%로 함유할 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예, 비교예 및 실험예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예, 비교예 및 실험예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예, 비교예 및 실험예에 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1> 난각막 미세분말의 제조
닭의 알 껍질(eggshell)로부터 난각 및 난각막(eggshell membrane)을 분리 및 분쇄하여 난각막 미세분말을 제조하였다.
구체적으로, 닭의 알 껍질과 물을 1 : 25의 중량비로 혼합하고 물로 세척하여 알 껍질에 존재하는 분변 미생물을 제거하였다. 물로 세척한 알 껍질을 햄머밀(Hammer mill)을 이용하여 20분 동안 분쇄하여 알 껍질에서 난각과 난각막을 분리하였다. 상기 분쇄물에 물을 1 : 25의 중량비로 추가하고 교반하여 물 위로 떠오른 분리된 난각막을 획득하였다. 상기 획득한 난각막을 상기와 같이 물로 세척하고, 60℃에서 20분 동안 건조한 후 증기 재킷 용기(steam jacketed vessel)에 넣고 80℃에서 45분 동안 열처리하여 살균하였다. 살균한 난각막을 햄머밀로 초미세 분쇄하고 균질화하여 체적평균입자경 30 ㎛인 난각막 미세분말을 획득하였다.
<비교예 1> 평균입자경이 상이한 난각막 미세분말의 제조
햄머밀로 분쇄하여 체적평균입자경 300 ㎛인 난각막 미세분말을 획득하는 것을 제외하고 상기 <실시예 1>에 기재된 방법과 동일한 방법으로 평균입자경이 상이한 난각막 미세분말을 제조하였다.
<실험예 1> 난각막 미세분말의 피부 개선 효과 분석
<1-1> 자외선 조사에 의한 피부 손상 동물모델 제작
자외선 조사에 의한 피부 손상 마우스모델을 제작하고 상기 <실시예 1> 또는 <비교예 1> 난각막 미세분말을 경피투여하였다.
구체적으로, 난각막 미세분말의 경구투여를 위해 상기 <실시예 1> 또는 <비교예 1>에서 제조한 난각막 미세분말과 부형제로 옥수수 기름(Corn oil)을 혼합하여 120 mg/kg 농도의 경구용 조성물을 제조하였다. 그 다음, 7주령의 SKH-1 무모쥐(hairless mice, 오리엔트바이오, 한국)를 하기 [표 1]과 같이 네 개의 그룹으로 나누고 정상대조군을 제외하고 나머지 군에 UVB 조사를 실시하여 자외선 조사에 의한 피부 손상을 유도하고, UV + <실시예 1>의 난각막 미세분말 투여군 및 UV + <비교예 1>의 난각막 미세분말 투여군 각각에 상기에서 제조한 <실시예 1> 및 <비교예 1>의 난각막 미세분말 경구용 조성물(OD) 각각을 UVB 조사를 실시하는 동안 경구투여하였다. 정상대조군 및 UV대조군에는 옥수수 기름을 경구투여하였다.
UVB 조사는 UVB(5 Sankyo Denki G5T5E lamps, Sankyo Denki Co., Japan)가 장착된 UV-Irradiation system(LK3500, Korea)을 이용하여 실시하였고, 첫째 주에 1 MED(minimal erythermal dose), 둘째 주에 2 MED, 셋째 주에 3 MED, 넷째 주에서 열째 주까지 4 MED로 실시하였다. 또한, 3회/주(월, 수, 금), 총 12주간 UVB 조사를 실시하여 유도하였다. MED는 예비시험을 통하여 최초의 홍반이 나타나는 자외선 조사량을 측정하여 설정하였다.
경구투여는 시험동물의 경배부 피부를 잡아 보정한 후 경구투여용 존데를 이용하여 강제 경구투여 하였고, 1회/일, 7회/주, 12주간(80 일), 투여 당일 오전 중에 투여하였다.
그룹 성별 동물수(마리) 투여액량(ml/kg) 투여용량(mg/kg)
NC 정상대조군 Female 8 10 0
UV UV대조군 Female 8 10 0
UV+
OD 30㎛		 UV + <실시예 1>의 난각막 미세분말 투여군
Female
8
10
120
UV+
OD 300㎛		 UV + <비교예 1>의 난각막 미세분말 투여군
Female
8
10
120
<1-2> 피부표면 수분함량 및 경표피 수분증발량 분석
본 발명의 난각막 미세분말에 의한 피부장벽 강화 효과를 확인하기 위하여, 상기 실험예 <1-1>의 마우스모델 각각의 피부표면 수분함량(Skin moisture) 및 경표피 수분증발량(Transepidermal water loss, TEWL)을 분석하였다.
구체적으로, 상기 실험예 <1-1>의 마우스 모델에 대하여 Corneometer CM825(Courage & Khazaka Electronics, Cologne, Germany)를 이용하여 자외선 조사 12주차에 피부표면 수분함량을 측정하였다.
또한, 상기 실험예 <1-1>의 마우스 모델에 대하여 Tewameter TM300(Courage & Khazaka Electronics, Cologne, Germany)를 이용하여 자외선 조사 12주차에 경표피 수분증발량을 측정하였다.
그 결과, 도 1에 나타낸 바와 같이, 정상대조군(NC 군)과 비교하여 UV대조군(UV 군)의 수분함량이 감소하는 것을 확인하였다. 이를 통해 지속적인 자외선 조사에 의해 UV 군의 피부표면 수분함량이 감소하여 피부장벽이 손상됨을 알 수 있다. 반면, UV + <실시예 1>의 난각막 미세분말 투여군(UV+OD 30㎛ 군)은 수분함량이 UV군에 비하여 유의하게 증가하고, UV + <비교예 1>의 난각막 미세분말 투여군(UV+OD 300㎛ 군)에 비해서도 증가하는 것을 확인하였다.
또한, 도 2에 나타낸 바와 같이, NC 군과 비교하여 UV 군의 경표피 수분증발량이 현저히 증가하는 것을 확인하였다. 이를 통해 지속적인 자외선 조사에 의해 경표피 수분증발량이 증가하여 피부장벽이 손상됨을 알 수 있다. 반면, UV+OD 30㎛ 군은 경표피 수분증발량이 UV 군에 비하여 유의하게 감소하고, UV+OD 300㎛ 군에 비해서도 감소하는 것을 확인하였다.
상기의 결과를 통해 체적평균입자경이 30㎛인 본 발명의 난각막 미세분말이 피부표면 수분 증가 및 경피수분손실 억제 효과가 현저히 우수하고, 상기 효과를 통해 현저히 우수한 피부장벽 강화 및 보호 효과를 나타냄을 알 수 있다.
<1-3> 피부 표피 주름 분석
본 발명의 난각막 미세분말에 의한 피부 주름 개선 효과를 확인하기 위하여, 상기 실험예 <1-1>의 마우스모델 각각의 피부 표피 주름 변화를 측정하였다.
구체적으로, 상기 실험예 <1-1>의 마우스 모델을 마취한 후 피부 표피의 주름 생성정도를 살펴보기 위하여 Visioscan VC98(Courage & Khazaka Electronics, Cologne, Germany)를 이용하여 피부 표피를 사진촬영을 실시하고 이미지를 분석하여 주름을 평가하였다.
그 결과, 도 3에 나타낸 바와 같이, NC 군과 비교하여 UV 군의 피부 표피 주름 깊이가 높은 것을 확인하였다. 반면, UV+OD 30㎛ 군은 피부 표피 주름 깊이가 UV 군에 비하여 유의하게 낮아지고, UV+OD 300 ㎛ 군에 비해서도 낮아지는 것을 확인하였다.
상기의 결과를 통해 체적평균입자경이 30 ㎛인 본 발명의 난각막 미세분말이 현저히 우수한 피부 주름 개선 효과를 나타냄을 알 수 있다.
<실험예 2> 농도별 난각막 미세분말의 피부 개선 효과 분석
<2-1> 자외선 조사에 의한 피부 손상 동물모델 제작
자외선 조사에 의한 피부 손상 마우스모델을 제작하고 상기 <실시예 1>의 난각막 미세분말을 농도별로 경피투여하였다.
구체적으로, 동물실험 프로토콜은 한국식품연구원 동물실험연구위원회(Institutional Animal Care and Use Committee of the Korea Food Research Institute)의 심의 및 승인을 받았다(승인번호: KFRIM-21016). 5주령 암컷 SKH-1 털이 없는 마우스를 하기 [표 2]와 같이 6개 그룹으로 나누고, 10마리의 마우스를 23±2℃, 상대습도 50±10%, 12시간 명/암 주기에서 적응시켰다. 모든 마우스에 표준 식이(AIN-93G)와 음용수를 자유롭게 제공하였다. 도 4에서 나타낸 바와 같이, 마우스를 1주 동안 적응시킨 후 UVB 조사하고 12주 동안 상기 <실험예 1>에서 제조한 난각막 미세분말 경구용 조성물(ESM)을 섭취시켰다. ESM 섭취와 UVB 조사는 일주일에 세 번 수행하였다. UVB 조사는 1 MED(minimal erythermal dose)(0.05 J/cm2)으로 시작하여 4주차에 4 MED까지 점진적으로 증가시켰다. ESM은 30, 60 및 120 mg/kg 체중으로 투여하였다. 양성 대조군은 히알루론산(hyaluronic acid, HA)을 60 mg/kg 체중으로 경구투여하였다.
그룹 동물수(마리) 투여 용량
정상대조군 10 -
UV대조군 10 UVB 조사
양성대조군 10 UVB 조사 + HA 60 mg/kg
ESM 30 mg/kg 투여군 10 UVB 조사 + <실시예 1>의 난각막 미세분말 30 mg/kg
ESM 60 mg/kg 투여군 10 UVB 조사 + <실시예 1>의 난각막 미세분말 60 mg/kg
ESM 120 mg/kg 투여군 10 UVB 조사 + <실시예 1>의 난각막 미세분말 120 mg/kg
<2-2> 체중 및 음식섭취량 분석
상기 실험예 <2-1>의 마우스모델 각각에서 UVB 조사 12주 후 체중(Body weight) 및 음식섭취량(Food intake)을 분석하였다.
그 결과, 도 5에 나타낸 바와 같이, ESM 투여군 모두 대조군과 비교하여 체중 및 음식섭취량의 유의적인 변화가 나타나지 않는 것을 확인하였다.
<2-3> 피부표면 수분함량 및 경표피 수분증발량 분석
본 발명의 난각막 미세분말에 의한 피부장벽 강화 효과를 확인하기 위하여, 상기 실험예 <2-1>의 마우스모델 각각에서 피부표면 수분함량(Skin moisture) 및 경표피 수분증발량(Transepidermal water loss, TEWL), 피부 수화(skin hydration)에 관여하는 인자의 발현을 분석하였다.
구체적으로, 피부표면 수분함량 및 TEWL은 상기 실험예 <1-2>에 기재된 방법과 동일한 방법으로 측정하였다.
또한, 피부 수화에 관여하는 인자로 HAS1, HAS2 및 HAS3의 발현을 측정하기 위하여, RNA 추출 및 정량적 실시간 PCR을 수행하였다. 먼저, TRIzol 시약(15596026, Thermo Fisher Scientifc, Waltham, MA, USA)을 사용하여 UVB 조사 12주 후 상기 실험예 <2-1>의 마우스모델 각각의 등 피부 조직에서 총 RNA를 추출하였다. 그 다음, amfRivert cDNA synthesis platinum master mix(R5600-200, GenDEPOT, Katy, TX, USA)를 사용하여 39 사이클, 총 반응 부피 20 μL로 상보적 DNA를 합성하였다. 정량적 PCR은 CFX96 Touch Real-Time PCR Detection 시스템(Bio-rad, Hercules, CA, USA)에서 Accupower®2X GreenStarTM qPCR Master Mix(K-6253, Bioneer, Daejeon, Korea)를 사용하여 수행하였다. 프라이머 서열은 [표 3]에 나타내었다.
프라이머 서열(5'→3') 서열번호
HAS1 정방향 GTGCGAGTGTTGGATGAAGACC 1
역방향 CCACATTGAAGGCTACCCAGTATC 2
HAS2 정방향 GCCATTTTCCGAATCCAAACAGAC 3
역방향 CCTGCCACACTTATTGATGAGAACC 4
HAS3 정방향 GCTTCAGTCCAGAAACCAAAGTAGG 5
역방향 CCTCGTTCCTCAAGAGAAACAAGG 6
COL1A1 정방향 GGTCTTGGTGGTTTTGTATTCG 7
역방향 AACAGTCGCTTCACCTACAGC 8
COL3A1 정방향 AAGGCTGCAAGATGGATGCT 9
역방향 GTGCTTACGTGGGACAGTCA 10
MMP-2 정방향 CAGAGACCTCAGGGTGACAC 11
역방향 GAAGAAGTTGTAGTTGGCCA 12
SOD1 정방향 GGAAGCATGGCGATGAAA 13
역방향 AAATGAGGTCCTGCACTGGTA 14
IL-1β 정방향 TGGACCTTCCAGGATGAGGACA 15
역방향 GTTCATCTCGGAGCCTGTAGTG 16
TNF-α 정방향 GGTGCCTATGTCTCAGCCTCTT 17
역방향 GCCATAGAACTGATGAGAGGGAG 18
IL-6 정방향 TACCACTTCACAAGTCGGAGGC 19
역방향 CTGCAAGTGCATCATCGTTGTTC 20
COX-2 정방향 TTCCAATCCATGTCAAAACCGT 21
역방향 AGTCCGGGTACAGTCACACTT 22
GAPDH 정방향 CATCACTGCCACCCAGAAGACTG 23
역방향 ATGCCAGTGAGCTTCCCGTTCAG 24
그 결과, 도 6a에 나타낸 바와 같이, 정상대조군과 비교하여 UV대조군의 수분함량이 감소하는 반면, ESM 투여군은 수분함량이 UV대조군에 비하여 유의하게 증가하는 것을 확인하였다. 또한, ESM 투여군의 경우 농도 의존적으로 수분함량이 증가하였다.
또한, 도 6b에 나타낸 바와 같이, 정상대조군과 비교하여 UV대조군의 경표피 수분증발량이 증가하는 반면, ESM 투여군은 경표피 수분증발량이 UV대조군에 비하여 유의하게 감소하는 것을 확인하였다. 또한, ESM 투여군의 경우 농도 의존적으로 경표피 수분증발량이 감소하였다.
아울러, 도 6c에 나타낸 바와 같이, 정상대조군과 비교하여 UV대조군에서 수분 관련 인자로 HAS1, HAS2 및 HAS3의 mRNA 발현이 현저히 감소하는 반면, ESM 투여군에서는 이들의 mRNA 발현이 UV대조군에 비하여 유의하게 증가하는 것을 확인하였다. 특히,ESM 투여군에서 HAS1 및 HAS2의 mRNA 발현은 양성대조군과 비교하여 현저히 증가하였다.
상기의 결과를 통해 체적평균입자경이 30㎛인 본 발명의 난각막 미세분말이 피부표면 수분 증가, 경피수분손실 억제 및 피부 수화 증가 효과가 현저히 우수하고, 상기 효과를 통해 현저히 우수한 피부장벽 강화 및 보호 효과를 나타냄을 알 수 있다.
<2-4> 콜라겐 함량 분석
콜라겐 감소에 의한 피부 탄력 저하는 주름 발생의 원인이다. 또한, 콜라겐 형성 동안 프로콜라겐이 먼저 인코딩 DNA에서 내생적으로 생성되어 세포외 공간으로 분비되고, 분비된 프로콜라겐 분자는 자가 조립되어 성숙한 콜라겐 섬유를 생성한다((Canty-Laird et al. 2005). 이에, 본 발명의 난각막 미세분말에 의한 피부 주름 개선 효과를 확인하기 위하여, 상기 실험예 <2-1>의 마우스모델 각각에서 콜라겐 함량 및 프로콜라겐 1형(procollagen type 1) 함량, 탄력도를 분석하였다.
구체적으로, UVB 조사 12주 후 상기 실험예 <2-1>의 마우스모델 각각을 희생시킨 후, 마우스 등 피부 조직을 채취하고 4℃에서 10% 포르말린으로 밤새 고정하고 파라핀에 포매하였다. 콜라겐 염색을 위해 Masson's trichrome 염색 분색법을 수행하였다(도 7a).
또한, 상기와 같이 마우스 등 피부 조직을 채취하고, 프로콜라겐 1형 ELISA 키트(AI72204A, Takara, Shiga, Japan)를 사용하여 프로콜라겐 I형을 제조사의 절차에 따라 정량하였다(도 7b).
또한, 상기 실험예 <2-3>에 기재된 방법과 동일한 방법으로 정량적 PCR을 수행하여 COL1A1 및 COL3A1의 발현을 측정하였다(도 7c).
또한, UVB 조사 12주 후 상기 실험예 <2-1>의 마우스모델 각각의 마우스 등쪽 피부의 탄력도를 Cutometer® MPA580(CK Electronics GmbH)를 이용하여 측정하였다(도 7d).
그 결과, 도 7a에 나타낸 바와 같이, 정상대조군과 비교하여 UV대조군에서 콜라겐 함량이 현저히 감소하는 반면, ESM 투여군에서는 UV대조군 대비 농도 의존적으로 콜라겐 함량이 증가하는 것을 확인하였다.
또한, 도 7b에 나타낸 바와 같이, 정상대조군과 비교하여 UV대조군에서 프로콜라겐 I형 생성이 감소하는 반면, ESM 투여군에서는 UV대조군 대비 콜라겐 I형 생성이 증가하는 것을 확인하였다.
또한, 도 7c에 나타낸 바와 같이, 정상대조군과 비교하여 UV대조군에서 COL1A1 및 COL3A1의 mRNA 발현이 감소하는 반면, ESM 투여군에서는 UV대조군 대비 농도 의존적으로 이들 발현이 증가하는 것을 확인하였다.
아울러, 도 7d에 나타낸 바와 같이, 정상대조군과 비교하여 UV대조군에서 탄력도가 감소하는 반면, ESM 투여군에서는 UV대조군 대비 탄력도가 증가하는 것을 확인하였다.
상기의 결과를 통해 체적평균입자경이 30 ㎛인 본 발명의 난각막 미세분말이 콜라겐 생성 촉진 효과가 우수하고, 상기 효과를 통해 피부 탄력 저하를 완화하며 현저히 우수한 피부 주름 개선 효과를 나타냄을 알 수 있다.
<2-5> 콜라겐 분해 및 피부 표피 주름 분석
UV 노출에 의해 콜라겐 분해(degradation)가 유도되어 피부 주름이 형성된다(Quan et al. 2004). 이에, 본 발명의 난각막 미세분말에 의한 피부 주름 개선 효과를 확인하기 위하여, 상기 실험예 <2-1>의 마우스모델 각각에서 콜라겐 분해에 관여하는 효소의 발현 변화 및 피부 표피 두께 및 피부 표피 주름 변화를 분석하였다.
구체적으로, UVB 조사 12주 후 상기 실험예 <2-1>의 마우스모델 각각을 희생시킨 후, 마우스 등 피부 조직을 채취하고 4℃에서 10% 포르말린으로 밤새 고정하고 파라핀에 포매하였다. 콜라겐 분해에 관여하는 효소로 MMP-1 염색을 위해 면역조직화학 분석법을 수행하였다(도 8a). 또한, 상기 마우스 등 피부 조직을 이용하여 상기 실험예 <2-3>에 기재된 방법과 동일한 방법으로 정량적 PCR을 수행하여 콜라겐 분해에 관여하는 효소로 MMP-2의 발현을 측정하였다(도 8b).
또한, 상기와 같이 마우스 등 피부 조직을 파라핀에 포매한 후 표피 두께를 ImageJ 소프트웨어를 사용하여 측정하였다(도 8c).
또한, 실리콘 레플리카(Silicon replicas, R201, Biobridge, 경기도, 한국)를 사용하여 UVB 조사 12주 후 상기 실험예 <2-1>의 마우스모델 각각의 마우스 등쪽 피부 주름을 측정하였다. Visioscan VC98(Courage & Khazaka Electronics)을 사용하여 피부 거칠기를 분석하고, SurfCharJ plugin이 포함된 ImageJ 소프트웨어를 사용하여 피부 주름 깊이를 분석하였다(도 8d).
그 결과, 도 8a 및 도 8b에 나타낸 바와 같이, 정상대조군과 비교하여 UV대조군에서 MMP-1 및 MMP-2의 발현이 증가하는 반면, ESM 투여군에서는 UV대조군 대비 이들의 발현이 감소하는 것을 확인하였다.
또한, 도 8c 및 도 8d에 나타낸 바와 같이, 정상대조군과 비교하여 UV대조군에서 피부 표피 두께 및 주름 깊이가 증가하는 반면, ESM 투여군에서는 피부 표피 두께 및 주름 깊이 증가가 억제되는 것을 확인하였다.
상기의 결과를 통해 체적평균입자경이 30 ㎛인 본 발명의 난각막 미세분말이 피부 콜라겐 분해 효소의 생성을 억제하여 현저히 우수한 피부 주름 개선 효과를 나타냄을 알 수 있다.
<2-6> MAPK 신호전달 경로 분석
MMP-1 발현을 상향 조절하는 ERK, p38 및 JNK를 포함한 MAPK 신호전달 경로는 UVB 노출에 의해 인산화 되어 피부 손상을 일으키는 것으로 알려져 있다 (Nelson et al. 2004). 이에, 본 발명의 난각막 미세분말에 의한 피부 손상 개선 효과를 확인하기 위하여, 상기 실험예 <2-1>의 마우스모델 각각에서 MAPK 신호전달 경로에 관여하는 인자들의 발현을 측정하였다.
구체적으로, UVB 조사 12주 후 상기 실험예 <2-1>의 마우스모델 각각에서 마우스 등 피부 조직을 채취하고, 용해 완충액(20 mM Tris-HCl [pH 7.5], 150 mM NaCl, 1 mM Na2EDTA, 1 mM EGTA, 1% 트리톤(Triton), 2.5 mM 피로인산나트륨(sodium phrophosphate), 1 mM 베타-글리세로인산(beta-glycerophosphate), 1 mM Na3VO4 및 1 μg/mL 류펩틴(leupeptin))(Cell Signaling Technology®Dallas, TX, USA)을 이용하여 마우스의 등 피부 조식으로부터 단백질을 추출하였다. 용액을 4℃에서 30분 동안 18,956 x g로 원심분리하고, Pierce™BCA Protein Assay Kit(23225, Thermo Fisher Scientifc, MA, USA)를 사용하여 상층액의 단백질 농도를 측정하였다. 그런 다음 단백질 샘플을 SDS-PAGE에 적용하였다. 분리된 단백질은 웨스턴 블롯팅(Western blotting)을 이용하여 젤에서 PVDF 막으로 옮겼다. 제조자의 절차에 따라 막을 4℃에서 24시간 동안 항체와 함께 인큐베이션하였다. 화학발광 판독기(LuminoGraph 3 Lite; Atto, Tokyo, Japan)를 사용하여 단백질 밴드를 검출하였다. p-MEK1/2, p-MEK3/6, p-MEK4, p-p38, p-JNK 및 MMP-1에 대한 항체는 Cell Signaling Technology(Danvers, MA, USA) 및 Biorbyt(영국 캠브리지)의 것을 구매하여 사용하였고, Vinculin 및 p-ERK에 대한 항체는 각각 Santa Cruz Biotechnology®(Dallas, TX, USA) 및 R&D Systems(Minneapolis, MN, USA)의 것을 구매하여 사용하였다.
그 결과, 도 9a 및 도 9b에 나타낸 바와 같이, 정상대조군 대비 UV대조군에서 MEK1/2 및 MEK4의 인산화가 유도되는 반면, ESM 투여군에서 UV에 의해 유도된 MEK1/2 및 MEK4의 인산화가 감소하는 것을 확인하였다. MEK1/2 및 MEK4의 하위 신호전달 인자인 ERK 및 JNK의 인산화 또한 ESM 투여군에서 감소하는 것을 확인하였다.
상기의 결과를 통해 체적평균입자경이 30 ㎛인 본 발명의 난각막 미세분말이 MEK1/2-ERK 및 MEK4-JNK 신호전달 경로를 조절하여 피부 손상을 완화하는 것을 알 수 있다.
<2-7> 항염증 및 항산화 분석
UV 노출은 산화적 스트레스를 통한 면역 과활성화 및 염증을 유발하는 것으로 알려져 있다 (Yang et al. 2007; Hanel et al. 2013). 이에, 본 발명의 난각막 미세분말에 의한 피부 내 항산화 및 항염증 효과를 확인하기 위하여, 상기 실험예 <2-1>의 마우스모델 각각에서 염증성 사이토카인의 발현 및 항산화 효소의 발현 변화를 측정하였다.
구체적으로, UVB 조사 12주 후 상기 실험예 <2-1>의 마우스모델 각각에서 상기 실험예 <2-3>에 기재된 방법과 동일한 방법으로 정량적 PCR을 수행하여 염증성 사이토카인으로 IL-1β, TNF-α, IL-6 및 COX-2 발현을 측정하고(도 9a), 항산화 효소로 SOD1 발현을 측정하였다(도 9b).
그 결과, 도 10a에 나타낸 바와 같이, 정상대조군과 비교하여 UV대조군에서 IL-1β, TNF-α, IL-6 및 COX-2 mRNA 발현이 증가하는 반면, ESM 투여군에서는 UV대조군 대비 이들의 발현이 감소하는 것을 확인하였다.
또한, 도 10b에 나타낸 바와 같이, 정상대조군과 비교하여 UV대조군에서 SOD1 mRNA 발현이 감소하는 반면, ESM 투여군에서는 UV대조군 대비 이의 발현이 증가하는 것을 확인하였다.
상기의 결과를 통해 체적평균입자경이 30 ㎛인 본 발명의 난각막 미세분말이 피부 내 염증성 사이토카인의 발현을 억제하고 항산화 효소를 상향조절하여 항염증 및 항산화 작용을 하는 것을 알 수 있다.

Claims (13)

  1. 평균입자경이 20 내지 40 ㎛인 난각막 미세분말을 유효성분으로 함유하는, 피부 상태 개선용 건강기능식품 조성물.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 평균입자경이 20 내지 40 ㎛인 난각막 미세분말은 하기의 단계를 거쳐 제조되는 것을 특징으로 하는, 피부 상태 개선용 건강기능식품 조성물:
    1) 난각막을 세척한 후 건조하는 단계;
    2) 건조한 난각막을 살균하는 단계; 및
    3) 살균한 난각막을 분쇄하고 균질화하여 평균입자경이 20 내지 40 ㎛인 난각막 미세분말을 획득하는 단계.
  3. 제 2항에 있어서, 상기 단계 1)에서 난각막은 하기의 단계를 거쳐 획득하는 것을 특징으로 하는, 피부 상태 개선용 건강기능식품 조성물:
    a) 조류의 알 껍질과 물을 1 : 15 내지 35의 중량비로 혼합하고 물로 세척한 후 분쇄하여 분쇄물을 획득하는 단계;
    b) 획득한 분쇄물에 물을 첨가하고 교반하여 난각막을 획득하는 단계.
  4. 제 3항에 있어서, 상기 단계 a)에서 조류의 알 껍질과 물을 1 : 20 내지 30의 중량비로 혼합하는 것을 특징으로 하는, 피부 상태 개선용 건강기능식품 조성물.
  5. 제 3항에 있어서, 상기 단계 a)에서 조류의 알 껍질을 10 내지 30분 동안 분쇄하는 것을 특징으로 하는, 피부 상태 개선용 건강기능식품 조성물.
  6. 제 2항에 있어서, 상기 단계 1)에서 난각막을 50 내지 70℃에서 10 내지 30분 동안 건조하는 것을 특징으로 하는, 피부 상태 개선용 건강기능식품 조성물.
  7. 제 2항에 있어서, 상기 단계 2)에서 건조한 난각막을 70 내지 90℃에서 25 내지 45분 동안 살균하는 것을 특징으로 하는, 피부 상태 개선용 건강기능식품 조성물.
  8. 제 1항에 있어서, 상기 피부 상태 개선은 자외선에 의한 피부 노화, 피부 손상, 피부 탄력 저하 또는 피부 주름 개선, 또는 자외선으로부터 피부 장벽 강화, 피부 보습, 항염증 또는 항산화인 것을 특징으로 하는, 피부 상태 개선용 건강기능식품 조성물.
  9. 제 8항에 있어서, 상기 자외선은 자외선 B(ultraviolet-B, UVB)인 것을 특징으로 하는, 피부 상태 개선용 건강기능식품 조성물.
  10. 제 1항에 있어서, 상기 조성물은 분말, 과립, 환, 정제, 캡슐, 캔디, 시럽 및 음료 중에서 선택된 1종 이상의 제형으로 제조되는 것을 특징으로 하는, 피부 상태 개선용 건강기능식품 조성물.
  11. 평균입자경이 20 내지 40 ㎛인 난각막 미세분말을 유효성분으로 함유하는, 피부 상태 개선용 화장료 조성물.
  12. 제 11항에 있어서, 상기 화장료 조성물은 용액, 외용연고, 크림, 폼, 영양화장수, 유연화장수, 팩, 유연수, 유액, 메이크업베이스, 에센스, 비누, 액체 세정료, 입욕제, 선 스크린크림, 선오일, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클렌징, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션, 패치 및 스프레이로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 제형인 것인, 피부 상태 개선용 화장료 조성물.
  13. 평균입자경이 20 내지 40 ㎛인 난각막 미세분말을 유효성분으로 함유하는, 피부 상태 개선용 피부외용제 조성물.
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