CN101780105B - 小牛血去蛋白提取物的滴眼液 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种滴眼液，其包含治疗有效量的小牛血去蛋白提取物、壳寡糖、和水。本发明的滴眼液稳定，并且可以用于治疗角膜和结膜病变以及干眼症。

Description

小牛血去蛋白提取物的滴眼液

技术领域：

本发明涉及一种含有小牛血去蛋白提取物的滴眼液。

背景技术：

小牛血去蛋白提取物是德国学者Jaeger教授研究发明的一种生物制剂，它是从新生六个月以内的健康且发育旺盛的小牛血液中，用膜过滤技术制成的分子量小于6000的去蛋白血液提取物。这种去蛋白质血液提取物中含有电解质、微量的必需元素以及核酸衍生物、氨基酸、低聚糖、低分子多肽、糖脂类和类脂代谢的中间产物等。小牛血去蛋白提取物能在细胞水平上促进细胞线粒体对葡萄糖和氧的摄取和利用(不依赖胰岛素)，使ATP合成增加，细胞能量提高，激活多种酶活力。在低血氧以及能量需增加等情况下，迅速改善组织细胞乏氧状态，改善微循环，激活组织细胞增生，促进损伤组织细胞的修复，是一种高效细胞营养素及促细胞生长因子。

小牛血去蛋白提取物不含抗原，耐受良好，安全无毒，作为一种促进细胞能量代谢的药物，临床应用效果良好。小牛血去蛋白提取物眼用液体制剂通过改善组织细胞对氧和葡萄糖的摄取及利用，改善局部血液循环和营养障碍，也能通过促进成纤维细胞和血管内皮细胞的游走和增殖等作用，临床上主要用于创伤性、炎症性和营养性角膜、结膜病变及干眼症等的治疗。目前，已上市的用于治疗此类疾病的新药产品有：重组牛碱性成纤维细胞生长因子，重组人表皮生长因子，均为基因工程产物，虽在理论上有促进表皮生长作用，但与实际体表生长中所需要的媒介相差甚远，尚不能和小牛血提取物相提并论。

小牛血去蛋白提取物的眼用膏剂已在国外上市。例如由瑞士生产、商品名为“素高捷疗”的产品，是以小牛血去蛋白提取物为活性成分的眼膏剂，其对眼组织的创伤修复有明显的疗效。小牛血去蛋白提取物眼用制剂特别是滴眼液尚未在国内用于临床。

尽管目前在国内有小牛血去蛋白提取物注射液在临床上使用，但是本发明人发现，这种加有吐温-80的注射液因为稳定性不理想而并不适合作为眼用制剂特别是作为滴眼液使用。因此，开发适合临床应用的小牛血去蛋白提取物的眼用制剂特别是滴眼液，仍是本领域技术人员急需解决的问题。

发明内容：

本发明的目的在于提供一种适合临床应用的含有小牛血去蛋白提取物的滴眼液。本发明人发现，使用壳寡糖可以有效地提高小牛血去蛋白提取物的稳定性，本发明人基于该发现而得以实现本发明。

为此，本发明提供了一种供眼用的滴眼液，其包含治疗有效量的小牛血去蛋白提取物、壳寡糖、和水。

在本发明滴眼液的一个实施方案中，按该滴眼液的总量计，其包含10～30％(v/v)的小牛血去蛋白提取物、0.01～1％(w/v)的壳寡糖、和水。

在本发明的一个实施方案中，所述壳寡糖的分子量小于5000，优选小于3000，优选小于2000，优选小于1500。

在本发明滴眼液的一个实施方案中，其还包含一种或多种选自以下的抑菌剂：苯乙醇、苯氧乙醇、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸丙酯、苯扎氯铵、三氯叔丁醇。在进一步的实施方案中，所述的抑菌剂是选自苯氧乙醇、对羟基苯甲酸乙酯、苯扎氯铵、三氯叔丁醇中的一种或多种。在再进一步的实施方案中，所述的抑菌剂是苯氧乙醇和对羟基苯甲酸乙酯的组合。在更进一步的实施方案中，所述的抑菌剂占该滴眼液总量的0.005～1％(w/v)。优选的，所述的抑菌剂占该滴眼液总量的0.01～0.5％(w/v)。优选的，所述的抑菌剂占该滴眼液总量的0.1～0.5％(w/v)。优选的，所述的抑菌剂占该滴眼液总量的0.01～0.1％(w/v)。优选的，所述的抑菌剂占该滴眼液总量的0.01、0.1、或0.5％(w/v)。

在本发明滴眼液的一个实施方案中，其还包含pH调节剂。在进一步的实施方案中，该滴眼液的pH值为6.0至9.0。在再在进一步的实施方案中，所述的pH调节剂选自磷酸盐、乙酸盐、硼酸盐，例如磷酸二氢钠与磷酸氢二钠组合、乙酸钠和乙酸组合、硼酸钠和硼酸组合等，本领域技术人员根据具体情况可以确定其用量。

在本发明滴眼液的一个实施方案中，其还包含渗透压调节剂。所述的渗透压调节剂的实例包括氯化钠、硼酸、硝酸钾、葡萄糖等，本领域技术人员根据具体情况可以确定其用量。

在本发明滴眼液的一个实施方案中，其还包含粘度调节剂，本领域技术人员通常还将这种粘度调节剂理解为增稠剂。本发明所述的粘度调节剂的实例包括聚乙烯吡咯烷酮、羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、聚乙烯醇等，本领域技术人员根据具体情况可以确定其用量。

下面对本发明的各个方面以及它们的益处作进一步的描述。

本发明的小牛血去蛋白提取物是通过从出生后不满6个月的小牛采血，血液经去除蛋白、病毒灭活、超滤截留等工艺获得。该小牛血去蛋白提取物应当满足《小牛血去蛋白提取物质量标准》(该标准是国家食品药品监督管理局所批复的标准，标准号为YBH05782007，批复时间为2007年12月29日)的要求。本提取物是小牛血经过去蛋白、浓缩、超滤等工艺精制而成，含有氨基酸、小分子肽等活性成分。含总固体量应不少于35mg/ml。

本发明的壳寡糖(Chitosan Oligosaccharide，β-1，4-寡聚-D-氨基葡萄糖，又称几丁寡糖、氨基寡糖素)，它是是指2～10个氨基葡萄糖以β-1，4-糖苷键连接而成的低聚糖，它通常是由甲壳素(虾、蟹壳等)脱乙酰化的产物壳聚糖的降解而获得。壳寡糖可以通过已知的方法获得，也可直接通过商业购买而获得，例如可以购自大连中科格莱克生物科技有限公司。可以根据需要使用不同分子量的壳寡糖，在本发明的一个实施方案中，所述壳寡糖的分子量小于5000。在本发明进一步的实施方案中，所述壳寡糖的分子量小于3000。在本发明再进一步的实施方案中，所述壳寡糖的分子量小于2000。在本发明更进一步的实施方案中，所述壳寡糖的分子量小于1500。在本发明滴眼液的一个实施方案中，其中含有0.01～1％(w/v)的壳寡糖。在本发明滴眼液的另一个实施方案中，其中含有0.01～0.5％(w/v)的壳寡糖。在本发明滴眼液的又一个实施方案中，其中含有0.05～0.2％(w/v)的壳寡糖。在本发明滴眼液的再一个实施方案中，其中含有0.05或者0.1％(w/v)的壳寡糖。

本发明的滴眼液为一种水性组合物，其中使用水作为该组合物的介质或溶媒或赋形剂或载体。尽管本发明的滴眼液没有具体指出所用的水占滴眼液总重量的百分数，或者在配制本发明滴眼液时没有具体指出所用水的量，但是，本领域技术人员清楚，作为滴眼液的介质或溶媒或赋形剂或载体，该水的量是以水加至滴眼液全量来计算的，这在液体制剂例如滴眼液、注射液配制过程中一般采用的计量方式。

在本发明的滴眼液中，所述的抑菌剂可以是一种或多种的任意组合。在一个实施方案中，所述的抑菌剂是苯氧乙醇和对羟基苯甲酸乙酯的组合；在进一步的实施方案中，所述的抑菌剂是苯氧乙醇和对羟基苯甲酸乙酯以任意比例的组合；在再进一步的实施方案中，所述的抑菌剂是苯氧乙醇和对羟基苯甲酸乙酯以重量比50∶1的比例组合。在一个实施方案中，所述的抑菌剂是苯氧乙醇和苯扎氯铵的组合；在进一步的实施方案中，所述的抑菌剂是苯氧乙醇和苯扎氯铵以任意比例的组合；在再进一步的实施方案中，所述的抑菌剂是苯氧乙醇和苯扎氯铵以重量比50∶1的比例组合。在一个实施方案中，所述的抑菌剂是三氯叔丁醇和苯扎氯铵的组合；在进一步的实施方案中，所述的抑菌剂是三氯叔丁醇和苯扎氯铵以任意比例的组合；在再进一步的实施方案中，所述的抑菌剂是三氯叔丁醇和苯扎氯铵以重量比10∶1的比例组合。在一个实施方案中，所述的抑菌剂是三氯叔丁醇和对羟基苯甲酸乙酯的组合；在进一步的实施方案中，所述的抑菌剂是三氯叔丁醇和对羟基苯甲酸乙酯以任意比例的组合；在再进一步的实施方案中，所述的抑菌剂是三氯叔丁醇和对羟基苯甲酸乙酯以重量比10∶1的比例组合。

本发明第二方面还可以提供这样的滴眼液，即，其包含本发明第一方面任一项所述的滴眼液，其中还可以含有药学可接受的赋形剂，例如可以将本发明第一方面的滴眼液在临床使用前用适当的溶媒稀释成本发明第二方面的即用型滴眼液，以获得某种临床适用的效果，例如本发明第一方面的滴眼液长期保存所适用环境pH与生理pH不一致时，可以在临用前向本发明第一方面的滴眼液中加入适量的pH调节剂，以便使获得的本发明第二方面的滴眼液的pH值调节到眼部生理可接受的pH环境下。

本发明的滴眼液可采用如下工艺制备：在无菌条件下称取处方量壳寡糖(以及，必要时，还可包括抑菌剂例如苯氧乙醇和羟苯乙酯的组合、pH调节剂、渗透压调节剂、粘度调节剂等)，用适量注射用水溶解，加入小牛血去蛋白提取物，搅拌均匀，加入注射用水至近全量。先用0.45μm微孔滤膜过滤，再补加注射用水至全量，最后用0.22μm微孔滤膜过滤除菌即得。根据本发明制得的小牛血去蛋白提取物的滴眼液，小牛血来源固定、质量稳定，生产工艺易于控制。制得的小牛血去蛋白提取物眼用液体制剂外观澄明、无菌、刺激性低、毒性低，可以为临床提供一种安全、有效的眼用制剂。

本发明提供的小牛血去蛋白提取物的滴眼液能通过增加线粒体的呼吸能力和高能磷酸的合成而促进细胞对氧的利用，并能维持人体内重要酶的生理功能，因此，它具有改善组织营养、刺激细胞再生和加速组织修复的作用，并能使过度增生的肉芽组织蜕变，胶原纤维重组，减少或避免瘢痕形成。小牛血去蛋白提取物的滴眼液表面活性好，眼部耐受性佳，它可在角结膜表面均匀分布，从而润滑角膜，减少眼睑对角膜表面的机械摩擦，减轻局部刺激症状。故对于角膜病尤其是角膜损伤，在常规治疗的基础上，联合应用小牛血去蛋白提取物的滴眼液，可促进角膜上皮的生长修复，加速损伤愈合。

本发明提供的小牛血去蛋白提取物的滴眼液，可以用于治疗角膜和结膜病变，亦可用于干眼症，给创伤性、炎症性和营养性角膜、结膜病变及干眼症等的治疗带来新的选择。

具体实施方式：

下面通过具体的实施例进一步说明本发明，但是，应当理解为，这些实施例仅仅是用于更详细具体地说明之用，而不应理解为用于以任何形式限制本发明。

本发明对试验中所使用到的材料以及试验方法进行一般性和/或具体的描述。虽然为实现本发明目的所使用的许多材料和操作方法是本领域公知的，但是本发明仍然在此作尽可能详细描述。本领域技术人员清楚，在下文中，如果未特别说明，本发明所用材料和操作方法是本领域公知的。

如未特别说明，本发明以下实施例中所用的小牛血去蛋白提取物中总固含量均不少于35mg/ml。

实施例1

处方：

小牛血去蛋白提取物                    200ml

苯氧乙醇                              5.0g

苯扎氯铵                              0.1g

壳寡糖                                0.5g

注射用水                              适量

全量                                  1000ml

制备工艺：

在无菌条件下称取处方量的苯氧乙醇、苯扎氯铵、壳寡糖用适量注射用水加热溶解，冷却至室温加入小牛血去蛋白提取物与注射用水至全量。先用0.45μm微孔滤膜过滤，之后用0.22μm微孔滤膜过滤除菌，灌装，即得滴眼液。本实施例中所用壳寡糖的分子量为5000以下。

实施例2

处方：

小牛血去蛋白提取物                           200ml

苯氧乙醇                                     5.0g

羟苯乙酯                                     0.1g

壳寡糖                                       0.5g

注射用水                                     适量

全量                                         1000ml

制备工艺：

在无菌条件下称取处方量的苯氧乙醇、羟苯乙酯、壳寡糖用适量注射用水加热溶解，冷却至室温加入小牛血去蛋白提取物与注射用水至全量。先用0.45μm微孔滤膜过滤，之后用0.22μm微孔滤膜过滤除菌，灌装，即得滴眼液。本实施例中所用壳寡糖的分子量为3000以下。

实施例3

处方：

小牛血去蛋白提取物                       200ml

三氯叔丁醇                               1.0g

苯扎氯铵                                 0.1g

壳寡糖                                   1.0g

注射用水                       适量

全量                           1000ml

制备工艺：

在无菌条件下称取处方量的三氯叔丁醇、苯扎氯铵、壳寡糖，用适量注射用水加热溶解，冷却至室温加入小牛血去蛋白提取物与注射用水至全量。先用0.45μm微孔滤膜过滤，之后用0.22μm微孔滤膜过滤除菌，灌装，即得滴眼液。本实施例中所用壳寡糖的分子量为1500以下。

实施例4

处方：

小牛血去蛋白提取物                            200ml

三氯叔丁醇                                    1.0g

羟苯乙酯                                      0.1g

壳寡糖                                        1.0g

注射用水                                      适量

全量                                          1000ml

制备工艺：

在无菌条件下称取处方量的三氯叔丁醇、羟苯乙酯、壳寡糖，用适量注射用水加热溶解，冷却至室温加入小牛血去蛋白提取物与注射用水至全量。先用0.45μm微孔滤膜过滤，之后用0.22μm微孔滤膜过滤除菌，灌装，即得滴眼液。本实施例中所用壳寡糖的分子量为1500以下。

对照实施例1

处方：

小牛血去蛋白提取物                       200ml

三氯叔丁醇                               1.0g

苯扎氯铵               0.1g

注射用水               适量

全量                   1000ml

制备工艺：除了不加壳寡糖外，其它操作同实施例3，灌装成滴眼液。

对照实施例2

处方：

小牛血去蛋白提取物                       200ml

三氯叔丁醇                               1.0g

羟苯乙酯                                 0.1g

注射用水                                 适量

全量                                     1000ml

制备工艺：除了不加壳寡糖外，其它操作同实施例4，灌装成滴眼液。

眼刺激性实验：

(一)、实验材料

受试药物：本发明实施例1的滴眼液，滴眼液的空白对照液，本公司提供。

动物：家兔，日本大耳白种，体重2.0～3.0kg，雌雄兼用，由锦州医学院实验动物中心提供。

(二)、实验方法

多次给药对兔眼刺激性的观察：取健康家兔6只，试验前24小时内对每只动物的双眼进行检查，经检查选无眼刺激症状、角膜缺陷、角膜损伤的家兔进行试验。雌雄兼用，每只眼睛于眼结膜囊内一侧给以小牛血去蛋白提取物眼用液体制剂，另一侧给以空白液作为对照，滴入量为0.1ml，每日给药4次，连续给药7日，使眼睑被动闭合约10秒。每日给药前及末次给药后6、24、48、72小时观察眼的局部反应情况。与对照眼进行比较，结果见表1。

表1多次给药眼刺激试验检查结果(X±SD)(n＝4)

从表中结果可见，给药组及对照组给药期及给药后6、24、48、72小时无异常，评分为0，按标准判断本品无刺激性。

(三)、结论：小牛血去蛋白提取物的滴眼液多次给药家兔无眼刺激作用

局部皮肤过敏实验

(一)、实验材料

受试药物：本发明实施例1的滴眼液，滴眼液的空白对照液，阳性致敏物(2，4-二硝基氯代苯)由本公司提供。

动物：白色豚鼠，体重250～300g，雌雄兼用，由锦州医学院实验动物中心提供。

(二)、实验方法

取白色豚鼠30只，随机分为3组，每组10只，雌雄兼用。给药前24h将豚鼠背部两侧脱毛。其中I组给予本发明滴眼液；II组给予空白对照液，III组给予阳性致敏物。

致敏接触：将眼用液体制剂0.2ml涂在豚鼠左侧脱毛区，持续6h。第7d和第14d，以同样方法重复一次。空白对照液、阳性致敏物组方法同眼用液体制剂组。

激发接触：于末次给予眼用液体制剂致敏后14d，将眼用液体制剂0.2ml涂于豚鼠背部右侧脱毛区，6h后去掉眼用液体制剂，即刻观察，然后于24、48、72h再次观察皮肤过敏反应情况，按《新药临床前安全性评价与实践》中制剂常规安全试验的评分标准进行评分，皮肤过敏反应评分标准见表2，致敏率分类见表3。空白对照液、阳性致敏物组方法同眼用液体制剂组。

表2皮肤过敏反应评分标准

表3致敏率分类

致敏率(％)	反应强度
		0～1020～3040～6070～8090～100	弱致敏性轻度致敏性中度致敏性高度致敏性极度致敏性

结果：皮肤过敏反应评分结果见表4。

表4小牛血去蛋白提取物滴眼液局部皮肤过敏试验结果

将小牛血去蛋白提取物滴眼液涂于豚鼠皮肤进行致敏接触和激发接触，无红斑和水肿出现，与空白对照液组无差别，阳性致敏物组致敏率为100％，表明本品无皮肤局部致敏性。

(三)、结论：

小牛血去蛋白提取物眼用液体制剂给药豚鼠无局部致敏性。

稳定性实施例：

(一)、实验材料

受试药物：本发明实施例3和4及对照实施例1和2(分别简称对照1和对照2)的滴眼液，本公司提供。

(二)、考察项目

pH值测定：参照中国药典2005年版二部附录VI H操作。pH在6.0-9.0之间。

可见异物：参照中国药典2005年版二部附录IX H可见异物检查法进行检查。

活力测定：取本品，采用瓦氏呼吸检压仪测定豚鼠肝匀浆的呼吸活力QO₂，呼吸活力应不小于4.0μl O₂/mg·h。

多肽含量：参照国家药品标准第十六册16-119福林酚测定法，分光光度法测定。

(三)、实验方法

取受试滴眼液，于温度25℃±2℃，相对湿度60％±5％的条件下放置，按照分别于0个月、3个月、6个月、9个月、12个月、16个月、18个月、20个月、22个月、24个月按考察项目进行检测，与0月样品比较。结果见表5、表6。

表5稳定性考察实验结果(1)

表6稳定性考察实验结果(2)

依据实验要求，活力测定要满足QO₂≥4。从结果可见，与不使用壳寡糖相比，滴眼液在18月后蛋白活力仍满足要求。说明壳寡糖可在一定程度上保护蛋白呼吸活力，使得制剂更加稳定。因此，通过稳定性实验结果证明，加入壳寡糖，使得本发明滴眼液的稳定性明显提高。

Claims (10)

1.一种滴眼液，其包含10～30％v/v的小牛血去蛋白提取物、0.01～1％w/v的壳寡糖、和水。

2.权利要求1所述的滴眼液，其中所述壳寡糖的分子量小于5000。

3.权利要求1所述的滴眼液，其中所述壳寡糖的分子量小于3000。

4.权利要求1所述的滴眼液，其中所述壳寡糖的分子量小于2000。

5.权利要求1所述的滴眼液，其中所述壳寡糖的分子量小于1500。

6.权利要求1至5任一项所述的滴眼液，其还包含一种或多种选自以下的抑菌剂：苯乙醇、苯氧乙醇、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸丙酯、苯扎氯铵、三氯叔丁醇。

7.权利要求6的滴眼液，其中所述的抑菌剂是选自苯氧乙醇、对羟基苯甲酸乙酯、苯扎氯铵、三氯叔丁醇中的一种或多种。

8.权利要求1至5任一项所述的滴眼液，其还包含pH调节剂。

9.权利要求1至5任一项所述的滴眼液，其还包含渗透压调节剂。

10.权利要求1至5任一项所述的滴眼液，其还包含粘度调节剂。