CN109640694A - 使用丝衍生蛋白质增强伤口愈合的方法 - Google Patents

Abstract

本申请描述了利用丝素衍生蛋白质(SDP)，其包括低分子量SDP片段，促进伤口愈合的方法。本申请还描述了用于治疗伤口的组合物，其中所述伤口包括角膜伤口、皮肤伤口、外科切口、烧伤和皮肤溃疡，并且所述组合物包括SDP片段，其包含低分子量SDP片段。

Description

使用丝衍生蛋白质增强伤口愈合的方法

优先权

本申请要求2016年4月8日提交的美国临时专利申请62/320177的优先权。上述在先申请在此通过引用全部纳入本文。

联邦资助申明

本发明获得了由National Science Foundation提供的项目编号为DGE-1144153和项目编号为1152561以及由US Army提供的项目编号为A151-061-0107的政府资助。美国政府对于本发明拥有一定的权益。

发明背景

角膜上皮创伤愈合依赖于针对角膜上皮再生和重塑的复杂且动态的修复过程，对于恰当恢复角膜高度整齐和有序的组织结构以及维持其视觉完整性和透明性从而确保眼睛的正常视力是至关重要的。损伤后，角膜缺损的再上皮化涉及适当粘附的基底上皮细胞片的集合迁移以覆盖受伤表面，随后上皮细胞增殖和分化增加，从而重新填充剥露区域并恢复非角质化的分层上皮。整个伤口愈合过程中关键上皮细胞表现的整合，其包括迁移、增殖、细胞支架重组和粘附，是由有序的级联信号事件驱动的，受到各种生长因子和细胞因子释放到损伤部位的刺激，并且对于有效可行地修复眼表面是必不可少的。然而，严重的创伤可使角膜的自然发生的再生性能不能恢复健康的上皮表面，因此不能重建其关键的屏障功能。因此，需要新的生物材料和疗法来促进伤口愈合的加快进程并减轻不适当角膜上皮再生的并发症。

发明概述

本文描述了使用丝衍生蛋白质(SDPs)增强伤口愈合的方法，其中所述SDPs包括低分子量SDPs。本文还描述了用于治疗伤口的组合物，所述伤口包括角膜伤口和皮肤伤口，或疤痕，其中所述组合物包括SDPs，含有低分子量SDPs。在一些实施方式中，本文提供的组合物能够有效促进伤口愈合。

本文描述了，在某些实施方式中，用于治疗伤口的方法，包括向有需要的受试者施用包含低分子量SDP的组合物。本文提供了，在一些实施方式中，用于治疗伤口或疤痕的方法。在一些实施方式中，本文提供的所述方法包括，将丝衍生蛋白质(SDP)片段的组合物施用于伤口中的活动物组织。在一些实施方式中，所述组合物是被局部施用于角膜伤口或皮肤伤口，覆盖伤口的外表面。在一些实施方式中，所述SDP片段，在丝氨酸、甘氨酸和丙氨酸的组合氨基酸含量方面，具有与天然丝素蛋白相比至少4％不同的一级氨基酸序列。在一些实施方式中，多个SDP片段终止于酰胺(-C(＝O)NH₂)基团。本文提供的组合物，在一些实施方式中，具有与天然丝素蛋白相比降低超过40％的丝氨酸含量，其中所述丝氨酸含量为至少约5％。在一些实施方式中，丝素蛋白的丝素蛋白重蛋白链和丝素蛋白轻蛋白链之间的半胱氨酸二硫键被减少或去除。本文提供的组合物在一些实施方式中具有增强的水溶液中的稳定性。在一些实施方式中，所述SDP片段衍生自蚕丝、蜘蛛丝或基因工程丝。在一些实施方式中，所述SDP片段是衍生自家蚕(Bombyx mori)。

本文提供的组合物，在某些实施方式中，具有约30kDa至60kDa的平均分子量。在一些实施方式中，至少75％的SDP片段具有小于约100kDa的分子量。在一些实施方式中，SDP片段具有小于约100kDa的分子量，以促进组织中的细胞迁移和增殖以闭合伤口。在一些实施方式中，至少90％的SDP片段具有小于约100kDa的分子量。在一些实施方式中，至少75％的SDP片段具有小于约80kDa的分子量。在一些实施方式中，至少90％的SDP片段具有小于约80kDa的分子量。在一些实施方式中，至少75％的SDP片段具有小于约60kDa的分子量。在一些实施方式中，SDP片段具有小于约60kDa的分子量，以促进组织中的细胞迁移和增殖以闭合伤口。在一些实施方式中，至少90％的SDP片段具有小于约60kDa的分子量，以促进组织中的细胞迁移和增殖以闭合伤口。在一些实施方式中，至少75％的SDP片段具有小于约50kDa的分子量。在一些实施方式中，至少90％的SDP片段具有小于约50kDa的分子量。在一些实施方式中，至少75％的SDP片段具有约30kDa至60kDa的分子量。在一些实施方式中，至少90％的SDP片段具有约30kDa至60kDa的分子量。在一些实施方式中，至少75％的SDP片段具有小于约30kDa的分子量。在一些实施方式中，至少90％的SDP片段具有小于约30kDa的分子量。在一些实施方式中，至少75％的SDP片段具有约10kDa至30kDa的分子量。在一些实施方式中，至少90％的SDP片段具有约10kDa至30kDa的分子量。在一些实施方式中，至少75％的SDP片段具有小于约10kDa的分子量。在一些实施方式中，至少90％的SDP片段具有小于约10kDa的分子量。在一些实施方式中，至少50％的SDP片段具有大于约60kDa的分子量。在一些情况下，SDP片段增加了伤口细胞中转化生长β因子的信号传递。

用本文提供的组合物治疗的伤口，在一些实施方式中，是眼部伤口、手术伤口、切口或擦伤。在某些情况下，所述伤口是由眼部疾病引起的眼部伤口，所述眼部疾病为例如角膜溃疡、角膜糜烂、角膜磨损、角膜变性、角膜穿孔、角膜疤痕、上皮缺损、角膜结膜炎、特发性葡萄膜炎、角膜移植、干眼症综合征、年龄相关性黄斑变性、糖尿病眼、睑缘炎、青光眼、高眼压、术后眼痛和炎症、后段新生血管、增生性玻璃体视网膜病变、巨细胞病毒性视网膜炎、眼内炎、脉络膜新生血管膜、血管闭塞性疾病、过敏性眼病、肿瘤、色素性视网膜炎、眼部感染、巩膜炎、眼睑下垂、瞳孔缩小、眼痛、瞳孔散大、神经痛、疤痕性眼表疾病、眼部感染、炎症性眼病、眼表疾病、角膜疾病、视网膜疾病、系统性疾病的眼部表现、遗传性眼部疾病、眼部肿瘤、眼压升高、疱疹病变感染，翼状胬肉或巩膜肿瘤，持续到眼表面的伤口，光折射角膜切开术后眼睛疼痛和炎症，热或化学角膜灼伤，巩膜创伤或圆锥角膜和结膜创伤。

本文提供了用于治疗伤口或疤痕的组合物。在一些实施方式中，所述组合物包含SDP片段，其包括，在丝氨酸、甘氨酸和丙氨酸的组合氨基酸含量方面，具有与天然丝素蛋白相比至少4％不同的一级氨基酸序列。在一些实施方式中，多个SDP片段终止于酰胺(-C(＝O)NH₂)基团。在一些实施方式中，本文提供的组合物包含SDP片段，其丝氨酸含量与天然丝素蛋白相比降低超过40％，其中丝氨酸含量为至少约5％。在一些实施方式中，至少75％的SDP片段具有小于约100kDa的分子量，以促进组织中的细胞迁移和增殖以闭合伤口。在一些实施方式中，本文提供的组合物包含药物载体。在一些实施方式中，所述药物载体是磷酸盐缓冲盐水、膜、纤维、泡沫、水凝胶、基质、三维支架、微粒、纳米颗粒、聚合物或垫状物。在一些实施方式中，所述SDP片段附着于基质。在一些实施方式中，所述基质是角膜移植物、伤口敷料、隐形镜片、组织、组织移植物或可降解材料。

本文提供了制备用于治疗伤口的组合物的方法。在一些实施方式中，所述方法包括分离SDP片段的第二组合物与SDP片段的第一组合物。在一些实施方式中，所述第二组合物中的SDP片段具有比在所述第一组合物中的SDP片段更低的平均分子量。在一些实施方式中，所述第一组合物中的SDP片段，在丝氨酸、甘氨酸和丙氨酸的组合氨基酸含量方面，具有与天然丝素蛋白相比至少4％不同的一级氨基酸序列。在一些实施方式中，所述第一组合物中的多个SDP片段终止于酰胺(-C(＝O)NH₂)基团。在一些实施方式中，所述第一组合物中的SDP片段具有与天然丝素蛋白相比降低大于40％的丝氨酸含量。在一些实施方式中，所述丝氨酸含量为至少约5％。在一些实施方式中，所述第二组合物中至少75％的SDP片段具有小于约100，kDa的分子量，以促进组织中的细胞迁移和增殖以闭合伤口。在一些实施方式中，所述第二组合物是通过离心作用与所述第一组合物分离。在一些实施方式中，所述第一组合物是通过包括在升高的压力下加热水性丝素蛋白溶液的方法制备。在一些实施方式中，所述水性丝素蛋白溶液包含浓度为至少8M的溴化锂。在一些实施方式中，所述水性丝素蛋白溶液在至少约10PSI的压力下被加热至少约20分钟到至少约105℃(221°F)，以提供所述第一组合物。在一些实施方式中，所述第一组合物包含小于8.5％的丝氨酸氨基酸残基，并且所述第一组合物，作为10％w/w水溶液，具有低于5cP的水性粘度。

在一些实施方式中，所述低分子量SDP小于100kDa。在一些实施方式中，所述低分子量SDP小于80kDa。在一些实施方式中，所述低分子量SDP是组合物中总SDP的10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或以上。在一些实施方式中，所述组合物不包含高分子量SDP。在一些实施方式中，所述低分子量SDP衍生自蚕丝、蜘蛛丝或基因工程丝。在一些实施方式中，所述低分子量SDP衍生自家蚕(Bombyx mori)。在一些实施方式中，所述伤口是眼部伤口、手术伤口、切口或擦伤。在一些实施方式中，所述伤口是角膜伤口。在一些实施方式中，受试者患有眼部病症。在一些实施方式中，所述眼部病症选自的群组包括角膜溃疡、角膜糜烂、角膜磨损、角膜变性、角膜穿孔、角膜疤痕、上皮缺损、角膜结膜炎、特发性葡萄膜炎、角膜移植、干眼综合征、年龄相关性黄斑变性(AMD，湿性或干性)、糖尿性眼病、睑缘炎、青光眼、高眼压、术后眼痛和炎症、后段新生血管(PSNV)、增生性玻璃体视网膜病变(PVR)、巨细胞病毒性视网膜炎(CMV)、眼内炎、脉络膜新生血管膜(CNVM)、血管闭塞性疾病、过敏性眼病、肿瘤、色素性视网膜炎、眼部感染、巩膜炎、眼睑下垂、瞳孔缩小、眼痛、瞳孔散大、神经痛、瘢痕性眼表疾病、眼部感染、炎症性眼病、眼表疾病、角膜疾病、视网膜疾病、系统性疾病的眼部表现、遗传性眼病、眼部肿瘤、眼压升高，疱疹感染、翼状胬肉(巩膜肿瘤)、持续到眼表面的伤口、光折射角膜切开术后眼睛疼痛和炎症、热或化学角膜灼伤、巩膜创伤、圆锥角膜和结膜创伤。在一些实施方式中，所述眼部病症由衰老、自身免疫病症、创伤、感染、退行性病症、内皮营养不良和/或手术引起。

在某些实施方式中，本文描述了包含低分子量SDP和药学上可接受的载体的组合物。在一些实施方式中，所述低分子量SDP小于100kDa。在一些实施方式中，所述低分子量SDP小于80kDa。在一些实施方式中，所述载体是磷酸盐缓冲盐水。在一些实施方式中，所述低分子量SDP是组合物中总SDP的10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％，80％，90％或以上。在一些实施方式中，所述组合物不包含高分子量SDP。在一些实施方式中，所述低分子量SDP衍生自蚕丝、蜘蛛丝或基因工程丝。在一些实施方式中，所述低分子量SDP衍生自家蚕(Bombyx mori)。在一些实施方式中，所述载体是膜、纤维、泡沫、水凝胶、基质、网丝、三维支架、微粒、纳米颗粒、聚合物或垫状物。在一些实施方式中，所述低分子量SDP附着于基质。在一些实施方式中，所述基质是角膜移植物。在一些实施方式中，所述基底是伤口敷料或隐形镜片。在一些实施方式中，所述基底是组织移植物。在一些实施方式中，所述基质在施用于受试者后降解。

本文提供了包含低分子量SDP片段或高分子量SDP片段或其组合的组合物。低分子量SDP片段可以增加细胞增殖、迁移和伤口闭合速率。在一些实施方式中，所述低分子量SDP片段用于治疗发炎的伤口。在一些实施方式中，在一些情况下使用所述低分子量SDP片段的组合物以加速伤口愈合是有用的。在一些实施例中，这些情况包括战争期间在战场上形成的创伤、在相对健康的人身上期望快速愈合以缓解疼痛的手术伤口或在高感染区域中形成的伤口。所述高分子量SDP片段可以增加细胞与基底膜的粘附或有助于基底膜形成。在一些情况下，将所述高分子量SDP片段的组合物用于慢性伤口或有溃烂的伤口或难以愈合的伤口，例如糖尿病性溃疡或皮肤烧伤是有用的。所述低分子量SDP片段可涉及伤口的闭合速率，而所述高分子量SDP片段可涉及伤口的闭合质量。在一些情况下，选定的所述低分子量SDP片段和所述高分子量SDP片段的组合物被用来获得优化的伤口愈合速率和质量。

附图说明

图1显示了用以描述生成SDP溶液和现有技术丝素蛋白(PASF)溶液的关键处理步骤的流程图。所述SDP生产过程包含额外的步骤(位于中部以斜体表示)以增强溶液的稳定性，这是PASF溶液生产过程中不会有的操作。

图2为对于稳定SDP溶液(试样1，左边，经由实施例1中描述的步骤所生产)以及PASF溶液(试样2，右边，在标准水解条件下所生产)的Lawrence Stability Test的结果图示。目测表明试样1是稳定的水性溶液，没有形成胶体；但试样2有胶体，因此不是稳定的水性溶液。

图3为胶体图片，显示水性丝素蛋白对SDP溶液的修饰介导的过程。该图显示SDP溶液(泳道3，高压灭菌)对比PASF溶液(泳道2，非高压灭菌)的分子量(MW)分布。蛋白质标准梯度(泳道1)和相关重量(泳道1左侧的数字)用来作为MW的参考。在泳道2中23-26kDa的显著MW条带是值得注意的并且在高压灭菌过程后完全不存在，表明丝素蛋白轻链的降解有助于提高SDP蛋白质材料的稳定性。在高压灭菌后，在丝素蛋白的MW范围内也观察到明显的移动(泳道3)，表明天然丝素蛋白向SDP材料组合物的修饰。

图4A-B显示的图像表明(A)SDP溶液材料没有凝胶，但(B)PASF溶液材料在超声2小时之内有凝胶。

图5说明了各种分子量范围分布的再生SDP溶液的十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析。将SDP水溶液分级分离成(B)高分子量和(C)低分子量SDP片段，并将它们的分子量分布与(E)未分级SDP(unfractionated SDP)溶液进行比较。(A,D)分子量蛋白质标记物。

图6描述可溶性SDP促进人角膜缘—上皮(HCLE)细胞体外迁移。总结性图表显示采用增加浓度不同MW的SDP处理的HCLE细胞的平均细胞迁移率(Unfr.SF＝未分级SDP；HighMW SF＝高分子量SDP；Low MW SF＝低分子量SDP)(***p<0.05对比对照组(Control)；#p<0.05对比Unfr.SF；αp<0.05对比High MW SF(1mg/ml)；βp<0.05对比High MW SF(2mg/ml)，对比High MW SF(4mg/ml)；N＝3,n＝100)。

图7描述SDP增强HCLE细胞体外生长和活力。在增加浓度的不同MW SDP溶液存在下培养12小时的细胞进行MTT活力测定的总结性图表。(***p<0.05对比Control；#p<0.05对比Unfr.SF；αp<0.05对比High MW SF(1mg/ml)；βp<0.05对比High MW SF(2mg/ml)；对比High MW SF(4mg/ml)；N＝3,n＝3)。

图8A和图8B描述低分子量SDP片段在体外增强了擦痕伤口闭合。图8A是来自伤口闭合测试的代表性图像，表明在低分子量SDP存在下细胞生长和向无细胞区域(白色轮廓)迁移显著加速。图8B是说明在擦痕伤口测试期间在指定时间点伤口闭合百分比的总结性条形图(***p<0.05对比Control；#p<0.05对比Unfr.SF；p<0.05对比High MW SF；N＝3,n＝3)。

图9为总结性图表，显示在暴露于高流体剪切力之后剩余粘附的HCLE细胞数量的显著增加，表明当用高分子量SDP处理细胞时细胞—基底粘附强度增加。(***p<0.05对比Control；#p<0.05对比Unfr.SF；p<0.05对比High MW SF；N＝3,n＝100)。

图10描述SDP通过促进粘着斑聚集来增强细胞粘附。在PBS处理载体(对照组)中以及在未分级SF(Unfractionated SF)(阳性对照组)，Low MW SF或High MW SF存在下培养的HCLE细胞的代表性图像。用未分级或HighMW SF处理的细胞显示沿细胞膜增加的纽蛋白(绿色)染色，表明细胞附着点(细胞核＝蓝色)。沿着细胞周边的纽蛋白聚集，相对于所有其他处理组，在高MW SF处理中更为明显。

图11A描述了代表性相位对比图像，其显示在高MW SDP存在下HCLE细胞扩散的增加。图11B表示在不同MW SDP溶液或PBS处理载体(Control)存在下稀疏培养(单个细胞)或融合(细胞片)的HCLE细胞的平均表面积的总结性图表(***p<0.05对比Control；#p<0.05对比Unfr.SF；对比High MW SF；N＝3,n＝100)。

图12说明在不同MW SDP溶液或PBS载体处理(对照组)存在下培养的HCLE细胞中TGFβ家族基因的相对表达的Q-PCR。(**p<0.05对比Control；#p<0.05对比Unfr.SF；p<0.05对比Low MW SF；N＝3，n＝100)。

图13A和图13B描述在TGFβ信号传导途径抑制剂存在下，低分子量丝对细胞迁移和体外擦痕伤口闭合的作用减弱。图13A是来自擦痕伤口愈合测定的代表性图像。图13B是说明在擦伤愈合测定期间在指定时间点伤口闭合百分比的总结条形图(***p<0.05对比Control；对比Low MW SF；#p<0.05对比Control(+SB431542)；N＝3,n＝3)。

发明详述

本文提供了衍生自SDP的用于治疗伤口的蛋白质组合物。在一些情况下，本文提供的SDP组合物可包括或衍生自美国专利公开号2016/0096878中描述的蛋白质组合物，所述专利申请的全部内容通过引用纳入到本说明书。本文提供的SDP组合物可在水溶液中具有增强的溶解性和稳定性。制备本文提供的SDP组合物的方法可包括修饰天然丝素蛋白的一级氨基酸序列，从而减少或去除丝素蛋白重蛋白链和丝素蛋白轻蛋白链之间的半胱氨酸二硫键。另外，与天然丝素蛋白相比，本文提供的SDP组合物可具有降低大于40％的丝氨酸含量，并且蛋白质的平均分子量小于约100kDa。在一些实施方式中，本文提供的SDP组合物用于治疗伤口，包括但不限于角膜伤口、皮肤伤口、手术切口、烧伤或皮肤溃疡(例如，糖尿病性皮肤溃疡)。

定义

下面的定义是用来对说明书和权利要求书提供清晰和一致的理解。本文所采用的术语具有下述的含义。本说明书中所采用的其他术语和短语具有本领域技术人员所能理解的普通含义。这种普通含义可通过参考技术辞典获得，例如Hawley’s Condensed ChemicalDictionary 14^th Edition,by R.J.Lewis,John Wiley&Sons,New York,N.Y.,2001。

本说明书中提及的“一种实施方式”("one embodiment")、“实施方式”("anembodiment")等表明所描述的实施方式可包含特定的方面、特征、结构、部分或特性，但并不是每个实施方式都必须包含这些特定的方面、特征、结构、部分或特点。此外，这些短语可能，但并不一定，适用于在本说明书其它部分提及的相同的实施方式。此外，当特定的方面、特征、结构、部分或特点是结合某种实施方式进行描述的，本领域技术人员应当能够知道将这些特定的方面、特征、结构、部分或特点应用到或关联到其它的实施方式，无论是否明确地表述出来。

单数形式的冠词“a”“an”和“the”包括复数含义，除非上下文存在明确的不同阐述。因此，例如，“化合物”可以是指包括多个这样的化合物，从而化合物X包括多个的化合物X。进一步值得注意的是，权利要求书可能被撰写为排除任何可选元素。因此，本声明旨在作为排除性术语使用的前置基础，例如“单独(solely)”、“仅仅(only)”等术语，与本文所描述的任何元素相关联和/或作为对权利要求所述要素的限定或者用作“负面”限制。

术语“和/或”("and/or")是指相关项目的任何一项、任何组合，或它们的全部。短语“一个或多个”("one or more")和“至少一个”("at least one")是本领域技术人员都能容易理解的，尤其是根据上下文理解。例如，这些短语可以是指一、二、三、四、五、六、十、一百，或大约比已经列举的下限高出10、100或1000倍的任何上限值。

术语“大约”(“about”)表示特定值可以具有±5％、±10％、±20％或±25％的变化。例如，“大约50”百分比在一些实施方式中可变化为45到55百分比。对于整数范围，术语“大约”可包含在所指范围各端相较于所列举的整数小或大一个或两个整数。除非文中另有说明，术语“大约”是用来包括对于成分、组合或实施例的功能来说等同的接近所列范围的数值。术语“大约”也能够用来对本段前述范围的端点进行调整。

本领域技术人员应当能够理解，包括表示成分含量、诸如分子量的性质、反应条件等等的任何数目都可以是近似的，并且在各种情下都能够采用术语“大约”进行修饰。取决与本领据技术人员通过本文所述方法所期望获得的性质，这些值是可以有变化的。还应当理解，这些值，由于测试中出现的标准偏差必然会导致其内在的可变化性。

本领域技术人员应当能够理解，出于任何各种目的，尤其是就提供文字描述来说，本文提供的任何范围还包括所有可能的子范围和这些子范围的组合，以及构成所述范围的单独值，尤其是整数值。所引述范围(例如重量百分比或碳基团)包括各个特定的数值、整数、小数或所述范围内的特性。应当易于理解，所列举的任何范围能够充分描述并能够使的相同的范围被分解为相等的二等份、三等分、四等分、五等分或十等分。作为非限制性例子，本文所述的每个范围都可容易地分解为下三分之一，中三分之一和上三分之一等等。本领域技术人员也应当能够理解，诸于“高至”、“至少”、“高于”、“低于”、“多于”、“或以上”或类似的术语包含所列举的数字，并且这种术语还指所述范围可随后分成上文述及的子范围。同样地，本文所列的任何比率也包含落在较宽比率之内的子比率。因此，自由基、取代基和范围的具体数值只是用来进行说明；其不排除自由基和取代基的其它指定数值或其它指定范围的数值。

本领域技术人员还应当能够容易理解，当单元被按照通常的方式例如在马库什群组中被组合起来时，本发明不仅包括所列单元组合构成的整体，还包括所述群组单独的每个单元以及所述基本群组的任何可能的亚群组。另外，对于所有的目的，本发明不仅包括基本群组，还包括基本群组去掉一个或多个单元的群组。可见，本发明可以包括明确排除所引述群组的任何一个或多个单元。因此，有关约束条件可以附加于任何公开的范畴或实施方式，其中任何一个或多个单元、种类或实施方式，可从所述范畴或实施方式中排除出来，例如，用于明示负面限定的场合。

术语“接触”("contacting")是指触及、接触，或者邻接或紧密地靠近，例如，包括在细胞或分子水平，比如在溶液或反应混合物中，在体外或体内，发生生理反应、化学反应或物理变化。

对于治疗应用，术语“有效量”是指有效地治疗疾病、失调和/或病症，或者造成所述效果的量。例如，有效量可以是有效地减缓所治疗的病症或症状的进展或程度的剂量。对治疗上有效量是在本领域技术人员能力范围内能够确定的。术语“有效量”是指包括本文所描述的化合物的量，或本文所描述的肽类的组合的量，比如，是用于针对受试者有效地治疗或预防疾病或失调，或者治疗疾病或失调的症状。因此，“有效量”通常是指能提供预期效果的量。

对于工艺和制备应用，“有效量”是指有效引起所指效果的量，例如在反应混合物中形成产物所需的量。对治疗上有效量是在本领域技术人员能力范围内能够方便确定的,尤其是根据本文所提供的详细描述。对治疗上有效量是在本领域技术人员能力范围内能够确定的。术语“有效量”是指包括本文所描述的化合物或用剂的量，或本文所描述的化合物的组合、或与本文所述过程的相关条件的量，比如，在反应混合物中有效形成所需产物的量。因此，“有效量”通常是指能提供预期效果的量。

如本文所用，术语“丝素蛋白”包括蚕丝蛋白和昆虫或蜘蛛的丝蛋白。参见例Lucaset al.,Adv.Protein Chem.13,107(1958)。可以使用任何类型的丝素蛋白。由家蚕(Bombyxmori)等蚕产生的丝素蛋白是最常见的，并代表了对地球友好的以及可再生资源。例如，可以通过从家蚕的茧中提取丝胶蛋白来获得丝素蛋白。有机蚕茧也是可以商购的。然而，存在许多不同的丝，包括蜘蛛丝(例如，从Nephila clavipes获得)，转基因丝，基因工程丝，例如来自细菌、酵母、哺乳动物细胞、转基因动物或转基因植物的丝(参见例如WO 97/08315；U.S.Patent No.5,245,012)及其可用的变体。

丝素蛋白的一种例子是源于Bombyx mori家蚕的蚕茧。所述丝素蛋白包括约350-400kda分子量的重链和约25kda分子量的轻链，其中所述重链和轻链通过二硫桥连接在一起。所述重链和轻链的初级序列在本领域是已知的。丝素蛋白链具有亲水的N和C末端结构域，以及疏水/亲水氨基酸序列的交替嵌段，从而允许与溶液中周围分子的空间和静电作用。在低浓度的稀释度(1％或以下)所述丝素蛋白分子已知呈现延长的蛋白链形式并且在溶液中不会立即聚结。所述丝素蛋白能够高度混溶于诸如HA、PEG、甘油和CMC的水合分子，并且被发现是高度生物相容的，在体内通过酶的作用自然结合或降解。天然的丝素蛋白质或现有技术丝素蛋白(PASF)是在本领域已知的，并且已被描述于，例如Daithankar et al.(Indian J.Biotechnol.2005,4,115-121)。

术语“丝衍生蛋白质(silk-derived protein)”(SDP)和“丝素衍生蛋白(fibroin-derived protein)”在本文中可以交换使用。这些物料由本文所述方法制备，涉及热、压力和重盐溶液的高浓度。因此“丝衍生的”和“丝素衍生的”指的是修饰丝素蛋白的工艺过程的原料，以获得具有本文所述结构、化学和物理性质的蛋白质组合物。

概述

在本文所述的研究中，已经成功表明SDP片段影响角膜上皮细胞表现和增强伤口愈合反应中涉及的生物学过程的能力取决于以溶液形式递送的丝蛋白的片段大小。这项工作证明，丝素蛋白作为生物材料的多功能性源于蛋白质的化学和分子属性，这些属性已知受到最终丝绸产品形成所需的各种加工方式和条件的严重影响。制备基于丝素蛋白的生物材料的最初步骤是通过脱胶工艺从生丝虫茧中提取丝纤维，该脱胶工艺依赖于强烈的变性剂，例如热量和pH值的变化，以排除丝胶蛋白涂层受到丝纤维的污染。纯化的纤维然后被强离液剂(包括浓酸、无机盐、氟化有机溶剂和离子液体)溶解，以破坏稳定蛋白质晶体结构的强氢键，并产生所谓的再生丝素蛋白溶液，从中可以制备出各种形式的材料。因此，通过在脱胶和溶解过程中将丝素蛋白暴露于苛刻的变性条件而破坏分子间氢键和/或范德华键，导致其肽分子结构的断裂和降解，最终影响再生的丝素蛋白溶液分子量分布，并导致其生物功能材料性能发生重大变化。

以前的工作主要集中在建立丝素蛋白结构中加工诱导断裂与生物材料性质变化之间的关系，所述性质为例如机械强度、降解速率、热稳定性和丝绸用作膜支架材料时的生物相容性。

当作为细胞培养物的补充物添加时，低分子量SDP刺激细胞迁移率和增殖的显著增加。相比之下，用高分子量SDP处理显著抑制细胞迁移，但未显示出对细胞增殖和活力的任何显著影响。另外，在用于评估伤口闭合的体外上皮磨损模型中，SDP刺激角膜上皮细胞表现的分子量依赖性差异导致伤口愈合反应增强。相较于采用高分子量丝处理的细胞，其由于细胞迁移和生长较慢而显示伤口闭合率显著较低，用低分子量SDP处理的HCLE细胞显示伤口闭合率显著加快并且完全占据伤口区域。这些结果暗示蛋白质分子量对SDP的生物功能特性的重要性及其通过刺激细胞生长和迁移来增强伤口愈合的能力。

角膜上皮伤口愈合需要整合关键的生物过程和上皮细胞表现，由有序的级联信号机制驱动。TGFβ细胞因子族及其受体，其包含在正常生理条件下在哺乳动物角膜上皮中表达但在损伤后显著上调的复杂多功能蛋白组，是角膜上皮维持和伤口愈合中涉及的各种活动的已知调节因素。研究表明，TGFβ信号传导的减少或抑制导致角膜伤口修复的延迟，从而使其成为在伤口愈合过程中调节细胞迁移和增殖的重要内在因素。在目前的研究中，用低分子量丝进行治疗引起TGFβ2同种型表达的急剧增加，与观察到的细胞迁移、增殖和伤口闭合的增强相关。此外，用高分子量丝进行处理导致TGFβ的所有同种型的表达显著下调，表明观察到的细胞迁移、增殖和擦痕伤口闭合的减少可归因于对TGFβ表达和信号的抑制作用。

在TGFβRI特异性抑制剂存在下，低分子量SDP对擦痕伤口闭合的影响部分减弱，该抑制剂用于在体外擦痕试验期间破坏HCLE细胞中的TGFβ信号传导途径。当在基础状态下抑制TGFβ信号传导时，细胞迁移和伤口闭合也减弱，尽管SDP的刺激作用降低，用低分子量丝处理的受抑制细胞的伤口闭合率仍然比用单独的抑制剂处理的对照细胞更快。这表明SDP通过激活TGFβ信号传导至少部分地刺激细胞迁移和生长，但是当TGFβ信号传导途径被抑制时，最有可能激活能够调节角膜上皮细胞表现和增加细胞迁移的多种信号传导途径。评估了SDP刺激角膜伤口愈合中涉及的基因表达的能力，并且片段大小对TGFβ表达的影响是显著的。低分子量丝可显著增加TGFβ2的表达，而高分子量丝则具有显著的下调作用。此外，在伤口闭合期间使用TGFβRI抑制剂显示低分子量SDP通过TGFβ介导的信号传导刺激细胞生长和迁移的增加。本文所述研究的结果进一步表征了SDP的伤口愈合效应，并揭示了其生物功能特性依赖于其蛋白质结构的化学和分子属性的程度。因此，这些结果证明了使用低分子量SDP来改善组织再生和伤口修复，包括眼部伤口、皮肤伤口和疤痕。

在示例性实施方式中，本文提供的包含SDP片段的组合物衍生自Bombyx mori家蚕丝素蛋白(GenBank Accession Nos.P05790)。在一些实施方式中，SDP片段衍生自与来自其他昆虫如蜘蛛的丝相关的其他示例性丝素蛋白，并且考虑包含在本文提供的组合物中。下述表1示例性列出产丝种类和丝蛋白：

表1：产丝种类和丝蛋白的示例性列表(取自Bini et al.(2003),J.Mol.Biol.335(1):27-40)。

A.蚕

注：Accession(登记号),Species(种类),Producing gland(分泌腺),Protein(蛋白),Salivary(唾液的),Fibroin(丝素蛋白),Heavy-chain fibroin(重链丝素蛋白),N-terminal(N端),C-terminal(C端),Fibroin heavy chain precursor(丝素蛋白重链前体),Fibroin light chain precursor(丝素蛋白轻链前体)。

B.蜘蛛

注：Accession(登记号),Species(种类),Producing gland(分泌腺),Protein(蛋白),Major ampullate(大壶状),Minor ampullate(小壶状),Ampullate(壶状),Largerampule-shaped(大安瓿形),Flagelliform(鞭状),Spidroin(蜘蛛丝蛋白),Dragline silkfibronin(拉索丝蛋白),Fibroin(丝素蛋白),MiSp1silk protein(MiSp1丝蛋白),N-terminal(N端),C-terminal(C端)。

在一些实例中，丝素蛋白从天然来源分离或在体内由基因工程细胞产生。

SDP组合物的制备

与天然丝素蛋白在水溶液中相比，本文所述的SDP组合物可具有增强的稳定性。本文提供的SDP组合物(本文中称SDP)实现的增强的稳定性，与天然/PASF蛋白(本文中称PASF)相比，使得所述材料能够显著更长地维持在溶液中。本文提供的SDP材料的增强的稳定性还允许制备高浓度的SDP溶液而没有聚集、沉淀或凝胶化。在诸如滴眼剂或需要蛋白质可溶于溶液的商业应用中，增强的稳定性可通过减少蛋白质聚集而提供适当长的保质期和提高产品质量。溶液中蛋白质的潜在聚集会对产品在特定应用中的期望性能产生负面影响。将SDP浓缩至溶液中较高组成(超过50％w/v或>500mg/mL)的能力对于贮存可以原样使用或稀释成任何量使用的有用工作溶液是非常有利的。此类使用的例子包括将SDP片段作为成分用作眼科制剂或施于伤口的外用制剂，例如，如本文所述，作为蛋白质补充剂或添加剂。

如本文所述，通过降低分子对聚集的敏感性，将天然丝素蛋白的一级氨基酸序列转化为SDP材料增强了其在水溶液中的稳定性。聚集最终导致凝胶形成。在天然丝素蛋白的转化中，丝氨酸和半胱氨酸氨基酸都在高温和脱水条件下裂解。同样，Patchornik et al.(J.Am.Chem.Soc.1964,86,1206)证明脱氢丙氨酸(DHA)中间体由溶液中的丝氨酸和半胱氨酸形成。氨基酸的降解进一步借助于强脱水溶剂系统，例如本文所述的50-55％w/v LiBr溶液，其中发生氢化物转移以诱导水的去除。降解反应可以在氢氧根离子(例如，pH7.5至pH11)的存在下进行，这进一步驱动DHA中间体的裂解。该裂解形成酰胺、丙酮酰肽和LiBr。式1中概述了一种用于丝氨酸氨基酸的可行化学机理，该式也适用于半胱氨酸氨基酸。将PASF蛋白的丝氨酸和半胱氨酸氨基酸化学改变为具有进一步水解切割的DHA中间体使得SDP产物的溶液稳定性增强。

式1：示意性详细描述了丝氨酸和半胱氨酸降解基于的化学反应。通过在脱水高盐浓度环境下由氢化物转移反应形成的DHA中间体的产生来促进降解。然后通过碱性溶剂环境内的SN2反应完成DHA的降解。

上面讨论的这种裂解反应可以显著影响所得肽的大分子性质，这导致水溶液中的稳定的SDP材料。如Greving et al.(Biomacromolecules 2012,13(3):676-682)所述，丝素蛋白的初始蛋白质聚集被认为是由天然丝素蛋白重链和轻链在半胱氨酸氨基酸上的相互作用引发的。丝素蛋白轻蛋白链和重蛋白链内的半胱氨酸氨基酸通过二硫键相互作用。这些二硫键参与丝素蛋白聚集和凝胶网络絮凝。没有天然的丝素蛋白轻链存在，蛋白质明显不易聚集。因此，本文所述的方法可通过降低半胱氨酸含量从而降低或消除二硫键形成能力来有效降低天然丝素蛋白轻链形成二硫键的能力。通过这种机理，本文所述的转化过程通过降低或消除形成半胱氨酸衍生的聚集的能力在功能上稳定所得的SDP在溶液中。

除了聚集诱导二硫键外，丝素蛋白进一步聚集成絮凝结构的敏感性也受到Mayenet al.(Biophysical Chemistry 2015,197:10-17)描述的蛋白质氨基酸化学的驱动。丝素蛋白丝氨酸，丙氨酸和甘氨酸氨基酸序列的分子模型显示，丝氨酸的存在通过更大的在相邻丝素蛋白链部分之间产生氢键的倾向增强了初始蛋白质与蛋白质的相互作用。模型表明，丝氨酸减少和丙氨酸和甘氨酸增加降低了蛋白质聚集的初始倾向。分子模拟观察表明，通过改变丝素蛋白的天然氨基酸化学，可以使得材料具有在水溶液中更高的稳定性。

实现增强稳定性的一种策略是从蛋白质中消除带电的官能团，比如羟基。由于羟基的相对高的电负性，该化学反应可以驱动与可用氢原子的氢键和与带正电荷的氨基酸基团的非特异性电荷相互作用。几乎12％的天然丝素蛋白含量是丝氨酸，其带有羟基官能团。因此，通过降低促进氢键的羟基的可用性，溶液中的总蛋白质稳定性增强。本文所述的方法有效地降低了丝氨酸含量并增加了相对丙氨酸和甘氨酸含量，这消除了可用于形成氢键的可用羟基的数量。本文所述的过程在长时间段内在功能上稳定了所得的SDP。在一些实施方式中，溶液中的SDP稳定至少3个月，至少4个月，至少5个月，至少6个月，至少7个月，至少8个月，至少9个月，至少10个月，至少11个月，至少1年，至少1.5年，至少2年，至少3年或更长时间。

除了半胱氨酸和丝氨酸部分的减少之外，溶剂电荷相互作用对于稳定蛋白质溶液是重要的。在最初的蛋白质絮凝之后，认为凝胶化过程继续推动天然丝素蛋白重链之间的更紧密的关联，这导致重链的疏水性嵌段之间的分子内和分子间β-折叠形成。一旦发生显著的β-折叠形成，丝素蛋白溶液就转变为凝胶。随着溶液转变为凝胶，并且丝素蛋白变得不可溶并且不再可用作基于溶液的产品。为了防止凝胶化，可以将SDP溶液的pH升高至高碱度，例如高于pH 7.5，以增强稳定性。结果，增高的pH产生额外的游离羟基，在溶液中的SDP分子周围形成价盾。形成的化合物屏蔽用于产生ζ电位，其通过减少源自氢键或非特异性带电和/或疏水相互作用的蛋白质─蛋白质相互作用来稳定蛋白质。丝素蛋白转化过程通过这种和其它机理在功能上稳定溶液中处理的SDP。

在一些实施方式中，SDP片段是通过以下过程制备：

1.通过去除蛹材料并在温水中预漂洗来制备丝茧。

2.通过在碱性pH以及高水温(通常95℃或以上)的水中洗涤茧，从胶状蛋白丝胶蛋白中提取天然丝素蛋白纤维。

3.将提取的丝素蛋白纤维干燥，然后使用能够中和β-折叠之间氢键的溶剂系统进行溶解；20％w/v丝素蛋白的54％LiBr水溶液对该中和步骤是有效的。

4.将LiBr溶液中溶解的丝素蛋白在高压釜环境(～121℃[～250°F]，在～15-17PSI压力下，在温度下处理约30分钟)进行处理。

5.然后对经热处理的丝素蛋白和LiBr溶液进行透析，以从溶液中除去锂和溴离子。在该过程的这个时间点，所述材料已经被化学转化为SDP。

6.然后经过透析的SDP被过滤，以除去任何未溶解的聚集体和污染的生物负载。

所述SDP溶液是通过与现有丝素蛋白溶液生产工艺显著不同的方法进行生产，如图1示意描述。值得注意的是，丝素蛋白在溶液中与LiBr结合时的高压灭菌引发化学品转化以产生稳定的SDP材料。将丝素蛋白溶解在LiBr溶液中，中和溶解的天然丝素蛋白的氢键和静电相互作用。这使得在溶液中所述蛋白质没有特定的二级结构。结果，丝素蛋白链内的共价键水解所需的热力学能量达到其启动水解切割的最低能量需求。

在一种实施方式中，在15-17PSI高压釜条件下将温度设定为121℃达30分钟。然而，在各种实施例中，可以修改处理条件以使SDP材料稳定到不同的程度。在其他实施方式中，在所述方法中使用了其它的蛋白质增溶剂，包括其他或另外的诸如氯化钙的卤化物盐，硫氰酸钠，诸如尿素、盐酸胍和1,1,1,3,3,3-六氟异丙醇的有机试剂，诸如硝酸钙和1-丁基-3-甲基咪唑氯化物或其组合的其它强离子液体溶液添加剂。

SDP组合物

本文提供的SDP组合物衍生自丝纤蛋白并且在水溶液中具有增强的溶解性和稳定性。在一些实施方式中，本文提供的SDP组合物通过包括在升高的压力下加热水性丝素蛋白溶液的方法制备。水性丝素蛋白溶液包含浓度至少为8M的溴化锂。将水性丝素蛋白溶液在至少约10PSI的压力下加热到至少约105℃(221°F)达至少约20分钟，以提供蛋白质组合物。蛋白质组合物的多肽包含小于8.5％的丝氨酸氨基酸残基，并且蛋白质组合物具有小于5cP的水性粘度，作为10％w/w水溶液，。

在一些情况下，本文提供的SDP组合物通过包括在升高的压力下加热水性丝素蛋白溶液的方法制备，其中水性丝素蛋白溶液包含浓度为9-10M的溴化锂，并且其中水性丝素蛋白溶液是在约15PSI至约20PSI的压力下加热至约115℃(239°F)至约125℃(257°F)的温度达至少约20分钟；提供蛋白质组合物。所述蛋白质组合物可包含小于6.5％的丝氨酸氨基酸残基，并且所述蛋白质组合物可具有小于10cP的水性粘度，作为15％w/w水溶液。

在一些实施方式中，本文提供的SDP组合物可在水溶液中具有增强的稳定性，其中：SDP组合物的一级氨基酸序列，在丝氨酸、甘氨酸和丙氨酸含量的组合差别(SDP对比PASF)方面，与天然丝素蛋白的差异为至少4％；丝素蛋白重蛋白链和丝蛋白轻蛋白链之间的半胱氨酸二硫键被减少或消除；与天然丝素蛋白相比，所述组合物的丝氨酸含量降低了25％以上。所述SDP组合物的平均分子量可小于约100kDa且大于约25kDa。

在一些实施方式中，本文提供的SDP组合物在水溶液中具有增强的稳定性，其中：在丝氨酸的组合差异方面，SDP组合物的一级氨基酸序列与天然丝素蛋白的差异至少为6％，甘氨酸和丙氨酸含量；丝素蛋白重蛋白链和丝蛋白轻蛋白链之间的半胱氨酸二硫键被减少或消除；与天然丝素蛋白相比，所述组合物的丝氨酸含量降低了40％以上。在一些实施方式中，所述SDP组合物的平均分子量小于约96kDa且大于约25kDa。

在一些实施方案中，本文提供的SDP组合物在水溶液中具有增强的稳定性，其中：SDP组合物的一级氨基酸序列是从天然丝素蛋白修饰的；丝素蛋白重蛋白链和丝蛋白轻蛋白链之间的半胱氨酸二硫键被减少或消除；SDP组合物的平均分子量小于约100kDa且大于约25kDa；在超声波处理5秒后，所述SDP组合物在550nm下的光学吸光度保持小于0.25达至少2小时。例如，在10Hz和20％振幅下超声处理5秒后，5％w/w的蛋白质组合物溶液可以在550nm保持小于0.1的光学吸光度，这是本文所述的用于超声波处理的标准条件。

在一些实施方式中，本文提供的SDP组合物在水溶液中具有增强的稳定性，其中：SDP组合物的一级氨基酸序列从天然丝素蛋白修饰，在丝氨酸，甘氨酸和丙氨酸含量的组合差异方面，它们与天然丝素蛋白相差至少5％；丝素蛋白重蛋白链和丝蛋白轻蛋白链之间的半胱氨酸二硫键被减少或消除；SDP组合物的平均分子量小于约96kDa且大于约25kDa；在超声波处理5秒后，SDP组合物在550nm处的光学吸光度保持小于0.2达至少2小时。

在一些实施方式中，本文提供的SDP组合物被分离和/或纯化为干粉或薄膜，例如通过透析和/或过滤的方式。或者，在一些实施方式中，本文提供的SDP组合物作为稳定的水溶液被分离和/或纯化。在一些实施方式中，所述SDP组合物可以被修饰以用作治疗制剂，例如眼科制剂或用于皮肤伤口或疤痕的局部制剂。

在各种实施方式中，本文提供的所述SDP组合物中存在的SDP的氨基酸组成可以与天然丝素蛋白的氨基酸组成相差至少4％、至少4.5％、至少5％、至少5.5％或至少6％，就组合的丝氨酸、甘氨酸和丙氨酸的含量来说。

在一些实施方式中，本文提供的SDP组合物可具有降低大于25％、大于30％、大于35％、大于40％或大于45％的丝氨酸含量，与天然丝素蛋白的丝氨酸含量相比。

在一些实施方式中，本文提供的SDP组合物的平均分子量小于约100kDa、小于约98kDa、小于约96kDa、小于约95kDa、小于约90kDa、小于约85kDa、小于约80kDa、小于约75kDa或小于约70kDa。在各种实施方式中，SDP组合物的平均分子量大于约30kDa、大于约35kDa、大于约40kDa、大于约50kDa、大于约60kDa或大于约70kDa。因此，在一些实施方式中，本文提供的SDP组合物的(重均)平均分子量为约30kDa至约100kDa、约30kDa至约96kDa、约30kDa至约90kDa、约35kDa至约80kDa、约35kDa至约70kDa、约40kDa至约60kDa。在各种实施方式中，SDP组合物的平均分子量为约60kDa至约80kDa、约50kDa至约70kDa、约40kDa至约60kDa、约30kDa至约50kDa、约35kDa至约50kDa、约35kDa至45kDa或约40kDa至约43kDa。

在各种实施方式中，本文提供的SDP组合物，作为10％w/w水溶液，可具有小于4cP的水性粘度。在一些情况下，本文提供的SDP组合物，作为24％w/w水溶液，可具有小于10cP的水性粘度。

在一些实施方式中，本文提供的SDP组合物可在40％w/w下溶于水，并且没有可以通过目测观察到的任何沉淀。

在某些情况下，本文提供的某些SDP组合物在高达10％w/w的浓度下在蛋白质组合物的水溶液超声处理时不凝胶。在一些情况下，本文提供的某些SDP组合物在超声处理蛋白质组合物的水溶液时不会发生凝胶的浓度高达15％w/w、高达20％w/w、高达25％w/w、高达至30％w/w、高达35％w/w或高达40％w/w。

在一些实施方式中，本文提供的SDP组合物包含少于8％的丝氨酸氨基酸残基。在一些情况下，本文提供的SDP组合物包含少于7.5％的丝氨酸氨基酸残基，少于7％的丝氨酸氨基酸残基，少于6.5％的丝氨酸氨基酸残基，或少于6％的丝氨酸氨基酸残基。

在一些实施方式中，相对于蛋白质组合物的总氨基酸含量，本文提供的SDP组合物包含大于46.5％的甘氨酸氨基酸。在一些情况下，本文提供的SDP组合物包含大于47％的甘氨酸氨基酸，大于47.5％的甘氨酸氨基酸，或大于48％的甘氨酸氨基酸。

在一些实施方式中，相对于蛋白质组合物的总氨基酸含量，本文提供的SDP组合物包含大于30％的丙氨酸氨基酸。在一些情况下，本文提供的SDP组合物包含大于30.5％的丙氨酸，大于31％的丙氨酸，或大于31.5％的丙氨酸。

在一些实施方式中，本文提供的SDP组合物在干燥成薄膜后可完全再溶解。在各种实施方式中，本文提供的SDP组合物可以在水溶液中缺乏β-折叠蛋白质结构。在一些情况下，本文提供的SDP组合物在超声处理至少5秒后可以在550nm处保持水溶液中的光吸收小于0.25。

在一些实施方式中，本文提供的SDP组合物与水组合。在一些情况下，本文提供的SDP组合物可以在10％w/w的浓度完全溶解于水中，或甚至在更高的浓度，例如15％w/w，20％w/w，25％w/w，30％w/w，35％w/w，或40％w/w。在一些实施方式中，本文提供的SDP组合物可通过例如透析、过滤或其组合方法进行分离和纯化。

在各种实施方式中，本文提供的SDP组合物可以增强包含蛋白质组合物和眼科制剂组分的水溶液的扩散，例如，与不包含蛋白质组合物的相应组合物的扩散相比。这种增强的扩散可导致水溶液的表面积增加大于两倍或大于三倍。

在一些实施方式中，本文提供的SDP组合物在浓度高达20％w/v、高达30％w/v或高达40％w/v时不形成凝胶。在一些情况下，本文提供的SDP组合物可以维持在溶液中达9.8cP的粘度。

在一些实施方式中，本文提供的SDP组合物具有甘氨酸-丙氨酸-甘氨酸-丙氨酸(GAGA)片段的氨基酸，其包括所述SDP组合物的的氨基酸的至少大约47.5％。在一些情况下，本文提供的SDP组合物具有GAGA片段的氨基酸，其包括所述蛋白组合物的氨基酸的至少大约48％，至少大约48.5％，至少大约49％，至少大约49.5％，至少大约50％。

在一些实施方式中，本文提供的SDP组合物具有甘氨酸-丙氨酸(GA)片段的氨基酸，其包括所述SDP组合物的氨基酸的至少大约59％。在一些情况下，本文提供的SDP组合物具有GA片段的氨基酸，其包括所述SDP组合物的氨基酸的至少大约59.5％，至少大约60％，至少大约60.5％，至少大约61％，或者至少大约61.5％。

在一些情况下，相对于丝氨酸、甘氨酸和丙氨酸含量的组合差异，本文提供的SDP组合物可具有与天然丝素蛋白至少6％不同的一级氨基酸序列；平均分子量小于约100kDa；并且在超声波处理5秒后，在550nm处保持小于0.25的光学吸光度达至少2小时。因此，例如，本文提供的特定SDP组合物可以在水溶液中具有增强的稳定性，其中：相对于丝氨酸、甘氨酸和丙氨酸含量的组合差异，SDP组合物的一级氨基酸序列与天然丝素蛋白相比的差异至少为6％。丝素蛋白重蛋白链和丝素蛋白轻蛋白链之间的半胱氨酸二硫键被减少或消除；与天然丝素蛋白相比，所述组合物的丝氨酸含量降低了40％以上；并且其中SDP组合物的平均分子量小于约96kDa。

在一些情况下，本文提供的SDP组合物可在水溶液中具有增强的稳定性，其中：SDP组合物的一级氨基酸序列由天然丝素蛋白修饰；丝素蛋白重蛋白链和丝素蛋白轻蛋白链之间的半胱氨酸二硫键被减少或消除；平均分子量小于约100kDa；并且在超声波处理5秒后，在550nm处保持小于0.25的光学吸光度达至少2小时。在一种实施方式中，SDP组合物的一级氨基酸序列，其是从天然丝素蛋白修饰的，与天然丝素蛋白相比在丝氨酸、甘氨酸和丙氨酸含量的组合差异方面相差至少5％。SDP组合物的平均分子量小于约96kDa；在超声波处理5秒后，SDP组合物在550nm处的光学吸光度保持小于0.2达至少2小时。

因此，在一种实施方式中，本文提供的SDP组合物在水溶液中具有增强的稳定性，其中：SDP组合物的一级氨基酸序列是从天然丝素蛋白修饰的，使得它们在丝氨酸、甘氨酸和丙氨酸含量的组合差异方面与天然丝素蛋白不同至少5％；丝素蛋白重蛋白链和丝素蛋白轻蛋白链之间的半胱氨酸二硫键被减少或消除；SDP组合物的平均分子量小于约96kDa；在超声波处理5秒后，SDP组合物在550nm处的光学吸光度保持小于0.2达至少2小时。

在一些实施方式中，本文提供了一种SDP组合物，其制备方法包括：在升高的压力下加热水性丝素蛋白溶液，其中水性丝素蛋白溶液包含浓度为至少8M的溴化锂，并且其中水性丝素蛋白溶液是在至少约10PSI的压力下加热到至少约105℃(221°F)达至少约20分钟；提供蛋白质组合物，其包含小于8.5％的丝氨酸氨基酸残基，并且蛋白质组合物作为10％w/w水溶液具有小于5cP的水性粘度。因此，本文还提供了制备SDP组合物的方法。本文提供的SDP组合物的制备方法可包括本文所述的一个或多个处理步骤。

在一些情况下，本文提供的制备方法可以使用浓度为约8.5M至约11M的溴化锂。在一些实施方式中，所述溴化锂的浓度为约9M至约10M，或约9.5M至约10M。

在一些实施方式中，将含有溴化锂的含水丝素蛋白溶液加热到至少约107℃(225°F)，至少约110℃(230°F)，至少约113℃(235°F)，至少约115℃(239°F)，或至少约120℃(248°F)。

在一些实施方式中，含有溴化锂的含水丝素蛋白溶液被加热于至少约12PSI、至少约14PSI、至少约15PSI、或至少约16PSI、高达约18PSI，或高达约20PSI的压力。

在一些实施方式中，将含有溴化锂的含水丝素蛋白溶液加热至少约20分钟、至少约30分钟、至少约45分钟、或至少约1小时，直至几十(例如12-24)小时。

在一些实施方式中，蛋白质组合物作为10％w/w水溶液具有小于4cP的水性粘度。在各种实施方式中，蛋白质组合物作为24％w/w水溶液具有小于10cP的水性粘度。

在一些实施方式中，将蛋白质组合物以40％w/w溶解于水中而没有可观察到的沉淀。

在一些实施方式中，丝素蛋白已与丝胶蛋白分离。

在一些实施方式中，溴化锂已经被从蛋白质组合物中除去以提供纯化的蛋白质组合物。在各种实施方式中，蛋白质组合物已经分离和纯化，例如，通过透析、过滤或其组合的方法。

在各种实施方式中，蛋白质组合物在超声处理组合物的水溶液时不会凝胶，其浓度为高达10％w/w，高达15％w/w，高达20％w/w，高达25％w/w，高达30％w/w，高达35％w/w，或高达40％w/w。

在另外的实施方式中，蛋白质组合物具有如上所述的性质，以及如上所述的关于丝氨酸、甘氨酸和丙氨酸含量的氨基酸组成。

在各种实施方式中，蛋白质组合物在干燥后作为薄膜重新溶解。蛋白质组合物在溶液中可以缺乏β-折叠蛋白质结构。在超声处理至少5秒后，蛋白质组合物可以在550nm处保持溶液中的光吸收小于0.25

在一种实施方式中，本发明提供了一种蛋白质组合物，其制备方法包括：在升高的压力下加热水性丝素蛋白溶液的方法制备的，其中所述水性丝素蛋白溶液包含浓度为9-10M的溴化锂，并且其中所述水性丝素蛋白在约15PSI至约20PSI的压力下被加热至约115℃(239°F)至约125℃(257°F)的温度达至少约30分钟；提供蛋白质组合物，其中蛋白质组合物包含小于6.5％的丝氨酸氨基酸残基，并且蛋白质组合物作为15％w/w水溶液具有小于10cP的水性粘度。

在一些实施方式中，本文提供了与天然丝素蛋白在化学上不同的SDP组合物。SDP在水溶液中具有增强的稳定性。在一些实施方式中，SDP可用例如包括本文所述蛋白质组合物的眼科成分的制备，例如蛋白质组合物水溶液。所述溶液可包括约0.01％至约92％w/v的SDP。在一些实施方式中，所述溶液为约8％至约99.9％w/v的水。

在一些实施方式中，提供了诱导丝素蛋白的水解、氨基酸降解或其组合的方法，使得从现有技术生产的丝素蛋白的蛋白质平均分子量约100-200kDa降低到本文所述SDP材料的约30-90kDa或约30-50kDa。在一些实施方式中，所得到的多肽是具有本文所述范围平均分子量的各种分子量的随机分类的肽。另外，在一些实施方式中，通过标准测定方法将半胱氨酸含量降低至不可检测的水平来改变氨基酸化学。例如，在一些实施方式中，丝氨酸含量从天然丝素蛋白中发现的水平降低超过50％，这可以导致总丙氨酸和甘氨酸含量增加5％(相对氨基酸含量)，如标准测定程序所确定的。所述方法可提供蛋白质组合物，其中在加工后以及使用标准十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)方法运行样品时，丝素蛋白轻蛋白链不可检测。此外，所得SDP材料在后处理中形成最低至没有β-折叠蛋白质二级结构，而使用现有技术方法产生的丝素蛋白溶液形成显著量的β-折叠二级结构。在一种实施方式中，通过在40-60％w/v溴化锂(LiBr)溶液存在下、在高压釜或高压釜状条件下(即，约120℃和14-18PSI)处理丝素蛋白纤维来制备SDP材料。

在一些实施方式中，提供了眼科组合物用于治疗人或哺乳动物的干眼症。在一些实施方式中，本文提供的组合物是水溶液，其包含有效治疗干眼症的SDP量。例如，所述水溶液可包含约0.01％重量至约80％重量的SDP。在其他实施方式中，所述水溶液包含约0.1％重量至约10％重量，或约0.5％重量至约2％重量的SDP。在某些实施方式中，眼科用组合物包含约0.05％w/v SDP，约0.1％w/v SDP，约0.2％w/v SDP，约0.25％w/v SDP，约0.5％w/vSDP，约0.75％w/v SDP，约1％w/v SDP，约1.5％w/v SDP，约2％w/v SDP，约2.5％w/v SDP，约5％w/v SDP，约8％w/v SDP，或约10％w/v SDP。

在各种实施方式中，所述眼科制剂包括水溶液中的其他组分，例如缓和剂、缓冲剂和/或稳定剂。在一些实施方式中，所述缓和剂是透明质酸(HA)、羟乙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、葡聚糖、明胶、多元醇、羧甲基纤维素(CMC)、聚乙二醇、丙二醇(PG)、羟丙甲纤维素、甘油、聚山梨醇酯80、聚乙烯醇或聚维酮。在一些实施方式中，所述缓释剂为，例如，约0.01％重量至约10％重量、或约0.2％重量至约2％重量。在一种实施方式中，所述缓和剂是HA。在各种实施方式中，HA为制剂重量的约0.2％。

在一些实施方式中，所述眼科制剂的缓冲剂或稳定剂是磷酸盐缓冲盐水、硼酸盐缓冲盐水、柠檬酸盐缓冲盐水、氯化钠、氯化钙、氯化镁、氯化钾、碳酸氢钠、氯化锌、盐酸、氢氧化钠、乙二胺四乙酸二钠或它们的组合。

所述眼科制剂可进一步包括有效量的抗微生物防腐剂。在一些实施方式中，所述抗微生物防腐剂是，例如，过硼酸钠、聚季铵盐-1(例如防腐剂)、苯扎氯铵(BAK)氯化物、亚氯酸钠、溴莫尼定、溴莫尼定碳酸钠、波利克西通尼(polexitonium)或它们的组合。

所述眼科制剂还可包含有效量的血管收缩剂、抗组胺或它们的组合。在一些实施方式中，所述血管收缩剂或抗组胺药是盐酸萘甲唑啉、盐酸麻黄碱、盐酸苯肾上腺素、盐酸四氢唑啉、马来酸吡嗪、或它们的组合。

在一种实施方式中，所述眼科制剂包括与水和一种或多种眼用组分组合的如本文所述的有效量的SDP片段。在一些实施方式中，所述眼用组分是，例如，a)聚乙烯醇；b)PEG-400和透明质酸；c)PEG-400和丙二醇；d)CMC和甘油；e)丙二醇和甘油；f)甘油，羟丙甲纤维素和PEG-400；或者前述组分中的任何一个或多个的组合。在一些实施方式中，所述眼科制剂包括一种或多种非活性成分，例如HP-瓜尔胶，硼酸盐，氯化钙，氯化镁，氯化钾，氯化锌等。在一些实施方式中，所述眼科制剂包括一种或多种眼科防腐剂，例如亚氯酸钠(防腐剂(NaClO₂)，聚四联体，BAK，EDTA，山梨酸，苯甲醇等。在一些实施方式中，所包括的眼科成分、无活性的成分和防腐剂的含量为约0.1％至约5％w/v，例如约0.25％、0.3％、0.4％、0.5％、1％、2％、2.5％或5％，或者在任何两个上述值之间。

因此，本文提供的SDP组合物在水溶液中具有增强的稳定性，其中天然丝素蛋白的一级氨基酸序列由天然丝素蛋白修饰，其中丝素蛋白重蛋白链和丝素蛋白轻蛋白链链之间的半胱氨酸二硫键减少或消除；其中所述组合物的丝氨酸含量与天然丝素蛋白相比降低了40％以上；以及，其中丝衍生蛋白质的平均分子量小于约96kDa。

本文提供了用于治疗人或哺乳动物的眼科疾病的眼科制剂，其包含水和如上所述的有效量的SDP。本文提供了用作人或哺乳动物眼睛治疗的眼科组合物，其包含水、缓冲剂和稳定剂中的一种或多种，以及如上所述的有效量的SDP。

所述SDP在水中高度稳定，其中保质期溶液的稳定性是溶液中天然丝素蛋白的两倍以上。例如，所述SDP在水中高度稳定，其中与溶液中的天然丝素蛋白相比，保质期溶液稳定性大10倍以上。当在水溶液中时，所述SDP材料在5％(50mg/mL)浓度的溶液超声处理时不凝胶。在其他实施方式中，当在水溶液中时，所述SDP材料在10％(100mg/mL)浓度下超声处理溶液时不凝胶化。

所述SDP材料，与天然丝素蛋白相比，可以去除50％以上的丝素蛋白轻链。所述SDP材料可具有相对氨基酸含量小于约8％的丝氨酸氨基酸含量，或相对氨基酸含量小于约6％的丝氨酸氨基酸含量。

所述SDP材料可具有高于约46.5％的甘氨酸氨基酸含量。所述SDP材料可具有高于约30％或高于约30.5％的丙氨酸氨基酸含量。所述SDP材料可以没有可检测的半胱氨酸氨基酸含量，例如，通过蛋白质组合物的水解多肽的HPLC分析测定。

与天然丝素蛋白相比，SDP材料可以形成少于90％、少于95％或少于98％的β-折叠二级蛋白结构，例如，通过下文实施例8中描述的FTIR分析测定。

本文提供了用作人或哺乳动物眼睛治疗的眼科组合物，其包含含有有效量的如上所述的SDP材料的水溶液和缓冲剂或稳定剂。

本文提供了用于治疗人或哺乳动物眼病的眼科制剂，其包含含有有效量SDP材料的水溶液，所述SDP材料具有如本文所述的增强的稳定性。

本文提供了制备眼用组合物的方法，例如采用丝蛋白，所述方法包括将眼用组分与所述SDP组合物组合。

在一些实施方式中，本文提供的SDP组合物被配制用于皮肤伤口或疤痕的局部治疗。本文公开的药物局部制剂可以任何合适的方式配制。可以考虑将任何合适的技术、载体和/或赋形剂与本文公开的SDP片段一起使用。

在一些实施方式中，本文提供的SDP组合物配制成水溶液、悬浮液、分散液、油膏、软膏、凝胶、乳膏、洗剂、喷雾剂或糊剂。在一些实施方式中，所述SDP组合物包含药物载体，例如但不限于磷酸盐缓冲盐水、膜、纤维、泡沫、水凝胶、基质、三维支架、微粒、纳米颗粒、聚合物或垫状物。在一些实施方式中，蛋白质片段附着于基质，例如角膜移植物，伤口敷料，隐形眼镜，组织，组织移植物或可降解材料。

在某些实施方式中，本文公开了本文提供的SDP组合物的局部制剂，其中局部制剂与伤口敷料一起施用(或通过伤口敷料施用)。所述伤口敷料包括但不限于纱布、透明薄膜敷料、水凝胶、聚氨酯泡沫敷料、水胶体和藻酸盐。在某些情况下，所述伤口敷料促进伤口愈合。在某些情况下，所述伤口敷料减少或抑制异常伤口愈合。

在某些情况下，在皮肤病变的治疗中，用敷料接触病变通常会干扰受损组织。去除伤口的许多敷料，例如烧伤涉及皮肤的显著区域的表面损伤，可引起显著的疼痛，并且通常可以至少部分愈合的伤口重新打开。在一些情况下，本文所述的局部制剂作为液体施用于受影响的区域，并且液体在受影响的区域上作为薄膜凝胶化。在某些情况下，薄膜是水溶性薄膜，可以用水或温和的含水洗涤剂除去，避免与消除伤口敷料有关的疼痛和不适。在某些情况下，本文所述的局部制剂是真皮膜，其包含由聚烷基恶唑啉制成的柔性膜。在一些情况下，所述膜具有由聚烷基恶唑啉制成的结构层和将膜保持在适当位置的压敏粘合剂层。

在某些实施方式中，本文公开了本文提供的SDP组合物的局部制剂，其中局部制剂通过贴剂给药。在一些实施方式中，将本文公开的局部SDP制剂溶解和/或分散在聚合物或粘合剂中。在一些实施方式中，膜，本文所述的贴剂被构造用于连续、间断或根据需求递送本文所述的SDP组合物。

在一些情况下，本文所述的局部制剂包含压敏粘合剂(例如，聚烷基恶唑啉聚合物)并允许将粘合剂膜施用于受影响的皮肤区域。

在一些实施方式中，本文公开的制剂和组合物作为真皮涂料施用。如本文所用，所述涂料(也称为成膜剂)是由溶剂、单体或聚合物、活性剂和任选的一种或多种药学上可接受的赋形剂组成的溶液。在施用于组织后，溶剂蒸发，留下由单体或聚合物和活性剂组成的薄涂层。涂层保护活性剂并在施用部位将它们保持在固定状态。这减少了可能丢失的活性剂的量，并相应地增加了递送到个体皮肤受影响区域的量。作为非限制性实例，所述涂料包括胶棉(例如Flexible Collodion，USP)，以及包含糖硅氧烷共聚物和交联剂的溶液。胶棉是含有火棉胶(一种硝酸纤维素)的乙醚/乙醇溶液。施用后，乙醚/乙醇溶液蒸发，留下薄薄的火棉胶。在包含糖硅氧烷共聚物的溶液中，糖类硅氧烷共聚物在溶剂蒸发后形成涂层，引发糖硅氧烷共聚物的交联。

在某些情况下，所述制剂是半固态(例如，软固体或稠液体)制剂，其包括分散在水包油乳液或油包水乳液中的本文提供的SDP组合物。在某些情况下，所述组合物是流体乳液(例如，水包油乳液或油包水乳液)。在一些实施方式中，洗剂和/或乳膏的疏水性组分衍生自动物(例如羊毛脂、鳕鱼肝油和龙涎香、鲱鱼油)；植物(例如红花油、蓖麻油、椰子油、棉籽油、棕榈仁油、棕榈油、花生油、大豆油、菜籽油、亚麻子油、米糠油、松油、芝麻油或葵花籽油)，或石油(例如矿物油或凡士林)。

在某些实施方式中，本文所述的局部制剂包含SDP组合物，其任选地掺入控释微粒、脂质复合物、脂质体、纳米颗粒、微球、微粒、纳米胶囊或其它增强或促进局部递送到皮肤。用于药物制剂的常规微囊化方法的实例呈现于美国专利No.3,737,337，其在此引入作为参考用以披露上述内容。

在一些情况下，本文描述的局部制剂是脂质体制剂。通过将含水缓冲液引入磷脂和有机溶剂的混合物中来制备脂质体，随后通过减压蒸发除去有机溶剂。脂质体制剂的一个实例描述于Proc.Natl.Acad.Sci.1978,75,4194-98，其通过引用并入本文用以披露上述内容。通过尺寸排阻色谱(SEC)根据它们的粒径分级分离脂质体。脂质体的亚级分通过光子相关光谱法(PCS)进一步确定其粒径。酶促测定(例如，磷脂酰胆碱(PC)测定)用于分析脂质体的脂质含量。

在某些实施方式中，本文公开了本文提供的SDP组合物的局部制剂，其中局部制剂包含载体。合适的载体包括水，乙酰透明质酸，胶原，乙醇，多元醇(丙二醇、聚乙二醇、甘油，氢化蓖麻油等)，植物油(如橄榄油)，可注射的有机酯(如油酸乙酯)，脂肪油(如芝麻油)和合成脂肪酸酯(例如油酸乙酯或甘油三酸酯)。

在某些实施方式中，本文公开了本文提供的SDP组合物的局部制剂，其包含渗透促进剂。渗透促进剂包括但不限于十二烷基硫酸钠，月桂酸钠，聚氧乙烯-20-十六烷基醚，月桂醇聚醚-9，十二烷基硫酸钠，二辛基磺基琥珀酸钠，聚氧乙烯-9-月桂基醚(PLE)，吐温80，壬基苯氧基聚乙烯(NP-POE)，聚山梨醇酯，甘氨胆酸钠，脱氧胆酸钠，牛磺胆酸钠，牛磺酸二氢呋喃钠，甘氨酸二氢呋喃钠，油酸，辛酸，甘油单甘油酯和月桂酸甘油酯，酰基胆碱，辛酸，酰基肉碱，癸酸钠，EDTA，柠檬酸，水杨酸盐，DMSO，癸基甲基亚砜，乙醇，异丙醇，丙二醇，聚乙二醇，甘油，丙二醇和二乙二醇单乙醚。在某些实施方式中，本文所述的局部制剂被设计用于最小程度的全身暴露，并且包括例如少量的渗透促进剂。

在某些实施方式中，提供了本文所述的SDP组合物的局部制剂，其包含胶凝(或增稠)剂。在一些实施方式中，本文公开的局部制剂还包含约0.1％至约5％，约0.1％至约3％，或约0.25％至约2％的胶凝剂。在某些实施方式中，本文公开的局部制剂的粘度为约100cP至约500,000cP，约100cP至约1,000cP，约500cP至约1500cP，约1000cP至约3000cP，约2000cP至约8,000cP，约4,000cP至约10,000cP，约10,000cP至约50,000cP。用于制备凝胶局部制剂的合适胶凝剂包括但不限于纤维素，纤维素衍生物，纤维素醚(例如羧甲基纤维素、乙基纤维素、羟乙基纤维素、羟甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羟丙基纤维素、甲基纤维素)，瓜尔胶，黄原胶，刺槐豆胶，藻酸盐(如海藻酸)，硅酸盐，淀粉，黄蓍胶，羧乙烯基聚合物，角叉菜胶，石蜡，凡士林，阿拉伯树胶(阿拉伯胶)，琼脂，硅酸铝镁，海藻酸钠，硬脂酸钠，胶囊，膨润土，卡波姆，卡拉胶，卡波姆，黄原胶，纤维素，微晶纤维素(MCC)，角鲨，角叉菜，葡萄糖，红藻胶，明胶，咖替胶，瓜尔胶，锂蒙脱石，乳糖，蔗糖，麦芽糖糊精，甘露醇，山梨糖醇，蜂蜜，玉米淀粉，小麦淀粉，大米淀粉，马铃薯淀粉，明胶，梧桐树胶，聚乙二醇(如PEG 200-4500)，黄蓍胶，乙基纤维素，乙基水羧乙基纤维素，乙基甲基纤维素，甲基纤维素，羟乙基纤维素，羟乙基甲基纤维素，羟丙基纤维素，聚甲基丙烯酸羟乙酯，氧聚明胶，果胶，聚苯乙烯，聚维酮，碳酸丙烯酯，甲基乙烯基醚/马来酸酐共聚物(PVM/MA)，聚(乙烯基甲基纤维素)甲基丙烯酸甲氧基乙酯)，聚甲基丙烯酸甲氧基乙酯，羟丙基纤维素，羟丙基甲基纤维素(HPMC)，羧甲基纤维素钠(CMC)，二氧化硅，聚乙烯吡咯烷酮(PVP：聚维酮)，或它们的组合。

凝胶包括单相或两相系统。单相凝胶由均匀分布在整个液体中的有机大分子组成，使得在分散的大分子和液体之间不存在明显的边界。有些单相凝胶由合成大分子(例如卡波姆)或天然树胶(例如黄蓍胶)制备。在一些实施方式中，单相凝胶通常是含水的，但也可以使用醇和油制备。两相凝胶由小的离散颗粒网络组成。

凝胶分类为疏水性或亲水性。在某些实施方式中，疏水性凝胶的基质由液体石蜡与聚乙烯或与胶体二氧化硅胶凝的脂肪油或铝或锌皂组成。相反，疏水凝胶的基质通常由水、甘油、或丙二醇胶凝于合适的胶凝剂(例如黄蓍胶、淀粉、纤维素衍生物、羧乙烯基聚合物和镁-铝硅酸盐)。

在用于配置作为液体和凝胶施用于皮肤上形成薄膜的制剂时，合适的试剂包括但不限于由聚氧丙烯和聚氧乙烯组成的聚合物，当其掺入水溶液中时已知形成热可逆凝胶。这些聚合物具有在接近体温的温度下从液态变为凝胶态的能力，因此允许作为凝胶和/或薄膜施用于受影响区域的有用制剂。在体温下凝胶并用于本文所述的凝胶和/或薄膜的聚合物的实例包括但不限于泊洛沙姆(例如，和它们是环氧乙烷和环氧丙烷的嵌段共聚物)。液态─凝胶态相变取决于聚合物浓度和溶液中的成分。

在某些实施方式中，提供了本文所述的SDP组合物的局部制剂，其包含润肤剂。润肤剂包括但不限于蓖麻油酯，可可脂酯，红花油酯，棉籽油酯，玉米油酯，橄榄油酯，鳕鱼肝油酯，杏仁油酯，鳄梨油酯，棕榈油酯，芝麻油酯，角鲨烯酯，kikui油酯，大豆油酯，乙酰化单甘油酯，乙氧基化单硬脂酸甘油酯，月桂酸己酯，月桂酸异己酯，棕榈酸异己酯，棕榈酸异丙酯，棕榈酸甲酯，癸酸酯，油酸异癸酯，硬脂酸十六烷基酯，硬脂酸异丙酯，异硬脂酸异丙酯，异硬脂酸甲酯，己二酸二异丙酯，己二酸二异己酯，己二酸二己基癸酯，癸二酸二异丙酯，乳酸月桂酯，乳酸肉豆蔻酯和乳酸十六烷酯，肉豆蔻酸油基酯，硬脂酸油酯和油酸油酯，壬酸，月桂酸，肉豆蔻酸，棕榈酸，硬脂酸，异硬脂酸，羟基硬脂酸，油酸，亚油酸，蓖麻油酸，花生酸，山ic酸，芥酸，月桂醇，肉豆蔻醇，鲸蜡醇，十六烷醇，硬脂醇，异硬脂醇，羟基硬脂醇，油醇，蓖麻油醇，山醇，芥子醇，2-辛基十二烷醇，羊毛脂和羊毛脂衍生物，蜂蜡，鲸蜡，肉豆蔻酸肉豆蔻酯，硬脂酸硬脂酸酯，巴西棕榈蜡，小烛树蜡，卵磷脂和胆固醇。

在某些实施方式中，提供了包含本文提供的SDP组合物的局部制剂，其包含其它的赋形剂，例如研磨剂、吸收剂、抗结块剂、收敛剂、精油、香料、皮肤调理剂、皮肤愈合剂、皮肤保护剂(例如防晒剂、紫外线吸收剂或散射剂)，皮肤舒缓剂或其组合。

以下实施例是用来对上述发明内容进行说明，而不应被解释为限制发明的范围。本领域技术人员应很容易的认识到所述实施例能够提示本发明可以通过很多其他方法来实施。应当理解，在本发明的范围内可以进行很多的变化和修改。

实施例1：SDP制备和劳伦斯稳定性测试(LAWRENCE STABILITY TEST)

材料：家蚕茧从日本田岛商事株式会社获得。溴化锂(LiBr)获自FMC Lithium,Inc.,NC。高压釜获自Tuttnauer Ltd.,NY。所述3,500Da分子量截留(MWCO)透析膜获自ThermoScientific,Inc.,MA。Oakton Bromide(Br^-)双结离子选择性电极获自ISE,OaktonInstruments,IL。

工艺：制备了两个样品，SDP和PASF，如图1所示。简而言之，SDP是通过将无蛹的切割蚕茧(3-5切/茧)浸入在233mL水/克茧中含有0.3wt％NaCO₃的95℃加热的去离子水(diH₂O)中而制成。将茧在该溶液中搅拌75分钟以溶解丝胶，从而将其与丝纤维分离。随后将茧在稀释的diH₂O中洗涤四次，每次冲洗20分钟，以从洗涤的丝纤维中除去残留的丝胶。然后将纤维在对流烘箱中在60℃下干燥2小时，称重，并以4×LiBr体积/克提取纤维的比例溶解在54wt％LiBr水溶液中。将该溶液覆盖，然后在60℃的对流烘箱中加热2小时以加速提取的纤维溶解。然后将溶液置于高压釜中并暴露于灭菌条件(121℃,17PSI,90-100％湿度)30分钟以促进丝素蛋白转化。将所得溶液冷却至室温，然后用diH₂O稀释至5％丝素蛋白，并使用3,500Da MWCO膜透析以除去LiBr盐。在diH₂O中进行多次交换直至Br-离子小于1-ppm，如在Oakton Bromide(Br-)双结离子选择性电极上读取的水解丝素蛋白溶液中所测定的。然后使用1-5μm孔隙率过滤器进一步过滤溶液，接着通过0.2μm抛光过滤器过滤。该产品在图2中称为“SDP溶液”。

如图1所示，制备“对照组”丝素蛋白溶液，以提供图2中所示的“PASF溶液”。除高压釜步骤外，采用如上所述相同的过程。将来自每个样品的取样体积(5mL)置于单独的20mL玻璃烧杯中，并用箔密封。然后将样品进行劳伦斯稳定性测试。

所述劳伦斯稳定性测试是通过将含水蛋白质测试溶液(5％w/v,50mg/mL)置于高压釜室内来进行的。然后将高压釜在121℃，17PSI，30分钟，97-100％湿度条件下活化一个循环。循环完成后，使溶液冷却，然后从高压釜室中取出。然后摇动溶液以观察溶液凝胶化表现。如果溶液在摇动约10秒后凝胶化，则样品未通过劳伦斯稳定性试验。未通过测试表明该材料作为蛋白质溶液本质上不稳定。

劳伦斯稳定性测试在SDP溶液和PASF溶液进行。所述PASF溶液样品立即发生胶凝，因此未通过劳伦斯稳定性测试。相反，所述SDP溶液样品无限期地保留在溶液中，因此通过了劳伦斯稳定性测试。缺乏凝胶化可归因于SDP溶液生产结合了高压釜处理步骤，如上图1所示。图2显示了不同测试结果(未胶凝与凝胶化)的图像。

实施例2：SDP分子量鉴定

为了评价工艺过程对溶解的蛋白质的分子量分布的影响，对SDP溶液和PASF溶液进行了聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)分析，其通过分子量分离蛋白质。具体地，将15μg每种样品与含有十二烷基硫酸钠和二硫苏糖醇(Biorad Inc.,CA)的运行缓冲液混合，以分别除去任何二级折叠结构和二硫键。然后将混合物加热至70℃保持5分钟。将混合物与2.5-200kDa分子量梯(Life Technologies,CA)一起加载到含有Bis-Tris缓冲盐(Life Technologies,CA)的预制4-12％聚丙烯酰胺梯度凝胶上，然后暴露于BioRad PowerPac电源(BioRadInc.,CA)上的120V电场90分钟。然后取出凝胶并置于考马斯蓝染色中12小时以染色蛋白质，然后在diH₂O中洗涤6小时。然后在Biorad GS-800Calibrated Desitometer(BioRadInc.,CA)上扫描凝胶。

所得到的凝胶显示在图3中。结果显示用于制备SDP溶液的过程显著地将平均分子量从150-200kDa转变为小于80kDa(图3)。这种分子量的变化清楚地表明原始天然丝素蛋白的一级和/或二级结构的转变。此外，在高压灭菌过程后SDP中不存在丝素蛋白的丝素蛋白轻链(在现有技术的丝素蛋白的泳道2中可见23-26kDa)，这表明蛋白质的丝素蛋白轻链部分已经降解。或通过处理删除。这些结果表明高压釜处理将天然丝素蛋白转化为具有比天然丝素蛋白更小的肽片段的新材料。该过程进一步降解/改变丝素蛋白轻链。这些转化作用形成SDP材料，其由于这些化学变化而具有增强的溶液稳定性。

实施例3：SDP稳定性研究

为了进一步确定高压釜工艺对所得SDP的稳定性与现有技术丝素蛋白的稳定性相比的功能影响，所述样品是通过使用Wang et al.(Biomaterials 2008,29(8):1054-1064)的方法进行分析以模拟丝素蛋白凝胶化充分表征的模型。将两个样品(0.5mL,SDP和PASF)加入1.7mL透明离心管中并进行超声处理(20％振幅，10Hz，15秒)。然后对含有所述溶液的透明管进行目测以观察凝胶形成，作为凝胶化的筛选。

所述SDP溶液样品未能形成凝胶，如图4A所示。甚至在超声处理后3个月，所述SDP样品保持在溶液中并且通过视觉检查确定没有蛋白质聚集。所述PASF溶液样品在超声处理后迅速凝胶化(2小时内)。得到的凝胶化PASF如图4B所示。这些结果进一步表明，高压釜工艺将现有技术的丝素蛋白转化为新材料并导致所得SDP材料的稳定性。

实施例4：伤口处理

严重创伤性角膜损伤可使自然发生的伤口愈合过程不足以恢复健康的角膜上皮，从而会导致永久性视力损害。SDP已被证明可显著增强角膜伤口愈合；然而，几乎没有做任何工作用以理解SDP的有益效果的机理基础，并描述蛋白质的涉及伤口愈合特性的化学和分子属性。如本申请中所述，从上述SDP组合物中分离高分子量和低分子量SDP片段，以评估和鉴定蛋白质片段大小对SDP调节可能参与伤口愈合过程的角膜上皮细胞表现的能力的影响。

当添加到细胞培养物中时，低分子量SDP片段被发现显著增加细胞迁移、增殖并加速体外擦痕伤口闭合速率。在一些实施方式中，低分子量的SDP片段的的分子量小于约100kDa，小于约90kDa，小于约80kDa，小于约70kDa，小于约60kDa，小于约50，kDa小于约40kDa，小于约30kDa，小于约20kDa，或小于约10kDa。在一些实施方式中，从再生的SDP组合物中分离的蛋白质片段组合物具有约30kDa至60kDa的平均分子量。在一些实施方式中，所述蛋白质片段组合物中至少75％的SDP片段具有小于约100kDa的分子量。在一些实施方式中，所述蛋白质片段组合物中至少90％的SDP片段具有小于约100kDa的分子量。在一些实施方式中，所述蛋白质片段组合物中至少75％的SDP片段具有小于约80kDa的分子量。在一些实施方式中，所述蛋白质片段组合物中至少90％的SDP片段具有小于约80kDa的分子量。在一些实施方式中，所述蛋白质片段组合物中至少75％的SDP片段具有小于约60kDa的分子量。在一些实施方式中，所述蛋白质片段组合物中至少90％的SDP片段具有小于约60kDa的分子量，以促进组织中的细胞迁移和增殖以闭合伤口。在一些实施方式中，所述蛋白质片段组合物中至少75％的SDP片段具有小于约50kDa的分子量。在一些实施方式中，所述蛋白质片段组合物中至少90％的SDP片段具有小于约50kDa的分子量。在一些实施方式中，蛋白质片段组合物中至少75％的SDP片段具有约30kDa至60kDa的分子量。在一些实施方式中，所述蛋白质片段组合物中至少90％的SDP片段具有约30kDa至60kDa的分子量。在一些实施方式中，所述蛋白质片段组合物中至少75％的SDP片段具有小于约30kDa的分子量。在一些实施方式中，所述蛋白质片段组合物中至少90％的SDP片段具有小于约30kDa的分子量。在一些实施方式中，所述蛋白质片段组合物中至少75％的SDP片段具有约10kDa至30kDa的分子量。在一些实施方式中，所述蛋白质片段组合物中至少90％的SDP片段具有约10kDa至30kDa的分子量。在一些实施方式中，所述蛋白质片段组合物中至少75％的SDP片段具有小于约10kDa的分子量。在一些实施方式中，所述蛋白质组合物中至少90％的SDP片段具有小于约10kDa的分子量。在一些实施方式中，所述蛋白质组合物中至少50％的SDP片段具有大于约60kDa的分子量。

相比之下，高分子量丝对细胞增殖和活力没有任何影响，但被发现显著减少细胞迁移和伤口闭合，并显著增加细胞-基质粘附或细胞与其基底膜的粘附或基底膜的形成。在一些实施方式中，所述高分子量的SDP片段具有的分子量大于约30kDa，大于约40kDa，大于约50kDa，大于约60kDa，大于约70kDa，大于约80kDa，大于约90kDa，或大于约100kDa。在一些实施方式中，所述蛋白质片段组合物中至少50％的SDP片段具有大于约60kDa的分子量。

所述低分子量SDP片段影响伤口愈合或闭合的速率。所述高分子量SDP片段显得影响伤口是怎么愈合或闭合的(例如伤口轮廓)。在一些实施方式中，含有低分子量SDP片段和高分子量SDP片段两者的蛋白质片段组合物用于治疗伤口。在一些实施方式中，所述蛋白质片段组合物含有约50％分子量小于约60kDa的SDP片段和约50％分子量大于约60kDa的SDP片段。

在某些情况下，需要快速愈合伤口而不是正确地愈合伤口，例如，希望减轻手术后(例如屈光手术后)疼痛的健康人、受伤的军人、感染区域的人。在一些实施方式中，在这些情况下，所述蛋白质片段组合物含有比含有的高分子量SDP片段更多的低分子量SDP片段。例如，在一些实施方式中，所述蛋白质片段组合物含有约75％分子量小于60kDa的SDP片段和约25％分子量大于60kDa的SDP片段。

在一些实施方式中，伤口类型还决定是否使用高分子量SDP片段或低分子量SDP片段来治疗伤口。低分子量SDP片段具有抗炎特性，并且可以用低分子量SDP片段处理溃烂的伤口。有些伤口需要关注细胞与基底膜的粘附或基底膜形成。这种伤口的一些例子包括皮肤烧伤和糖尿病性溃疡。在这些情况下，在一些实施方式中，蛋白质片段组合物含有比含有的低分子量SDP片段更多的高分子量SDP片段。例如，在一些实施方式中，蛋白质片段组合物含有约75％的分子量大于60kDa的SDP片段和约25％的分子量小于60kDa的SDP片段。

虽然不受任何理论的束缚，但这种作用可能是通过聚焦粘连和肌动蛋白细胞骨架的重组来实现的。此外，低分子量丝被发现可以上调TGFβ的表达，而高分子量丝可以显著降低所有TGFβ同种型的表达。此外，在TGFβRI特异性抑制剂的存在下，低分子量SDP对擦痕伤口闭合的影响部分减弱，表明TGFβ介导的信号传导部分地促成SDP对人角膜缘-上皮细胞(HCLE)细胞迁移和增殖的刺激作用。这些发现证明了SDP的生物功能和伤口愈合特性在多大程度上依赖于其蛋白质结构的化学和分子属性。

源自Bombyx mori蚕茧的丝素蛋白，因其合适的可控材料特征和加工成各种生物材料形式的能力，被选择用于组织工程和再生医学应用。先前的研究已经报道，基于丝素蛋白的材料在体内使用时表现出高生物相容性、可控降解性和固有的非免疫原性和非炎性性质，因此，与广泛用于生物医学的其他生物聚合物相比显示出许多优点与。此外，我们先前的研究工作表明，再生丝素蛋白溶液，在活体兔角膜创面愈合模型应用时，刺激体外角膜上皮细胞生长、迁移、粘附，并促进组织再生、导致角膜伤口愈合反应增强，从而显示其用于眼表修复的应用。

尽管再生丝素蛋白已成功用作增强组织再生的治疗剂，但仍需要在分子水平上理解其生物功能特性，以提供使用丝素蛋白的改进方法。研究工作已经证明，丝作为生物材料的多功能性源于丝素蛋白的化学和分子属性，这些属性可能受到用于从生丝虫茧制备再生丝素蛋白溶液的加工方法的严重影响。丝素蛋白暴露于苛刻的变性条件会影响蛋白质的固有分子结构，并导致再生丝素蛋白溶液的分子量分布不同。虽然研究报道了丝素蛋白分子量分布对其机械性能、生物相容性、蛋白水解降解性和热稳定性的影响，但尚未详细研究分子量分布对丝素蛋白伤口愈合性能的影响。

在本文提供的实施例中，评估和鉴定了分子量分布对SDP调节伤口愈合过程中涉及的角膜上皮细胞表现的能力的影响。使用离心过滤器将再生的SDP溶液分级成高分子量和低分子量SDP片段，以研究丝蛋白质片段大小对上皮细胞表现的影响。延时成像用于跟踪在不同分子量大小的丝片段存在下培养的HCLE细胞的迁移。使用MTT比色生存力测定评估SDP蛋白质分子量对上皮细胞增殖的影响。

此外，使用平行板流动室系统和粘着斑蛋白纽蛋白的免疫荧光染色评估蛋白质片段大小对SDP刺激上皮细胞-基质粘附能力的影响。然后使用体外擦痕试验来模拟角膜磨损，其中汇合的HCLE细胞片被部分剥离并随后用不同分子量的SDP片段处理以评估在擦痕闭合期间对SDP伤口愈合性质的影响。使用定量PCR评估丝素蛋白分子量对细胞因子转化生长因子β(TGFβ)的遗传表达的影响，其已经涉及在角膜上皮伤口愈合过程中起关键作用。最后，用TGFβ-RI特异性抑制剂处理HCLE细胞以破坏TGFβ信号通路，以阐明构成SDP伤口愈合作用的分子途径。

所述研究结果表明，SDP分子量与其对基于SDP的材料的表现和性能的影响之间存在明确的关系。例如，本发明人已经证明了SDP片段大小与其伤口愈合性质差异之间的联系。因此，提供了根据其片段大小使用SDP作为眼表再生的生物材料的方法。

实施例5：SDP蛋白质溶液的分级和分子量分布

再生SDP溶液的分级分离是通过一系列离心步骤完成，使用了截止值为100、50、30和10kDa MW的Amicon Ultra 15mL离心过滤器(EMD-Millipore,MA,USA)。为了评估分级SDP溶液的分子量范围，使用SDS-PAGE显现SDP蛋白的电泳迁移率，并与未分级的SDP溶液进行比较(图5)。未分级的SDP的SDS-PAGE表明溶液中SDP蛋白的分子量分布宽，如大约300kDa和30kDa分子量范围之间的大涂片所证明的。然而，再生的SDP溶液的分级产生了高分子量和低分子量SDP蛋白质的溶液。与未分级的SDP溶液相比，高分子量溶液的SDS-PAGE产生涂片，表明在300kDa和100kDa范围之间的近似分子量分布，而低分子量溶液产生涂片，表明分子量分布主要在30kDa范围，从而证实了SDP分离成高分子量和低分子量SDP蛋白质溶液。

实施例6：SDP溶液分馏

来自Bombyx mori蚕茧的50mg/mL SDP水溶液是由Silk Technologies,Inc.(Plymouth,MN)友情提供，并用于所有以下所述的研究。SDP片段的分级分离的完成采用了带有100,50,30,and 10kDa MW截止值的Amicon Ultra 15mL离心过滤器(EMD-Millipore,MA,USA)。简言之，将15mL的40mg/mL SDP储备溶液加入到具有100kDa MW截止值的离心过滤器中，并以4,000x g离心30分钟以分离100kDa MW及以上的SDP片段。收集分离的浓缩物，随后将滤液转移至具有50kDa MW截止值的离心过滤器，并再次以4,000x g离心30分钟以分离～50kDa MW的SDP片段。收集分离的浓缩物，然后将滤液转移至具有30kDa MW截止值的离心过滤器，并再次以4,000×g离心30分钟以分离～30kDa MW的SDP片段。收集分离的浓缩物，然后将滤液转移至具有10kDa MW截止值的离心过滤器，并再次以4,000x g离心30分钟以分离～10kDa MW的SDP片段。将来自每个MW截止值的收集的浓缩物用5mL dH2O单独洗涤6次，并使用离心过滤器再次以4,000x g离心30分钟，每个浓缩物具有相应的MW截止过滤器尺寸。使用SDS-PAGE和考马斯蓝R-250染色(Gibco,Invitrogen Corporation,Grand Island,NY,USA)验证SDP片段的分级分离。

SDP蛋白质分子量分布对调节上皮细胞表现的影响，首先使用体外上皮细胞迁移测定法研究。基于在处理诸如SDP的新生物材料时细胞系高度特征化的历史记录和可靠性，选择HCLE细胞作为体外研究的可靠细胞模型。我们以前的研究成功证明，当用4mg/mL未分级的SDP溶液处理细胞时，上皮细胞迁移和增殖的增加，以及体外擦痕伤口闭合的加速，因此，针对整个当前研究中SDP的刺激作用。它被用作阳性对照。

实施例7：擦痕伤口闭合测试

具有HCLE细胞的擦痕试验被用来确定SDP蛋白质片段大小对体外伤口闭合的影响。将HCLE细胞以5x10⁴细胞/cm²接种于24孔板(VWR Radnor,PA,USA)，并被允许在K-SFM培养基中孵育24小时以形成融合的单层细胞。移除K-SFM培养基，并通过用100μl移液管尖端刮擦使融合的细胞片受伤，产生无细胞剥露区域。刮擦伤的HCLE细胞用1X PBS洗涤以除去任何细胞碎片或分离的细胞，然后在含有递增浓度(1mg/mL、2mg/mL和4mg/mL)高分子量或低分子量SDP蛋白溶液的新鲜K-SFM培养基中孵育20小时。用含有4mg/mL未分级SDP蛋白溶液或PBS载体(分别作为阳性对照和阴性对照)的新鲜K-SFM培养基处理细胞。细胞迁移的监测采用显微镜的24孔板微量培养箱(PeCon,GmbH；M24S1)。使用带有10x物镜、1.6x OptoVar和相衬滤光片的Zeiss Observer Z1显微镜(Carl Zeiss,AG)，在测定过程中依次分析伤口闭合。显微镜的标记和查找功能用于记忆每个孔内的选定位置，以捕获剥露表面上的多个区域。使用AxioCam单通道照相机和AxioVision软件(Carl Zeiss,AG)，通过使用延时相衬成像在20小时培养期间每15分钟记录一帧。

为了确保比较的是具有相同伤口区域的伤口，使用ImageJ软件追踪并测量伤口的面积，用于每个孔内的多个位置。分析孔中每个位置的延时图像，并测量伤口面积以确定在整个测定过程中几个时间点的伤口闭合百分比记录伤口完全愈合的时间点。将用高分子量或低分子量SDP片段处理的HCLE细胞的伤口闭合与用未分级SDP溶液处理的细胞以及PBS载体对照进行比较。

使用融合的HCLE细胞片在体外模拟角膜上皮细胞在眼表面伤口愈合期间的表现，该细胞片被部分剥离以模拟角膜磨损。随后在不存在或存在高分子量和低分子量以及未分级(阳性对照组)SDP溶液的情况下处理细胞，随后通过在限定时间点测量剥露空间中的细胞覆盖度来计算上皮生长和迁移率(图8A)。低分子量SDP表现出刺激伤口闭合。与未分级的SDP治疗相比，对照细胞显示伤口闭合在16小时之内增加40％。当用低分子量SDP处理细胞时，伤口愈合速率进一步增加，与对照细胞和用未分级丝处理的细胞相比，其导致伤口闭合在16小时之内增加超过50％和10％。与之前证明上皮细胞迁移和生长减少的实验相似，高分子量丝的处理不出所料导致擦伤闭合时间的显著减少，证据为，分别相较于对照组和用低分子量丝处理的细胞，伤口闭合在16小时之内减少20％和50％(图8B)。

实施例8：HCLE细胞迁移

HCLE细胞以1x10⁴细胞/cm²接种于24孔板(VWR Radnor,PA,USA)，并在K-SFM培养基中孵育24小时。然后除去K-SFM培养基，并用含有递增浓度(1mg/mL，2mg/mL和4mg/mL)的高分子量或低分子量SDP蛋白溶液的新鲜K-SFM培养基处理细胞达20小时。用含有4mg/mL未分级SDP溶液或PBS载体(分别作为阳性对照和阴性对照)的新鲜K-SFM培养基处理细胞。对细胞迁移监测，采用显微镜的24孔板微培养箱(PeCon,GmbH；M24S1)，Zeiss Observer Z1显微镜(Carl Zeiss,AG)，带有10x物镜，1.6X Opto Var和相衬滤波器。显微镜的标记和查找功能用于记忆每个孔内的选定位置，以捕获多个区域。使用AxioCam单通道相机和AxioVision软件(Carl Zeiss,AG)，通过延时相衬成像在20小时的孵育期间每15分钟记录一帧。

单个细胞迁移和单个HCLE细胞的迁移路径，采用针对单个延时视频的AxioVision软件中的“跟踪”软件包进行分析。从每个孔内的代表性位置跟踪来自每个组的随机取样的细胞，并且软件编译单个细胞迁移率的平均测量值。

HCLE细胞的培养是在不存在或存在递增浓度的高分子量和低分子量以及未分级(阳性对照)SDP溶液的情况下进行。使用细胞追踪软件评估单细胞的能动性，并比较来自每组的随机选择细胞的平均迁移率(图6)。低分子量SDP显示刺激上皮细胞迁移。正如所料，相对于对照细胞，用4mg/mL未分级SDP处理的细胞显示平均细胞迁移率增加40％。然而，有趣的是，与对照细胞相比，用所有浓度的高分子量SDP蛋白处理导致细胞迁移率降低50％，并且相对于用未分级丝处理的细胞，细胞迁移率降低60％。引人注目的是，低分子量SDP蛋白的治疗表现出相反的效果，结果显示细胞迁移率呈剂量依赖性增加。与用载体对照和未分级丝分别处理的细胞相比，用4mg/mL低分子量SDP蛋白处理的细胞显示细胞迁移率增加约80％和20％。另外，相对于用相同浓度的高分子量丝处理的细胞，用4mg/mL低分子量丝处理导致细胞迁移率增加200％。

实施例9：上皮细胞活力测定

HCLE细胞的培养，是在存在递增浓度(1mg/mL，2mg/mL，和4mg/mL)的高分子量或低分子量SDP蛋白溶液的情况下，在96孔板(VWR Radnor,PA,USA)中进行，细胞接种密度为3x10³细胞/cm²。细胞用4mg/mL未分级的SDP溶液或PBS载体(作为阳性对照和阴性对照)分别进行处理。然后按照厂商说明，在处理后12小时对培养物进行MTT比色测定，这是在我们之前的研究中体外观察到伤口愈合最大影响的持续时间。简言之，将50μl MTT储备溶液(5mg/mL,Gibco,Invitrogen Corporation,Grand Island,NY,USA)加入到含有500μl新鲜培养基的培养物中，并在黑暗中于37℃温育4小时。吸出培养基后，加入200μl二甲基亚砜(DMSO,Sigma-Aldrich,St.Louis,MO,USA)并充分混合以释放甲腊，使用Biomek读板仪(BeckmanCoulter,Brea,CA,USA)在540nm下记录所得溶液的吸光度。将不含细胞的培养基的孔设置为阴性对照。

研究评估分子量是否也在影响SDP对上皮细胞增殖的影响中起作用。在不存在或存在递增浓度的高分子量和低分子量、以及未分级(阳性对照)SDP溶液的情况下培养相同数量的HCLE细胞达12小时，这是我们之前的研究中体外观察到的伤口愈合最大增加持续时间。然后对培养物进行MTT比色代谢测定，以评估细胞数量的差异(图7)。低分子量SDP刺激上皮细胞增殖。确认我们先前研究得到的结果，相对于对照细胞，用4mg/mL未分级丝的处理使细胞增殖增强超过30％。令人惊讶的是，相对于对照细胞，用所有浓度的高分子量SDP处理的细胞未显示细胞增殖的任何增加或减少。然而，当用低分子量SDP处理细胞时，细胞增殖以剂量依赖性方式显著增加。与用对照细胞和用未分级丝处理的细胞相比，用4mg/mL低分子量SDP溶液处理的细胞显示细胞生长增强45％和10％。此外，与用高分子量SDP处理的细胞相比，细胞增殖高出50％以上。

实施例10：细胞基底粘附测定

HCLE细胞被接种于35mm细胞培养皿中，每皿3x10⁵细胞。选择该细胞接种密度以确保适当的表面覆盖，同时尽量减少细胞-细胞接触形成。让细胞孵育过夜以确保最佳细胞附着于基质。

取出来自细胞接种培养皿的培养基，加入含有4mg/mL不同SDP蛋白质溶液(高分子量、低分子量或未分级)或PBS载体对照组的新鲜K-SFM，并且让细胞孵化过夜。孵育后，使用平行板流动室(Glycotech,Gaithersburg,MD)评估细胞基质粘附。腔室内的流动通道的尺寸为5mm宽(w)、0.1mm高(h)和48.2mm长(l)。从细胞接种的培养皿中吸出培养基，将流动室置于细胞顶部。将PBS温热至37℃，得到～0.8cp的表观流体粘度(μ)。使用注射泵以52.2ml/min的体积流速(Q)输送PBS，以在通道内产生连续的一维层流体流动。如前所述测定壁剪切应力。输送的流体剪切应力由下式定义：

τw＝6μQ/b(h²)

通道宽度(b)和通道高度(h)是固定变量，其由附接到流动室平台、置于电池上方的硅树脂垫圈的尺寸决定。通过流动通道注入以产生层流条件的PBS保持在37℃，以在整个测定过程中产生～0.8cp的恒定表观流体粘度(μ)。因此，输送的壁剪切应力(τw)保持为只是注射泵输注的PBS的体积流速(Q)的函数。细胞经受98.4Pa的壁剪切应力达1分钟，并且在配有使用10倍物镜和相衬滤镜的Zeiss Observer Z1显微镜(Carl Zeiss,AG)的测定过程中对细胞计数为30-40细胞的分析区域成像。

细胞的图像是使用AxioCam单通道相机和AxioVision软件(Carl Zeiss,AG)捕获。在流动开始之前和之后确定分析区域内的粘附细胞的总数。评估用不同SDP蛋白质溶液处理的细胞的细胞粘附情况，并与用PBS缓冲液(处理载体)处理的细胞作为对照来进行比较。

HCLE细胞是在不存在或存在高分子量和低分子量、以及未分级SDP溶液的情况下进行培养，并且层流体流动室用于评估和量化当通过流体剪切攻击时细胞对分离的抗性，如前所述(图9)。高分子量SDP似乎通过组织粘着斑复合物和上皮细胞细胞骨架的重新排列来促进上皮细胞-底物粘附。当用连续的一维流体剪切进行挑战时，非丝素蛋白处理的(对照组)细胞保留率约为75％。预期地，添加4mg/mL未分级SDP可显著提高细胞保留率至90％以上。

有趣的是，当用高分子量SDP处理细胞时，细胞保留率进一步增加5％，表明细胞-基质粘附的改善。然而，有趣的是，相对于未分级丝和高分子量丝处理的细胞，通过添加低分子量SDP没有改善细胞附着，以细胞保留降低14％和18％所证明。此外，细胞分离特征和低分子量丝处理细胞在经受高剪切时的细胞保留与对照细胞没有统计学上的差异。

实施例11：HCLE免疫荧光染色和成像

HCLE细胞在4mg/mL不同SDP蛋白溶液(高分子量、低分子量或未分级)或PBS载体对照组的存在下培养过夜，用4％多聚甲醛(PFA,Electron Microscopy Sciences,Hatfield,PA,USA)固定达15分钟，然后在含有0.5％牛血清白蛋白(BSA,Sigma-Aldrich,St.Louis,MO,USA)的PBS中再水合，和0.05％非离子表面活性剂(Triton-X-100；Sigma-Aldrich,St.Louis,MO,USA)作用1小时。固定后，在室温下加入50μl一抗溶液(抗纽蛋白,1:400,Sigma-Aldrich,St.Louis,MO,USA)作用1小时。使用适当的同种型匹配的非特异性IgG作为对照组，将样品与二抗孵育1小时。样品也用Alexa568鬼笔环肽(Gibco,InvitrogenCorporation,Grand Island,NY,USA)染色。用PBS洗涤后，用带有DAPI的VECTASHIELDMounting Medium(Vector Laboratories,Burlingame,CA,USA)固定样品。使用带有10x和40x两种物镜的Observer Z1荧光显微镜(Carl Zeiss,AG)使荧光染色进行观察。使用AxioCam HRm数码相机(Carl Zeiss,AG)和AxioVision 4.0软件，捕获在0.25μm切片上单层和z层图像(45-60层范围)，采用了DAPI、GFP和Texas Red过滤通道。使用3D HuygensDeconvolution Software(Scientific Volume Imaging BV,The Netherlands)对每个z-堆叠进行解卷积。

纽蛋白的免疫荧光染色和成像被用于观察和评估，在不存在或存在高分子量和低分子量的、以及未分级的SDP溶液的情况下培养的HCLE细胞中焦点粘着亚单位的形成与排布(图10)。用PBS载体(对照组)和低分子量丝进行处理导致沿着基底质膜表面分散排列的纽蛋白。然而与之相反，沿着细胞周边的纽蛋白的聚结和聚集发生在未分级的丝处理细胞中，并且当用高分子量丝处理细胞时显著增加，而高分子量丝在先前实验中显示最大程度地增强了细胞粘附。

实施例12：细胞扩散和细胞骨架重组

HCLE细胞在4mg/mL不同SDP蛋白溶液(高分子量、低分子量或未分级)或PBS载体对照组的存在下培养过夜，并利用4％多聚甲醛(PFA,Electron Microscopy Sciences,Hatfield,PA,USA)固定15分钟，然后在含有0.5％BSA(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO,USA)和0.05％Triton-X-100(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO,USA)的PBS中再水合1小时。固定化后，将样品用Alexa568鬼笔环肽(1:40,Gibco,Invitrogen Corporation,GrandIsland,NY,USA)染色20分钟。用PBS洗涤后，用VECTASHIELD^TM Mounting Medium with DAPI(Vector Laboratories,Burlingame,CA,USA)固定样品。使用带有10x物镜的Observer Z1荧光显微镜(Carl Zeiss,AG)观察荧光染色。使用AxioCam HRm数码相机(Carl Zeiss,AG)和AxioVision 4.0软件，捕获以0.25μm切片的单层和z层图像(45-60层范围)，采用了DAPI和Texas Red过滤通道。使用3D Huygens Deconvolution Software(Scientific VolumeImaging BV，The Netherlands)对每个z-堆叠进行解卷积。在稀疏和融合条件下，使用ImageJ软件(ver.1.48,NIH)测量细胞的表面积，以评估响应于不同SDP级分刺激的细胞扩散的改变。

为了确定是否响应于不同分子量的SDP溶液的处理而发生细胞质的改变，将HCLE细胞以低密度接种在二维表面上以模拟与伤口区域相邻的环境，或者在高密度形成诸如在健康眼睛表面存在的融合的完整单层，随后用PBS载体(对照组)或高分子量和低分子量以及未分级的SDP溶液处理。然后测量处理细胞的细胞表面积以评估细胞扩散(图11A和11B)。与在较低密度下培养的细胞相比，在紧密细胞片中的细胞具有较低的平均表面积，其具有更大的扩散空间。然而，对于低和高细胞密度，用未分级SDP孵育刺激细胞表面积的强烈增加，并且当用高分子量丝处理细胞时细胞扩散程度进一步增加。有趣的是，观察到的细胞反应是分子量依赖性的，因为与非丝素蛋白处理的(对照组)细胞相比，用低分子量丝处理不会导致细胞扩散的任何显著增加。

实施例13：RNA分离和定量的PCR

将HCLE细胞以每皿6×10⁵细胞接种于35mm培养皿中，并在4mg/mL不同SDP蛋白质溶液(高分子量、低分子量或未分级分离)或PBS运输对照组存在下培养12小时。然后使用Qiagen RNeasy Plus Mini Kit(Qiagen,Valencia,CA,USA)提取总RNA，并使用AgilentTechnologies 2100生物分析仪和Nanodrop分光光度计在Weill Cornell MedicalCollege的Genomics Resources Core Facility检查RNA完整性和数量。然后，使用HighCapacity cDNA Reverse Transcription试剂盒(Applied Biosystems,LifeTechnologies,Grand Island,NY)将来自每个样品的450ng总RNA逆转录成cDNA。使用SYBRSelect Master Mix Kit(Applied Biosystems，Life Technologies，Grand Island，NY)和以下特异性引物，在Step One Plus实时PCR系统(Applied Biosystems,LifeTechnologies,Grand Island,NY)进行定量PCR，并且所述特异性引物如下：

hTGFA-Fw:TTTTGGTGCAGGAGGACAAG(SEQ ID NO:1)

hTGFA-Rv:GCACACATGTGATGATAAGG(SEQ ID NO:2)

hTGFB1Fw:AATGGTGGAAACCCACAACG(SEQ ID NO:3)

hTGFB1-Rv:GCTGCTCCACTTTTAACTTG(SEQ ID NO:4)

hTGFB2Fw:GTTCAGAGTCTTTCGTTTGC(SEQ ID NO:5)

hTGFB2-Rv:TCAGTTACATCGAAGGAGAG(SEQ ID NO:6)

hTGFB3-Fw:ATGAGCACATTGCCAAACAG(SEQ ID NO:7)

hTGFB3-Rv:GGACAGTGAATGCTGATTTC(SEQ ID NO:8)

候选基因的表达被针对持家基因，甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)，进行标准化。使用2^(–ΔΔCt)方法进行相对定量化。

实施例14:TGFβ信号在SDP诱导的伤口闭合中的作用

为了评估TGFβ信号传导可能的参与SDP诱导的伤口闭合，使用TGFβRI特异性抑制剂(5μM,SB431542,Tocris Bioscience,Ellisville,MO)在伤口闭合期间抑制HCLE细胞中的TGFβ信号传导途径。将HCLE细胞以5x10⁴细胞/cm²接种于24孔板(VWR Radnor,PA,USA)中，并使其在K-SFM培养基中孵育24小时以形成熔合的单层细胞。然后如前所述，在存在低分子量SDP蛋白质溶液或PBS载体的情况下进行擦痕测定，其具有或不具有5μM的TGFβRI特异性抑制剂SB431542，以阐明在SDP诱导的细胞迁移和加速伤口愈合期间TGFβ介导的信号传导的作用。进行双因素ANOVA测试以揭示任何实验组是否受SDP分子量差异的影响，并确定不同治疗组和对照组之间细胞反应的统计学显著变化。P值的计算使用了Prism软件。

进行QPCR操作，并分析了TGFβ1、TGFβ2和TGFβ3的遗传表达(图12)。SDP显示出影响TGFβ基因表达。相对于非丝素蛋白处理的(对照组)细胞和用未分级丝处理的细胞，用低分子量SDP处理诱导的TGFβ2基因表达分别增加2倍和增加1.75倍。用未分级丝或低分子丝处理不会导致TGFβ1基因表达的显著变化，而低分子量丝的TGFβ3基因表达显著增加。另外，当用高分子量丝处理细胞时，所有基因的遗传表达显著降低，进一步证明了SDP刺激作用对分子量的依赖性。

刮擦测试，在不存在或存在5μM的TGFβRI抑制剂SB43152的情况下，采用了PBS载体(对照)或低分子量SDP治疗HCLE细胞。TGFβ信号通路抑制剂显示出阻止低分子量SDP促发细胞的迁移和伤口的愈合。结果表明，通过抑制TGFβ信号(图13A和13B)降低了对细胞迁移的低分子量SDP刺激。用低分子量的丝处理的细胞在SB43152的存在下，明显降低了治疗速度，经16小时降低～20％伤口愈合，相较于在不存在SB43152的情况下用低分子量丝处理的细胞。值得注意的是，与没有SB431542的非丝素处理细胞相比，添加SB431542也降低了细胞迁移和伤口闭合速率。

实施例15

预备了一种伤口治疗组合物的样本。蛋白质片段从丝衍生纤维蛋白质组合物中按照分子量进行分离，形成了诸如小于约60kDa的低分子量蛋白质片段的第一水解物。还形成了诸如大于约60kDa的高分子量蛋白质片段的第二水解物。还形成蛋白质片段的第三水解物，其来自于所述第一水解物和第二水解物，适于小于约60kDa和大于约60kDa的蛋白质片段的混合物。每种水解物包含水，至少一种缓冲体系(如PBS、柠檬酸、硼酸盐)，至少一种防腐剂，至少一种附加辅料(稳定剂、盐)。

所述第一水解物用于健康患者的外科手术(例如屈光后手术)伤口。针对伤口闭合速率和病人舒适度以及疼痛评估而随着时间的推移对伤口进行监测。

第二水解物被施于慢性伤口、糖尿病性溃疡或烧伤创面。所述伤口针对其闭合情况被监测。

第三水解物被施用于任何伤口。所述伤口针对其闭合速度和质量被监测。

Claims (33)

1.一种治疗伤口或疤痕的方法，其包括：

将丝素蛋白衍生蛋白质(SDP)片段的组合物施用于伤口中的活动物组织，其中多个所述SDP片段终止于酰胺(-C(＝O)NH₂)基团，从而治疗伤口或瘢痕。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述组合物包含SDP片段，其具有与天然丝素蛋白相比，在丝氨酸、甘氨酸和丙氨酸的组合氨基酸含量方面至少4％不同的一级氨基酸序列。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述组合物包含SDP片段，其丝氨酸含量与天然丝素蛋白相比降低了40％以上，其中所述丝氨酸含量为至少约5％。

4.根据权利要求1-3任一项所述的方法，其中丝素蛋白重蛋白链和丝素蛋白轻蛋白链之间的半胱氨酸二硫键被减少或消除。

5.根据权利要求1-4任一项所述的方法，其中，与天然丝素蛋白相比，所述组合物在水溶液中具有增强的稳定性。

6.根据权利要求1-5任一项所述的方法，其中所述SDP片段衍生自蚕丝、蜘蛛丝或基因工程丝。

7.根据权利要求1-6任一项所述的方法，其中所述SDP片段衍生自Bombyx mori。

8.根据权利要求1-7任一项所述的方法，其中所述组合物包含平均分子量为约30kDa至60kDa的SDP片段。

9.根据权利要求1-8任一项所述的方法，其中至少75％的所述SDP片段的分子量小于约100kDa，小于约80kDa，小于约60kDa，小于约50kDa，小于约30kDa，或小于约10kDa。

10.根据权利要求1-8任一项所述的方法，其中至少90％的所述SDP片段的分子量小于约100kDa，小于约80kDa，小于约60kDa，小于约50kDa，小于约30kDa，或小于约10kDa。

11.根据权利要求1-8任一项所述的方法，其中至少75％的所述蛋白质片段的分子量为约30kDa至60kDa。

12.根据权利要求1-8任一项所述的方法，其中至少90％的所述蛋白质片段的分子量为约30kDa至60kDa。

13.根据权利要求1-8任一项所述的方法，其中至少75％的所述蛋白质片段的分子量为约10kDa至30kDa。

14.根据权利要求1-8任一项所述的方法，其中至少90％的所述蛋白质片段的分子量为约10kDa至30kDa。

15.根据权利要求1-8任一项所述的方法，其中至少50％的所述蛋白质片段的分子量大于约60kDa。

16.根据权利要求1-15任一项所述的方法，其中所述SDP片段促进组织中的细胞迁移和增殖以闭合所述伤口。

17.根据权利要求1-16任一项所述的方法，其中所述伤口是眼部伤口、手术伤口、切口、皮肤溃疡或擦伤。

18.根据权利要求17所述的方法，其中所述眼部伤口是由眼部病症引起的，并且其中所述眼部病症是角膜溃疡、角膜糜烂、角膜磨损、角膜变性、角膜穿孔、角膜瘢痕、上皮缺损、角膜结膜炎、特发性葡萄膜炎、角膜移植、干眼综合征、年龄相关性黄斑变性、糖尿性眼病、睑缘炎、青光眼、高眼压、术后眼痛和炎症、后段新生血管、增生性玻璃体视网膜病变、巨细胞病毒性视网膜炎、眼内炎、脉络膜新生血管膜、血管闭塞性疾病、过敏性眼病、肿瘤、色素性视网膜炎、眼部感染、巩膜炎、眼睑下垂、瞳孔缩小、眼痛、瞳孔散大、神经痛、瘢痕性眼表疾病、眼部感染、炎症性眼病、眼表疾病、角膜疾病、视网膜疾病、系统性疾病的眼部表现、遗传性眼病、眼部肿瘤、眼压升高、疱疹感染、翼状胬肉或巩膜肿瘤、持续到眼表面的伤口、光折射角膜切开术后眼睛疼痛和炎症、热或化学角膜灼伤、巩膜创伤、或圆锥角膜和结膜创伤。

19.根据权利要求1-18任一项所述的方法，其中所述SDP片段增加所述伤口细胞中转化生长β因子信号传导。

20.一种用于治疗伤口或疤痕的组合物，其包括：

丝素蛋白衍生蛋白(SDP)片段，其中多个所述SDP片段终止于酰胺(-C(＝O)NH₂)基团。

21.根据权利要求20所述的组合物，其中所述SDP片段具有与天然丝素蛋白相比，在丝氨酸、甘氨酸和丙氨酸的组合氨基酸含量方面，至少4％不同的一级氨基酸序列。

22.根据权利要求20或21所述的组合物，其中所述SDP片段的丝氨酸含量与天然丝素蛋白相比降低了40％以上，其中所述丝氨酸含量为至少约5％。

23.根据权利要求20-22任一项所述的组合物，其中至少75％的所述SDP片段的分子量小于约100kDa。

24.根据权利要求20-23任一项所述的组合物，其中所述SDP片段促进组织中的细胞迁移和增殖以闭合所述伤口。

25.根据权利要求20-24任一项所述的组合物，其中所述组合物是被配制成水溶液，悬浮液，分散液，油膏，软膏，凝胶，霜剂，洗剂，喷雾剂或糊剂。

26.根据权利要求20-25任一项所述的组合物，其中所述组合物包含药物载体。

27.根据权利要求20-26任一项所述的组合物，其中所述药物载体是磷酸盐缓冲盐水，膜，纤维，泡沫，水凝胶，基质，三维支架，微粒，纳米颗粒，聚合物或垫状物。

28.根据权利要求20-27任一项所述的组合物，其中所述SDP片断附着于基底。

29.根据权利要求28所述的组合物，其中所述基底是角膜移植物，伤口敷料，隐形镜片，组织，组织移植物或可降解材料。

30.一种用于治疗伤口的组合物的制备方法，其包括

将丝素蛋白衍生蛋白质片段的第二组合物与丝素蛋白衍生蛋白质片段的第一组合物分离，在所述第二组合物中的丝素蛋白衍生蛋白质片段具有与在所述第一组合物中的丝素蛋白衍生蛋白质片段相比较低的平均分子量，

其中所述第一组合物中的所述蛋白质片段具有与天然丝素蛋白相比，在丝氨酸、甘氨酸和丙氨酸的组合氨基酸含量方面至少4％不同的一级氨基酸序列；

其中所述第一组合物中的多个所述蛋白质片段终止于酰胺(-C(＝O)NH2)基团；

其中所述第一组合物的丝氨酸含量与天然丝素蛋白相比降低了40％以上，其中所述丝氨酸含量为至少约5％。

31.根据权利要求30所述的方法，其中所述第二组合物中至少75％的所述蛋白质片段的分子量小于约100kDa。

32.根据权利要求30或31所述的方法，其中所述第二组合物是通过离心作用与所述第一组合物分离。

33.根据权利要求30-32任一项所述的方法，其中所述第一组合物的制备工艺包括：

在升高的压力下加热水性丝素蛋白溶液，

其中所述水性丝素蛋白溶液包含浓度至少为8M的溴化锂，以及

其中将所述水性丝素蛋白溶液在至少约10PSI的压力下加热到至少约105℃(221°F)达至少约20分钟；

提供所述第一组合物，其中所述第一组合物包含小于8.5％的丝氨酸氨基酸残基，并且所述第一组合物，作为10％w/w水溶液，具有低于5cP的水性粘度。