CN110051623B

CN110051623B - 一种抗疱疹病毒凝胶剂及其制备方法

Info

Publication number: CN110051623B
Application number: CN201910364813.1A
Authority: CN
Inventors: 王一飞; 马婧; 吴燕婷
Original assignee: Guangzhou Jinan Biomedical Research And Development Center
Current assignee: Guangzhou Jinan Biomedical Research And Development Center
Priority date: 2019-04-30
Filing date: 2019-04-30
Publication date: 2022-07-05
Anticipated expiration: 2039-04-30
Also published as: CN110051623A

Abstract

本发明属于制药技术领域，具体涉及一种抗疱疹病毒凝胶剂及其制备方法。该抗疱疹病毒凝胶剂主要由AT‑533、丙二醇、酰胺化修饰丝素蛋白、卡波姆、三乙醇胺和水组成。本发明提供的抗疱疹病毒凝胶剂具有生物利用度高，稳定性好，不容易污染衣着等优点，同时该抗疱疹病毒凝胶剂还具有不含渗透促进剂，抗病毒药物吸收效果好，对皮肤刺激性低，可以有效的促进病毒性疱疹的愈合，缩短愈合时间的优点，是一种较为理想的抗疱疹病毒药物剂型。

Description

一种抗疱疹病毒凝胶剂及其制备方法

技术领域

本发明属于制药技术领域，具体涉及一种抗疱疹病毒凝胶剂及其制备方法。

背景技术

单纯疱疹病毒(HSV)是一类引起皮肤病和性病的常见病原体，根据抗原性的不同，单纯疱疹病毒分为I型和II型单纯疱疹病毒。I型单纯疱疹病毒(HSV-1)常引起嘴唇或面部唇疱疹，同时还可以感染中枢神经系统。II型单纯疱疹病毒(HSV-2)多与生殖器感染或新生儿感染有关。有研究表明，HSV与艾滋病的传播有密切关系，是严重危害人们健康的病原体。

水痘-带状疱疹病毒(VZV)是引起儿童常见的一种急性、高传染性的水痘疾病的病原体。带状疱疹是水痘治愈后潜伏在体内的病毒被再激活所致，健康儿童感染VZV后症状一般轻微，预后良好。但在某些特殊人群，如免疫功能缺陷及使用免疫抑制剂治疗过的儿童，会导致严重后果，甚至引起死亡。

有大量的研究显示，四氢吲唑酮类Hsp90抑制剂具有抗病毒活性，其可以通过特异性调节宿主细胞Hsp90基因的蛋白水平，发挥其抗病毒活性，而且不会产生耐药性的问题。专利文献CN1896060A公开了四氢吲哚酮的衍生物和四氢吲唑酮的衍生物及它们的应用，其公开了四氢吲哚酮的衍生物和四氢吲唑酮的衍生物具有抑制肿瘤细胞及恶性细胞生长的特点，如乳腺癌、肺癌、宫颈癌、直肠癌、前列腺癌、肝癌、血癌等癌细胞。专利文献CN101273991A公开了四氢吲哚酮/四氢吲唑酮/四氢咔唑衍生物及其盐在制备抗病毒药物中的应用，其公开了四氢吲哚酮/四氢吲唑酮/四氢咔唑衍生物及其盐对疱疹病毒I和II型，柯萨奇病毒III型(CVB3)，乙肝病毒等具有很好的抗病毒活性。

另外，鞠怀强发表了一篇题目为“新型HSP90抑制剂BJ-B11抗病毒及抗肿瘤作用研究”的论文，该论文表明Hsp90抑制剂BJ-B11能够显著的抑制人单纯疱疹病毒(HSV-1/HSV-2)体外增殖的活性，可以有效的治疗单纯疱疹病毒感染症。

然而，四氢吲唑酮类Hsp90抑制剂的溶解度很小，在使用时难以达到临床用药浓度，而且其在体内分布无特异性，肠毒性较强，容易产生腹泻等肠道毒副作用，大大的限制了四氢吲唑酮类Hsp90抑制剂的应用。

现有技术为了提高热休克蛋白90抑制剂的溶解性，将其制成软膏剂，专利文献CN105311636A公开了一种抗疱疹病毒软膏剂及其制备方法，该抗疱疹病毒软膏剂主要由热休克蛋白90抑制剂、油相基质、乳化剂、渗透促进剂、防腐剂和水组成，该软膏剂可以直接涂抹于病变部位，克服了热休克蛋白90抑制剂溶解度差，给药困难和体内给药具有严重的肠毒性的缺陷，同时该软膏剂载药量和透皮率高，可以快速、有效的治疗疱疹病毒感染症，大大的减轻疱疹病毒感染症患者的痛苦。然而软膏剂中含有渗透促进剂，对皮肤具有较大的刺激性，不利于病毒性疱疹的愈合。

因此，研究和发开出一种四氢吲唑酮类Hsp90抑制剂溶解度高，不会产生耐药性，毒副作用小，抗疱疹病毒效果显著，刺激性低和稳定性高的四氢吲唑酮类Hsp90抑制剂药物剂型仍是目前亟需解决的问题。

发明内容

为了克服现有技术中四氢吲唑酮类Hsp90抑制剂药物剂型存在的缺陷，本发明的目的在于提供一种抗疱疹病毒凝胶剂及其制备方法，以解决上述的问题。本发明提供的抗疱疹病毒凝胶剂具有AT-533溶解度高、不含有透皮促渗透剂，抗疱疹病毒效果显著、刺激性低和稳定性高的优点。

本发明提供了一种抗疱疹病毒凝胶剂，包括以下组分及其重量百分数：

AT-533 0.02～0.05％、丙二醇50～70％、酰胺化修饰丝素蛋白0.05～0.1％、卡波姆0.3～0.5％、三乙醇胺0.2～0.5％和水25～50％。

进一步地，所述的抗疱疹病毒凝胶剂包括以下组分及其重量百分数：

AT-533 0.04％、丙二醇60％、酰胺化修饰丝素蛋白0.08％、卡波姆0.4％、三乙醇胺0.3％和水39.18％。

进一步地，所述AT-533为2-(4-羟基环己氨基-4-(1-(3,6,6-三甲基-4-氧-4,5,6,7-四氢吲哚))苯甲酰胺，所述AT-533的英文名称为2-[(4-hydroxycyclohexyl)amino]-4-(4,5,6,7-tetrahydro-3,6,6-trimethyl-4-oxo-1H-indazol-1-yl)-benzamide。

进一步地，所述酰胺化修饰丝素蛋白的制备方法为：

将丝素蛋白和酰胺基甘氨酸溶于浓度为7mol/L的尿素水溶液中，接着用浓度为1.5mol/L的盐酸溶液调节pH值至4.75，然后再加入浓度为0.1mol/L的1-乙基3-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亚胺，在室温下反应1～1.5h，在反应过程中滴入1.5mol/L的盐酸溶液，保持反应液的pH在4.75，反应结束后，加入pH为4.75的乙酸缓冲液，分解过量的1-乙基3-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亚胺，接着将反应液在去离子水中进行透析，冷冻干燥，即得。

进一步地，所述丝素蛋白的尿素水溶液的浓度为10mg/mL。

进一步地，所述酰胺基甘氨酸的尿素水溶液的浓度为1mol/L。

进一步地，所述卡波姆为卡波姆C型。

另外，本发明还提供了所述的抗疱疹病毒凝胶剂的制备方法，包括以下步骤：

S1将丙二醇加热至70～80℃，加入AT-533，搅拌均匀，得混合液I；

S2将卡波姆加入步骤S1得到的混合液I中搅拌至完全分散，加入水搅拌至完全溶解，得混合液II；

S3将三乙醇胺和酰胺化修饰丝素蛋白加入步骤S2得到的混合液II中搅拌均匀，即得。

本发明提供的AT-533为四氢吲唑酮类Hsp90抑制剂中的一种，其主要通过特异性调节宿主细胞Hsp90基因的蛋白水平，其抗病毒活性可以通过多种途径发挥，而且该药物药物全身毒性小，稳定性好，不会产生耐药性。

然而，四氢吲唑酮类Hsp90抑制剂的溶解度很小，现有技术为了提高其溶解度，将其制成软膏剂，具体为将四氢吲唑酮类Hsp90抑制剂溶解于油相基质中，添加渗透促进剂用于增加Hsp90抑制剂经皮肤或粘膜的透过率。但是，油相的软膏剂比较油腻，不利于病毒性疱疹的涂抹使用，而且，该渗透促进剂对皮肤具有较大的刺激性，不利于病毒性疱疹的治疗与愈合。

本发明提供了一种抗疱疹病毒的凝胶剂，其具有生物利用度高，稳定性好，不容易污染衣着的优点，同时该抗疱疹病毒凝胶剂还具有不含渗透促进剂，抗病毒药物吸收效果好，对皮肤刺激性低，可以有效的促进病毒性疱疹的愈合，缩短愈合时间的优点，是一种较为理想的抗疱疹病毒药物剂型。

本发明将抗疱疹病毒药物AT-533制成凝胶剂时，由于AT-533在水溶液体系中溶解度小，易析出，需增加丙二醇添加量达到60％左右时，才能保证AT-533凝胶剂的冷热稳定性，形成稳定均一的凝胶剂，但是，丙二醇对皮肤有刺激性，尤其是当含量达到60％时，其对皮肤的刺激性会增加，延缓受损皮肤的愈合，同时，用于中和卡波姆基质的胺类碱对皮肤也具有刺激性，也会阻碍病毒性疱疹的愈合。

本发明人经过大量的摸索试验发现，将酰胺化修饰丝素蛋白添加到凝胶剂中可以有效的缓解丙二醇和三乙醇胺对皮肤的刺激性，同时，酰胺化修饰丝素蛋白与丙二醇联合使用可以促进皮肤对抗疱疹病毒药物AT-533的透皮吸收率，从而提高抗疱疹病毒药物AT-533的生物利用度。

进一步地，卡波姆分子结构中含有大量羧基，酰胺化修饰丝素蛋白可以有效的吸附带负电荷的羧基，与卡波姆形成较为稳定的复合物，可以降低中和剂三乙醇胺的添加量，同时还可以有效的提高卡波姆的稳定性，可以有效的维持抗疱疹病毒药物AT-533的含量不变，从而可以更好的提高凝胶剂的稳定性。

与现有技术相比，本发明提供的抗疱疹病毒凝胶剂具有如下优势：

1)本发明提供的抗疱疹病毒凝胶剂有效成分明确，毒副作用小，载药量高，药理药效确切，对疱疹病毒引起的感染症具有显著的治疗效果；

2)本发明提供的抗疱疹病毒凝胶剂克服了Hsp90抑制剂在体内溶解度小、不稳定和具有严重的肠毒性的缺陷，而且经皮吸收率高，对皮肤的刺激性小，是一种理想的抗疱疹病毒制剂，有利于该抗疱疹病毒凝胶剂的推广和应用。

具体实施方式

以下通过具体实施例进一步描述本发明，本发明不仅仅限于以下实施例。在本发明的范围内或者在不脱离本发明的内容、精神和范围内，对本发明进行的变更、组合或替换，对于本领域的技术人员来说是显而易见的，且包含在本发明的范围之内。

实施例1、酰胺化修饰丝素蛋白的制备

将丝素蛋白和酰胺基甘氨酸溶于浓度为7mol/L的尿素水溶液中，所述丝素蛋白的尿素水溶液的浓度为10mg/mL，所述酰胺基甘氨酸的尿素水溶液的浓度为1mol/L，接着用浓度为1.5mol/L的盐酸溶液调节pH值至4.75，然后再加入浓度为0.1mol/L的1-乙基3-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亚胺，在室温下反应1.5h，在反应过程中滴入1.5mol/L的盐酸溶液，保持反应液的pH在4.75，反应结束后，加入pH为4.75的乙酸缓冲液，分解过量的1-乙基3-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亚胺，接着将反应液在去离子水中进行透析，冷冻干燥，即得。

实施例2、一种抗疱疹病毒凝胶剂

所述抗疱疹病毒凝胶剂由以下组分及其重量百分比组成：

AT-533 0.02％、丙二醇50％、酰胺化修饰丝素蛋白0.06％、卡波姆C型0.3％、三乙醇胺0.3％和水49.32％；所述酰胺化修饰丝素蛋白为实施例1制得的酰胺化修饰丝素蛋白。

制备方法：

S1将丙二醇加热至75℃，加入AT-533，搅拌均匀，得混合液I；

实施例3、一种抗疱疹病毒凝胶剂

所述抗疱疹病毒凝胶剂由以下组分及其重量百分比组成：

AT-533 0.04％、丙二醇60％、酰胺化修饰丝素蛋白0.08％、卡波姆C型0.4％、三乙醇胺0.3％和水39.18％；所述酰胺化修饰丝素蛋白为实施例1制得的酰胺化修饰丝素蛋白。

制备方法与实施例2类似。

实施例4、一种抗疱疹病毒凝胶剂

所述抗疱疹病毒凝胶剂由以下组分及其重量百分比组成：

AT-533 0.05％、丙二醇70％、酰胺化修饰丝素蛋白0.1％、卡波姆C型0.5％、三乙醇胺0.5％和水28.85％；所述酰胺化修饰丝素蛋白为实施例1制得的酰胺化修饰丝素蛋白。

制备方法与实施例2类似。

对比例1、一种抗疱疹病毒凝胶剂

所述抗疱疹病毒凝胶剂由以下组分及其重量百分比组成：

AT-533 0.04％、丙二醇60％、卡波姆C型0.4％、三乙醇胺0.3％和水39.26％。

制备方法与实施例2类似。

与实施例3的区别在于：缺少酰胺化修饰丝素蛋白。

对比例2、一种抗疱疹病毒凝胶剂

所述抗疱疹病毒凝胶剂由以下组分及其重量百分比组成：

AT-533 0.04％、丙二醇60％、丝素蛋白0.08％、卡波姆C型0.4％、三乙醇胺0.3％和水39.18％。

制备方法与实施例2类似。

试验例一、抗疱疹病毒凝胶剂的刺激性试验

1、试验材料：

实施例2、实施例3和实施例4制备得到的抗疱疹病毒凝胶剂。

2、试验方法：

取8只白色家兔，雌雄各半，随机分配为4组，每组2只，试验前24h将家兔背部脊柱左、右两侧被毛剪掉，去毛范围各约为3cmX3cm。取实施例2、实施例3和实施例4制备得到的抗疱疹病毒凝胶剂待测凝胶约0.5g直接涂在左侧皮肤上，然后用二层纱布和一层玻璃纸覆盖，再用无刺激性胶布和绷带固定，右侧皮肤作为对照。以不含AT533药物的本发明实施例3的空白凝胶为空白对照组。每次敷用4h后，观察家兔皮肤反应，并用温水清除给药部位残留的凝胶。连续给药7天，每天一次，在最后一次清除待测凝胶后的1、24、48和72h观察涂抹部位皮肤是否有红斑、水肿、色素等刺激现象。

3、试验结果：

试验结果如表1所示。

表1抗疱疹病毒凝胶剂的刺激性试验

由表1可知，本发明提供的抗疱疹病毒凝胶剂对家兔皮肤无毒、无刺激性，更有利于病毒性疱疹的治疗与愈合，而且其对有损伤的皮肤，也基本刺激性，可以促进损伤皮肤的愈合，而对比例1和对比例2制备得到的抗疱疹病毒凝胶剂对有损伤的皮肤具有刺激性，延缓病毒性疱疹的的愈合。

试验例二、抗疱疹病毒凝胶剂的透皮吸收试验

1、试验对象：

实施例2、实施例3、实施例4和对比例1制备的抗疱疹病毒凝胶剂，专利申请号为20150793213.9的实施例2制备得到的抗疱疹病毒软膏剂。

2、试验方法：

采用改良的Franz双室渗透装置，以离体小鼠皮肤为透皮屏障，以Hsp90抑制剂-AT-533为指标，采用体外扩散池法，进行体外渗透试验。分别称取3g实施例2、实施例3、实施例4和对比例1制备的抗疱疹病毒凝胶剂3，专利申请号为20150793213.9的实施例2制备得到的抗疱疹病毒软膏剂(记为对照例一)各三份，均匀涂抹于离体小鼠皮肤后进行透皮试验，分别于给药后1、2、4、6、8、10、12、14h各取接受液1mL，采用高效液相色谱法测定Hsp90抑制剂-AT-533的累积渗透量，取样后即向接收池内补充1ml含2％吐温80的PBS液。其累积渗透量的计算公式如下：

其中：Cn为第n个取样点测得的药物浓度；A为渗透面积；Ci为第i(i<n—1)个取样点测得的药物浓度。以累积渗透量的平均值分别对时间t分别按零级、一级及Higuchi方程进行拟合，所得方程的斜率即为透皮速率常数J。其中扩散池面积为2.92cm²，接收液体积为7ml，接收液温度为37±0.5℃，磁振子转速200r·min^-1，接收液为含2％吐温-80的PBS液。

3、试验结果：

试验结果如表2所示，以零级速率透皮转运，则Q-t直线的斜率即为透皮吸收速率。

表2抗疱疹病毒凝胶剂的透皮吸收试验

	透皮吸收速率(μg/(cm<sup>2</sup>·h))
		实施例2	4.01
实施例3	4.04
		实施例4	3.99
对比例1	3.85
		对照例一	4.11

由表2可知，本发明提供的抗疱疹病毒凝胶剂的透皮吸收速率与添加渗透促进剂的软膏的吸收率效果基本一致，证明本发明提供的抗疱疹病毒凝胶剂透皮吸收率高，更有利于疱疹病毒感染症的治疗。

试验例三、抗疱疹病毒凝胶剂的药效学试验

1、试验材料：

2、试验对象：

选取豚鼠15只，购于广东省医学实验动物中心。

3、试验方法：

将25只豚鼠按性别、体重随机分为5组，分别为实施例2、实施例3、实施例4、对比例1和对照例一组，每组5只。然后使用8％的Na₂S脱毛剂将豚鼠背部的毛脱去，洗净，用7针梅花针深刺后，滴加30μLHSV-1原液感染。感染后2h，均匀涂抹实施例2、实施例3、实施例4和对比例1制备的抗疱疹病毒凝胶剂，专利申请号为20150793213.9的实施例2制备得到的抗疱疹病毒软膏剂(记为对照例一)，每天2次，每天观察豚鼠背部皮肤的病变情况，当豚鼠皮肤病变级别为0级时停止给药，并记录豚鼠皮肤病变级别为0级的天数。

其中：皮肤病变级别的评判标准如下：

0.5级，皮肤发红；1级，出疱1-3个；2级，出疱3-5个；3级，出疱6-10个；4级，出疱>10个；20％～40％结痂降1级；50％～100％结痂降2级；10％～50％脱痂为0.5级；60％～100％脱痂为0级。

3、试验结果

试验结果如表3所示。

表3抗疱疹病毒凝胶剂的药效学试验

	豚鼠皮肤病变级别为0级的天数(天)
		实施例2	11
实施例3	9
		实施例4	12
对比例1	17
		对照例一	15

由表3可知，本发明提供的抗疱疹病毒凝胶剂可以有效的缩短病毒性疱疹的愈合时间，提高治疗效果。

试验例四、抗疱疹病毒凝胶剂的稳定性试验

1、试验材料：

实施例3、对比例1和对比例2制备得到的抗疱疹病毒凝胶剂。

2、试验方法：

将实施例3、对比例1和对比例2制备得到的抗疱疹病毒凝胶剂采用铝箔袋+纸盒包装，在温度为25±2℃，相对湿度为60％±10％，进行6个月温室留样试验，对样品的外观、重量差异、微生物限度进行考察测定。

3、试验结果：

试验结果如表4-6所示。

表4实施例3制备得到的抗疱疹病毒凝胶剂的稳定性试验

由表4可知，本发明制备得到的抗疱疹病毒凝胶剂在温度为25±2℃，相对湿度为60％±10％的条件下保存6个月，其外观、重量差异、微生物限度均符合规定，而且AT-533含量基本不变，具有较高的稳定性。而缺少酰胺化修饰丝素蛋白的对比例1和含有丝素蛋白的对比例2制备得到的抗疱疹病毒凝胶剂在温度为25±2℃，相对湿度为60％±10％的条件下保存6个月后，会有白色针状物析出，不利于该凝胶剂的药效发挥。

Claims

1.一种抗疱疹病毒凝胶剂，其特征在于，包括以下组分及其重量百分数：

2-(4-羟基环己氨基-4-(1-(3,6,6-三甲基-4-氧-4,5,6,7-四氢吲哚))苯甲酰胺0.02～0.05％、丙二醇50～70％、酰胺化修饰丝素蛋白0.05～0.1％、卡波姆0.3～0.5％、三乙醇胺0.2～0.5％和水25～50％；

所述酰胺化修饰丝素蛋白的制备方法为：

2.如权利要求1所述的抗疱疹病毒凝胶剂，其特征在于，包括以下组分及其重量百分数：

2-(4-羟基环己氨基-4-(1-(3,6,6-三甲基-4-氧-4,5,6,7-四氢吲哚))苯甲酰胺0.04％、丙二醇60％、酰胺化修饰丝素蛋白0.08％、卡波姆0.4％、三乙醇胺0.3％和水39.18％。

3.如权利要求1所述的抗疱疹病毒凝胶剂，其特征在于，所述丝素蛋白的尿素水溶液的浓度为10mg/mL。

4.如权利要求1所述的抗疱疹病毒凝胶剂，其特征在于，所述酰胺基甘氨酸的尿素水溶液的浓度为1mol/L。

5.如权利要求1或2所述的抗疱疹病毒凝胶剂，其特征在于，所述卡波姆为卡波姆C型。

6.如权利要求1-5任一所述的抗疱疹病毒凝胶剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1将丙二醇加热至70～80℃，加入2-(4-羟基环己氨基-4-(1-(3,6,6-三甲基-4-氧-4,5,6,7-四氢吲哚))苯甲酰胺，搅拌均匀，得混合液I；