JPH07504928A - 高分子グルクロン酸化合物，その製造方法及び用途，特にゲル化剤，粘度付与剤，湿気付与剤，安定剤，キレート化剤又は凝集剤としての用途 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 高分子グルクロン酸化合物、その製造方法及び用途、特にゲル化剤、粘度付与剤 、湿気付与剤、安定剤、キレート化剤又は凝集剤としての用途発明Ω分団 本発明は新規な産業生産物としての高分子グルクロン酸化合物、すなわち、下記 式■で表されるβ（１−４）結合を有するポリグルクロン酸化合物に関する。

本発明は、また、それら新規化合物の製造方法及び用途、特に、ゲル化剤、粘度 付与剤、湿気付与剤、安定剤、キレート化剤、凝集剤、清浄剤及び繊維形成剤と しての用途、またオリゴ糖化合物の製造用の原料としての用途に関する。

本発明は更に、新規な産業生産物であって、醗酵による上記高分子グルクロン酸 化合物の製造に好適に用いられるリゾビウム属に属する特定の細菌菌株、即ち、 リゾビウム・メリロチ　ＮＣＩＭＢ　４０４７２・に関する。

従来技術 本発明のポリマーはβ（１−４）結合を有するグルクロン酸成分又は単位のみか らなり、このような多糖類は今まで報告されていない。

本出願人が知る限りで最も近い従来技術としては、Ｍｅｒｃｋ　Ｉｎｄｅｘ、第 １１版。

（１９８９）、　７５１−７５２頁等に記載されたヒアルロン酸（生成物Ｎｏ、 ４６７５）及び仏国特許公開第ＦＲ−Ａ−２３７８０９２号公報に記載された多 糖類がある。

ヒアルロン酸は、２個の単位、即ちグルクロン酸単位１個及びグルコサミニド単 位１個で構成される繰り返し単位からなる天然多糖類である。グルクロン酸単位 はβ（１−３）結合を有し、グルコサミニド単位はβ（１−４）結合を有し、こ れら２種の単位はこの多糖類中で交互に存在している。上記のＭｅｒｃｋ　Ｉｎ ｄｅｘに記載されたヒアルロン酸の構造式を下記に示す。

仏国特許公開第ＦＲ−Ａ−２３７８０９２号公報に記載された多糖類は、菌株、 プソイドモナス　ＮＣＩＢ　１１２６４　（ＡＴＣＣ３１２６０）から細胞外ル ートで製造され、７個のＤ−グルコース単位（１個の６−位置換グルコース単位 、２個の４−位二置換グルコース単位、２個の３−位置換グルコース単位及び２ 個の４．６−位二置換グルコース単位）と１個の３−位置換Ｄ−ガラクトース単 位とからなる繰り返し単位を有し、この繰り返し単位は酢酸単位１個及びピルビ ン酸単位１個でエステル化されており、このポリマーの側鎖の末端は４．６−０ −　（１−カルボキシエチリデン）−Ｄ−グルコース単位で停止されている。

また、Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、、　（１９８８）、　１７０．５９２５−５ ９２７頁には、土壌から単離された原株、リゾビウム・メリロチ　Ｍ５Ｎ１　（ 本出願人による参照番号）がＪ。

Ｃｏｕｒｔｏｉｓ等により開示されている。この菌株は、下記の醗酵条件下で、 β（１−３）−グルコシド結合を有する多糖類、例えば、下記式の構造を有する ポリマーを生成する。

上記構造（Ｉ　Ｉ　ｌ）は＾、　１ｌｅｙｒａｕｄ等により確認されたものであ る（Ｉｎｔ、　Ｊ。

Ｍａｃｒｏ！１ｏ１．、　（１９８６）、　１１．５５−１１１８頁）。

最後に、Ｇ、　Ｄｅ　Ｒｕ１ｔｅｒ等により、Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ　Ｐｏ ｌｙｍｅｒｓ、　（１９９２）、１１．１−７頁には、ムコール目に属するカビ により生成された細胞外多糖類から、β（１４）結合を有するポリグルクロン酸 化合物が単離されたことが記載されている。

これらのポリグルクロン酸化合物は、上記文献の第３頁の表１にＭｗ５５００〜 １０．０００ダルトン（約３５〜５６ｄｐ）であることが記載されており、実際 は本発明による多糖類とは構造的に、特にその重合度において異なるオリゴ糖で ある。更に、この文献には、２００を超える平均ｄｐ１特に３００以上の平均ｄ ｐを有する本発明の多糖類についての記載も示唆もない。特に、この文献には、 ムコール目に属するカビによって生成され、Ｍｗ５５００〜１０，０００ダルト ンのオリゴ糖の単離源として用いられた上記の細胞外多糖類中に、β（１−４） 結合及び高ｄｐを有するＤ−ポリグルクロン酸多糖類が存在することを示す記載 や示唆はなく、また、それのみの製造に関する記載も示唆もない。

米国特許第２２３２９９０号明細書には、（ｒ）Ｎ０２ガスによる非硝化条件下 でのセルロースの酸化方法が記載されており、（ｉｉ）ｒもし、完全に酸化され たセルロースを水酸化ナトリウム水溶液又はナトリウムの弱酸塩と反応させた場 合には、ポリアンヒドロゲルクロネートが得られるであろう」と推測されている （３頁、右欄、１６−１９行）。ということは、即ち、この方法ではセルロース は部分的にしか酸化されず、セルロースのポリオキサイド骨格のＤ−グルコース 単位のいくつかしかＤ−グルクロン酸単位に転化されていないことを示している 。

この米国特許第２２３２９９０号明細書に記載された方法によって得られた酸化 セルロースは、本発明のβ（１−４）結合を有するＤ−ポリグルクロン酸型の多 糖類とは異なる。この酸化セルロースは、（＋）分子量が本発明のものより大き いこと（米国特許第２２３２９９０号明細書、２頁、右欄、６０〜６４行に、原 料セルロースをポリオキサイド鎖を開裂せずに用いることが記載されている）、 （ｉｉ）本発明の多糖類（及びそれから誘導されるオリゴ糖）はβ（１−４）結 合を有するＤ−ポリグルクロン酸型のポリマーであり、水溶性のＤ−グルクロン 酸単位のみを含有するのに対して、水に溶解しないこと（実施例では、酸化セル ロースのＮａＯＨを２％含有する水への溶解性が記載されているだけである）の ２点において、本発明の多糖類とは異なる。

即ち、この米国特許第２２３２９９０号明細書の記載によれば、上記の酸化方法 では酸化度の低いセルロースしか得られないことがわかる。また、この酸化方法 による生成物が部分的に酸化されたポリオキシ物質であることは、Ａ、　Ｃｅ５ ａｒｏ等によって確認されている（”Ｎｅｗ　Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓ　ｉｎ 　Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ　Ｐｏ１ｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ。

Ｇｏｒｄｏｎ　ａｎｄ　Ｂｒｅａｃｈ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、　１９８５つ。

兄朋公旦迫 本発明の目的は、上記ヒアルロン酸やその他従来の多糖類、特に上記のポリマー 生成物及びアルギン酸塩と異なる構造を有する新規な多糖類であって、特に食品 、食事療法、医薬品（ヒト又は獣医学治療用）、化粧品、農業、浄水及び塗料等 の分野でゲル化剤、粘度付与剤、湿気付与剤、安定剤、キレート化剤、凝集剤、 浄化剤及び繊維形成剤として産業上有用な多糖類を提供することにある。

本発明は、また、それら新規な多糖類、即ちβ（１−４）結合を有する高分子グ ルクロン酸化合物の製造方法を提供することを目的とする。

更に本発明は、オリゴ糖料に属する化合物を製造するための原料としてのこれら 新規な多糖類の用途に関する。

現在、特に、（主に）ヒアルロン酸や、（ｌ！実に必要とする分野では）アルギ ン酸塩に代る高分子材料が必要とされている。この要求に応えるために、ヒアル ロン酸同様の特長を有する物質を製造・開発するための研究がなされてきている 。本発明はこの目的を達成するものである。この目的を達成し、多糖類に属する 新規な物質を提供するため、本発明者らは産業上有用な新規な高分子グルクロン 酸化合物を開発するための研究を重ねた。

兄悲ΩΔ底 第−に、本発明は、（ａ）下記式 ［式中、ｎは平均値が約３００〜２５００である数である。］で表されるβ（１ −４）結合を有するＤ−ポリグルクロン酸、（ｂ）それに対応するエステル、 （Ｃ）それに対応するエーテル及び （ｄ）それらの混合物 からなる群から選ばれる高分子グルクロン酸化合物を提供するものである。

第二に、本発明は、この高分子グルクロン酸化合物の製造方法を提供するもので ある。

具体的には、本発明は、窒素源、炭素源及び塩を含有する栄養培地の存在下、リ ゾビウム属に属し、Ｋ２ＨＰＯ４１ｇ／Ｉ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２００，２ｇ／Ｌ ＮＨ４Ｎｏ３１ｇ／ｌ及びグルコースＬｏｇ／ｌを含有する水性栄養培地中でｐ Ｈ７で培養した場合に多糖類を生成する細菌菌株の醗酵を行うことからなる、式 Ｉで表される高分子グルクロン酸化合物又はそのアルコール基、ＯＨ１の一部が ０−アセチル化されたエステルの製造方法に関する。

第三に、本発明は、新規な産業生産物としての菌株、リゾビウム・メリロチＮＣ ＩＭＢ　４．０４７２（出願人の参照番号：Ｍ５Ｎ１　ｃｓ）に関し、この菌株 は前記した原株　Ｍ５Ｎ１の突然変異によって得られる。

第四に、本発明は、上記高分子グルクロン酸化合物の用途に関し、特に、食品、 医薬（ヒト又は獣医学治療用）、化粧品又は浄水の分野における、ゲル化剤、粘 度付与剤、湿気付与剤、安定剤、可塑剤、キレート化剤又は凝集剤、更にはフィ ルム形成剤、繊維形成剤等としての用途に関する。

第五に、本発明は、農業分野で特に好適に用いられるオリゴ糖の製造における上 記化合物の用途に関する。

竪往 便宜上、本明細書中、下記の略称を用いる。

Ａｃ　＝アセチル Ｂｕ　＝ｎ−ブチル ｄｐ　＝重合度 Ｅｔ　＝エチル ＥｔＯ＝エトキシ ｇａｌ　＝ガラクトース ｇｌｃ　＝グルコース Ａ、ｇｌｕｅ　＝グルクロン酸 ＨＰＬＣ＝高性能液体クロマトグラフィーｉＢｕ　＝イソブチル ｊＢｕｏ　＝インブトキシ ｉＰｒ　＝イソプロピル １Ｐｒｏ　”イソプロポキシ Ｍｌ　＝に２ＨＰ０４１ｇ／ｌ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２００，２ｇ／ｌ。

ＮＨ４ＮＯ３１ｇ／ｌ及びグルコース１０ｇ／ｌを含有する同定用水性栄養培地 であり、この培地中でｐＨ７で培養することにより、ＰＳを生成するりゾビウム 属の菌株と、ＰＳを生成しない菌株とを区別することができる。

Ｍ２　＝本発明に用いられる好ましい製造用水性栄養培地であり、酵母エキス　 １ｇ／ｌ、Ｋ２ＨＰＯ４１ｇ／Ｉ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２００，２ｇ／ｌ及びグル コース、フルクトース又はスクロースＬｏｇ／ｌを含有する。

Ｍ　５　Ｎ　１　＝Ｊ、　Ｃｏｕｒｔｏｉｓ等によりＪ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ 、、（ＩＱ８８）、　１３ＪＪ、　５９２５−５９２７に開示された原株リゾビ ウム・メリロチ。

Ｍ５ＮＩ　Ｃ３＝本発明によるリゾビウム・メリロチ菌株であり、Ｍ５Ｎｌ原株 の突然変異により得られ、ＮＣＩＭＢにＮｏ、４０４７２の番号で寄託されてい る。

Ｍｅ　エステル ＭｅＯ＝メトキシ Ｍｗ　＝重量平均分子量 ＮＣＩ　ＢＭ　＝Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｉｎｄｕｓ ｔｒｉａｌ　ａｎｄ　Ｍａｒｉｎｅ　Ｂａｃｔｅｒｉａ　（■ 株寄託当局として認可された英国組織）Ｏ８＝オリゴ糖 Ｐｒ　＝ｎ−プロピル ＰＳ　＝多糖 ＲＴ　＝室温（１５−２５℃） ｓＢｕ　＝ｓ−ブチル ５ＢｕＯ＝ｓ−ブトキシ ｔＢｕ　はｔ−ブチル ｔＢｕｏ　−ｔ−ブトキシ Ｖｉ　＝固有粘度（又はη） 光皿Ω肛細ム説盟 上述の如く、本発明の高分子グルクロン酸化合物には、式Ｉで表わされるポリ即 ち、本発明の高分子グルクロン酸化合物の具体例としては、式■で表されるポリ グルクロン酸； 式Ｉ中の少なくとも１つのカルボン酸基、Ｃ０ＯＨ，のＯＨ基が０１−０４−ア ルコキシ基で置換された、式１で表されるポリグルクロン酸のエステル二式Ｉ中 の少なくとも１つのアルコール基、ＯＨ，の水素原子がＣ２−Ｃ４脂肪族アシル 基で置換された、式Ｉで表されるポリグルクロン酸のエステル；式Ｉ中の（ｉ） 少なくとも１つのカルボン酸基、Ｃ０ＯＨ，のＯＨ基がＣｔ−０４−アルコキシ 基で置換され、かつ、式Ｉ中の（ｉ　ｉ）少なくとも１つのアルコール基、ＯＨ ，の水素原子がＣ２−Ｃ４脂肪族アシル基で置換された、式ｌで表されるポリグ ルクロン酸のエステル； 式■中の少なくとも１つのアルコール基、ＯＨ１の水素原子がＣＩ　Ｃ４−アル キル基で置換された、式Ｉで表されるポリグルクロン酸のエーテル；式Ｉ中の（ ｉ）少なくとも１つのカルボン酸基、Ｃ０ＯＨ，のＯＨ基がＣｔ−０４−アルコ キシ基で置換され、カリ、式Ｉ中の（ｉ　ｉ）少な（とも１つのアルコール基、 ＯＨ１の水素原子がＣ１−０４−アルキル基で置換された、式！で表されるポリ グルクロン酸のエーテル−エステル；及びそれらの混合物 からなる群から選ばれるものが挙げられる。

上記ＣＩ　Ｃ４−アルコキシ基の炭化水素鎖は直鎖状であっても分岐状であって もよく、該アルコキシ基としては、例えばＭｅｎ、Ｅｔａ、Ｐｒｙ、１Ｐｒｏ。

Ｂｕｄ、１Ｂｕｏ、５Ｂｕｏ及びｊＢｕｏ基が挙げられる。

上記Ｃｔ　Ｃ４−アルキル基の炭化水素鎖は直鎖状であっても分岐状であっても よく、該アルキル基としては、例えばＭｅ、Ｅｔ、Ｐｒ、ｉＰｒ、Ｂｕ。

ｉＢｕ、ｓＢｕ及びｔＢｕ基が挙げられる。−上記Ｃ２−Ｃ４脂肪族アシル基の 炭化水素鎖は直鎖状であっても分岐状であってもよく、該アシル基としては、例 えばＡｃ、Ｃ０Ｅｔ、Ｃ０Ｐｒ及びＣｏ　ｉ　Ｐ　ｒ基が挙げられる。

上記本発明の化合物のなかで好ましいものは、８０，０００〜４００，０００ダ ルトンのＭｗを有し、 式ｌで表されるポリグルクロン酸；及び式！中、アルコール基、ＯＨ，の一部が ０−アセチル化されており、各グルクロン酸環が該グルクロン酸環の重量に基づ いて３３重量％以下の０−Ｃｏ−ＣＨ３基（即ち、ＯＡｃ基）を有する該ポリグ ルクロン酸に対応する酢酸エステル系エステル； からなる群から選ばれる化合物である。

後者の場合、アセトキシ基はグルクロン酸単位の２−位、又は３−位、又は２− 及び３−位に位置する。

勿論、このアセトキシ基は除去してもよい。脱アセチル反応は、８．Ｏを超える ｐＨで（８，Ｏを超えるｐＨへの調整は、強塩基、例えばＮａＯＨ，ＫＯＨ等の アルカリ金属水酸化物を用いて行う）室温で行う。室温及びｐＨ１１の場合、７ −８時間でグルクロン酸環の重量に基づいて３３重量％以下のＯＡｃ基を有する 高分子化合物を脱アセチル化することができる。

式■で表わされる脱アセチル化高分子化合物は、下記式で略記することができる 。

Ａ、ｇｌｕｃβ　ｌ−［−＞４　Ａ、ｑｌｕｃ　β　ｌ−１，−＞４　Ａ、ｑｌ ｕｃ　（１０）本発明の製造方法に好適に用いられる細菌菌株は、（ｉ）リゾビ ウム属に属し、（ｉ　ｉ）同定用の水性栄養培地、即ち、Ｋ２ＨＰＯ４１ｇ／１ ５Ｍｇ５０４・７Ｈ２００，２ｇ／Ｉ、ＮＨ４ＮＯ３１ｇ／ｌ及びグルコース１ ０ｇ／ｌを含有する培地Ｍｌ中でｐＨ７で培養した場合にＰＳを生成する細菌菌 株である。

このような好適な細菌菌株の具体例としては、リゾビウム・メリロチに属し、Ｍ ｗ約１００，０００〜１５０，０００ダルトンの単一プラスミドを含有する菌株 とそれに近縁する菌株である。中でも本発明に好適に用いられる菌株は、リゾビ ウム・メリロチ　ＮＣＩＭＢ　４０４７２である。

本発明による上記高分子グルクロン酸化合物の製造方法は、リゾビウム属に属し 、ｐＨ７で上記水性培地Ｍｌ中で培養することによりＰＳを生成する細菌菌株の 、窒素源、炭素源及び塩の存在下での醗酵を行うことからなる。本発明による上 記高分子化合物の生成は、細胞内生成、細胞外生成のいずれであってもよく、通 常は細胞外生成による。。細胞外生成を行う場合には、Ｋ２ＨＰＯ４０，５〜２ ｇ／１１ＭｇＳＯ４０，０５〜０．３ｇ／Ｌ酵母エキス０．　８〜３ｇ／ｌ及び 糖（ｓｕｇａｒ）　７〜２０ｇ／Ｉを含有する水性培地中、２５〜４０℃の温度 で行う。この水性培地中に用いられる糖（ｓｕｇａｒ）としては制限はなく、特 にグルコース、フルクトース、スクロース及びそれらの混合物から選ばれる糖が 好ましい。

このような水性培地中で適当な時間（好ましくは１００時間以下、或いは必要に 応じて１００時間を超えて）上記細菌の培養を行うことにより、（上記細菌の増 殖期及び増殖を停止した静止期の両方において）式（１）の高分子Ｄ−グルクロ ン酸化合物又はそのアルコール基、ＯＨ，が部分的に０−アセチル化したエステ ルが生成する。その他のエステル及び／又はエーテルは、式Ｉの化合物から公知 の方法によって得られる。

本発明の高分子グルクロン酸化合物の製造用に用いられる上記水性醗酵−培養培 地としては、酵母エキス１　ｇ／Ｌ　Ｋ２ＨＰＯ４１ｇ／Ｌ　ＭｇＳＯ４・７Ｈ ２０（ＭｇＳ０４源）０．２ｇ／Ｉ及び糖（ｓｕｇａｒ）　’ｌ　Ｏｇ／　Ｉ　 （好ましくはグルコース、フルクトース又はスクロース）を含有する３０℃、ｐ Ｈ７（ＮａＯＨ又はＫＯＨの添加により調整）及び酸素分圧（ｐ０２）３０〜１ ００％（所望するアセチル化の程度に応じて異なる）の培地を用いることが好ま しい。

上記醗酵は、細菌個体数１０２細菌／ｍ１以上、好ましくは１０４細菌／ｍ１以 上から開始することが望ましい。１００時間以内の培養により細菌固体数が１０ ’細菌／ｍ１以上になった時点で、直ちに本発明の高分子ポリグルクロン酸を含 有する液体醗酵培地を回収する。この回収は、濾過又は膜透析等の透析、或いは 遠心分離により細菌を醗酵培地から分離し、醗酵液中に含まれる高分子ポリグル クロン酸化合物を回収することにより行う。

得られた濾液、透析液又は上澄み液からの高分子ポリグルクロン酸化合物の単離 は、ＥｔＯＨＳＰｒＯＨ，１ＰｒＯＨ，ＭｅＣＯＭｅ等の有機溶媒による沈殿、 或いはｐＨ３以下の酸性培地中での沈殿により行う。

有機溶媒を用いる沈殿による高分子ポリグルクロン酸化合物の単離は、低温、好 ましくは４℃程度の温度で行うことが好ましい。沈殿物を遠心分離により回収し たのち、乾燥（例えば室温での真空乾燥）する。

酸性培地中で沈殿させて得た高分子ポリグルクロン酸化合物は、遠心分離により 回収し、水洗し、ｐＨ８，０以上の水溶液に分散して精製することが好ましい。

このようにしてアルカリ性溶液に溶解させた高分子ポリグルクロン酸化合物を直 ちに上記の有機溶媒で再沈させる。

カルボン酸基、Ｃ００Ｈ１のエステルは、脱アセチル化したポリマーを公知の方 法でアルキル化することにより得られる。一方、アルコール基、ＯＨ，のエステ ルは、式■で表わされる脱アセチル化した化合物と適当な酸とを公知の方法で反 応させることにより得られる。アルコール基、ＯＨ，のエーテルは、脱アセチル 化した化合物から公知の反応機構を用いて得ることができる。Ｃ０ＯＨ及びＯＨ 基のエステル並びにエーテル−エステルについても同様である。

本発明のβ（１−４）結合を有する高分子ポリグルクロン酸化合物は、多（の分 野で、すなわち、 人及び動物用食品生産業において、例えば粘度付与剤又は構造剤として；紙・板 紙製造業において、例えば塗料添加物又はコーティング剤、更には繊維として； 織物工業において、例えば媒染剤及び繊維として；化粧品製造業において、例え ば粘度付与剤、構造剤、湿気付与剤及び／又は安定剤として； 製薬業（ヒト及び獣医学治療、手術及びガレヌス製剤）において、例えば構造剤 、コーティング剤、安定剤又は吸収剤として、並びに包帯又は人工皮膚用の添加 剤として： 写真工業において、例えばフィルム形成剤として：爆薬製造業において、例えば 乾燥剤又は可塑剤として：清浄剤及び表面活性剤製造業において；インク、塗料 、ワニス、ラッカー、接着剤及びエナメル製造業において、例えば粘度付与、構 造又は可塑化添加剤として；金属加工業（特に酸洗）及び水処理分野において、 例えばキレート化剤又は凝集剤として； ドリリング加工において、例えば掘窄泥水用添加剤として；農業において、例え ばコーティング基材として；及び細胞の固定用の培養基質として： 使用することができる。

本発明のポリグルクロン酸化合物は、特に、従来ヒアルロン酸が用いられてきた 産業分野において、ヒアルロン酸の代替物として好適に用いられることがわかっ た。

具体的には、本発明のポリグルクロン酸化合物は、ヒト及び獣医学治療に極めて 有用であると同時に、繊維及び糸又は紡績糸に成形可能であることから、外科的 用途にも極めて好適に用いられる。特に、本発明のポリグルクロン酸化合物製の 糸は生分解又は水処理により分解する構造を有するため、縫合糸として好適に用 いられる。従って、本発明のポリグルクロン酸化合物製の糸はヒアルロン酸層の 糸に極めて近い物性を有することから、内臓外科における貴重な素材である。

ポリグルクロン酸繊維及び糸は、また、紙及び織物分野においても極めて有用で ある。

本発明のポリグルクロン酸化合物は、また、β（１−４）結合を有するＤ−ポリ グルクロン酸オリゴ糖の製造にも用いられる。具体的には、このＯ８はβ（ｌ− ４）結合を有する上記高分子Ｄ−ポリグルクロン酸化合物の加水分解、特に酸又 は酵素を用いる加水分解により得られる。

この加水分解は、（１）リゾビウム・メリロチ　ＮＣＩＭＢ　４０４７２の存在 下に、培地Ｍ２での醗酵を１００時間を超えて行うことにより、或いは（ｉ　ｉ ）β（１−４）結合を有する高分子ポリグルクロン酸化合物自体、又はそれを含 有する醗酵液を１００時間を超えて２０〜４０℃で培養することにより、或いは （ｉ　ｉ　ｉ）酵素、特にセルラーゼによる開裂反応、或いは（ｉｖ）ｐＨ３以 下の酸性培地中での１００℃、９０時間以上の開裂反応により行うことができる 。

乾燥及び単離を行、って得られるＯ８は広範囲のｄｐを有し、ｄｐ２〜１０の短 鎖ＯＳ、ｄｐ１０〜５０の中間サイズＯＳ及びｄｐ５０〜約１００の長鎖ＯＳを 含む。本発明のＯ８としては、ｄｐ５〜２０のものが好ましい。

これらのＯ８はグルクロン酸単位を含有し、ガラス器内植物作物； 機成長物（特に吸収管系の形成）； 植物の細菌、カビ、ウィルス、その他の外部臨床剤に対する防衛システムの誘発 ：及び コーティング添加物としての種子の保護；に対して有益な効果を発揮することか ら、特に農業分野において有用である。

これらのＯ８は、また、ヒト及び獣医学治療用の医薬品分野において、或いは診 断分野において、特に有効成分の選定手段としても有用である。

立艮Ω鷹榎 本発明の最良の実施態様は、Ｍｗ８０，０００〜４００，０００の式Ｉで表され るポリグルクロン酸の製造にある。このポリグルクロン酸は、細菌菌株であるリ ゾビウム・メリロチ　ＮＣＩＭＢ　４０４７２から製造される。

具体的には、酵母エキス１ｇ／ｌ、Ｋ２ＨＰＯ４１ｇ／１１ＭｇＳＯ４・７Ｈ２ ００，２ｇ／Ｉ及びグルコース、フルクトース又はスクロース１０ｇ／ｌを含有 する水性栄養培地（即ち上記培地Ｍ２）に、３０℃、ｐＨ７及び３０〜製する。

細菌個体数が１０９細菌／ｍ１以上になるまで醗酵を行う（所望とする生成物に 応じて、更に続けてもよい。）。孔径２００ｎｍの濾過器又は濾過膜上でのタン ジェンシャル濾過（ｔａｎｇｅｎｔｉａｌ　ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）により、醗 酵培地から細菌をに分離する。アセチル化又は非アセチル化ポリグルクロン酸を 含有する濾液をＥｔＯＨＳ　１ＰｒＯＨ又はＭｅＣＯＭｅで４℃において処理す る。生じた沈殿を濾過により回収し、次いで乾燥する。このようにして得られた ポリマーを再度溶解し、ｐＨ１１で７〜２４時間室温で処理することにより、脱 アセチル化することができる。

式１で表される多糖類及びそれらのエステル（アルコール基、ＯＨ，が部分的に アセチル化されたエステル）を製造するための菌株、リゾビウム・メリロチＮＣ ＩＭＢ　４０４７２を接種した栄養培地（培地Ｍ２或いはグルコース、フルクト ース、スクロース以外の糖（ｓｕｇａｒ）を含有する同様の培地）の醗酵−培養 の合計時間は、３０℃、ｐＨ７において１００時間以内又は以上である。上記多 糖類及びエステルの生成は、（ａ）菌株の増殖期中、及び／又は、（ｂ）細菌個 体数が１０９細菌／ｍ１以上に達した後の非増殖期において起こる。１００時間 よりかなり短い醗酵−培養時間は、Ｍｗ８０，０００〜４００，０００ダルトン の範囲内でも高分子量域のＰＳの製造に適し、１００時間を超える醗酵−培養時 間は、上記範囲内でも低分子量域のＰＳ又はＯ８の製造に適する。

その他の本発明の利点及び特徴は、下記の製造例及び実験結果により明らかとな るであろう。各データは実例にすぎず、本発明の範囲を限定するものではない。

製造例１ リゾビウム・メリロチ　ＮＣＩＭＢ　４０４７２の製造ａ）朶然皿且 Ｎ−メチル−Ｎ′−二トローＮ−ニトロソグアニジンを用いて上記原株Ｍ５Ｎ１ を突然変異させる。

ｂ）ａ 突然変異の後に得られる生きた細菌の混合物を、培地Ｍｌに接種する。この培地 は、栄養要求性において本発明に関与しないと思われる細菌を排除する機能を有 する。Ｍｌ中のグルコースは、２つの機能を有する。即ぢ、一方においては炭素 源として存在し、他方においては、このグルコースの存在下でＰＳを生成しない 突然変異した又はしていない細菌と、このグルコースの存在下でＰＳを生成する 突然変異した細菌との鑑別を可能にする。

ＰＳを生成するコロニーをアニリンブルー培地で培養することにより、この培地 に陽性反応を示すβ（１−３）−グリコシド結合を有する菌株と、隘性反応を示 す菌株とを鑑別し、後者を採取する。

このようにして採取した菌株の染色体外ＤＮＡ含量（即ち、プラスミド含量）を 分析する。Ｔ、　Ｅｃｋｈａｒｄｔ　（”　Ｐｌａｓｍｉｄ、（１９７８）、１ ゜５８４−５８８頁）により考案された直接ジ−シス法を該菌株に適用する。

上記菌株のプラスミド特性を原料である原株Ｍ５Ｎ１のプラスミド特性と比較し てプラスミド含量の変化した菌株を識別し、それのみを保管する。このようにし て保管される菌株は、ＭｗｌＯｏ、０００〜１５０，０００ダルトンの単一プラ スミドのみを含有し、菌株Ｍ５Ｎ１の構成プラスミド、即ちＭｗ＝１゜ｏｏｏ、 ｏｏｏダルトンのプラスミド２種及びＭｗ＝９０，０００ダルトンのプラスミド １種はもはや含有していない。

このようにして選別した菌株につき、（ｉ）アルファルファへの感染能力を検査 しくアルファルファ：リゾビウム・メリロチの検査用の結節マメ科の植物であり 、アルファルファの根に結節が生じ、感染反応は陽性であった。）、（ｉｉ）次 いで認可された寄託当局へ寄託した。この菌株の受託番号はＮＣＩＭＢ４０４７ ２である。

製造例ＩＩ 増殖条件下での醗酵 リゾビウム・メリロチ　ＮＣＩＭＢ　４０４７２の接種材料［この接種材料は、 菌株ＮＣＩＭＢ　４０４７２を含有する培地Ｍ２　１リツトル（コニカルフラス コ中）からなる。コを、Ｍ２１５リツトルを入れた２０−リットル培養器に入れ る。この接種材料は、細菌懸濁液の細菌個体数が１０９細菌／ｍ１程度にある時 点で用いる。醗酵を下記の条件で行う。

温度：　３０℃ ｐＨ：　１Ｍ以上のＫＯＨの添加により７に保つ。

ｐＯ２：　３０〜１００％（所望とするアセチル化の程度に応じる）攪拌：　１ １００ｒｐ この醗酵工程の終了時には、上記培地はβ（１−４）結合を有する本発明のボリ グルクロン酸ポリマーを１〜５ｇ−１−ｄａｙ−’の量で含有する。培地Ｍ２中 の糖に基づ（収率は２０〜８５％である（測定はベックマンＴＳＫ　２０００Ｓ Ｗカラムを用いるＨＰＬＣにより行い、検出は屈折率測定方により行う。）。

製造伊ＩＩ　Ｉ　Ｉ 非増殖条件下での醗酵 細胞を製造例ＩＩに記載した条件（接種材料／培地）下で培養する。培養器内の 懸濁液中のりゾビウム・メリロチ　ＮＣＩＭＢ　４０４７２が１０９細菌／ｍｌ に達した時点で、マイクロ濾過膜（孔径２００ｎｍ）を用いて醗酵培地を濾過し 、得られた細胞を水洗し、回収する（無菌条件下での連続遠心分離により直接回 収することができる。）。

これらの細胞を ＭｇＳＯ４・７Ｈ２００，２ｇ Ｈ２Ｏｑｓｐ　１リツトル からなる無窒素培地で洗浄した後、グルコース、フルクトース又はスクロース１ ０ｇ／ｌを添加した無窒素培地を入れた醗酵槽に入れる。

このようにして細菌濃度約１０９細菌／ｍ＋の接種をした醗酵槽を、先に増殖条 件下での製造用として記載した条件下にお（。

醗酵終了後の培地は、製造例ＩＩで増殖条件下で得られたと同じポリマーを同様 の濃度で含有する。

製造例ＩＶ 連続醗酵 操作方法は、増殖条件下での製造方法におけると方法と同じである。製造中に培 地の一部を取り出して連続的にマイクロ濾過し、β（１−４）結合を有するポリ グルクロン酸ポリマーを含有する濾液を回収する。濾過により分離された細菌は 、状況に応じ、その細菌を含有しない以外は同一組成の無菌醗酵培地を入れた醗 酵槽にリサイクルすることができる。

製造例■ ポリマーの単離 （ａ）　製造例ＩＩＳ　ＩＩＩ又はＩＶの醗酵培地から、濾過［特に、孔径２０ ０ｎｍの濾過器、例えば５ＡＲＴＯＲＩＵＳ製濾過器、ＭＩＣＲＯ３ＡＲＴＭＩ ＮＩフィルター、を用いるタンジェンシャル濾過、或いは遠心分離により、細菌 を除去する。

（ｂ）　濾液又は上澄み液から、ＥｔＯＨ，１ＰｒＯＨ，ＭｅＣＯＭｅ等の有機 溶媒を用いてβ（１−４）結合を有するポリグルクロン酸化合物を沈殿させ、回 収する。１ＰｒＯＨを用いる場合、必要に応じてＩＭのＮａＣ１の存在下に、７ ０容量％の割合で濾液に添加する。得られる混合物を均質化すると、ポリグルク ロン酸化合物の沈殿が生じる（沈殿には低温、特に４℃が好適である。）。沈殿 を遠心分離により回収し、室温で真空乾燥する。

製造例ＶＩ ポリマーの単離 製造例Ｖの工程（ａ）の後、下記の方法で沈殿を行う。

（ｂ）　酸性培地（ＨＣＩを使用することができる）中、ｐＨ約３で沈殿が起こ る。生じた沈殿を遠心分離により回収し、水洗した後、攪拌下、ｐＨ８の水溶液 に分散させる。ポリマーは再度溶解し、それを製造例Ｖの工程（ｂ）に記載した 如く有機溶媒を用いる濾過により回収するか、或いは、直接乾燥又は脱水して回 収する。

製造例Ｖｌｌ ポリマーの単離 製造例Ｖ及びＶＩの方法で単離したβ（１−４）結合を有するポリグルクロン酸 化合物は低純度であるため、高純度の生成物を得るために下記の条件の操作を行 うことが好ましい。

製造例Ｖの工程（ａ）により得られた濾液又は上澄み液を、孔径６０，０００〜 ｓｏ、ｏｏｏダルトンの膜を用いるタンジェンシャル限外濾過により精製する。

濾液を捨て、代わりに蒸留水を加えることにより、濃縮物を精製する。この操作 を所望の精製度に達するまで繰り返す。減圧下、室温での蒸発により、β（１− ４）結合を有するポリグルクロン酸ポリマーを単離する。

製造例ＶＩＩＩ 脱アセチル化 製造例Ｖｌｌにより単離され、グルクロン酸繰り返し単位の重量に基づき３３重 量％以下のＯＡｃ基を有するポリマーを、ＮａＯＨにより８より高いｐＨで処理 する。室温及びｐＨ１１で一昼夜処理を続けることにより、分子が脱アセチル化 される。

分析 （ａ）　製造例Ｖ−Ｖｌｌによって得られたポリマー及び製造例Ｖｌｌｌによっ て得られたポリマーの分析により、下記のことが分った。

１”）　製造例Ｖ−ＶＩＩＩの生成物は、β（１−４）結合を有するＤ−グルク ロン酸単位のみからなる高分子Ｄ−ポリグルクロン酸化合物である。

２°）　製造例Ｖ−ＶＩＩの生成物は、２−位、３−位又は２−及び３−位が部 分的にアセチル化（上記の如く、３３重量％以下）された高分子Ｄ−グルクロン 酸化合物である。

３°）　製造例ＶＩＩＩの生成物は、脱アセチル化されている。

（ｂ）　安定性については、製造例Ｖ−ＶＩ　Ｉ　Ｉによるポリグルクロン酸化 合物の溶液は、アルカリ性、例えばｐＨ１１の媒質中、冷却下では安定であるが 、温度が上がるとＯＡｃ置換基が脱離することがわかった。このポリグルクロン 酸化合物は、酸性媒質中でも安定であるが、ｐＨ３程度になると沈殿する。

（ｃ）　粘度については、０．ＩＭ　ＮａＣｌ中での固有粘度（Ｖｉ）はＭｗ１ ５０，０００に相当する６５０ｍ１／ｇであることがわかつた（Ｍｗは、醗酵時 間に応じて８０，０００〜４００，０００ダルトン、好ましくは１００゜０００ 〜３５０，０００の範囲で変化する。）。この固有粘度は、原株であるリゾビウ ム・メリロチ　Ｍ５Ｎ１により製造されるコハク酸グリカン（ｓｕｃｃ　ｉｎｏ ｇ　ｌ　ｙｃａｎ）のＭｗ４，０００，０００ダルトンに相当するＶｉ５４８０ ｍｌ／Ｈに比較して低い。この固有粘度に関して得られた結果は、Ｍｗ２７０， ０００を有するアルギン酸塩のものと同等である。

３００．０００ダルトンを超えるＭｗを有する本発明の高分子ポリグルクロン酸 化合物の濃度２０〜３０　ｇ／　ｌの溶液は、均質化後、数分で熱可逆的な硬い ゲルを形成する。

水中の同じ濃度で、８０，０００ダルトン程度のＭｗを有する本発明のポリマー は、均質化後数分で軟らかいゲルを形成する。より低い濃度では、本発明のポリ マーの溶液は粘度付与剤として機能する。

（ｄ）　１価のイオンとの相互作用 １価のイオンは本発明のポリグルクロン酸ポリマーの溶液と共にゲルを形成する 。これらのゲルは熱可逆性である。ゲルを形成するか否かはカチオンの性質、イ オン強度及び濃度によって異なり、イオンの選択性はＮａ　＜Ｌｓ　＜Ｋ　＜Ｎ Ｈの順である。

４゜ ＮＨを用いて、形態転移を観察する。転移温度はＮＨ４の濃度（０，５Ｍ〜１． ５Ｍ以上のＮＨ４Ｃ１）及び分子中の酢酸エステルの割合によって異なる。

０．５ＭのＮＨ４Ｃｌと１０〜１５ｇ／Ｉ濃度の本発明のポリグルクロン酸化合 物とから形成されるゲルは、１００℃で２４時間加熱しても、はとんど劣化しな い。

（ｅ）　２価のイオンとの相互作用 ２価の金属イオン、特にカルシウム、バリウム、ストロンチウム、マグネシウム 、亜鉛及び２価の銅のイオンにより、ゲルが形成される。カルシウムイオンと本 発明の多糖類が形成するゲルは、ペクチン酸（ポリガラクツロン酸型の物質）及 びアルギン酸塩（マンヌロン酸／グルクロン酸コポリマー型の物質）の形成する ゲルに類似する。ペクチン酸及びアルギン酸と異なる点は、本発明の高分子ポリ グルクロン酸化合物は、水に溶解してＭｇＣｌ２と接触させると、熱可逆的なゲ ルを形成することにある。

Ｃａ２＋とβ（１−４）結合を有する高分子ポリグルクロン酸化合物とを、例え ば透析、その他の該イオンと該高分子化合物との漸進的な接触を可能にする方法 により接触させると、ゲルを直接形成することができる。例えば、ゲル化を漸進 させる試薬を用いることにより、これらのゲルを形成することができる。例えば 、１０ｇ／Ｉ濃度の高分子化合物水溶液、ＣａＨＰＯ４−２Ｈ２０（濃度１．２ 〜１．５ｇ／ｌ）及びグルコノラクトン（濃度４．５ｇ／Ｉ）からゲルを形成す ることができ、この調製液を均質化した後、静置することにより調製液中にゲル が形成される。

３ｇ／Ｉ程度の濃度の本発明の高分子グルクロン酸化合物からは、硬いゲルが得 られる。

ゲルの安定性について、Ｃａの存在下で本発明の高分子ポリグルクロン酸化合物 の水溶液を用いて調べたところ、下記のことが観察された：１００℃において 水中では、ゲルを１００℃で１．５時間加熱しても変化はなく、また２４時間後 もゲルの強度（引張応力）は変化しない（インストロン測定機を用いる圧縮測定 ）； ＨＣＩ中では、ゲルを１００℃、ｐＨ２未満で加熱した場合、１時間以上安定で ある； ＮａＯＨ中では、ゲルを１００℃、ｐＨ８〜１３で加熱した場合、１時間以上安 定である； ０−　３４　Ｍ　Ｃａ　Ｃ＋　２中では、ゲルは２４時間以上安定である；宜二 に五社互。

水中では、ゲルは安定である（１週間で引張応力は１．８から１．３Ｎ／ｃｍ２ に低下する）： ＨＣＩ中では、１週間以上経過しても、ゲルの質の変化は認められない；Ｃａ　 ＣＩ　２中では、１週間後にもゲルの引張応力は変化しない。

更に、ＣａＣＩ　を用いて得られたゲルをＮａＣ１と接触させると、Ｃａ”＆Ｎ ａ　とのイオン交換がおこる。４ＭのＮａＣ１を用いるとほとんど完全に交換さ れるが、引張応力は変化しない。

また、ポリマー中の酢酸エステルの割合が、上記の操作条件すべてにおいて安定 性に影響しないことが観察される。

（ｆ）　３価のイオンとの相互作用 ３価のイオン、特にＦｅ３＋及びＣｒ３＋を用いて形成したゲルは、上記の操作 条件下で熱的に安定であることが観察された。

（ｇ）　その他 β（１−４）結合を有する本発明の高分子ポリグルクロン酸化合物は、油脂類に 実質的に可溶であることがわかった。脂質又は油中の溶液は、カルシウムの存在 下でゲルを形成する。

また、濃度が３ｇ／１以上の本発明のポリグルクロン酸ポリマーの水溶液は、ア ルコール、特にＥｔＯＨとの接触によりゲルを形成することがわかった。

さらに、ポリマー／　Ｃａ　Ｃｌ　２のゲルからは繊維が得られる。ポリマー／ Ｃａ　Ｃｌ　２繊維のＸ−線陰画によると、各繊維の軸に沿って１１０３ｎの周 期性が認められる。この周期性はセルロースのものに類似する。

製造例ＩＸ オリゴ糖化合物の製造 ここでは、増殖培地中における、リゾビウム・メリロチ　ＮＣＩＭＢ４０４７２ の存在下でのＯ８の製造方法を説明する。

（ａ）　Ｏ３の収量を増やすために室温における醗酵時間を１００時間、好まし くは１００時間以上とすることを除いては、製造例ＩＩに記載したと同様の操作 を行い、増殖培地中での醗酵を行う。このようにして加水分解をさらに進めるこ とにより、培地中にＯ８が生成する。

（ｂ）　遠心分離或いは孔径２００ｎｍのフィルターによるタンジエンシャルマ イクロ濾過により、醗酵培地から細菌を分離する。Ｏ８化合物を限外濾過により 回収し、クロマトグラフィーにより精製し、乾燥する。得られるＯ８化合物はｄ ｐ５〜６０であり、例えばクロマトグラフィーにより（ａ）ｄｐ５〜１０、（ｂ ）ｄｐ１０〜５０及び（ｃ）ｄｐ５０〜６０の３フラクションニ分画することが できる。

製造例Ｘ オリゴ糖化合物の製造 ここでは、細菌の不在下でＯ８を製造する方法を説明する。

（ａ）　製造例Ｖの工程（ａ）において細菌を除去した後に得られる液体醗酵培 地を、２０〜４０℃において１００時間培養する。

（ｂ）　この液体培地中に生成したＯ８化合物を、製造例ＩＸの工程（ｂ）に記 載した方法により単離する。限外濾過、精製及び乾燥を行い、ｄｐ５〜６０のｏ ｓを得る。、、＋７）ＯＳｌｉｄ９５〜１０．１０〜５０及び５０〜６ｏの３フ ラクシヨンに分画することができる。

製造例ＸＩ オリゴ糖化合物の製造 ここでは、酵素性加水分解によるＯ８の製造方法を説明する。

（ａ）　製造例Ｖ、Ｖｌ又はＶｌｌ記載の方法で製造したβ（１−４）結合を有 する高分子ポリグルクロン酸化合物を、セルラーゼを用いて酵素分解する。

（ｂ）　得られるＯ８化合物を製造例ＩＸの工程（ｂ）と同様にして単離する。

限外濾過、精製及び乾燥を行って得られるＯ８は５〜６０のｄｐを有し、ｄｐ５ 〜１０．１０〜５０及び５０〜６０の３フラクシランに分画することができる。

製造例Ｘｌｌ オリゴ糖化合物の製造 ここでは、酸加水分解によるＯ８の製造方法を説明する。

（ａ）　製造例ＶＳＶＩ又はＶｌｌに記載した方法で得られるβ（１−４）結合 を有する高分子ポリグルクロン酸化合物を、ＨＣＩを用い、ｐＨ３で９６時時間 割水分解する。

（ｂ）　得られるＯ３化合物を、製造例ＩＸの工程（ｂ）に記載した方法で単離 する。限外濾過、精製及び乾燥を行って得られるＯ８は５〜６０のｃｔｐを有し 、ｄｐ５〜１０．１０〜５０及び５０〜６０の３フラクシヨンに分画することが できる。

製造例ｌＸ−Ｘ１ｌにより得られるＯ８の３分画物の単離は、ゲル濾過型のクロ マトグラフィー、或いは、分子を大きさ別及び／又は質量別に分離し得るその他 の方法により行うことができる。

製造例Ｘ１ｌｌ グルクロン酸の製造 製造例ＶＩＩＩに記載した方法で脱アセチル化して得られる式Ｉのポリグルクロ ン酸を、完全に酵素加水分解し、グルクロン酸を得た。

このようにして生成したグルクロン酸は、限外濾過により単離し、イオン交換ク ロマトグラフィー、電気透析、或いはこの酵素加水分解培地中に存在するより大 きい分子及びその塩からグルクロン酸を分離し得るその他の方法により精製する ことができる。

フロントページの続き （７２）発明者　コラン−モール・フィリップフランス国・３８５００・ボアロ ン・う・ビュイス・クロ・ピュイソニエール （７２）発明者　リノドー−デュアム・マルガリータフランス国・３８０００・ グルノープル・リュ・し・ディゲイエール・６

Claims (13)

【特許請求の範囲】
1. １．（ａ）下記式 ▲数式、化学式、表等があります▼（Ｉ）〔式中、ｎは平均値が約３００〜２５ ００である数である。］で表されるβ（１−４）結合を有するＤ−ポリグルクロ ン酸、（ｂ）それに対応するエステル、 （ｃ）それに対応するエーテル及び （ｄ）それらの混合物 からなる群から選ばれる高分子グルクロン酸化合物。
2. ２．式Ｉ中の少なくとも１つのカルボン酸基、ＣＯＯＨ、のＯＨ基がＣ１−Ｃ４ −アルコキシ基で置換された、式Ｉで表されるポリグルクロン酸のエステル；式 Ｉ中の少なくとも１つのアルコール基、ＯＨ、の水素原子がＣ２−Ｃ４脂肪族ア シル基で置換された、式Ｉで表されるポリグルクロン酸のエステル；式Ｉ中の（ ｉ）少なくとも１つのカルボン酸基、ＣＯＯＨ、のＯＨ基がＣ１−Ｃ４−アルコ キシ基で置換され、かつ、式Ｉ中の（ｉｉ）少なくとも１つのアルコール基、Ｏ Ｈ、の水素原子がＣ２−Ｃ４脂肪族アシル基で置換された、式Ｉで表されるポリ グルクロン酸のエステル； 式Ｉ中の少なくとも１つのアルコール基、ＯＨ、の水素原子がＣ１−Ｃ４−アル キル基で置換された、式Ｉで表されるポリグルクロン酸のエーテル；式Ｉ中の（ ｉ）少なくとも１つのカルボン酸基、ＣＯＯＨ、のＯＨ基がＣ１−Ｃ４−アルコ キシ基で置換され、かつ、式Ｉ中の（ｉｉ）少なくとも１つのアルコール基、Ｏ Ｈ、の水素原子がＣ１−Ｃ４−アルキル基で置換された、式Ｉで表されるポリグ ルクロン酸のエーテルーエステル；及びそれらの混合物 からなる群から選はれる請求の範囲１記載の化合物。
3. ３．請求の範囲Ｉ記載の式Ｉで表されるポリグルクロン酸；及びアルコール基、 ＯＨ、の一部がＯ−アセチル化されて式Ｉ中の各グルクロン酸環が該グルクロン 酸環の重量に基づいて３３重量％以下のＯ−ＣＯ−ＣＨ３基を有する、該ポリグ ルクロン酸に対応する酢酸エステル；からなる群から選はれ、重量平均分子量が ８０，０００〜４００，０００ダルトンである請求の範囲１記載の化合物。
4. ４．窒素源、炭素源及び塩を含有する栄養培地の存在下に、リゾビウム属に属し 、Ｋ２ＨＰＯ４１ｇ／１、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ０．２ｇ／１、ＮＨ４ＮＯ３１ ｇ／１及びグルコース１０ｇ／１を含有する水性栄養培地中でｐＨ７で培養した 場合に多糖類を生成する細菌菌株の醗酵を行うことからなる、請求の範囲１記載 の式Ｉで表される高分子グルクロン酸化合物又はそのアルコール基、ＯＨ、の一 部がＯ−アセチル化されたエステルの製造方法。
5. ５．該菌株が、重量平均分子量１００，０００〜１５０，０００ダルトンの単一 プラスミドを含有するものである請求の範囲４記載の方法。
6. ６．リゾビウム・メリロチＮＣＩＭＢ４０４７２を用いて醗酵を行うことからな る請求の範囲４又は５記載の方法。
7. ７．該醗酵を、Ｋ２ＨＰＯ４０．５〜２ｇ／ｌ、ＭｇＳＯ４０．０５〜０．３ｇ ／ｌ、酵母エキス０．８〜３ｇ／ｌ並びにグルコース、フルクトース、スクロー ス及びそれらの混合物から選はれる糖７〜２０ｇ／１を含有する水性培地中で、 ２５〜４０℃の温度で行う請求の範囲４〜６いずれか記載の方法。
8. ８．（ｉ）細菌個体数が１０９細菌／ｍｌ以上に達した後、適当期間培養した該 醗酵培地を回収し、（ｉｉ）次いで該高分子グルクロン酸化合物を単離すること からなる請求の範囲４〜７いずれか記載の方法。
9. ９．リゾビウム属に属する細菌菌株であるリゾビウム・メリロチＮＣＩＭＢ４０ ４７２。
10. １０．食品、ヒト若しくは獣医学治療用薬剤、化粧品又は浄水の分野における、 特にゲル化剤、粘度付与剤、湿気付与剤、安定剤、キレート化剤又は凝集剤とし ての請求の範囲１〜３いずれか記載の高分子グルクロン酸化合物の用途。
11. １１．ポリグルクロン酸繊維又は糸の製造における請求の範囲１〜３いずれか記 載の高分子グルクロン酸化合物の用途。
12. １２．β（１−４）結合を有するＤ−ポリグルクロン酸オリゴ糖化合物の製造に おけるの請求の範囲１〜３いずれか記載の高分子グルクロン酸化合物の用途。
13. １３．請求の範囲１〜３いずれか記載の高分子グルクロン酸化合物の加水分解、 特に酸又は酵素加水分解によって得られ、重合度が２〜１００、好ましくは５〜 ２０であるオリゴ糖化合物。