FR2688222A1 - Composes polymeres de l'acide glucuronique, procede de preparation et utilisation notamment en tant que moyens gelifiants, epaississants, hydratants, stabilisants, chelatants ou floculants. - Google Patents

Abstract

La présente invention concerne en tant que produit industriel nouveau un composé polymère de l'acide glucuronique caractérisé en ce qu'il est choisi parmi l'ensemble constitué par (a) les acides D-polyglucuroniques à enchaînement beta(1-4) de formule (CF DESSIN DANS BOPI) dans laquelle n est un nombre ayant une valeur moyenne comprise entre environ 300 et 2500, (b) les esters correspondants, (c) les éthers correspondants, et (d) leurs mélanges. Elle concerne également le procédé de préparation de ce nouveau produit par fermentation, de préférence par fermentation de la souche Rhizobium meliloti NCIMB 40472. Ce nouveau produit est utile notamment (i) dans le domaine alimentaire, pharmaceutique en thérapeutique humaine ou vétérinaire, cosmétique ou de l'épuration des eaux, en particulier en tant que moyen gélifiant, épaississant, hydratant, stabilisant, chélatant ou floculant, et (ii) dans la préparation d'oligosaccharides.

Description

COMPOSES POLYBERES DE L'ACIDE GLUClJRONIQlJE, PROCEDE DE
PREPARATION ET UTILISATION NO TANNENT EN TANT QUE MOYENS
GELIFIAXTS, EPAISSISSANTS, HYDRATANTS, STABILISANTS,
CHELATANTS OU FLOCLANTS DOMAINE DE L'INVENTION
La présente invention a trait, en tant que produits industriels nouveaux, à des composés polymères de l'acide glucuronique, à savoir les composés polyglucuroniques à enchaînement p(1-4) de formule I ci-après.Elle concerne également le procédé de préparation de ces nouveaux composés ainsi que leur utilisation, notamment en tant que moyens gélifiants, épaississants, hydratants, stabilisants, chélatants, floculants, épurants et susceptibles de former des fibres, d'une part, et en tant que matériaux de départ pour la préparation de composés oligosaccharides, d'autre part.

Elle vise également en tant que nouveau produit industriel une souche bactérienne particulière appartenant à l'ensemble des Rhizobium, à savoir la souche
Rhizobium meliloti NCIMB 40472, qui est utile dans la préparation desdits composés polymères de l'acide glucuronique par fermentation.

ART ANTERIEUR
Des polysaccharides, tels que les polymères de la présente invention, qui sont constitués exclusivement de motifs ou unités acide glucuronique à enchaînement p(1-4), n'ont pas encore été décrits jusqu'à maintenant.
L'art antérieur le plus proche, connu du Titulaire de la présente invention comprend l'acide hyaluronique décrit notamment dans l'ouvrage ierck Index, llè édition, (1989), pages 751-752 (produit No 4675), d'une part, et le polysaccharide décrit dans le document FR-A-2 378 092, d'autre part.

L'acide hyaluronique est un polysaccharide naturel constitué d'un motif répétitif à deux unités : une unité acide glucuronique et une unité glucosaminidique.

Dans ce polysaccharide, ces deux unités sont alternées l'unité acide glucuronique présente un enchaînement 8(1-3) et l'unité glucosaminidique un à enchalnement p(1-4). La formule développée de l'acide hyaluronique fournie dans le merci Index précité est la suivante

Le polysaccharide du document FR-A-2 378 092 est produit par voie exocellulaire à partir d'une souche de Pseudomonas NCIB 11264 (ATCC 31260) et comprend un motif répétitif constitué de 7 unités D-glucose (une unité de glucose substitué en position 6, deux unités de glucose disubstitué en position 4, deux unités de glucose substitué en position 3 et deux unités de glucose disubstitué en positions 4,6) et de 1 unité de D-galactose substitué en position 3, ce motif répétitif étant estérifié avec 1 unité acide acétique et 1 unité acide pyruvique, la chaîne latérale du polymère se terminant par une unité 4,6-0-(l-carboxyéthylidène)-D-glucose.

On sait par ailleurs que la souche sauvage Rhizobium meliloti M5N1 (référence donnée par le Titulaire de la présente invention), isolée du sol, a été décrite par J. COURTOIS et al., J. Bacteriol., (1988), 170, pages 5925-5927. Dans les conditions de fermentation données ci-après, cette souche produit des polysaccharides présentant des liaisons glycosidiques 8(1-3) et en particulier le polymère répondant à la formule

<tb> 4)-D-g1c <SEP> -(i <SEP> 4)-$-O-glc <SEP> (i <SEP> 3)-D-gal- <SEP> (i <SEP> 4).S.O-g1c <SEP> (lJp
<tb> <SEP> 6
<tb> <SEP> a;D11c <SEP> -(1 <SEP> ~33ss-D-slc <SEP> ( <SEP> 3)-D-g1c <SEP> -(1 <SEP> 46)-B-D-glc <SEP> (III)
<tb> <SEP> 6
<tb> <SEP> + <SEP> 6 <SEP> + <SEP> Succinate
<tb> <SEP> O <SEP> a <SEP> + <SEP> ACOt4fe
<tb> <SEP> H3C-C-C02H
<tb> qui a été déterminée par A.HEYRAUD et al., Int. J.

gacromol., (1986), 8, pages 55-88.

On sait enfin de l'article de G. De RUITER et al., Carbohydrate Polymers, (1992), 18, pages 1-7 que des composés polyglucuroniques à enchaînement (1-4) ont été isolés à partir de polysaccharides exocellulaires produits par des moisissures appartenant à l'ordre des mucorales. Ces composés polyglucuroniques, qui ont un Mw compris entre 5 500 et 10 000 daltons (i.e. un dp de 30 à 56 environ) selon les indications fournies dans le ta bleau I page 3 dudit article, sont en fait des oligosaccharides qui sont structurellement différents notamment par leur degré de polymérisation des polysaccharides selon l'invention. De plus, ledit article ne décrit ni ne suggère les polysaccharides de dp moyen supérieur à 200, et en particulier de dp moyen supérieur ou égal à 300, selon l'invention.En particulier, il ne décrit ni ne suggère la présence ou l'obtention de polysaccharides exclusivement D-polyglucuroniques à enchaînement p(1-4) et de dp élevé, parmi les polysaccharides exocellulaires produits par les moisissures appartenant à l'ordre des mucorales et utilisés comme sources d'oligosaccharides de
Mw allant de 5 500 à 10 000 daltons.

BUT DE L'INVENTION
Le but de l'invention est de fournir de nouveaux polysaccharides qui soient structurellement différents de l'acide hyaluronique précité et des autres polysaccharides de l'art antérieur, notamment les produits polymères mentionnés ci-dessus et les alginates, d'une part, et qui soient industriellement utiles notamment en tant que moyens gélifiants, épaississants, hydratants, stabilisants, chélatants, floculants, épurants et susceptibles de former des fibres, destinés notamment au domaine alimentaire, diététique, pharmaceutique (en thérapeutique humaine ou vétérinaire), cosmétique, agricole, de l'épu- ration des eaux, des peintures, d'autre part.

On se propose également de fournir un procédé de préparation de ces nouveaux polysaccharides, qui sont des composés polymères de l'acide glucuronique à enchaînement p(1-4).

De plus, on se propose d'utiliser ces nouveaux polysaccharides en tant que source pour l'obtention de composés appartenant à l'ensemble des oligosaccharides.

I1 existe en particulier un besoin en matériaux polymères pour remplacer notamment l'acide hyaluronique (principalement) et les alginates (à la rigueur). Pour satisfaire ce besoin, les chercheurs ont essayé de proposer des produits qui soient aussi intéressants que l'acide hyaluronique. Cet objectif particulier est atteint par la présente invention. Pour remplir ce but et fournir de nouveaux produits appartenant à l'ensemble des polysaccharides, on a recherché à mettre au point de nouveaux composés polymères de l'acide glucuronique qui soient utiles industriellement
OBJET DE L'INVENTION
Selon un premier aspect de l'invention, on préconise un nouveau composé polymère de l'acide glucuronique caractérisé en ce qu'il est choisi parmi l'ensemble cons titué par
(a) les acides D-polyglucuroniques à enchaînement
p(1-4) de formule

dans laquelle n est un nombre ayant une valeur
moyenne comprise entre environ 300 et 2500, (b) les esters correspondants, (c) les éthers correspondants, et (d) leurs melanges.

Selon un second aspect de l'invention, on préconise un procédé de préparation d'un tel composé polymère de l'acide glucuronique.

Plus précisément, on vise ici un procédé de préparation d'un composé polymère d'acide glucuronique de formule I ou de l'un de ses esters dans lesquels les fonctions alcool OH sont partiellement O-acétylées, ledit procédé étant caractérisé en ce qu'il comprend la fermentation en présence d'un milieu nutritif contenant une source d'azote, une source de carbone et des sels, d'une souche bactérienne appartenant à l'ensemble des
Rhizobium et produisant des polysaccharides quand elle est cultivée à pH 7 dans un milieu nutritif aqueux contenant 1 g/l de K2HPo, 0,2 g de MgSO4.7H20, 1 g/l de NHaNO3 et 10 g/l de glucose.

Selon un troisième aspect de l'invention, on vise en tant que produit industriel nouveau la souche
Rhizobium meliloti NCIMB 40472 (référence donnée par le
Titulaire de la présente invention : M5N1 CS) qui est obtenue par mutation de la souche sauvage M5N1 précitée.

Selon un quatrième aspect de l'invention, on préconise l'utilisation desdits composés polymères de l'acide glucuronique, notamment dans le domaine alimentaire, pharmaceutique (en thérapeutique humaine ou vétérinaire), cosmétique ou de l'épuration des eaux, en particulier en tant que moyens gélifiants, épaississants, hydratants, stabilisants, plastifiants, chélatants ou floculants, ou encore en tant que moyens filmogènes ou formant des fibres et des fibres.

Selon un cinquième aspect de l'invention, on préconise l'utilisation desdits composés dans la préparation d'oligosaccharides notamment utiles en agriculture.

ABREVIATIONS
Par commodité, les abréviations suivantes ont été utilisées dans le texte de la présente invention.

Ac = acétyle
Bu = n-butyle dp = degré de polymérisation
Et = éthyle
EtO = éthyloxy gal = galactose glc = glucose
A.gluc = acide glucuronique
HPLC = chromatographie liquide haute performance iBu = isobutyle iBu0 = isobutyloxy iPr = isopropyle iPrO = isopropyloxy M1 = milieu nutritif aqueux d'identification conte
nant 1 g/l de K2HPO, 0,2 g de MgSO4.7H20, 1 g/l
de NH4N03 et 10 g/l de glucose et permettant de
distinguer par culture à pH 7 les souches de
Rhizobium qui produisent des PS de celles qui
n'en produisent pas
M2 = milieu nutritif aqueux de production, préféré
selon l'invention, contenant 1 g/l d'extrait de
levure, 1 g/l de R2HPO, 0,2 g/l de MgSO.7H20 et
10 g/l de glucose, fructose ou saccharose
M5N1 = souche sauvage de Rhizobium meliloti décrite
par J. COURTOIS et al., J. Bacteriol., (1988),
170, pages 5925-5927
M5N1 CS = souche de Rhizobium meliloti selon l'invention,
obtenue par mutation de la souche sauvage M5N1
et déposée auprès du NCIMB sous le No 40472
Me = méthyle
MeO = méthyloxy
Mw = poids moléculaire moyen en poids
NCIMB = National Collection of Industrial and Marine
Bacteria, (il s'agit d'un organisme britannique
agréé pour le dépôt de souches)
OS = oligosaccharide
Pr = n-propyle
PS = polysaccharide
RT = température ambiante (15-25 C) sBu = s.-butyle sBuO = s.-butyloxy tBu = t.-butyle tBuO = t.-butyloxy
Vi = viscosité intrinsèque (ou
DESCRIPTION DETAILLEE DE L'INVENTION
Les composés polymères de l'acide glucuronique selon l'invention comprennent donc les acides polyglucuroniques de formule I, leurs esters, leurs éthers et leurs mélanges.

Plus précisément, un tel composé polymère de l'acide glucuronique est choisi parmi l'ensemble constitué par - les acides polyglucuroniques de formule I, - les esters des acides polyglucuroniques de formule I dans lesquels le reste OH d'au moins un groupe acide carboxylique COOH est remplacé par un reste alkoxy en
C1-C4, - les esters des acides polyglucuroniques de formule I dans lesquels l'atome d'hydrogène d'au moins un groupe alcool OH est remplacé par un reste acyle aliphatique en C2-C4, - les esters des acides polyglucuroniques de formule I dans lesquels (i) le reste OH d'au moins un groupe acide carboxylique COOH est remplacé par un reste alkoxy en C- C, et (ii) l'atome d'hydrogène d'au moins un groupe alcool OH est remplacé par un reste acyle aliphatique en C2-C4, - les éthers des acides polyglucuroniques de formule I dans lesquels l'atome d'hydrogène d'au moins un groupe alcool OH est remplacé par un reste alkyle en C1-C4, - les éther-esters des acides polyglucuroniques de formule I dans lesquels (i) le reste OH d'au moins un groupe acide carboxylique COOH est remplacé par un reste alkoxy en C- C, et (ii) l'atome d'hydrogène d'au moins un groupe alcool OH est remplacé par un reste alkyle en C1-C4, et - leurs mélanges.

Les groupes alkoxy précités en C1-C peuvent être à chaîne hydrocarbonée linéaire ou ramifiée, ils comprennent les groupes MeO, EtO, PrO, iPrO, BuO, iBuO, sBuO et tBuO.

Les groupes alkyle précités en C1-C4 peuvent être à chaîne hydrocarbonée linéaire ou ramifiée, ils comprennent les groupes Me, Et, Pr, iPr, Bu, iBu, sBu et tBu.

Les groupes acyle aliphatiques en C2-C, peuvent être à chaîne hydrocarbonée linéaire ou ramifiée, ils comprennent les groupes Ac, COEt, COPr, COiPr.

Le produit préféré selon l'invention, a un Mw de 80 000 à 400 000 daltons et est choisi parmi l'ensemble constitué par - les acides polyglucuroniques de formule I, - les esters du type acétate correspondants dans lesquels les fonctions alcool OH sont partiellement O-acétylées, chaque cycle acide glucuronique de la formule I comportant au plus 33 % en poids de groupes O-CO-CH3 (i.e. OAc) par rapport au poids dudit cycle acide glucuronique.

Dans ce dernier cas, la fonction acétyloxy est localisée soit en position 2, soit en position 3, soit encore en positions 2 et 3 du cycle acide glucuronique.

Bien entendu, il est possible d'éliminer ladite fonction acétyloxy. La désacétylation est réalisée à un pH supérieur à 8,0 à RT (le pH supérieur à 8,0 étant obtenu au moyen d'une base forte notamment un hydroxyde de métal alcalin comme NaOH ou KOH). Ainsi, 7-8 heures à RT et à pH 11 suffisent pour désacétyler le composé poly mère comportant jusqu'à 33 % en poids de groupe OAc par rapport au poids du cycle acide glucuronique.

Le polymère désacétylé qui répond à la formule I ci-dessus peut être représenté par la formule abrégée
A.gluc P 1-[- > 4 A.gluc P 1-],- > 4 A.gluc (Io)
Les souches bactériennes, qui conviennent pour la mise en oeuvre du procédé de préparation selon l'invention, sont celles qui (i) appartiennent à l'ensemble des
Rhizobium et (ii) produisent des PS quand elles sont cultivées à pH 7 dans un milieu nutritif aqueux d'identification, à savoir le milieu M1 qui contient 1 g/l de K2KPO,, 0,2 g de MgSO.7H20, 1 g/l de KHNO3 et 10 g/l de glucose.

Parmi les souches bactériennes qui conviennent, on peut notamment citer les souches de Rhizobium meliloti et les souches apparentées qui contiennent toutes un seul plasmide ayant un Mw d'environ 100 000 à 150 000 daltons.

Parmi celles-ci, la souche préférée selon l'invention est la souche Rhizobium meliloti NCIMB 40472.

Le procédé de préparation d'un composé polymère de l'acide glucuronique, selon l'invention, comprend la fermentation en présence d'une source d'azote, d'une source de carbone et de sels, d'une souche bactérienne appartenant à l'ensemble des Rhizobium qui produisent des
PS par culture à pH 7 dans le milieu aqueux M1 précité.

Selon ce procédé, la production dudit composé polymère peut être soit intracellulaire soit le plus souvent exocellulaire. En pratique, pour une production exocellulaire, ladite fermentation est effectuée au moyen d'un milieu aqueux contenant 0,5 à 2 g/l de K2HPO4, 0,05 à 0,3 g/l de MgSO4, 0,8 à 3 g/l d'extrait de levure et 7 à 20 g/l de sucre, à une température de 25 à 40"C. Le milieu nutritif peut contenir un sucre quelconque, le sucre préféré est notamment choisi parmi le glucose, le fructose, le saccharose et leurs mélanges.

Par incubation dans un tel milieu aqueux, pendant une durée appropriée (de préférence inférieure ou égale à 100 h ou à la rigueur supérieure à 100 h), les bactéries produisent (tant dans la phase de croissance que dans la phase stationnaire de non-prolifération), un composé polymère de l'acide D-glucuronique qui est le produit de formule I ou l'un de ses esters dans lequel les fonctions alcool OH sont partiellement O-acétylées. A partir de ce composé, on obtient les autres esters et/ou éthers selon une méthode connue en soi.

De préférence, pour l'obtention dudit composé polymère de l'acide glucuronique selon l'invention, le milieu aqueux de fermentation-incubation renfermera 1 g/l d'extrait de levure, 1 g/l de K2HPO4, 0,2 g/l de MgSO.7H20 (source de MgSO4) et 10 g/l de sucre (de préférence glucose, fructose ou saccharose), à une température de 30"C, à un pH de 7 (obtenu par addition de
NaOH ou KOH), avec pO2 de 30 à 100 % (selon le degré d'acétylation souhaité).

De façon avantageuse, cette fermentation est mise en oeuvre à partir d'une population bactérienne supérieure ou égale à 102 bactéries/ml et mieux supérieure ou égale à 10" bactéries/ml. On recueille le milieu liquide de fermentation incubé pendant une durée inférieure ou égale à 100 h, qui contient le composé polymère polyglucuronique selon l'invention, dès que la population bactérienne est supérieure ou égale à 109 bactéries/ml.

Dans cette optique, les bactéries sont séparées du milieu de fermentation notamment par filtration ou dialyse (en particulier sur membrane) ou encore par centrifugation afin de recueillir ledit composé polymère polyglucuronique contenu dans le jus de fermentation.

Ce composé polymère polyglucuronique est isolé du filtrat, dialysat ou surnageant résultant, soit par précipitation au moyen d'un solvant organique tel que EtOH,
PrOH, iPrOH, MeCOMe ou un solvant analogue, soit par précipitation en milieu acide à un pH inférieur ou égal à 3.

De façon avantageuse, quand le composé polymère polyglucuronique est obtenu par précipitation au moyen d'un solvant organique, on recommande d'opérer à basse température, de préférence à une température de l'ordre de 4"C ; le précipité est alors recueilli par centrifugation puis séché (notamment sous vide à RT).

De façon également avantageuse, quand le composé polymère polyglucuronique est obtenu par précipitation en milieu acide, il est recueilli par centrifugation, lavé à l'eau et dispersé sous agitation dans une solution aqueuse à pH supérieur ou égal à 8,0 pour être purifié ; le composé polymère polyglucuronique ainsi dissous en milieu alcalin est aussitôt reprécipité au moyen d'un solvant organique comme indiqué ci-dessus.

A partir du polymère désacétylé, on peut former les esters de la fonction acide carboxylique COOH par alkylation selon une méthode connue en soi. On peut également obtenir les esters de la fonction alcool OH par réaction du composé désacétylé de formule I avec un acide approprié selon une méthode connue en soi. Les éthers de la fonction alcool OH sont obtenus à partir dudit composé désacétylé par application d'un mécanisme réactionnel également connu en soi. Il en est de même pour les esters des fonctions COOH et OH et les éther-esters.

Les composés polymères polyglucuroniques à enchaînement p(1-4) selon l'invention, sont utiles dans plusieurs domaines, à savoir - l'industrie alimentaire tant humaine qu'animale, notamment en tant qu'agents épaississants ou texturants - l'industrie des papiers et cartons, notamment en tant qu'additifs ou moyens de couchage, voire même en tant que fibres ; - l'industrie textile, notamment en tant qu'agents mordants et en tant que fibres ; - l'industrie cosmétique, notamment en tant qu'agents épaississants, texturants, hydratants et/ou stabilisants; - l'industrie pharmaceutique (en thérapeutique humaine et vétérinaire, d'une part, en chirurgie, d'autre part, et en galénique, d'autre part), notamment en tant qu'agents de texture, d'enrobage, de stabilisation, de résorbage, en tant qu'additifs pour pansement ou peau artificielle ;; - l'industrie photographique, notamment en tant qu'agents filmogènes - l'industrie des explosifs, notamment en tant qu'agents de dessiccation ou moyens plastifiants - l'industrie des détergents et tensioactifs ; - l'industrie des encres, peintures, vernis, laques, adhésifs et émaux, notamment en tant qu'additifs épaississants, texturants ou plastifiants; - l'industrie du traitement des métaux (en particulier pour le décapage) et celle du traitement des eaux, notamment en tant qu'agents chélatants ou floculants ; - l'industrie des forages, notamment en tant qu'additifs pour boues de forage - l'agriculture, notamment en tant que support d'enrobage ; - l'immobilisation de cellules et en tant que support de culture.

Les composés polyglucuroniques, selon l'invention, se sont révélés particulièrement utiles industriellement en remplacement de l'acide hyaluronique dans les domaines où ledit acide hyaluronique est intervenu jusqu'à présent.

Les composés polyglucuroniques, selon l'invention, sont plus précisément très efficaces en thérapeutique humaine et vétérinaire, d'une part, et en chirurgie, d'autre part, en raison de leur aptitude à former des fibres et des fils ou filés. En particulier, les fils en polymère polyglucuronique selon l'invention conviennent parfaitement pour la réalisation de points de suture, ils ont une structure éliminable par biodégradation ou traitement à l'eau. De ce fait, ils présentent une grande analogie avec les fils constitués d'acide hyaluronique et sont très intéressants dans le domaine de la viscochirurgie.

Les fibres et fils polyglucuroniques sont égale ment très performants dans le domaine papetier et le domaine textile.

Les composés polyglucuroniques, selon l'invention, sont également utiles dans le domaine de la préparation d'oligosaccharides D-polyglucuroniques à enchalne- ment p(1-4). Plus précisément, les OS sont obtenus par hydrolyse notamment acide ou enzymatique desdits composés polymères D-polyglucuroniques à enchaînement p(1-4).

Cette hydrolyse peut être réalisée, soit (i) en présence des bactéries Rhizobium meliloti NCIMB 40472, en continuant la fermentation dans le milieu M2 pendant plus de 100 h, soit (ii) par incubation des composés polymères polyglucuroniques à enchaînement p(1-4) ou du jus de fermentation les contenant pendant plus de 100 h à une température de 20-40 C, soit (iii) par clivage enzymatique notamment au moyen d'une cellulase, soit encore (iv) par clivage en milieu acide à pH inférieur ou égal à 3, pendant au moins 90 h à 100"C.

Les OS ainsi obtenus puis séchés ont, après isolation, un dp variable de 2 à 10 pour les OS à chaîne courte, de 10 à 50 pour les OS de taille moyenne, et de 50 à 100 environ pour ceux ayant une chaîne longue. Les
OS préférés selon l'invention ont un dp compris entre 5 et 20.

Ces OS qui comportent des unités d'acide glucuronique sont en particulier utiles dans le domaine de l'agriculture, eu égard à leurs effets bénéfiques sur - les cultures végétales in vitro, - les croissances racinaires (notamment la formation de poils absorbants), - l'induction d'un système de défense chez les plantes vis-à-vis des bactéries, moisissures, virus et autres agents cliniques extérieurs, et - la protection des semences, en tant qu'additifs pour enrobage.

Ces OS sont également utiles dans le domaine pharmaceutique, en thérapeutique humaine et vétérinaire ou dans le domaine du diagnostic, notamment en tant que moyen de ciblage d'ingrédients actifs.

MEILLEUR MODE
Le meilleur mode de mise en oeuvre de l'invention consiste à fournir un acide polyglucuronique de formule I ayant un Mw de l'ordre de 80 000 à 400 000 daltons. Cet acide-polyglucuronique est obtenu à partir de la souche bactérienne Rhizobium meliloti NCIMB 40472.

De façon pratique, on procède à l'ensemencement d'un milieu nutritif aqueux contenant 1 g/l d'extrait de levure, 1 g/l de K2HPO,, 0,2 g/l de MgS04,7Hz0 et 10 g/l de glucose, fructose ou saccharose (i.e. le milieu M2 précité), à une température de 30 e C, à un pH de 7, avec p02 de 30 à 100 % au moyen de ladite souche Rhizobium meliloti NCIMB 40472 de façon à avoir dans le milieu de fermentation de départ pour cette souche une population bactérienne d'au moins 104 bactéries/ml. La fermentation est effectuée jusqu'à ce que l'on obtienne une population bactérienne d'au moins lO9 bactéries/ml (elle peut être poursuivie selon la production souhaitée).On sépare les bactéries du milieu de fermentation par filtration tan gentielle sur un filtre ou une membrane filtrante de 200 nm de porosité. Le filtrat qui contient l'acide polyglucuronique éventuellement acétylé est traité avec
EtOH, iPrOH ou MeCOMe à 4"C. Le précipité ainsi obtenu est recueilli par filtration puis séché. Le polymère, ainsi obtenu, remis en solution peut être ensuite désacétylé à pH 11, pendant au moins 7 h et au plus 24 h à RT.

En pratique, la durée totale de fermentationincubation du milieu nutritif (milieu M2 ou milieu analogue contenant un sucre différent du glucose, du fructose et du saccharose) avec la souche Rhizobium meliloti NCIMB 40472 pour la production des polysaccharides de formule I et de leurs esters correspondants (dans lesquels la fonction alcool OH est partiellement acétylée) est inférieure égale ou supérieure à 100 h, à 30"C et à pH 7. Cette production est réalisée (a) pendant la phase de croissance de la souche, et/ou (b) pendant la phase de non-prolifération de celle-ci après que la population bactérienne ait atteint au moins la valeur de 109 bactéries/ml.Quand la durée est nettement inférieure à 100 h, on favorise la production des PS de l'invention ayant un Mw se situant dans la partie haute de l'intervalle 80 000-400 000 daltons ; quand la durée est supérieure à 100 h, on favorise la production des PS ayant un
Mw se situant dans la partie basse de cet intervalle, et des OS.

D'autres avantages et caractéristiques de l'invention seront mieux compris à la lecture d'exemples de préparation et de résultats d'essais qui suivent. Bien entendu, l'ensemble de ces éléments n'est nullement limitatif mais donné à titre d'illustration.

PREPARATION I
Obtention de la souche Rhizobium meliloti NCIMB 40472 a) Mutation
On procède à la mutation de la souche sauvage M5N1 précitée au moyen de N-méthyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine.

b) Sélection
Le mélange des bactéries vivantes obtenues après mutation est ensemencé sur le milieu M1. Ce milieu sert à éliminer les bactéries jugées ici non intéressantes selon un caractère d'auxotrophie. Le glucose contenu dans M1 remplit deux fonctions : il intervient en tant que source de carbone, d'une part, et il permet de distinguer les bactéries mutées ou non-mutées, qui ne produisent pas de
PS, des bactéries mutées produisant des PS en présence dudit glucose.

Les colonies produisant des PS sont cultivées sur milieu au bleu d'aniline. Le milieu au bleu d'aniline permet de distinguer les souches, qui répondent positivement audit milieu et ont des liaisons glycosidiques pt1-3), des souches répondant négativement que l'on recueille.

Les souches ainsi recueillies sont analysées quant à leur contenu en DNA extrachromosomique (i.e. leur contenu plasmidique). On applique le protocole de lyse directe-mis au point par T.ECKHARDT, Plasmid, (1978), 1, pages 584-588, sur lesdites souches.

Les profils plasmidiques desdites souches sont comparés à celui de la souche sauvage M5N1 de départ, afin de repérer et de ne retenir que les souches présentant un contenu plasmidique modifié. On a ainsi retenu une souche, qui ne comporte qu'un seul plasmide de Mw compris entre 100 o00 et 150-000 daltons, et qui ne comporte plus les plasmides constitutifs de la souche M5N1, à savoir : 2 plasmides de Mw = 1 000 000 daltons et 1 plasmide de Mw = 90 000 daltons.

Cette souche ainsi sélectionnée a été (i) contrôlée en ce qui concerne son pouvoir d'infectivité vis-àvis de la luzerne (légumineuse spécifique de Rhizobium meliloti ; la réponse à l'infection étant positive puisque des nodules sont apparus sur des racines de luzerne), puis (ii) déposée auprès d'un organisme agréé. Cette souche est référencée NCIMB 40472.

PREPARATION II
Fermentation en condition de croissance
Dans un fermenteur de 20 litres contenant 15 litres de milieu M2, on introduit l'inoculum de la souche
Rhizobium meliloti NCIMB 40472 [l'inoculum est constitué ici par 1 litre de M2 (en fiole d'Erlenmeyer) contenant la souche NCIMB 40472].L'inoculum est utilisé quand la suspension bactérienne est de l'ordre de 109 bactéries/ mi. La fermentation est effectuée avec les paramètres suivants température 30"C pH maintenu à 7 (addition de KOH 1N ou plus) 30 30 à 100 % (selon le degré d'acétylation souhaité) agitation 100 t/min
A l'issue du processus de fermentation, le milieu peut contenir 1 à 5 g.l-l.jour-l de polymère polyglucuronique à enchaînement 8(1-4) selon l'invention. Le rendement par rapport au sucre du milieu M2 varie ainsi entre 20 et 85 % (les mesures sont effectuées en chromatographie HPLC avec une colonne Beckman TSK 2000 SW et détection par réfractométrie).

PREPARATION III
Fermentation en condition de non-prolifération
Les cellules sont cultivées dans les conditions (inoculum/milieu) décrites dans la préparation II cidessus. Lorsque la suspension dans le fermenteur atteint 109 bactéries/ml de Rhizobium meliloti NCIMB 40472, on fait passer le milieu de fermentation au travers de membranes de microfiltration (200 nm de porosité), les cellules sont lavées et récupérées (elles peuvent être récupérées directement par centrifugation en continu dans des conditions stériles).

Ces cellules sont lavées au moyen d'un milieu exempt d'azote comprenant
K2HPO4, 1 g
MgS0.7H2O, 0,2 g
H20 qsp 1 l et introduites ensuite dans un fermenteur contenant 15 litres de milieu dépourvu d'azote mais additionné de 10 g/l de glucose, fructose ou saccharose.

Le fermenteur ainsi inoculé à une concentration bactérienne d'environ 109 bactéries/ml est soumis aux mêmes paramètres que dans le cas d'une production en croissance.

A l'issue de la fermentation, le milieu contient le même polymère que celui de la préparation II à une concentration analogue à celle de la fermentation en croissance.

PREPARATION IV
Fermentation en continu
Le protocole opératoire est le même que selon la production en croissance. En cours de production, on prélève un volume de milieu qui est soumis en continu à une microfiltration, le filtrat contenant le polymère polyglucuronique à enchaînement p(î-4) est récupéré, les bactéries pouvant le cas échéant être recyclées dans le fermenteur avec un milieu de fermentation stérile correspondant à celui qui a été sous-tiré.

PREPARATION V Isolation du polymère (a) Les bactéries sont éliminées du milieu de fermentation par filtration (en particulier filtration tangentielle sur filtre de 200 nm de porosité, notamment filtre
MICROSART MINI commercialisé par la société SARTORIUS) ou par centrifugation du milieu de fermentation de la préparation II, III ou IV.

(b) Le composé polyglucuronique à enchaînement p(1-4) est récupéré du filtrat ou du surnageant par précipitation avec un solvant organique tel que EtOH, iPrOH ou
MeCOMe. Quand on utilise iPrOH, ce solvant est ajouté au filtrat selon une proportion de 70 % v/v, le cas échéant en présence de NaCl lM. On homogénéise l'ensemble résultant et il se forme un précipité de composé polyglucuronique (la précipitation est favorisée à basse température, notamment à + 4"C). Le précipité est recueilli par centrifugation et séché sous vide à RT.

PREPARATION VI
Isolation du polymère
Après l'étape (a) de la préparation V, on procède à la précipitation selon les modalités suivantes.

(b) La précipitation est réalisée en milieu acide (on peut utiliser HC1) et intervient à un pH voisin de 3. Le précipité obtenu est récupéré par centrifugation, lavé à l'eau puis dispersé sous agitation dans une solution aqueuse à pH 8 ; le polymère se redissout, il est récupéré par filtration avec un solvant organique comme indiqué à l'étape (b) de la préparation V, ou directement par séchage ou déshydratation.

PREPARATION VII Isolation du polymère
Le composé polyglucuronique à enchaînement p(1-4) isolé selon les modalités des préparations V et VI étant peu purifié, l'on recommande d'utiliser les conditions opératoires qui suivent pour obtenir un produit hautement purifié.

Le filtrat ou surnageant obtenu selon l'étape (a) de la préparation V est purifié par ultrafiltration tangentielle avec une membrane dont la porosité est comprise entre 60 000 et 80 000 daltons. Pour purifier le concentrat, on écarte le filtrat et l'on remplace par de l'eau distillée. Cette opération est répétée jusqu'à ce que la purification désirée soit atteinte. Le polymère polyglucuronique à enchainement p(1-4) est isolé par évaporation sous vide à RT.

PREPARATION VIII
Désacétylation
Le polymère isolé, obtenu selon la préparation
VII qui contient au plus 33 % en poids de groupe OAc par rapport au poids de l'unité répétitive acide glucuronique est traité à un pH supérieur à 8 au moyen de NaOH. Une nuit à RT et à pH 11 permet de désacétyler la molécule.

ANALYSES (a) Les analyses effectuées sur les produits polymères obtenus selon les préparations V-VII, d'une part, et la préparation VIII, d'autre part, ont permis de mettre en évidence que 1") les produits des préparations V-VIII sont des composés polymères D-polyglucuroniques exclusivement constitués d'unités acide D-glucuronique, et présentant un enchaînement p(1-4) 2") les produits des préparations V-VII sont des composés polymères de l'acide D-glucuronique partiellement acétylés (au plus 33 % en poids comme indiqué ci-dessus) en position 2, en position 3 ou en positions 2 et 3 3") le produit de la préparation VIII est désacétylé.

(b) En ce qui concerne la stabilité, on constate que les solutions du composé polyglucuronique selon les préparations V-VIII sont stables à froid en milieu alcalin, notamment à pH 11 ; si la température s'élève, les substituants OAc sont clivés. Ce composé polyglucuronique est également stable en milieu acide mais précipite à un pH de l'ordre de 3.

(c) En ce qui concerne la viscosité, on constate que la viscosité intrinsèque (Vi) dans NaCl 0,1 M est de 650 ml/g pour un Mw de 150 000 (le Mw peut varier en fonction de la durée de fermentation entre 80 000 et 400 000 daltons et mieux entre 100 000 et 350 000 daltons). Cette viscosité intrinsèque est faible par comparaison avec celle du succinoglycanne produit par la souche sauvage
Rhizobium meliloti M5N1 qui a une Vi de 5480 ml/g pour un Mrw de 4 000 000 daltons. Les résultats obtenus en ce qui concerne cette viscosité intrinsèque sont comparables à ceux d'un alginate ayant un Mw de 270 000 daltons.

Les solutions de composés polymères polyglucuroniques selon l'invention ayant un Mw supérieur à 300 000 daltons à des concentrations de 20 à 30 g/l forment quelques minutes après leur homogénéisation des gels fermes thermoréversibles.

Aux mêmes concentrations dans l'eau, le polymère selon l'invention ayant un Mw de l'ordre de 80 000 daltons, donne quelques minutes après son homogénéisation un gel souple. Aux concentrations plus faibles, les solutions des polymères selon l'invention se comportent comme des épaississants.

(d) Interaction avec les ions monovalents
Les ions monovalents forment des gels avec les solutions des polymères polyglucuroniques selon l'invention. Ces gels sont thermoréversibles. La formation du gel dépend de la nature du cation, de la force ionique et de la concentration, la sélectivité ionique étant la suivante : Na+ < Li+ < K+ < Ni4+.

Avec NH4+, on observe une transition conformationnelle : la température de transition dépend de la concentration en NH4+ (NHCl de 0,5 M à 1,5 M ou plus) et du taux d'acétate dans la molécule.

Le gel, formé avec NH4C1 0,5 M et le composé polyglucuronique selon l'invention à une concentration de 10 à 15 g/l, portée à 100"C pendant 24 h n'est pratiquement pas dégradé.

(e) Interaction avec les ions divalents
En association avec des ions métalliques divalents notamment ceux des calcium, baryum, strontium, magnésium, zinc et cuivre divalent, des gels sont formés.

Avec l'ion calcium, le polysaccharide forme un gel qui est comparable à ceux des acides pectiniques (substances du type acide polygalacturonique) et des alginates (substances du type copolymère acide mannuronique/acide guluronique). Contrairement aux acides pectiniques et alginiques, le composé polymère polyglucuronique selon l'invention, en solution dans l'eau et mis en présence de égal2 est capable de former un gel thermoréversible.

Les gels peuvent être formés directement au contact de Ca2+ et des composés polymères polyglucuroniques à enchaînement 8(1-4) par dialyse ou toute autre méthode permettant un contact progressif entre l'ion et lesdits composés polymères. En particulier, ces gels peuvent être formés en utilisant des réactifs permettant une gélification progressive : il est ainsi possible de former un gel à partir d'un composé polymère à 10 g/l dans l'eau et de CaHPO.2H20 (à la concentration de 1,2 à 1,5 g/l) et de gluconolactone (à la concentration de 4,5 g/l), après homogénéisation, le gel se forme dans la préparation maintenue immobile.

Des gels fermes peuvent être obtenus à partir de concentrations en composé polymère polyglucuronique selon l'invention de l'ordre de 3 g/l.

En ce qui concerne la stabilité des gels déterminée à partir de solutions aqueuses de composé polymère polyglucuronique selon l'invention en présence de Ca, on a constaté ce qui suit à 100"C - dans l'eau, le gel porté à une température de 100 C pendant 1,5 h ne subit pas de modification, la force du gel (module) est inchangée après 24 h (mesure de compression effectuée sur appareil INSTRÔN), - dans HCl, le gel placé à 100"C à des pH inférieurs à 2 est stable pendant au moins 1 h, - dans NaOH, le gel placé à 1000C à des pH de 8-13 est stable pendant au moins 1 h, - dans Cal2, 0,34 M, le gel est stable pendant au moins 24 h ; à RT - dans l'eau, le gel est stable (en une semaine, le module passe de 1,8 à 1,3 N/cm2), - dans la soude, le gel se maintient pendant au moins une semaine, - dans HCl, il n'y a pas de modification apparente de la qualité du gel pendant plus d'une semaine, - dans Cal2, il n'y a pas de changement du module du gel après une semaine,
On constate par ailleurs que les gels obtenus avec Cal2, mis en présence de NaCl donnent lieu à un échange entre les ions Ca2+ et Na+. L'échange est pratiquement total avec NaC1 4M, mais le module reste inchangé.

On observe en outre que le taux d'acétate dans le polymère ne semble pas modifier sa stabilité dans l'ensemble des conditions opératoires précitées.

(f) Interaction avec les ions trivalents
On a observé que les gels formés avec les ions trivalents, notamment Fie3+ et Cor3+, sont stables thermiquement dans les conditions opératoires précitées.

(g) Divers
On a constaté que les composés polymères polyglucuroniques à enchaînement p(1-4) selon l'invention sont substantiellement solubles dans les lipides, les huiles.

En présence de calcium, les solutions lipidiques ou huileuses peuvent former des gels.

On a également constaté que des solutions dans l'eau desdits polymères polyglucuroniques à partir de la concentration de 3 g/l, mises en contact avec un alcool, notamment EtOH, forment des gels.

Par ailleurs, des fibres peuvent être obtenues à partir de gels de polymère/CaCi2. Des clichés de rayons X sur des fibres polymères/CaCl2 montrent une périodicité le long de l'axe de chaque fibre de l'ordre de 103 nm.

Une telle périodicité est analogue à celle trouvée pour la cellulose.

PREPARATION IX
Obtention d'un composé oligosaccharide
La présente préparation illustre l'obtention d'OS dans le milieu de croissance et en présence de bactéries
Rhizobium meliloti NCIMB 40472.

(a) On procède à une fermentation en milieu de croissance selon les modalités opératoires décrites dans la préparation II ci-dessus, avec la différence que la durée de ladite fermentation est supérieure (de préférence) ou égale à 100 h à RT pour obtenir une quantité relativement importante d'OS. Cette hydrolyse prolongée conduit à la formation d'OS dans le milieu.

(b) On sépare les bactéries du milieu de fermentation par centrifugation ou microfiltration tangentielle au moyen de filtres de porosité de 200 nm. Le composé OS est récupéré par ultrafiltration, purifié par chromatographie et séché. I1 présente un dp de 5-60 et peut être séparé en trois fractions de (a) dp 5-10, (b) dp 10-50 et (c) dp 50-60, notamment par chromatographie.

PREPARATION X
Obtention d'un composé oligosaccharide
La présente préparation illustre l'obtention d'OS en l'absence de bactéries.

(a) On incube le milieu liquide de fermentation, obtenu après élimination des bactéries selon l'étape (a) de la préparation V, pendant 100 h à une température comprise entre 20 et 40"C.

(b) L'isolation du composé OS formé dans ledit milieu liquide est effectuée comme indiqué à l'étape (b) de la préparation IX. Après ultrafiltration, purification et séchage, on obtient un OS ayant un dp de 5-60 et sépara ble en trois fractions de dp 5-10, 10-50 et 50-60.

PREPARATION XI
Obtention d'un composé oligosaccharide
La présente préparation illustre l'obtention d'OS par hydrolyse enzymatique.

(a) On soumet le composé polymère polyglucuronique à enchaînement 8(1-4) obtenu selon les modalités opératoires décrites dans la préparation V, VI ou VII, à une dégradation enzymatique au moyen d'une cellulase.

(b) L'isolation du composé OS ainsi obtenu est effectuée comme indiqué à l'étape (b) de la préparation IX.

Après ultrafiltration, purification puis séchage, on obtient un OS ayant un dp de 5-60 séparable en trois fractions de dp 5-10, 10-50 et 50-60.

PREPARATION XII
Obtention d'un composé oligosaccharide
La présente préparation illustre l'obtention d'OS par hydrolyse acide.

(a) On soumet le composé polymère polyglucuronique à enchaînement B(1-4) obtenu selon les modalités opératoires décrites dans la préparation V, VI ou VII, à une hydrolyse acide pendant 96 h à pH 3 au moyen de HC1.

(b) L'isolation du composé OS ainsi obtenu est effectuée comme indiqué à l'étape (b) de la préparation IX.

Après ultrafiltration, purification puis séchage, on obtient un OS ayant un dp de 5-60 séparable en trois fractions de dp 5-10, 10-50 et 50-60.

Les OS des trois fractions obtenues suivant les préparations IX-XII peuvent être isolés par chromatographie du type gel-filtration ou par toute autre méthode permettant de séparer les molécules en fonction de leur taille et/ou de leur masse.

PREPARATION XIII
Obtention de l'acide glucuronique
L'acide polyglucuronique de formule I obtenu par désacétylation selon les modalités opératoires décrites dans la préparation VIII a été soumis à une hydrolyse enzymatique poussée de façon à fournir l'acide glucuronique.

L'acide glucuronique ainsi formé peut être isolé par ultrafiltration et purifié par chromatographie d'échanges d'ions, par électrodialyse ou toute autre méthode appropriée permettant de séparer ledit acide des molécules plus grandes et des sels présents dans le milieu d'hydrolyse enzymatique.

Claims (13)

REVENDICATIONS

1. Composé polymère de l'acide glucuronique caractérisé en ce qu'il est choisi parmi l'ensemble constitué par

(a) les acides D-polyglucuroniques à enchaînement

8(1-4) de formule

(d) leurs mélanges.

(c) les éthers correspondants, et

(b) les esters correspondants,

moyenne comprise entre environ 300 et 2500,

dans laquelle n est un nombre ayant une valeur

2. Composé suivant la revendication 1, caractérisé en ce qu'il est choisi parmi l'ensemble constitué par - les esters des acides polyglucuroniques de formule I dans lesquels le reste OH d'au moins un groupe acide carboxylique COOH est remplacé par un reste alkoxy en

C1-C4, - les esters des acides polyglucuroniques de formule I dans lesquels l'atome d'hydrogène d'au moins un groupe alcool OH est remplacé par un reste acyle aliphatique en C2C4, - les esters des acides polyglucuroniques de formule I dans lesquels (i) le reste OH d'au moins un groupe acide carboxylique COOH est remplacé par un reste alkoxy en C1-C4, et (ii) l'atome d'hydrogène d'au moins un groupe alcool OH est remplacé par un reste acyle aliphatique en

C2-C4, - les éthers des acides polyglucuroniques de formule I dans lesquels l'atome d'hydrogène d'au moins un groupe alcool OH est remplacé par un reste alkyle en Cl-c4, - les éther-esters des acides polyglucuroniques de formule I dans lesquels (i) le reste OH d'au moins un groupe acide carboxylique COOH est remplacé par un reste alkoxy en C1-C4, et (ii) l'atome d'hydrogène d'au moins un groupe alcool OH est remplacé par un reste alkyle en C1-C4, et - leurs mélanges.

3. Composé suivant la revendication 1, caractérisé en ce qu'il a un poids moléculaire moyen en poids de 80 000 à 400 000 daltons et est choisi parmi l'ensemble constitué par - les acides polyglucuroniques de formule I selon la revendication 1, - les esters acétate correspondants dans lesquels les fonctions alcool OH sont partiellement O-acétylées, chaque cycle acide glucuronique de la formule I comportant au plus 33 % en poids de groupes O-CO-CH3 par rapport au poids dudit cycle acide glucuronique.

4. Procédé de préparation d'un composé polymère d'acide glucuronique de formule I selon la revendication 1 ou de l'un de ses esters dans lesquels les fonctions alcool OH sont partiellement O-acétylées, ledit procédé étant caractérisé en ce qu'il comprend la fermentation, en présence d'un milieu nutritif contenant une source d'azote, une source de carbone et des sels, d'une souche bactérienne appartenant à l'ensemble des Rhizobium et produisant des polysaccharides quand elle est cultivée à pH 7 dans un milieu nutritif aqueux contenant 1 g/l de K2HPOw, 0,2 g de MgSO.7H20, 1 g/l de NHNO3 et 10 g/l de glucose.

5. Procédé suivant la revendication 4, caractérisé en ce que ladite souche contient un seul plasmide ayant un poids moléculaire moyen en poids d'environ 100 000 à 150 000 daltons.

6. Procédé suivant la revendication 4 ou 5, caractérisé en ce qu'il comprend la fermentation de la souche

Rhizobium meliloti NCIMB 40472.

7. Procédé suivant l'une quelconque des revendications 4 à 6, caractérisé en ce que la fermentation est effectuée dans un milieu aqueux contenant 0,5 à 2 g/l de K,HPO,, 0,05 à 0,3 g/l de MgSO4, 0,8 à 3 g/l d'extrait de levure et 7 à 20 g/l de sucre, à une température de 25 à 40"C, ledit sucre étant notamment choisi parmi le glucose, le fructose, le saccharose et leurs mélanges.

8. Procédé suivant l'une quelconque des revendications 4 à 7, caractérisé en ce qu'il comprend (i) le recueil du milieu de fermentation incubé pendant une durée appropriée, après que la population bactérienne ait atteint une valeur supérieure ou égale à 109 bactéries/ ml, puis (ii) l'isolation du composé polymère de l'acide glucuronique.

9. Souche bactérienne appartenant à l'ensemble des

Rhizobium, caractérisée en ce qu'il s-'agit de la souche

Rhizobium meliloti NCIMB 40472.

10. Utilisation du composé polymère de l'acide glucuronique selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, notamment dans le domaine alimentaire, pharmaceutique en thérapeutique humaine ou vétérinaire, cosmétique ou de l'épuration des eaux, en particulier en tant que moyen gélifiant, épaississant, hydratant, stabilisant, chélatant ou floculant.

11. Utilisation du composé polymère de l'acide glucuronique selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, pour la fabrication de fibres ou fils polyglucuroniques.

12. Utilisation du composé polymère de l'acide glucuronique selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, dans la préparation de composés oligosaccharides D-polyglucuroniques à enchalnement p(1-4).

13. Composé oligosaccharide, caractérisé en ce qu'il est obtenu par hydrolyse, notamment acide ou enzymatique, d'un composé polymère de l'acide glucuronique selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, et en ce qu'il a un degré de polymérisation notamment compris entre 2 et 100 et de préférence compris entre 5 et 20.