FR2687686A1 - Enzyme destinee a la fragmentation du n-acetylheparosane, obtention des preparations contenant cette enzyme et procedes de fragmentation utilisant cette enzyme. - Google Patents

Abstract

L'invention concerne une enzyme capable de fragmenter un N-acétylhéparosane de haute masse moléculaire. Cette enzyme a été obtenue par la souche Escherichia coli (K5), souche SEBR 3282.

Description

i La présente invention concerne une enzyme destinée à la fragmentation du

N-acétylhéparosane, I'obtention des préparations contenant

cette enzyme ainsi que des procédés de fragmentation utilisant cette enzyme.

Il est connu que certaines bactéries de l'espèce Escherichia 1 oi. produisent un polysaccharide capsulaire, habituellement appelé K 5, qui est une

famille de polymères constituée d'unités répétées B-D-glucuronyl-1,4 c N-

acétyl-D-glucosaminyl ( 1,4), (W F Vann et ai, Eur J Biochem, 1981, 116, 359-

364), de structure (a):

CH 2 OH COOH

OH OH (a)

NHCOCH 3 OH

Ce polysaccharide sera appelé ici N-acétylhéparosane Ce produit possède une masse moléculaire comprise entre 105 et 2 106 Da, et au niveau des unités "acide uronique", une structure très régulière composé uniquement d'acide D-glucuronique (W F Vann et al, Eur J Biochem, 1981,

116, 359-364, et la demande de brevet EP-A-0 333 243).

Le N-acétylhéparosane est surtout utile comme matière première pour l'industrie pharmaceutique mais, pour cette utilisation, il a une

masse moléculaire trop élevée.

Il est connu que le N-acétylhéparosane (polysaccharide K 5) peut-être fragmenté par une lyase phagique provenant d'un phage spécifique de la souche Escherichia co 9 i (K 5), mais cette fragmentation est très poussée et conduit à une disparition importante des fragments de masse moléculaire de 5000 Da vers des chaînes beaucoup plus petites (D Gupta et ai, FEMS Microbiology Letters, 1983, 16, 13-17 Cette fragmentation est utilisée dans la demande de brevet EP-A-0 333 243 pour la préparation de fragments

contenant au maximum 10 unités saccharidiques.

De manière surprenante il a été constaté que les cultures

d'Escherichia coli (K 5), souche SEBR 3282, produisent dans certaines condi-

tions environnementales, une enzyme qui fragmente le N-acétylhéparosane au cours de la culture en fermenteur De manière non moins surprenante, il a aussi été constaté que les fragments de N-acétylhéparosane se situent en dessous d'un pic de masse moléculaire d'environ 5000 Da rassemblant à

quelques unités disaccharidiques près, environ 70 %/a du produit.

Enfin, de manière toujours surprenante il a été constaté qu'une préparation de cette enzyme convenablement solubilisée permet d'obtenir des fragments de masse moléculaire plus élevée comparée aux fragments obtenus spontanément, c'est à dire avec l'enzyme non solubilisée En effet, des

préparations d'enzymes solubilisées permettent de moduler la fragmentation et.

d'obtenir des fragments dont la majorité a une masse moléculaire supérieure d'au moins 1000 à 3000 Da par rapport à la masse moléculaire des fragments

obtenus spontanément.

Ainsi, la présente invention a pour objet une enzyme qui permet la fragmentation modulée d'un N-acétylhéparosane de haute masse moléculaire et l'obtention de fragments de N-acétylhéparosane de masse moléculaire désirée avec un très bon rendement L'enzyme de la présente invention est donc utile pour préparer des N-acétylhéparosanes de petite masse moléculaire à partir d'un N-acétylhéparosane de haute masse moléculaire, pour les raisons suivantes: le N-acétylhéparosane de haute masse moléculaire s'obtient sur milieu synthétique peu coûteux avec des rendements supérieurs à ceux d'un milieu complexe, milieu nécessaire à l'obtention d'un N-acétylhéparosane de petite

masse moléculaire.

le N-acétylhéparosane de haute masse moléculaire est techniquement plus

facile à manipuler que celui de petite masse moléculaire.

la fragmentation in-vitro sépare la phase de production de celle de fragmentation, ce qui permet de maîtriser et d'optimiser les deux phases tout en offrant une grande latitude sur les caractéristiques du produit recherché,

par exemple, sur sa masse moléculaire.

i'enzyme et le N-acétylhéparosane sont particulièrement stables ce qui autorise des recyclages multiples éventuellement nécessaires dans la mise en oeuvre de procédés dynamiques, au cours desquels, les processus de fragmentation et de fractionnement sont mis en oeuvre simultanément ou successivement tout en s'affranchissant des contraintes de temps liées à

l'emploi d'un bioréacteur.

Plus précisément l'enzyme de la présente invention est caractérisée en ce que: elle est obtenue à partir d'une souche Escherichia coli (K 5), la souche Escherichia coli SEBR 3282, ou d'un mutant spontané ou induit de cette souche. sa masse moléculaire est comprise entre 62000 et 70000 Da, plus précisément environ 65000 Da, son point isoélectrique se situe dans la zone de p H comprise entre 4,7 et 5,4 unités p H,

elle est une éliminase, plus précisément une endo-13-éliminase.

L'enzyme de la présente invention est caractérisée aussi en ce qu'elle agit de la façon suivante: elle est d'origine membranaire, la température de son fonctionnement optimal est voisine de 37 C et la température à laquelle elle est inactivée est d'environ 60 C, la zone optimale de p H pour son fonctionnement se situe entre les valeurs p H 6 etp H 7, pour son fonctionnement, la zone optimale de concentration en ions monovalents ou bivalents se situe au voisinage de 0,2 M. De plus, I'enzyme de l'invention est caractérisée en ce que: elle ne permet pas de scinder le N-acétylhéparosane en dessous d'une certaine taille, taille qui correspond à une masse moléculaire d'environ 1000 à 1500 Da, elle est capable d'agir sur le N-acétylhéparosane de haute masse

moléculaire et de le fragmenter en l'absence de corps bactériens in vitro.

L'enzyme, objet de la présente invention, est une enzyme obtenue d'une culture d'Escherichia coli, notamment d'Escherichia coli SEBR 3282 Cette souche est une souche dérivée de la souche Bi 8337-41 (O 10:K 5:H 4) ATCC 23506 (décrite par D S Gupta et al FEMS Microbiology

Letters, 1982, 14, 75-78 et W Vann Eur J Biochem, 1981, 116, 359-364).

La souche Escherichia co 1 i (K 5) SEBR 3282 répond positivement au test de typage par le phage K 5 spécifique selon la méthode de B Kaiser et ai (J Clin Microbiol, ( 1984), 19, 2, 264-266) Il s'agit donc bien d'une souche Escherichia coli (K 5) Cette souche a été déposée auprès de la CNCM de l'institut Pasteur, Paris, France, sous le N 1-1013 Il est aussi possible d'isoler cette enzyme d'un mutant soit spontané soit induit de la souche Escherichia Qcoi SEBR 3282 ou encore par d'autres souches d'Escherichia coli (K 5)

appropriées par exemple, par la souche Bi 626-42 ( 012:K 5:NM) ATCC 23508.

La masse moléculaire de cette enzyme, évaluée par chromatographie d'exclusion, est comprise entre 62000 et 70000 Da, plus précisément la masse moléculaire est d'environ 65000 Da Le point isoélectrique de l'enzyme, objet

de la présente invention, se situe à un p H de 4,7-5,4.

En effet, I'enzyme de l'invention permet de fragmenter le Nacétylhéparosane et d'obtenir des fragments comportant à l'extrémité non réductrice un reste d'acide glucuronique ayant une double liaison entre les carbones 4 et 5 (élimination du groupe OH) De telles enzymes ne font pas intervenir l'eau dans la réaction chimique considérée et sont dites de type éliminase L'enzyme, objet de la présente invention est donc d'une éliminase et

notamment d'un endo-13-éliminase.

Le préfixe "endo" est utilisé pour indiquer que l'enzyme, objet de la présente invention est capable de fragmenter le N-acétylhéparosane à une distance considérable de l'extrémité de la molécule Plus particulièrement,

l'enzyme de la présente invention ne permet pas de scinder le N-

acétylhéparosane en dessous d'une certaine taille qui correspond à une masse moléculaire d'environ 1000 Da à 1500 Da Ainsi, l'enzyme, objet de la présente invention, lors d'une fragmentation totale d'un Nacétylhéparosane de haute masse moléculaire, permet d'obtenir des fragments de N-acétylhéparosane de masses moléculaires comprises entre 1000 Da et 10000 Da et plus spécialement d'obtenir des fragments ayant des masses moléculaires

regroupées à 70 % aux environs de 5000 Da.

Le N-acétylhéparosane de haute masse moléculaire utilisé dans ce but peut-être obtenu comme décrit par W F Vann et al, Eur J Biochem, 1981, 116, 359-364, et dans la demande de brevet EP-A-0 333 243, ou bien par fermentation de la même souche Escherichia coli (K 5) SEBR 3282 utilisée

pour la préparation de l'enzyme de la présente invention.

Par action de l'enzyme de la présente invention, le N-acétylhéparosane de haute masse moléculaire est fragmenté en des fragments ayant une masse moléculaire majoritaire d'environ 5000-Da Par le terme "masse moléculaire majoritaire" on entend la masse moléculaire qui correspond au maximum (pic) du profil chromatographique obtenu lors de la détermination de la masse moléculaire du N-acétylhéparosane par chromatographie en perméation de gel (CPG) Les fragments ainsi obtenus présentent à l'extrémité non réductrice une unité glucuronique-ayant une double liaison entre les carbones 4 et 5 Cette enzyme permet en particulier d'obtenir à la fin culture, à parti d'un N-acétylhéparosane de haute masse moléculaire, des fragments ayant dans leur majorité des tailles identiques qui correspondent à une masse moléculaire d'environ 5000 Da Donc, I'enzyme de l'invention doit être capable d'intervenir au niveau de la macromolécule de N-acétylhéparosane à une distance donnée de l'extrémité de cette macromolécule Cela permet d'obtenir

des fragments constitués par un nombre de motifs B 13-D-glucuronyl-1,4 N-

acétyl-D-glucosaminyl ( 1,4) bien précis Il s'agit donc d'une endo-B 13éliminase.

Le suivi de la fragmentation spontanée du N-acétylhéparosane au cours d'une culture en milieu complexe fait également apparaître un phénomène de lyse légère qui permet difficilement d'affirmer o l'enzyme concernée est localisée dans la cellule: cytoplasme, périplasme, membrane ou

encore milieu de culture extracellulaire.

Les méthodes employées pour localiser l'endo-3-éliminase sont

définies et regroupées dans le Schéma 1.

Localisation de l'éliminase) i Milieux de fermentation Centrifugation ( 3100,g 15 min) r Lyse enzymatique: 200 e de culots humides + 400 ml de tamnon Tris-HCI 50 m M p H= 8 + EDTA (l Om M) + 100 mg de Lysozvme en conctact jusqu'à obtention d'un mélange non visqueux. + Mg CI 2 ( 20 m M) + Dnase I ( 15 mg) Centrifugation ( 15000 z, 60 min) ? 2 ml de surnageant Surnageant (+) + 1 ml de K 5 haut PM ( 2,44 g/1) Tps R: 24 h T: 37 C, p H: 7,4 % de bas PM:47 % Centrifugation ( 105000 z, 60 min) Surnageant (-) 0,5 ml de surnageant + 0,75 ml de K 5 haut PM ( 2,44 g/1) Tps R: 24 h, T: 37 C , p H: 7 % de bas PM après réaction: 14 % 2 ml de culot resuspendu dans eau physiologique (D O = 350) Culot (+) + 1 ml de K 5 haut PM ( 2 44 g/l) Tps R: 24 h T: 37 C, PH: 7 % de bas PM après réaction: 68 % Culot (+) I g de culot resuspendu dans 2 ml de tampon Tris-Hcl 5 Om M + I ml de K 5 haut PM ( 2,44 g/il) Tps R: 24 h T: 37 C, p H: 7,4 % de bas PM après réaction:44 % Surnageant (-) 2 ml de sumrnagenant + I ml de K 5 haut PM Tps R: 15 h T: 37 C, p H: 7,4 % de bas PM après réaction: 12 % bréviations:

Tps R: Temps de réaction.

T: Température (<C).

-1 PM: Poids Moléculaire.

Culots membranaires (+) (repris dans le même volume) 2 ml de solution + 1 ml de K 5 haut PM ( 2,44 g/t) Tps R: 15 h, T: 37 C p H: 7,4 % de bas PM après réaction: 43 % Schéma n* 1 On observe que: le surnageant des suspensions de culture de la souche Escherichia cori (K 5) SEBR 3282 sur "milieu complexe" contient de faible quantité d'endo-13- éliminase.

l'essentiel de l'activité enzymatique se situe dans les culots bruts.

les préparations de membranes lipidiques obtenues à partir des surnageants de lyse des culots lavés, renferment l'essentiel de l'activité de type 13-éliminase. Par conséquent: à l'origine l'enzyme est membranaire et sans autre manipulation, l'essentiel

de l'activité se retrouve dans les membranes lipidiques des bactéries.

au cours de cultures en milieu liquide, et particulièrement sous agitation, ainsi que dans des conditions de lyse des corps bactériens, une partie de

l'activité peut se retrouver et s'exercer en dehors des corps bactériens.

il n'est pas nécessaire de concentrer l'enzyme, pour l'obtenir il suffit d'isoler

les membranes lipidiques.

L'enzyme, objet de la présente invention, est une enzyme d'origine membranaire, l'essentiel de l'activité se retrouvant dans les membranes lipidiques des bactéries Toutefois, au cours de cultures en milieu liquide, et particulièrement sous agitation, ainsi que dans des conditions de lyse des corps bactériens, une partie de l'activité peut se retrouver et s'exercer en

dehors des corps bactériens.

La solubilisation de l'enzyme de la présente invention a été établie à l'aide de différents détergents selon les techniques connues (Biotechnology and Applied Biochemistry, 1990, 12, 599-620), à partir d'un culot membranaire Ainsi par exemple, les préparations d'enzymes solubilisées par les détergents tels que le Triton X-1000, le Triton X-1 14 e, DOC, NP-40 ,

Tween 80 , tous à 2 % et le chlorhydrate de guanidine 0,1 M sont actives.

La détermination du point isoélectrique (p Hi) de l'enzyme a été effectuée selon la méthode de "chromatofocusing" dans une zone de p H

comprise entre 3,5 et 9.

Le p Hi ainsi déterminé se situe entre p H 4,7 et p H 5,4. La masse moléculaire de l'enzyme de la présente invention a été déterminée par chromatographie, en perméation de gel (CPG) et se situe entre

62000 et 70000, le pic des protéines étant à environ 65000 Da.

L'enzyme de la présente invention a été également soumise aux tests pour étudier les facteurs environnementaux exerçant une influence sur son activité Aussi, on connaît l'influence de la température, du p H, des ions monovalents, notamment de l'ion Na+, des ions divalents, notamment de l'ion Ca 2 + et on a déterminé la constante de Michaelis ainsi que la stabilité de l'enzyme. La température optimale de fonctionnement de l'enzyme, objet de la présente invention, est voisine de 370 C La température d'inactivation de l'enzyme est de 600 C, et à la température de 200 C, l'enzyme conserve 40 % de son activité versus celle à 370 C. La zone optimale de p H de fonctionnement de l'enzyme, objet de

la présente invention, se situe entre les valeurs p H 6 et p H 7.

Par ailleurs, la zone optimale de concentration en ions monovalents et plus particulièrement en ions sodium, pour le fonctionnement de l'enzyme, objet de la présente invention, se situe au voisinage de 0,2 M. Pour les ions bivalents, la zone optimale de concentration pour le fonctionnement d'enzyme, se situe au voisinage de 0,2 M En effet, lorsque l'on utilise l'enzyme mise en solution dans du chlorure de calcium à 0,2 M, on

observe une activation d'environ 50 %.

L'invention concerne aussi un procédé d'obtention de l'enzyme, objet de la présente invention, et notamment l'obtention des préparations contenant cette enzyme à partir d'une culture d'Escherichia 2 li (K 5), souche SEBR 3282 ou à partir d'un mutant soit spontané soit induit de la souche SEBR Plus particulièrement l'invention concerne aussi l'obtention des préparations des lysats bruts obtenus par lyse d'un culot de culture contenant

l'enzyme objet de la présente invention.

Elle concerne aussi les préparations membranaires contenant

cette enzyme.

L'invention concerne également les préparations contenant

l'enzyme sous forme solubilisée.

Le terme "préparation contenant l'enzyme" inclut bien les lysats bruts obtenus à partir d'une culture d'Escherichia coli (K 5), souche SEBR 3282,

ou par un mutant soit spontané soit induit de la souche.

Le terme "préparation contenant l'enzyme" inclut également les préparations membranaires obtenues à partir d'un lysat brut contenant

l'enzyme objet de la présente invention.

Le terme "préparation contenant l'enzyme" inclut également les préparations de l'enzyme solubilisée obtenues par des préparations membranaires contenant l'enzyme objet de la présente invention ou toute autre

préparation contenant cette enzyme.

Pour obtenir un lysat brut contenant l'enzyme, objet de la présente invention, on utilise le culot de la suspension d'une culture d'Escherichia coli (K 5), souche SEBR 3282 effectuée dans des conditions environnementales favorables à la formation de l'enzyme, objet de la présente invention. Comme milieu de culture on peut citer à titre d'exemple non exclusif, un milieu complexe tel qu'il est décrit dans la présente invention et notamment le "milieu D" pour la préculture de la souche Escherichia pli (K 5),

SEBR 3282 et le "milieu C" pour la culture de cette préculture.

A la fin de cette culture, le culot de la suspension de culture de la souche SEBR 3282 est récupéré par centrifugation puis lysé, par exemple par

addition de lysozyme Ce lysat brut ainsi obtenu peut être directement utilisé.

Les préparations membranaires contenant l'enzyme, objet de la présente invention, sont obtenues à partir du lysât brut, par centrifugations successives permettant d'isoler les culots membranaires qui sont ensuite solubilisés, soit dans l'eau ultra-purifiée, soit dans des tampons appropriés tel que par exemple le tampon TRIS-HCI p H 7,2 Il est également possible d'utiliser des solutions aqueuses contenant des ions monovalents ou bivalents

notamment de ions Na+ ou Ca 2 +.

Les préparations d'enzyme solubilisée sont obtenues à partir de préparations membranaires contenant cette enzyme En effet, l'enzyme, objet de la présente invention, peut-être solubilisée à partir de préparations

membranaires et obtenues sous forme active.

Pour la solubiliser, on peut utiliser des détergents, des sels, des

enzymes ou tout autre moyen connu de l'homme de l'art.

En effet, l'enzyme, objet de la présente invention, peut-être solubilisée à partir de préparations lipidiques en utilisant certains détergents sans être dénaturée Comme détergents on peut plus spécialement utiliser les détergents non-ioniques A titre d'exemple on peut citer le Triton X-100 , le Triton X-11 4 , le Déoxycholate (DOC), le NP-400, le Tween 80 et la Guanidine-HCI 0,1 M. Toutefois, la mise en évidence de l'activité enzymatique de l'enzyme objet de la présente invention nécessite l'élimination des résidus de détergents en utilisant par exemple des colonnes affines spécifiques du commerce L'enzyme, faisant l'objet de la présente invention, peut aussi être solubilisée de manière non dénaturée sans faire appel aux détergents, par lyse

partielle en milieu alcalin.

L'invention concerne aussi des procédés de fractionnement modulé des N-acétylhéparosanes de haute masse moléculaire mettant en

oeuvre des préparations de l'enzyme, objet de la présente invention.

Ces procédés peuvent mettre en oeuvre l'enzyme, objet de la présente invention, soit dans des milieux de culture in vivo lors de la production de N-acétylhéparosanes, soit in vitro dans le cas o la phase de production de N-acétylhéparosane est séparée de celle de fragmentation Dans ce dernier cas, les préparations de l'enzyme, objet de la présente invention, ne sont

utilisées qu'à la phase de fragmentation.

La mise en évidence in vivo de l'enzyme a été effectuée par la fragmentation provoquée d'une quantité de N-acétylhéparosane de haute masse moléculaire, ajoutée à une suspension de culture présentant une

activité éliminasique.

Il a été confirmé que l'enzyme ainsi obtenue coupe le N- acétylhéparosane de haute masse moléculaire de façon à obtenir un N- acétylhéparosane composé majoritairement de fragments de masse

moléculaire de 5000 Da.

F

On a trouvé, de façon surpenante, que la masse moléculaire du Nacétylhéparosane obtenu par fragmentation opérée par l'enzyme de la présente invention peut-être modulée en utilisant une préparation de l'enzyme solubilisée ou bien en réalisant la réaction enzymatique en présence de

cations,notamment des ions Na+.

Ainsi, selon un aspect ultérieur, la présente invention concerne un procédé pour la préparation de N-acétylhéparosane ayant des masses moléculaires regroupées, se situant notamment entre 2000 et 10000 Da, caractérisé en ce que l'on traite le N-acétylhéparosane de haute masse moléculaire (polysaccharide K 5) avec l'enzyme de la présente invention en présence d'une solution de chlorure de sodium ayant une molarité de 0, 2 à

0,5 M.

Le terme "masses moléculaires regroupées entre 2000 et 10000 Da", tel qu'utilisé ici, se rapporte aux différents N-acétylhéparosanes ayant une masse moléculaire avec une courbe de distribution assez étroite, par exemple 1000 à 3000 Da avec masse moléculaire majoritaire à 2000 Da, de 3200 à 4000 avec masse moléculaire majoritaire à 3600 Da, de 3900 à 4700 Da avec masse moléculaire majoritaire à 4300 Da, de 6000 à 8000 Da avec masse moléculaire majoritaire à 7000 Da, de 8000 à 10000 Da avec masse moléculaire majoritaire à 9200 Pa Il est entendu que ces masses moléculaires se réfèrent à la majorité des constituants, à savoir entre environ 50 % et

environ 90 %.

La masse moléculaire des produits ainsi obtenus dépend de la durée de la réaction enzymatique et de la molarité du milieu en chlorure de sodium du milieu réactionnel comme aussi de la forme solubilisée ou non de l'enzyme. Le procédé de la présente invention peut aussi être conduit en fixant le N-acétylhéparosane de haute masse moléculaire sur une colonne de résine échangeuse d'ions et en traitant le produit fixé sur la colonne avec une solution de l'enzyme de la présente invention En éluant avec une solution contenant du chlorure de sodium, on obtient le N-acétylhéparosane ayant la masse moléculaire souhaitée, dépendant de la molarité de la solution en

chlorure de sodium utilisée.

Pour cette variant, on peut utiliser comme résine, des résines échangeuses d'anions, par exemple une résine type Q-Sépharose ou d'autres

résines équivalentes.

Par ailleurs, compte-tenu du fait que l'enzyme, objet de la présente invention est active dans une large gamme de concentration en chlorure de sodium, on peut envisager l'utilisation de l'enzyme dans des procédés qui permettent une fragmentation et un fractionnement simultané du

N-acétylhéparosane fixé sur la colonne.

Les exemples suivants illustrent l'invention sans toutefois la limiter Dans la PREPARATION, et dans les EXEMPLES, on a utilisé des dénominations commerciales qui sont explicitées ci-après: Triton X-1 00 : polyethylene glycol tert-octylphenyl ether (Rohm & Hass Co) Triton X- 114 : polyethylene glycol tert-octylphenyl ether (Rohm & Hass Co) DOC: sel de sodim d'acide deoxycholique NP-40 : Nonidet P-40, ethylphenylpolyethyleneglycole (Shell) TRIS-HCI: Tris(hydroxymethyl)aminomethane hydrochloride Tween 80 : polyoxyethylene sorbitanmonoolate (Atlas Chem Ind Inc) Struktol J 673 : antimousse de (Schill & Seilacher) Germany/Hamburg

PREPARATION

N-acétylhéparosane majoritairement de haute masse moléculaire On ensemence 400 ml du milieu B, de composition précisée dans le tableau I ci-après, avec la souche Escherichia coli (K 5) SEBR 3282 et on

incube sous agitation pendant 2 h à 37 C.

La préculture obtenue est alors transférée dans un fermenteur de 18,5 I contenant 11 I du milieu A, de composition précisée aussi dans le tableau I ci-après, et on incube pendant 6 h 30 minutes à 37 C et p H égal à 7,2, la pression partielle en oxygène étant maintenue à 40 mm Hg par régulation de l'injection d'air (jusqu'à 20 I/minutes) et de l'agitation On ajoute alors du glycérol en introduisant de façon continue une solution stérile contenant 500 ' /I de glycérol à raison de 18 g/h pendant 16-17 heures. On poursuit la culture dans les mêmes conditions de température, de p H et de pression partielle en oxygène jusqu'à consommation quasi totale du glycérol Le suivi de la DO (< = 600 nm) de la suspension de culture après la fin de l'ajout en glycérol, montre un état stationnaire ou de lyse légère jusqu'à

I'arrêt de la culture à 28-30 h d'âge en fermenteur.

TABLEAU I

Composition et préparation du milieu A et du milieu B.

MILIEU A

Dans 900 ml d'eau ultra-purifiée dissoudre dans l'ordre: NTA (acide nitrilotriacétique)

K 2 HPO 4

Acideglutam ique Mg CI 2, 6 H 20

K 2504

Fe SO 4, 7 H 20 Ca CI 2, 2 H 20 Na CI KCI KCI Solution d'oligo- éléments (cf Tableau III, Exemple 1) Glycérol 1000 mg 790 mg 11000 mg 500 mg 450 mg 18 mg 2 mg 500 mg 5000 mg 1 ml 10000 mg Ajuster le p H à 7, 2 avec de la potasse concentrée de densité 1,38 et compléter à 1000 ml avec de l'eau ultra-purifiée Effectuer une filtration stérilisante sur

membrane de 0,2 pm.

Solution de glycérol Dissoudre 50 g de glycérol dans une quantité adéquate d'eau ultra-purifiée et ajuster le volume à 1000 ml avec le même solvant Effectuer une filtration

stérilisante sur membrane de 0,2 pm.

L'anti-mousse employé en cours de fermentation est le Struktol J 673 (Schill

et Seilacher).

MILIEU B

La préparation du milieu B est identique à celle du milieu A, à la différence

près, qu'il convient d'ajouter en plus le tampon (p H 7,2): acide 3-

morpholinopropanesulfonique (M O P S) après addition de l'agent anti-

mousse. On refroidit alors le bouillon de culture à 25 C On prélève 5 litres de culture, on centrifuge ( 11000 14000 g) pendant 15 à 20 mn Le surnageant est mélangé avec 5 litres de culture On répète l'opération de centrifugation Le culot est éliminé et le surnageant est filtré sur membrane écran en polycarbonate (Nucléopore ) 0,2 pm Le filtrat obtenu est concentré sur cartouche à fibre creuses Amicon , seuil de coupure 30000 Da ou équivalent On obtient ainsi une solution enrichie en N-acétylhéparosane de

haute masse moléculaire.

On ajoute à la solution une quantité adéquate de chlorure de sodium pour avoir une solution de 0,5 M en Na CI, puis on ajoute 4 volumes d'éthanol On laisse se former le précipité pendant 5 minutes à température ambiante On centrifuge à 5000 g pendant 20 minutes On reprend les culots de centrifugation dans l'éthanol, on agite la suspension obtenue, et on la laisse reposer pendant 1 heure à température ambiante On répète les opérations de centrifugation et de mise en suspension On centrifuge à nouveau à 5000 g pendant 20 minutes On sèche les culots de centrifugation obtenus dans une

étuve sous vide à 400 C pendant 24 heures.

Le N-acétylhéparosane ainsi obtenu est un "N-acétylhéparosane de haute masse moléculaire purifié" On reprend le N-acétylhéparosane dans de l'eau stérile de manière à avoir une solution de N-acétylhéparosane de

haute masse moléculaire de concentration 28 g/I.

EXEMPLE 1

OBTENTION ET CARACTERISATION DE L'ENZYME

1 OBTENTION D'UNE CULTURE D'ESCHERICHIACOLI (K 5) SEBR 3282 CONTENANT

L'ENZYME

Pour obtenir l'enzyme, une culture d'Escherichia (olii (K 5).

souche SEBR 3282 est effectuée dans des conditions environnementales favorables à la formation d'enzyme En effet, il est nécessaire d'utiliser un milieu de culture complexe tel qu'il est décrit ci- dessous Toutefois, d'autres milieux équivalents peuvent-être utilisés Les milieux C et D dont la composition est indiquée dans les tableaux Il et III ci-après seront appelés par la suite

"milieux complexes". On ensemence 400 ml du milieu D, avec la souche Escherichia jli SEBR 3282

(déposée auprès de la CNCM de l'institut Pasteur, Paris

France, sous le N 1-1013) et on incube sous agitation pendant 2 h à 37 C.

La préculture obtenue est alors transférée dans un fermenteur de 18,5 I contenant 11 I du milieu C, et on incube pendant 4 h à 370 C et à un p H égal à 7,4, la pression partielle en oxygène étant maintenue à 40 mm Hg par régulation de l'injection d'air (jusqu'à 20 I/min) et de l'agitation On ajoute alors du glucose en introduisant de façon continue une solution stérile contenant 600 g/l de glucose à raison de 250 ml/h pendant 8 h. On poursuit la culture dans les mêmes conditions de température, de p H et de pression partielle en oxygène pendant 10 h après l'arrêt de l'addition de glucose Le suivi de la DO ('X= 600 nm) du milieu de culture permet d'affirmer qu'il n'y a pas de croissance de la biomasse pendant

les 12 dernières heures de la culture.

TABLEAU II

Composition et préparation du milieu C et du milieu D

(MILIEUX COMPLEXES)

MILIEU C

Le milieu C est préparé par la réunion des trois solutions stériles cidessous: Solution N 1

dans 700 ml d'eau ultra-purifiée dissoudre dans l'ordre: -

l O Complexant: N'lTris-(hydroxyméthyl) méthyll glycine (Tricine commercialisé par Fluka ) 360 mg Fe SO 4,7 H 20 280 mg Ca CI 2, 2 H 20 6,7 mg Mg CI 2,6 H 20 1270 mg K 2 S O 4 500 mg KCI 5000 mg Hydrolysat de caséine (source principale d'acides aminés) HY CASE SF (commercialisé par Sheffield) 25000 mg Extrait de levure (commercialisé par Difco ) 18000 mg Solution d'oligo-éléments (cf tableau il ci-après) 1 mi Agent antimousse Struktol J 673 (commercialisé par Schill et Seilacher)

quelques gouttes à la pipette Pasteur.

Ajuster le p H à 7,4 avec une solution de KOH (d = 1,38) et compléter à 850 ml

avec de l'eau ultra-purifiée Autoclaver le milieu 45 minutes à 120 C.

Solution N 2 Dans environ 40 ml d'eau ultra-purifiée, dissoudre 5 g de K 2 HPO 4 puis ajuster à 50 ml avec le même solvant Filtrer la solutiorn obtenue à travers un filtre de

porosité 0,2 um.

Solution N 3 Dissoudre 20,7 g de glucose dans une quantité adéquate d'eau ultra-purifiée et ajuster le volume à 100 ml avec le même solvant Autoclaver à 110 C

pendant 30 minutes.

MILIEU D

La préparation du milieu D est identique à celle du milieu C, à la différence près,-qu'il convient d'ajouter en plus 20 g de tampon p H = 7, 2:

(acide 3-morpholinopropanesulfonique) après l'addition de l'agent anti-

mousse.

TABLEAU II 1

Préparation de la solution d'oligo-éléments utilisée dans la préparation du milieu C et du milieu D dans 800 ml d'eau ultra-purifiée dissoudre (dans l'ordre): H 3 BO 3 500 mg Na 2 Mo O 4,2 H 20 1930 mg l O Co CI 2,6 H 20 11850 mg Cu SO 4,5 H 20 25 mg Zn SO 4,7 H 20 2000 mg AICI 3,6 H 20 2410 mg Ajouter 100 ml d'acide chlorhydrique de densité 1,19 et compléter à 1000 ml

avec de l'eau ultra-purifiée.

On obtient ainsi une culture d'Escherichia coli (K 5) contenant

l'enzyme, objet de l'invention.

12 MISE EN EVIDENCE IN VIVO DE L'ENZYME EN FERMENTEUR |

La mise en évidence in vivo de l'enzyme a été effectuée par la fragmentation provoquée d'une quantité de N-acétylhéparosane de haute masse moléculaire, ajoutée à une suspension de culture présentant une

activité éliminasique.

La solution aqueuse de N-acétylhéparosane de haute masse moléculaire obtenue au stade précédent est ajoutée dans un fermenteur de 18,5 litres à une culture d'Escherichia coll (K 5), souche SEBR 3282 contenant l'enzyme, une fois que la culture est parvenue au plateau Ceci est mis en évidence par le suivi de la DO à X = 600 nm ( 1 Obtention d'une culture

d'Escherichia coli (K 5) SEBR 3282 contenant l'enzyme).

Des échantillons de suspension de culture ont été pris à 3, 5, 7, 9, 75 et 13,5 heures après addition du N-acétylhéparosane exogène ainsi que

juste après cette addition.

Etape A

Détermination de la répartition des masses moléculaires de N-

acétylhéparosanes au cours de la fermentation La détermination de la répartition des masses moléculaires de N-acétylhéparosanes contenus dans les différents échantillons à été effectuée

par HPLC d'exclusion.

a Conditions opératoires de HPLC d'exclusion Colonne: TSK G 3000 SWO (LKB) 7,5 x 300 mm constituée de billes de silice de diamètre 10 pm et de porosité 250 A. Eluant: solution aqueuse de sulfate de sodium 0, 5 M, filtrée sur 0,2 pm et dégazée. Débit:1 ml/minutes Détection UV à \ 205 nm L'étalonnage est effectué à l'aide d'une gamme d'oligosaccharides dérivés de l'héparine ( 10 mg) de masses moléculaires en suivantes (Da): 1320,

1880, 2440, 3410, 4000, 4540, 5000, 5370, 5730, 6150, 6670, 7540, 8660,

10090,11560,12950,14810,17390,22670.

b Préparation des échantillons A partir d'un prélèvement effectué sur la suspension de culture d'un fermenteur Centrifuger à 7000 g pendant 2 minutes Récupérer le surnageant et le filtrer sur membrane 0,2 gim, précipiter le filtrat en ajoutant 4 volumes d'éthanol absolu soit 80 % d'éthanol final, agiter au Vortex, attendre 5 minutes Centrifuger à 4000 g pendant 5 minutes, éliminer le surnageant, reprendre le culot dans l'eau ultra-purifiée au volume initial, agiter au Vortex et dialyser sur boudin Spectra-Por O (Spectrum) de seuil de coupure 10000 Da

pendant une nuit contre de l'eau ultra-purifiée.

Sous agitation magnétique à 4 e C, ajouter une solution concentrée de Na CI telle que la concentration finale de la solution contenant le Nacétylhéparosane soit de 0,5 M Précipiter en ajoutant 4 volumes d'éthanol absolu pour 1 volume de dialysat salé, agiter au Vortex Attendre 5 minutes, centrifuger à 4000 g pendant 5 minutes, jeter le surnageant, reprendre le culot dans du tampon pipérazine 25 m M p H 3,5 de manière à se situer entre 5 et 10

g de N-acétylhéparosane/litre, agiter au Vortex fortement.

Déposer l'équivalent de 1 mg de N-acétylhéparosane sur une colonne de résine Q-Sépharose préalablement équilibrée avec le Tampon Pipérazine, procéder au lavage de la colonne de résine par 2 volumes de

Tampon Pipérazine.

Laver avec 4-5 volumes d'eau ultra-purifiée, éluer avec 2 volumes de Na CI 0,5 M et recueillir l'éluat et précipiter à l'éthanol absolu comme

ci-dessus.

Centrifuger à 4000 g pendant 5 minutes et reprendre le culot

dans de l'eau ultra-purifiée de manière à se situer entre 5 et 10 g/I de N-

acétylhéparosane. Cette solution est prête pour la détermination de la répartition

des masses moléculaires par chromatographie d'exclusion.

Les résultats correspondant aux échantillons analysés, sont

donnés sous forme de profils chromatographiques dans la figure 1.

A partir de ces données, les fragments de N-acétylhéparosanes ont été divisés en trois classes:

Fragments ayant une masse moléculaire supérieure à 100000 Da.

Fragments ayant une masse moléculaire comprise entre 5000 et 100000 Da;

Fragments ayant une masse moléculaire égale à environ 5000 Da.

L'abondance relative de 3 classes de fragments dans le

fermenteur au cours du temps, est représentée dans la figure 2.

L'examen de la figure 1 permet les conclusions suivantes: Le Nacétylhéparosane de haute masse moléculaire de la culture et celui qui lui a été ajouté, évoluent progressivement vers du

N-acétylhéparosane majoritairement de faible masse moléculaire.

L'examen de la figure 2 permet les conclusions suivantes: Il existe des étapes fugitives o du N-acétylhéparosane de massse moléculaires intermédiaires est mis en évidence, c'est-à-dire que toute

la gamme des masses moléculaires est représentée au même moment.

Toutefois, au bout de 24 heures, le N-acétylhéparosane de haute masse moléculaire introduit dans le fermenteur, est fragmenté en quasi totalité ( 80 %)

en des fragments ayant une masse moléculaire d'environ 5000 Da.

La fragmentation s'effectue donc sur du N-acétylhéparosane exogène soit -par des enzymes en solution, soit au contact d'enzymes membranaires. Etape B Vérification de la structure des N- acétylhéparosanes de faible masse moléculaire obtenus par RMN Les spectres RMN du proton et du carbone 13 C des N-acétylhéparosanes obtenus après fragmentation enzymatique, sont comparés à ceux du N- acétylhéparosane W E Vann (Eur J Biochem, 1981,

116, 359-364).

: L'étude des spectres obtenus avec les N-acétylhéparosanes de faible masse moléculaire (environ 5000 Da), confirme l'identité chimique du produit au N-acétylhéparosane décrit par W E Vann Il s'agit de chaînes de polymères constituées de structures répétées de 13-D-glucuronyl-1, 4 N

-acétyl-D-glucosaminyl-( 1,4).

De plus, ces mêmes spectres permettent de conclure que les fragments comportent à l'extrémité non-réductrice un reste d'acide

glucuronique ayant une double liaison entre les carbones 4 et 5.

Les résultats obtenus indiquent bien que l'enzyme responsable de la dépolymérisation est de type 1-éliminase en raison de la présence d'une double liaison à l'extrémité non-réductrice du N-acétylhéparosane de faible

masse moléculaire obtenu, cette extrémité étant un reste d'acide glucuronique.

Par ailleurs, cette enzyme permet d'obtenir à la fin de la culture, à partir d'un N-acétylhéparosane de haute masse moléculaire, des fragments ayant dans leur majorité des tailles identiques qui correspondent à une masse moléculaire d'environ 5000 Da Donc, I'enzyme de l'invention doit être capable d'intervenir au niveau de la macromolécule de Nacétylhéparosane à une distance donnée de l'extrémité de cette macromolécule Cela permet d'obtenir des fragments constitués par un nombre de motifs "B 13-D-glucuronyl-1,4-c,-N

-acétyl-D-glucosaminyl-( 1,4)" bien précis Il s'agit donc d'une endo-B 3-éliminase.

3 LOCALISATION DE L'ENZYME OBTENTION DES PREPARATIONS CONTENANT

CETTE ENZYME

Les étapes principales représentées dans le Schéma 1, étapes qui ont permis d'obtenir des préparations contenant l'enzyme et notamment un lysat brut et

une préparation membranaire ayant une activité enzymatique, sont étayées ci-

après. Etape A Obtention d'un lysat brut présentant une activité enzymatique Evaluation de son activité a Préparation d'un lysat brut Le lysat brut présentant une activité enzymatique a été préparé à partir du culot d'une suspension de culture d'Escherichia coli (K 5) souche SEBR 3282 contenant l'enzyme ( 1-Obtention d'une culture d'Escherichia coli (K 5) souche SEBR 3282 contenant l'enzyme), de la manière suivante: Après incubation, le milieu de culture est refroidi à 25 C puis soumis à une centrifugation ( 31000 g) pendant 15 minutes A 200 g de culots humides, sont ajoutés 400 ml de tampon Tris-HCI 50 n M p H 8 et une quantité adéquate d'EDTA de façon à obtenir une concentration finale de 10 m M Sont

* ajoutés ensuite 100 mg de lysozyme.

La réaction enzymatique opérée par le lysozyme est menée à température ambiante, le p H -étant maintenu à 8,0 Quand le mélange est homogène, il est placé à 40 C pour une nuit Après cette pause, le p H est réajusté à 7,5 et on procède à un ajout de Mg CI 2 à 20 m M final, puis de

DNASE l 15 mg au total.

i.

b Mise en évidence de la fragmentation produite par le lysat brut.

A partir du lysat brut décrit ci-dessus, une fragmentation in vitro d'un N-acétylhéparosane de haute masse moléculaire, a été observée en procédant de la manière suivante: Le p H du lysat brut est ajusté à 6,8 On en prélève 600 pl et on y ajoute 1 mg de N-acétylhéparosane de haute masse moléculaire purifié, tel qu'il a été décrit dans la PREPARATION On incube ensuite à 37 C pendant 24 heures Une fois la réaction terminée, il est procédé à la détermination de la

répartition des masses moléculaires du N-acétylhéparosane obtenu.

La détermination de la répartition des masses moléculaires des échantillons a été effectuée par HPLC d'exclusion comme il est décrit cidessus

( 2 Mise en évidence in vivo de l'enzyme en fermenteur Etape A).

Un témoin de N-acétylhéparosane de haute masse moléculaire sans lysat a aussi été traité dans les mêmes conditions La comparaison des profils chromatographiques obtenus mettent en évidence qu'aucune fragmentation du témoin ne s'est produite Il s'agit encore d'un N- acétylhéparosane de haute masse moléculaire, composé par des

constituants ayant des masses moléculaires allant de 10000 à 100000 Da.

Par contre, une fragmentation est observée lorsque le N-acétylhéparosane de haute masse moléculaire est traité par le lysat brut Sur le profil chromatographique, on observe des fragments ayant une masse moléculaire comprise entre environ 4000 et 8000 Da, avec un pic accumulant des fragments d'environ 5000 Da, correspondant à l'essentiel du produit final

(figure 3).

L'activité enzymatique de type I-éliminase de la souche SEBR 3282 peut donc être exploitée en absence de corps bactériens, in vitro, à partir

d'un simple lysat brut.

Il est également étonnant que les fragments ne soient pas scindés en dessous d'une certaine taille, à l'opposé par exemple de ce qui est obtenu avec la lyase phagique spécifique de la souche d'Escherichia coli (K 5) qui procède à la disparition totale des fragments de 5000 Da vers des entités beaucoup plus petites (Gupta D, Jann B and Jann K; FEMS Microbiology

Letters 1983, 16, p 13-17).

Etape B Obtention d'une préparation membranaire présentant une activité enzymatique Evaluation de son activité Le lysat brut obtenu à l'étape précédente est soumis à une centrifugation à 15000 g pendant 60 minutes Le culot est éliminé et le surnageant est centrifugé à 105000 g pendant 60 minutes Le culot contenant les membranes bactériennes est isolé et repris dans le volume de départ avec

de l'eau ultra-purifiée.

La mise en évidence de l'activité éliminasique de cette prépa-

ration membranaire s'effectue comme décrit à l'étape précédente en incubant un aliquot de cette préparation mis en contact avec du Nacétylhéparosane de haute masse moléculaire à un p H voisin de la neutralité et une température de 37 C Après une nuit, un échantillon est prélevé et l'évaluation de la répartition de sa masse moléculaire est effectuée par HPLC en utilisant la méthode citée précédemment ( 2 Mise en évidence in vivo de l'enzyme en fermenteur Etape

A) Les résultats obtenus montrent que l'activité enzymatique endo-3 B-

éliminasique se retrouve au niveau des membranes bactériennes Cela n'exclut pas comme l'indique le Schéma 1 de détecter une activité dans le surnageant de la suspension de la culture obtenu, après une centrifugation basse vitesse ( 15000 g) En effet, une lyse partielle des bactéries se produit spontanément

après la phase plateau, au sein de la suspension de la culture.

14 SOLUBILISATION DE L'ENZYME

En raison des techniques de dosage de l'activité enzymatique qui nécessitent une enzyme fonctionnelle, les détergents considérés ont été choisis majoritairement parmi les non ioniques et non dénaturants (Schûtte H,

Kula M R; Biotechnology and applied Biochemistry ( 1990), 12, 559-620).

La solubilisation de l'enzyme sous forme membranaire a été

effectuée à partir d'un culot membranaire, telle que décrite ci-dessus ( 3-

Localisation de l'enzyme Obtention des préparations contenant cette enzyme

Etape B).

Les culots membranaires sont repris dans une solution de détergents de même volume que le lysat brut de départ, puis, le mélange est laissé en contact une nuit à 40 C Ensuite, il est soumis à une centrifugation à 105000 g pendant 1 heure Le surnageant contenant les protéines est récupéré, dialysé et passé sur une colonne affine pour les détergents, selon les

prescriptions du fournisseurs.

La mise en évidence de l'activité des différentes préparations contenant l'enzyme sous forme soluble a été effectuée en incubant un aliquot des préparations de haute masse moléculaire à un p H voisin de la neutralité et à une température de 370 C Après 6 jours d'incubation, des échantillons sont prélevés et la répartition des masses moléculaires des N-acétylhéparosanes obtenus est évaluée par HPLC selon la méthode précédemment décrite Les

résultats de cette étude sont rassemblés dans le tableau IV.

Une partie du culot membranaire repris dans le tampon Tris-HCI n M, p H 8, a servi de témoin Ce dernier a été traité dans les conditions

citées ci-dessus.

Le dosage des protéines totales a été effectué à l'aide de "BCA

protein assay reagent " de Pierce.

Les résultats indiqués dans le tableau IV démontrent que mis à part l'échantillon traité avec la guanidine thiocyanate, dans les conditions opératoires indiquées, les préparations d'enzyme solubilisées par des

détergents, sont actives.

En effet, le témoin après 6 jours d'incubation à 370 C ne présente qu'une faible attaque du N-acétylhéparosane, de l'ordre de 10 %, tandis que dans les autres essais le N-acétylhéparosane fragmenté de faible masse moléculaire représente environ 90 % de la masse initiale, ce qui est un maximum.

TABLEAU IV

ESSAI PROTEINES TAUX DE SOLUBIUSATION*/ ACTIVITE ENDO-38-

MEMBRANAIRE EN GJL PROTEINES MEMBRANAIRES EUMINASIQUE

SOUS FORME SOLUBLE

1Témoin Tris-HCI 0,32 17 % FAIBLE 2Triton X-1 00 2 % 0,88 44,5 % FORTE 3Triton X-1 14 2 % 1,64 68,6 % FORTE

4 DOC 2 % 0,86 55,1 % FORTE

NP-40 2 % 0,97 58,0 % FORTE 6Guanidine 2,72 90,7 % NULLE Thiocyanate 4 M 7Tween 80 2 %/a 0,57 24,1 % FORTE 8Guanidine-HCI 0,1 M 1,04 58,4 % FORTE Un autre fait intéressant qui apparaît sur la superposition des profils chromatographiques, est le déplacement du pic accumulant les fragments de N-acétylhéparosane majoritairement de basses masses moléculaires de 5000 Da Pour l'enzyme membranaire (témoin) il se situe vers 5000 Da Pour l'échantillon traité au Triton X-11 4 , il se situe vers 6500 à 7000

Da (selon standard héparine).

L'étude de la solubilisation de l'enzyme permet de conclure que: I'enzyme peut-être solubilisée par un grand nombre de détergents et obtenue sous forme active la forme soluble de l'enzyme, permet d'obtenir des pics rassemblant une majorité de fragments de N-acétylhéparosane autour d'une masse moléculaire (sommet du pic) supérieure à celle constatée pour la forme

membranaire de l'enzyme.

DETERMINATION DU POINT ISOELECTRIQUE (P Hi) DE

L'ENZYME

La détermination du p Hi de I'éliminase se fait grâce à la méthode "chromatofocusing" Son principe est, de créer à travers une colonne de chromatographie, un gradient de p H Les protéines sont alors éluées quand leurs charges sont globalement neutres (à leur p Hi) La zone de p H testée est

comprise entre p H 3,5 et p H 9.

a Matériel utilisé Colonne basse pression: 10 x 30 cm (Pharmacia ) Gel PBE 94 (Pharmacia )

Eluant: "Polybuffer 96 et polybuffer 74 (Pharmacia ) -

Tampon de départ pour 6 < p H < 9: diéthanolamine-HCI 0,025 M à p H 9,5 Tampon de départ pour 3,5 < p H < 6: histidine-HCI 0,025 M à p H 6,2 io -Pompe: Gilson b Obtention d'éliminase solubilisée : 4 g de culots membranaires humides sont introduits dans 10 m I de tampon Tris-HCI 0,1 M à p H 10,5, à 0,3 M de Ca CI 2 La solubilisation dure 2 heures à température ambiante La suspension est alors centrifugée à 105000 g pendant 1 heure Le surnageant contenant l'enzyme est à 3 mg/ml de

protéines actives -

Dans un premier temps, la zone de p H choisie se situait entre p H 6 et 9 Des résultats plus précis ont été obtenus en répétant les essais et en

utilisant une zone de p H comprise entre 4,7 et 5,4.

L'activité enzymatique des différentes fractions a été évaluée en mettant en contact les fractions obtenues lors de la chromatographie en gradient avec un N-acétylhéparosane de haute masse moléculaire et en déterminant la distribution des masses moléculaires du N- acétylhéparosane

obtenu après incubation pendant 60 heures à 37 C et à p H 6,8.

Le p Hi de l'enzyme est compris entre p H 4,7 et p H 5,4.

6 DETERMINATION DE LA MASSE MOLECULAIRE DE

L'ENZYME

La détermination de la masse moléculaire de l'éliminase a été effectuée par chromatographie en perméation de gel (GPC) Les protéines sont éluées en fonction de leur masse moléculaire, les plus petites tailles sortant en premier. a Matériel utilisé Colonne TSK G 2000 SW de 7,5 x 30 mm Eluant Na CI 0,3 M Tris 5 Om M p H 7 Débit 0,3 ml/minute Détection à 280 nm avec une sensibilité de 0,2 AUFS b Obtention d'éliminase solubilisée 4 g de culots membranaires humides sont introduits dans 10 ml de tampon Tris-HCI 0,1 M à p H 10,5, à 0,3 M de chlorure de calcium La solubilisation dure 2 heures à température ambiante La suspension est alors centrifugée à 105000 g pendant 1 heure Le surnageant contenant l'enzyme est à 3 mg/ml de protéines actives 24 fractions, collectées toutes les 30

secondes, ont été obtenues.

L'activité enzymatique des différentes fractions obtenues a été évaluée en mettant en contact chaque fraction avec un N-acétylhéparosane de haute masse moléculaire Après incubation pendant 38 heures à 371 C et à p H 7, la distribution des masses moléculaires du N- acétylhéparosane obtenu a été déterminée. Les fractions les plus actives sont situées entre 22 et 23 minutes (figure 4) En fonction des deux pics les plus élevés en activité éliminasique, la masse moléculaire de l'éliminase est située entre 62000 et

70000 Da et plus précisément vers 65000 Da.

On peut donc dire dans un premier temps que l'éliminase à un poids moléculaire situé entre 62000 et 70000 Da, et plus particulièrement vers

65000 Da.

7 FACTEURS ENVIRONNEMENTAUX EXER ANT UNE INFLUENCE SUR L'ACTIVITE DE

L'ENZYME (PREPARATION MEMBRANAIRE)

Pour cette étude, une préparation membranaire telle que décrite ci- dessus ( 3 Localisation de l'enzyme Etape B Obtention d'une préparation membranaire présentant une activité enzymatique Evaluation de son activité) à

été utilisée.

L'activité enzymatique de cette préparation, observée selon les différents paramètres étudiés, à été évaluée par la détermination de la dispersion des masses moléculaires d'un N-acétylhéparosane de haute masse

moléculaire, soumis à son action.

a Température La température optimale de fonctionnement de l'enzyme est voisin de 370 C, sa température d'inactivation est de 600 C et à 200 C, l'enzyme conserve 40 % de son activité versus celle à 370 C. b p H La zone optimale de fonctionnement de l'enzyme se situe entre les valeurs p H 6 et p H 7 A p H 5 et à p H 7,5, l'enzyme conserve 40 % de son activité versus celle observée dans la zone de p H 6-7 A p H 8,5, l'enzyme

conserve moins de 10 % de cette activité.

c Effet des ions monovalents (Na+) La zone optimale de concentrations en ions sodium pour le fonctionnement de l'enzyme se situe au voisinage de 0,2 M A cette concentration en ions monovalents, l'activité de l'enzyme augmente d'environ % par rapport au témoin Il faut noter ici que les ions sodium permettent de déplacer le sommet du pic des fragments de N-acétylhéparosane vers les hautes masses moléculaires L'enzyme membranaire, placée dans ces conditions, engendre des fragments de masse moléculaire supérieure d'environ

500 Da par rapport à celles du témoin.

Certains ions monovalents, le sodium en particulier, permettent

donc de moduler la taille des fragments obtenus en final.

d Effet des ions divalents (Ca 2 +) La zone optimale de concentrations en ions calcium pour le fonctionnement de l'enzyme se situe au voisinage de 0,2 M Pour cette concentration, l'activité de l'enzyme augmente d'environ 50 % par rapport au témoin. e Constante de Michaelis La mesure de la réaction de fragmentation en fonction de la concentration en substrat, (ici le N-acétylhéparosane de haute masse moléculaire), permet après tracé selon Lineweaver-Burk de constater: que l'on obtient une droite L'enzyme répond donc à une cinétique Michaelienne. que la constante de Michaelis, est égale à la concentration de substrat pour laquelle la vitesse de réaction, est la moitié de la vitesse maximale, et est pratiquement égale à 1 g de N-acétylhéparosane/litre de solution réactionnelle. que de fortes concentrations en substrat, par exemple 30 g/l, à partir desquelles la solution de N-acétylhéparosane commence à devenir visqueuse, ne constituent pas un obstacle sensible au bon fonctionnement

de l'enzyme -

f Stabilité de l'enzyme Influence du p H: Après passage à p H 10,5 o l'enzyme est inactivée, l'enzyme récupère son activité une fois revenue à des valeurs p H proches de la neutralité Conservation à 40 C: Après stockage à 40 C pendant 3 mois, aucune perte significative d'activité n'est

constatée sur l'enzyme.

EXEMPLE 2

Fragmentation modulée d'un N-acétylhéparosane de haute masse moléculaire Obtention d'un N-acétylhéparosane de masse moléculaire d'environ 7000 Da Stade A Mélanger 25 g de N-acétylhéparosane de haute masse moléculaire, obtenu selon la PREPARATION avec 500 g d'une préparation d'enzyme membranaire (dont la préparation est décrite dans l'EXEMPLE 1; 3 Localisation de l'enzyme) Obtention des préparations contenant cette enzyme -Etape B) Le p H est ajusté à 7 à l'aide du tampon Tris- HCI 0,05 M p H 7. Ajouter une quantité adéquate de Ca CI 2 de façon à obtenir une

concentration finale de 0,2 M Incuber à 37 C pendant 24 heures.

Stade B

Centrifuger le mélange obtenu pendant 5 minutes à 4000 g.

Récupérer le surnageant et le filtrer sur membrane 0,2 pm Précipiter le filtrat

en ajoutant 4 volumes d'éthanol absolu soit 80 % d'éthanol final.

Centrifuger à 4000 g pendant 5 minutes, éliminer le surnageant, reprendre le culot dans l'eau ultra-purifiée Dialyser sur boudin Spectra-Por (Spectrum) de seuil de coupure 10000 Da pendant une nuit contre de l'eau ultra-purifiée. Sous agitation magnétique à 4 C, ajouter une solution concentrée de chlorure de sodium telle que la concentration finale soit de 0,5 M avant de précipiter en ajoutant 4 volumes d'éthanol absolu pour 1 volume de

dialysat salé Centrifuger à 4000 g pendant 5 minutes, jeter le surnageant.

Reprendre les culots de centrifugation, dans un tampon appelé tampon D, de composition Tris-HCI 20 m M p H 7,5, à raison de 100 ml/g La solution obtenue est chromatographiée sur une colonne d'échange d'anions forts comportant une matrice d'agarose réticulée avec des groupes ammonium quaternaires (le "Q-Sepharose fast flow" de Pharmacia ) préalablement équilibré avec le tampon D, à raison de 50 mi de gel pour 1 g de poudre Laver le gel avec une quantité suffisante de tampon D pour le retour à la ligne de base de la détection UV à 214 nm, puis avec une solution de pipérazine 25 m M dont le p H a été ajusté à 3,5 Eluer avec une solution de p H 3,5 ayant une composition: Na CI 0,5 M et pipérazine 25 m M L'éluat est neutralisé à l'aide d'une solution de Na OH 5 N. Précipiter en ajoutant 4 volumes d'éthanol Centrifuger à 4000 g pendant 5 minutes Récupérer le culot de centrifugation et sécher On obtient ainsi un N-acétylhéparosane constitué de chaînes dont la majorité à une masse

moléculaire comprise entre 6000 et 8000 Da.

t A

EXEMPLE 3 Fragmentation modulée du N-acétylhéparosane de haute masse moléculaire

fixé sur colonne de résine échangeuse d'anions en présence de l'enzyme, objet de la présente invention. Une masse de résine Q- Sépharose (Pharmacia) est dans un premier temps saturée avec du N- acétylhéparosane majoritairement de haute masse moléculaire comme décrit dans la PREPARATION On introduit ensuite une préparation d'enzyme membranaire en solution dans un tampon Tris-HCI p H 7,2 et contenant du chlorure de sodium à 0,25 M Cette dernière solution a été préparée à partir d'un lysat brut comme décrit dans l'EXEMPLE 1 ( 3 Localisation de l'enzyme Obtention des préparations contenant cette enzyme Etape B), mais en utilisant un tampon Tris-HCI p H 7,2 contenant du

chlorure de sodium à 0,25 M au lieu de l'eau ultra-purifiée.

On laisse réagir pendant 60 heures Le N-acétylhéparosane relargué en raison de la présence de Na CI 0,25 M est isolé et analysé Il s'agit d'un N-acétylhéparosane dont la majorité des chaînes à un poids moléculaire compris entre 3200 et 4000 Da Sur le profil chromatographique représentant la

distribution des masses moléculaires, le maximum se situe à 3600 Da.

Le N-acétylhéparosane fixé sur la résine est ensuite élué en utilisant une solution aqueuse de Na CI à 0,30 M L'étude du profil chromatographique représentant la distribution des masses moléculaires permet de confirmer que le maximum se situe à 4300 Da Il s'agit d'un N-acétylhéparosane constitué de chaînes plus longues par rapport à celles du

N-acétylhéparosane relargué.

Selon une autre variante, il est possible de procéder comme ci-

dessus mais en utilisant une préparation d'enzyme membranaire en solution dans un tampon Tris-HCI p H 7,2 et contenant du chlorure de sodium à 0,5 M. Dans ce cas, l'étude du profil chromatographique de la distribution des masses moléculaires du N-acétylhéparosane relargué permet de confirmer qu'il s'agit d'un N-acétylhéparosane constitué de chaînes plus longues, le maximum du pic se situant à environ 9200 Da Cela démontre que l'on peut moduler le fractionnement du N- acétylhéparosane en utilisant des préparations

membranaires ayant une concentration en Na CI donnée.

AUTRES EXEMPLES DE LA MISE EN OEUVRE DE L'ENZYME POUR LA

FRAGMENTATION D'UN N-ACETYLHEPAROSANE DE HAUTE MASSE

MOLECULAIRE

La mise en oeuvre de l'enzyme, objet de la présente invention lors de la fragmentation d'un N-acétylhéparosane de haute masse moléculaire a aussi été illustrée dans l'exemple 1 et notamment dans:

* 2 Mise en évidence in vivo de l'enzyme en fermenteur.

* 3 Localisation de l'enzyme Obtention des préparations contenant cette enzyme.

Etape A Obtention d'un lysat brut présentant une activité enzymatique.

Evaluation de son activité; b) mise en évidence de la fragmentation produite par un lysat brut, et Etape B Obtention d'une préparation membranaire présentant une

activité enzymatique Evaluation de son activité.

* 4 Solubilisation de l'enzyme

Il s'agit de procédés de fragmentations d'un N-

acétylhéparosane de haute masse moléculaire qui sont aussi applicables au

niveau industriel ou semi-industriel.

Claims (7)

REVENDICATIONS

1 Enzyme capable de fragmenter un N-acétyl-

héparosane de haute masse moléculaire, caractérisée en ce que: elle est obtenue d'une souche d'Escherichia coli (K 5) souche SEBR 3282 ou d'un mutant spontané ou induit de cette souche, sa masse moléculaire est comprise entre 62000 et 70000 Da, plus précisément environ 65000 Da, son point isoélectrique se situe dans la zone de p H comprise entre 4,7 et 5,4 unités p H,

elle est une éliminase, plus précisément une endo-p-

éliminase.

2 Enzyme selon la revendication 1, caracté-

risée en ce que: elle est d'origine membranaire, la température de son fonctionnement optimal est voisine de 370 C et la température à laquelle elle est inactivée est environ 600 C, la zone optimale de p H pour son fonctionnement optimal se situe entre les valeurs de p H 6 et 7, la zone optimale de concentration en ions monovalents ou bivalents se situe au voisinage de 0,2 M. 3 Procédé de préparation-de l'enzyme selon la revendication 1, sous forme de lysats bruts la contenant, caractérisé en ce que l'on effectue une culture d'Escherichia coli (K 5) SEBR 3282 ou d'un mutant spontané ou induit de cette souche, dans un milieu de culture favorable à la formation de cette enzyme, on isole le culot de la culture et on soumet ce culot à une lyse.

4 Préparation contenant l'enzyme selon la revendication 1, constituée par un lysat brut obtenu par lyse d'un culot membranaire de culture, contenant cette enzyme, d'Escherichia coli (K 5) souche SEBR 3282 ou d'un

mutant spontané ou induit de cette souche.

Préparation selon la revendication 4 contenant cette enzyme sous forme solubilisée. 6 Préparation selon la revendication 5, dans laquelle l'enzyme a été solubilisée par des détergents

anioniques ou cationiques.

7 Préparation selon la revendication 5, dans laquelle l'enzyme a été solubilisée par lyse partielle

en milieu alcalin.

8 Procédé de fractionnement de N-acétylhépa-

rosane de haute masse moléculaire mettant en oeuvre

l'enzyme selon la revendication 1.

99 Procédé pour la préparation de N-acétylhé-

parosanes ayant des masses moléculaires regroupées, se situant entre 2000 et 10000 De, caractérisé en ce que

l'on traite un N-acétylhéparosane de haute masse molécu-

laire (polysaccharide K 5) avec une préparation contenant l'enzyme selon la revendication 1 en présence d'une solution de chlorure de sodium ayant une molarité de 0,2

à 0,5 M.

Procédé selon la revendication 9,

caractérisé en ce que l'héparosane de haute masse molécu-

laire est fixé sur une colonne de résine échangeuse d'ion sur laquelle on fait passer une préparation d'enzyme selon la revendication 1 sur la colonne et que l'on élue avec une solution de chlorure de sodium de 0,2 à 0,5 M. 11 Procédé selon la revendication 9 ou 10, caractérisé en ce que la réaction enzymatique est effectuée à un p H -d'environ 7,2

12 Procédé selon l'une qir-elconquedes reven-

dications 9 à Il-,-caractérisé en ce -que la r-ésine-esàt

du type échangeuse d'ions -