一种玻璃酸钠的纯化方法
技术领域:
本发明涉及一种玻璃酸钠的纯化方法。
背景技术:
玻璃酸(Hyaluronic acid,简称HA),是由(1→3)-2-乙酰氨基-2-脱氧-β-D-葡萄糖-(1→4)-O-β-D-葡糖醛酸双糖重复单位所组成的直链多聚糖,分子式为(C14H21NO11)n,依据组织来源不同,分子量变化范围为2×105~7×106,双糖单位数为300~11000对。
商品玻璃酸一般为钠盐形式,为白纤维状或粉末状固体,有较强的吸湿性,溶于水,不溶于有机溶剂。玻璃酸钠的大分子网状结构通过与H2O形成氢键结合大量的水,在体内具有构成多种基质、调节渗透压、调控大分子物质的转运、在细胞周围形成物理屏障以及调节细胞功能等作用。玻璃酸钠可作为眼科手术辅助用药及变形性膝关节病和肩关节周围炎的辅助治疗,还在组织生成、创伤愈合、肿瘤入侵和调节细胞功能诸方面具有重要的生理功能。
玻璃酸钠制剂中残留的蛋白质和核酸等杂质是导致其致炎症性的主要原因。长期以来,在生物分离纯化技术领域,寻求生物物质的分离纯化的新技术新方法,减少杂质含量成为业界关注的重点。
在以往的公开的文献中,无论是提取法还是发酵法生产玻璃酸钠的纯化工艺,对于用季铵盐沉淀及解离这一步,一般都是进行一次络合沉淀后,直接弃去上清液收集络合沉淀,用高盐浓度的解离液进行解离,此种方法有如下缺点:
1.一次CPC络合对去除药液中杂质能力有限。
2.一次络合沉淀后最终HA中间体吸收度指标较高。
3.络合沉淀结块后,解离时间一般需8-10小时,一方面时间长,过程中玻璃酸钠会发生降解,能耗较高;另一方面不利于大生产操作。
另外,也有文献报道季铵盐用十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)。
发明内容:
本发明的目的是提供一种玻璃酸钠的纯化方法,以克服上述生产玻璃酸钠工艺方法的不足,该方法从鸡冠酶解液中纯化得到的玻璃酸钠杂质含量少,尤其是降低了HA中间体吸收度指标。
为实现本发明的目的,本发明的技术方案是:
一种玻璃酸钠的纯化方法,其特征在于,包括以下步骤:
(1)鸡冠酶解液经活性炭一次吸附过滤后,所得滤液与CPC水溶液搅拌混匀,络合沉淀完全后,将沉淀静置,弃去上清液,用解离液将络合沉淀搅拌解离;
(2)用纯化水将步骤(1)得到的解离后的液体稀释,稀释至其体积的4-8倍,进行第二次络合沉淀,络合沉淀完毕后弃去上清液,将沉淀洗涤1-3次后,用解离液将络合沉淀搅拌解离;
(3)将步骤(2)得到的解离后的液体用活性炭吸附后除碳过滤,滤液用醇沉淀,所得玻璃酸钠脱水,抽真空。
在本发明的一优选实施例中,步骤(1)和(2)中,所述解离时间是3-5h。
在本发明的一优选实施例中,步骤(1)和(2)中,所述络合时间为30min。
在本发明的一优选实施例中,步骤(1)中每升活性炭吸附过滤后鸡冠酶解液加入CPC的量为3-5g。
在本发明的一优选实施例中,步骤(1)中所述解离液是0.4mol/L的氯化钠水溶液,其用量是鸡冠酶解液经活性炭一次吸附过滤后体积的20-30%。
在本发明的一优选实施例中,步骤(2)中所述解离液是0.4mol/L的氯化钠水溶液,其用量是第一次解离液体积的3-5倍。
在本发明的一优选实施例中,步骤(3)中的醇是95%乙醇,其用量是步骤(3)中滤液体积的2倍。
本发明的玻璃酸钠的纯化方法,在络合沉淀阶段,利用低盐浓度下CPC与HA特异性结合,高盐浓度下解离的特征,将第一次解离后的液体,通过纯化水将其稀释,使其离子强度降低,在低离子强度下,剩余的CPC与HA进行第二次络合沉淀,本方法利用两次络合和解离,制备所得的玻璃酸钠,可大大降低最终HA成品的吸收度,减少杂质,提高了收率,对提高HA中间体的理化性质,减少不良反应的发生有很大帮助,特别适合工业化生产玻璃酸钠的纯化。
具体实施方式:
通过下面给出的本发明的具体实施例可以进一步清楚地了解本发明,但它们不是对本发明的限定。
实施例1:
以现有提取法制备玻璃酸钠,取鸡冠酶解液一次活性炭吸附过滤后药液400ml,取1.6g的CPC加少许水溶解后,与药液搅拌混匀,络合沉淀30min。络合沉淀完全后,将沉淀静置,弃去上清液,配制65ml0.4mol/L的解离液将络合沉淀解离5h,解离完毕后,取纯化水适量,将解离液稀释至260ml,边稀释边搅拌,络合沉淀开始析出,解离液稀释至390ml时停止稀释,继续搅拌络合沉淀30min进行二次络合,络合沉淀完毕后弃去上清液,将沉淀洗涤一次后,配制260ml0.4mol/L的解离液将络合沉淀解离5h,解离完毕后取样少许,检测含量。将解离液用活性炭吸附30min后除碳过滤,再用滤液2倍体积的95%乙醇将其醇沉出来并脱水三次,抽真空后得HA。
实施例2:
以现有提取法制备玻璃酸钠,取鸡冠酶解液一次活性炭吸附过滤后药液1000ml,取4.0g的CPC加少许水溶解后,与药液搅拌混匀,络合沉淀30min。络合沉淀完全后,将沉淀静置,弃去上清液,配制163ml0.4mol/L的解离液将络合沉淀解离4h,解离完毕后,取纯化水适量,将解离液稀释至650ml,边稀释边搅拌,络合沉淀开始析出,解离液稀释至1250ml时停止稀释,继续搅拌络合沉淀30min进行二次络合,络合沉淀完毕后弃去上清液,将沉淀洗涤一次后,配制650ml0.4mol/L的解离液将络合沉淀解离5h,解离完毕后取样少许,检测含量。将解离液用活性炭吸附30min后除碳过滤,再用滤液2倍体积的95%乙醇将其醇沉出来并脱水三次,抽真空后得HA。
实施例3:
以现有提取法制备玻璃酸钠,取鸡冠酶解液一次活性炭吸附过滤后药液1000ml,取4.0g的CPC加少许水溶解后,与药液搅拌混匀,络合沉淀30min。络合沉淀完全后,将沉淀静置,弃去上清液,配制163ml0.4mol/L的解离液将络合沉淀解离5h,解离完毕后,取纯化水适量,将解离液稀释至650ml,边稀释边搅拌,络合沉淀开始析出,解离液稀释至1180ml时停止稀释,继续搅拌络合沉淀30min进行二次络合,络合沉淀完毕后弃去上清液,将沉淀洗涤一次后,配制650ml0.4mol/L的解离液将络合沉淀解离5h,解离完毕后取样少许,检测含量。将解离液用活性炭吸附30min后除碳过滤,再用滤液2倍体积的95%乙醇将其醇沉出来并脱水三次,抽真空后得HA。
以上每批实验均设置一组空白对照(现有车间工艺,未进行二次络合),3批样品进行平行实验,测定结果见下表1:
表1
如上述在对玻璃酸钠的纯化过程中,采用二次络合沉淀的纯化方法,最终使玻璃酸钠中的杂质核酸和蛋白质的吸收度大大降低,使最终HA收率有所提高,其中核酸的吸收度(A257nm)平均降低71.7%,蛋白质的吸收度(A280nm)平均降低68.9%,最终成品收率提高了6.75%。
根据实用医药杂志2002年5月第19卷第5期第387~388的记载,核酸和蛋白质是玻璃酸钠不良反应的主要原因,减少了核酸和蛋白的含量可减少炎症发生的概率。
尽管对本发明已经作了详细的说明并引证了一些具体实施例,但对本领域熟练技术人员来说,只要不离开本发明的精神和范围可作各种变化和修正是显然的。