CN106883319B - 一种降低蛋白质含量的玻璃酸钠的制备方法 - Google Patents

一种降低蛋白质含量的玻璃酸钠的制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种降低蛋白质含量的玻璃酸钠的制备方法，所述方法包括以下步骤：(1)向鸡冠酶解液中加入十六烷基三甲基氯化铵进行沉淀络合反应至生成的玻璃酸钠完全沉淀，得到沉淀物；(2)向得到的沉淀物中加入解离液氯化钠溶液进行解离，搅拌至溶液中无颗粒物，得到解离后药液；(3)向得到的解离后药液中加入稀释剂进行稀释至沉淀完全，再次得到沉淀物；(4)重复步骤(2)和步骤(3)至少一次，得到玻璃酸钠沉淀物；(5)向得到的玻璃酸钠沉淀物中加入解离液氯化钠溶液进行解离，搅拌至溶液中无颗粒物，经过后处理得到玻璃酸钠。本发明通过选取合适的络合沉淀剂，选取合适的解离次数，使玻璃酸钠中蛋白质含量达到最高质量标准。

Description

一种降低蛋白质含量的玻璃酸钠的制备方法
技术领域
本发明属于生物医药领域，涉及一种降低蛋白质含量的玻璃酸钠的制备方法，尤其涉及一种生物提取法制备蛋白质含量较低的玻璃酸钠的方法。
背景技术
玻璃酸(Hyaluronic Acid，简称HA)是由D-葡萄糖醛酸和N-乙酰葡萄糖胺双糖单位反复交替而形成的一种均聚物，其重均分子量一般为10万～1000万Da；玻璃酸钠(SodiumHyaluronate)为玻璃酸的钠盐形式，不同分子量的玻璃酸钠具有不同的生物活性。
HA的结构非常规则，相同的双糖单位为HA的基本结构单元，不同动物组织和细菌来源的HA无种属差异，对人类及动物无抗原性。
玻璃酸钠的蛋白质和核酸等杂质是导致其致炎症性的主要原因。长期以来，在生物分离纯化技术领域，寻求生物物质的分离纯化的新技术新方法，减少杂质含量成为业界关注的重点。在欧洲药典中对于蛋白质规定有“不得过0.3％，用于非肠道的剂型不得超过0.1％”；日本药典中规定“不得超过0.05％”。
传统的玻璃酸钠生物提取工艺生产出的玻璃酸钠的蛋白质含量一般在0.40wt～0.80wt％之间，达不到征求意见稿的要求，更达不到日本药典的要求，传统的两次醇沉虽然能明显改善蛋白质含量，但额外增加了酒精的用量，增加了安全风险和成本。
CN 102516408 A公开了一种玻璃酸钠的纯化方法，该方法首先将鸡冠酶解液经活性炭一次吸附过滤后，所得滤液与CPC水溶液搅拌混匀，络合沉淀完全后，将沉淀静置，弃去上清液，用解离液将络合沉淀搅拌解离；解离后的液体通过稀释至其体积的2～8倍，进行二次络合沉淀，络合沉淀完毕后弃去上清液，将沉淀洗涤1～3次后，用解离液将络合沉淀搅拌解离；第二次解离后的液体用活性炭吸附后除炭过滤，滤液用乙醇沉淀出来的玻璃酸钠，脱水，抽真空。
CN 104610466 A公开了一种生物提取法制备玻璃酸钠中降低蛋白质含量的方法，所述方法是在CPC沉淀解离后，向解离液中加入纯化水，稀释解离液离子强度，通过季铵盐络合沉淀解离的原理：在低盐浓度下季铵基上阳离子游离出来，与黏多糖分子上的阴离子结合形成季铵络合物，在高盐浓度下络合物逐渐解离。通过这一可逆反应，从而使解离液中的沉淀重新络合，再经漂洗、二次解离、过滤、醇沉、干燥。
然后上述现有技术制得的玻璃酸钠中蛋白质含量仍然较高，仍达不到日本药典的要求，并且玻璃酸钠的收率较低，仅可达到千分之几的水平。
发明内容
针对现有制备玻璃酸钠方法制得的玻璃酸钠中蛋白质含量较高，无法满足国际标准等问题，本发明提供了一种降低蛋白质含量的玻璃酸钠的制备方法，所述方法通过选取合适的络合沉淀剂，并选取合适的解离次数，使制得的玻璃酸钠中蛋白质含量达到最高质量标准。同时，所用溶解玻璃酸钠的解离液的浓度达到最低摩尔浓度，减少氯化物含量，降低后续工作的工作负荷，减少生产过程中异物的加入量。
为达此目的，本发明采用以下技术方案：
本发明提供了一种降低蛋白质含量的玻璃酸钠的制备方法，所述方法包括以下步骤：
(1)向鸡冠酶解液中加入十六烷基三甲基氯化铵(CTAC)进行沉淀络合反应至生成的玻璃酸钠完全沉淀，得到沉淀物；
(2)向步骤(1)得到的沉淀物中加入解离液氯化钠溶液进行解离，搅拌至溶液中无颗粒物，得到解离后药液；
(3)向步骤(2)得到的解离后药液中加入稀释剂进行稀释至沉淀完全，再次得到沉淀物；
(4)重复步骤(2)和步骤(3)至少一次，得到玻璃酸钠沉淀物；
(5)向步骤(4)得到的玻璃酸钠沉淀物中加入解离液氯化钠溶液进行解离，搅拌至溶液中无颗粒物，经过后处理得到玻璃酸钠。
其中，步骤(4)中的重复次数可为2次、3次、4次、5次、6次或7次以及更多，但并不仅限于所列举的数值，该数值范围内其他未列举的数值同样适用。
本发明中，所用鸡冠酶解液为鸡冠经粗洗、精洗绞碎、酶解和活性炭吸附后所得的药液，其具体操作过程为现有技术，故不再赘述。
本发明中，玻璃酸钠的阴离子与表面活性物质形成络合物，这些络合物在低离子强度的水溶液中不溶解，形成沉淀；在高离子强度时溶解，得到溶液。
本发明所述方法通过选取合适的络合沉淀剂，并选取合适的解离次数，使制得的玻璃酸钠溶液中的蛋白质含量明显降低，达到现行最高质量标准要求的蛋白质含量控制方法，使制得的玻璃酸钠中的蛋白质含量低于0.05wt％。
以下作为本发明优选的技术方案，但不作为本发明提供的技术方案的限制，通过以下技术方案，可以更好的达到和实现本发明的技术目的和有益效果。
作为本发明优选的技术方案，步骤(1)中所述十六烷基三甲基氯化铵的加入量不低于鸡冠酶解液质量的0.3wt％，例如0.3wt％、0.5wt％、0.7wt％、0.9wt％、1wt％、1.5wt％、2wt％、2.5wt％或3wt％等以及更高，但并不仅限于所列举的数值，该数值范围内其他未列举的数值同样适用，优选为鸡冠酶解液质量的0.3wt％～3wt％。此处，所述“不低于”为“大于等于”。
本发明中，所述十六烷基三甲基氯化铵的加入量不能过低，若加入量过低，会使鸡冠酶解液中的玻璃酸钠沉淀不完全。
优选地，步骤(1)中所述沉淀络合反应的时间为10min～20min，例如10min、11min、12min、13min、14min、15min、16mn、17min、18min、19min或20min等，优选为15min。
作为本发明优选的技术方案，步骤(2)中所述解离液的加入量为玻璃酸钠产量的150倍～200倍体积量，例如153倍、155倍、160倍、165倍、170倍、175倍、180倍、185倍、190倍、195倍或197倍等，但并不仅限于所列举的数值，该数值范围内其他未列举的数值同样适用。
本发明中，所述解离液的加入量若过少，会使无法完全溶解经十六烷基三甲基氯化铵络合后的玻璃酸钠；若加入量过多，解离液量过大，增加后续纯化工艺的乙醇用量，造成成本的浪费。
优选地，步骤(2)中所述氯化钠溶液的浓度≥0.35mol/L，例如0.37mol/L、0.39mol/L、0.4mol/L、0.43mol/L、0.45mol/L、0.47mol/L、0.5mol/L、0.53mol/L、0.55mol/L、0.57mol/L或0.6mol/L等，但并不仅限于所列举的数值，该数值范围内其他未列举的数值同样适用，优选为0.35mol/L～0.6mol/L。
作为本发明优选的技术方案，步骤(3)所述稀释剂为纯化水。
优选地，步骤(3)所述稀释剂的用量为步骤(2)得到的解离后药液的至少8倍体积量，例如8倍、9倍、10倍、11倍、12倍、13倍、14倍或15倍等以及更高，但并不仅限于所列举的数值，该数值范围内其他未列举的数值同样适用。此处，所述“不低于”为“大于等于”。
作为本发明优选的技术方案，步骤(4)中重复步骤(2)和步骤(3)一次，本发明中步骤(4)的重复次数为1次最优，即整个过程解离三次，若次数过多，对蛋白质含量影响较低，但会造成原料的浪费。
作为本发明优选的技术方案，步骤(5)中所述解离液的加入量为玻璃酸钠产量的150倍～200倍体积量，例如153倍、155倍、160倍、165倍、170倍、175倍、180倍、185倍、190倍、195倍或197倍等，但并不仅限于所列举的数值，该数值范围内其他未列举的数值同样适用。
优选地，步骤(5)中所述氯化钠溶液的浓度≥0.35mol/L，例如0.37mol/L、0.39mol/L、0.4mol/L、0.43mol/L、0.45mol/L、0.47mol/L、0.5mol/L、0.53mol/L、0.55mol/L、0.57mol/L或0.6mol/L等，但并不仅限于所列举的数值，该数值范围内其他未列举的数值同样适用，优选为0.35mol/L～0.6mol/L。
作为本发明优选的技术方案，步骤(5)中所述后处理为过滤、醇沉和真空干燥。此处所述后处理过程为本领域现有技术，故不再赘述。
作为本发明优选的技术方案，步骤(5)中制得的玻璃酸钠中蛋白质的含量＜0.05wt％。
作为本发明优选的技术方案，所述方法包括以下步骤：
(1)向鸡冠酶解液中加入不低于鸡冠酶解液质量的0.3wt％的十六烷基三甲基氯化铵进行沉淀络合反应至生成的玻璃酸钠完全沉淀，得到沉淀物；
(2)向步骤(1)得到的沉淀物中加入玻璃酸钠产量的150倍～200倍体积量的浓度≥0.35mol/L的解离液氯化钠溶液进行解离，搅拌至溶液中无颗粒物，得到解离后药液；
(3)向步骤(2)得到的解离后药液中加入8倍体积量的稀释剂纯化水进行稀释至沉淀完全，再次得到沉淀物；
(4)重复步骤(2)和步骤(3)一次，得到玻璃酸钠沉淀物；
(5)向步骤(4)得到的玻璃酸钠沉淀物中加入玻璃酸钠产量的500倍体积量的浓度≥0.35mol/L的解离液氯化钠溶液进行解离，搅拌至溶液中无颗粒物，经过后处理得到玻璃酸钠。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明所述方法通过选取合适的络合沉淀剂，并选取合适的解离次数，使制得的玻璃酸钠溶液中的蛋白质含量明显降低，达到现行最高质量标准要求的蛋白质含量控制方法，使制得的玻璃酸钠原料药中的蛋白质含量低于0.05wt％；
同时，减少了过程中的漂洗对玻璃酸钠的损耗，最终玻璃酸钠的收率为0.90％。
具体实施方式
为更好地说明本发明，便于理解本发明的技术方案，下面对本发明进一步详细说明。但下述的实施例仅仅是本发明的简易例子，并不代表或限制本发明的权利保护范围，本发明保护范围以权利要求书为准。
本发明具体实施例部分所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购买得到的常规产品。
本发明具体实施例部分提供了一种降低蛋白质含量的玻璃酸钠的制备方法，所述方法包括以下步骤：
(1)向鸡冠酶解液中加入十六烷基三甲基氯化铵进行沉淀络合反应至生成的玻璃酸钠完全沉淀，得到沉淀物；
(2)向步骤(1)得到的沉淀物中加入解离液氯化钠溶液进行解离，搅拌至溶液中无颗粒物，得到解离后药液；
(3)向步骤(2)得到的解离后药液中加入稀释剂进行稀释至沉淀完全，再次得到沉淀物；
(4)重复步骤(2)和步骤(3)至少一次，得到玻璃酸钠沉淀物；
(5)向步骤(4)得到的玻璃酸钠沉淀物中加入解离液氯化钠溶液进行解离，搅拌至溶液中无颗粒物，经过后处理得到玻璃酸钠。
以下为本发明典型但非限制性实施例：
实施例1：
本实施例提供了一种降低蛋白质含量的玻璃酸钠的制备方法，所述方法包括以下步骤：
(1)取鸡冠酶解液2kg，向其中加入鸡冠酶解液质量0.35wt％的CTAC进行沉淀络合反应至生成的玻璃酸钠完全沉淀，排去上清液，得到沉淀物，；
(2)向步骤(1)得到的沉淀物中加入玻璃酸钠产量的150倍体积量的浓度为0.35mol/L的解离液氯化钠溶液进行解离，搅拌至溶液中无颗粒物，得到解离后药液；
(3)向步骤(2)得到的解离后药液中加入8倍体积量的稀释剂纯化水进行稀释至沉淀完全，排去上清液，再次得到沉淀物；
(4)重复步骤(2)和步骤(3)一次，得到玻璃酸钠沉淀物；
(5)向步骤(4)得到的玻璃酸钠沉淀物中加入玻璃酸钠产量的150倍体积量的浓度0.35mol/L的解离液氯化钠溶液进行解离，搅拌至溶液中无颗粒物，经过过滤、醇沉及真空干燥得到玻璃酸钠，
使用福林酚法测玻璃酸钠中的蛋白质的含量和吸收度，结果如表1中所示。
实施例2：
本实施例提供了一种降低蛋白质含量的玻璃酸钠的制备方法，所述方法除了步骤(1)中加入鸡冠酶解液质量0.3wt％的CTAC；步骤(2)中加入玻璃酸钠产量的170倍体积量的浓度为0.35mol/L的解离液氯化钠；步骤(3)中稀释剂的加入量为9体积量；步骤(5)中解离液加入量为170倍外，其他步骤均与实施例1中相同，制得玻璃酸钠。
使用福林酚法测玻璃酸钠中的蛋白质的含量和吸收度，结果如表1中所示。
实施例3：
本实施例提供了一种降低蛋白质含量的玻璃酸钠的制备方法，所述方法除了步骤(1)中加入鸡冠酶解液质量0.4wt％的CTAC；步骤(2)中加入玻璃酸钠产量批量的200倍体积量的浓度为0.35mol/L的解离液氯化钠；步骤(3)中稀释剂的加入量为10体积量；步骤(5)中解离液加入量为200倍外，其他步骤均与实施例1中相同，制得玻璃酸钠。
使用福林酚法测玻璃酸钠中的蛋白质的含量和吸收度，结果如表1中所示。
实施例4：
本实施例提供了一种降低蛋白质含量的玻璃酸钠的制备方法，所述方法除了步骤(4)中重复步骤(2)和步骤(3)两次外，其他步骤均与实施例1中相同，制得玻璃酸钠。
使用福林酚法测玻璃酸钠中的蛋白质的含量和吸收度，结果如表1中所示。
实施例5：
本实施例提供了一种降低蛋白质含量的玻璃酸钠的制备方法，所述方法除了步骤(1)中加入鸡冠酶解液质量0.3wt％的CTAC外，其他步骤均与实施例4中相同，制得玻璃酸钠。
使用福林酚法测玻璃酸钠中的蛋白质的含量和吸收度，结果如表1中所示。
实施例6：
本实施例提供了一种降低蛋白质含量的玻璃酸钠的制备方法，所述方法除了步骤(2)中解离液氯化钠溶液的用量为170倍，步骤(5)中解离液氯化钠溶液的用量为150倍体积量外，其他步骤均与实施例4中相同，制得玻璃酸钠。
使用福林酚法测玻璃酸钠中的蛋白质的含量和吸收度，结果如表1中所示。
对比例1：
本对比例提供了一种玻璃酸钠的制备方法，所述方法包括以下步骤：
(1)取鸡冠酶解液2kg，向其中加入鸡冠酶解液质量0.3wt％的CTAC进行沉淀络合反应至生成的玻璃酸钠完全沉淀，排去上清液，得到沉淀物，；
(2)向步骤(1)得到的沉淀物中加入玻璃酸钠产量的150倍体积量的浓度为0.35mol/L的解离液氯化钠溶液进行解离，搅拌至溶液中无颗粒物，再经过滤、醇沉及真空干燥得到玻璃酸钠。
使用福林酚法测玻璃酸钠中的蛋白质的含量和吸收度，结果如表1中所示。
对比例2：
本对比例提供了一种玻璃酸钠的制备方法，所述方法除了步骤(1)中加入鸡冠酶解液质量0.35wt％的CTAC，步骤(2)中解离液氯化钠溶液的加入量为200倍体积量外，其他步骤均与对比例1中相同，得到玻璃酸钠。
使用福林酚法测玻璃酸钠中的蛋白质的含量和吸收度，结果如表1中所示。
对比例3：
本对比例提供了一种玻璃酸钠的制备方法，所述方法除了步骤(1)中加入鸡冠酶解液质量0.35wt％的CTAC，步骤(2)中解离液氯化钠溶液的加入量为170倍体积量外，其他步骤均与对比例1中相同，得到玻璃酸钠。
使用福林酚法测玻璃酸钠中的蛋白质的含量和吸收度，结果如表1中所示。
对比例4：
本对比例提供了一种玻璃酸钠的制备方法，所述方法为CN 102516408 A中实施例1。
对比例5：
本对比例提供了一种玻璃酸钠的制备方法，所述方法为CN 102516408 A中实施例2。
对比例6：
本对比例提供了一种玻璃酸钠的制备方法，所述方法为CN 102516408 A中实施例3。
对比例7：
本对比例提供了一种玻璃酸钠的制备方法，所述方法除了步骤(1)中向鸡冠酶解液中加入氯代十六烷基吡啶(CPC)外，其他步骤均与实施例1中相同，得到玻璃酸钠。
使用福林酚法测玻璃酸钠中的蛋白质的含量和吸收度，结果如表1中所示。
表1：实施例1-6和对比例1-7中制得的玻璃酸钠结果测试表
Figure BDA0001281989770000111
Figure BDA0001281989770000121
从表1中可以看出，本发明所述方法通过选取合适的络合沉淀剂，并选取合适的解离次数，使制得的玻璃酸钠溶液中的蛋白质含量明显降低，达到现行最高质量标准要求的蛋白质含量控制方法，使制得的玻璃酸钠中的蛋白质含量低于0.05wt％，将蛋白质含量降低到目标区间，且次数设计合理。
并且，采用本发明所述方法可以大大降低玻璃酸钠对核酸和蛋白质的吸收度，进而使玻璃酸钠的收率达到0.9％以上。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细工艺设备和工艺流程，但本发明并不局限于上述详细工艺设备和工艺流程，即不意味着本发明必须依赖上述详细工艺设备和工艺流程才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

Claims (9)

1.一种降低蛋白质含量的玻璃酸钠的制备方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
(1)向鸡冠酶解液中加入十六烷基三甲基氯化铵进行沉淀络合反应至生成的玻璃酸钠完全沉淀，得到沉淀物；
(2)向步骤(1)得到的沉淀物中加入玻璃酸钠产量的150倍～200倍体积量的浓度≥0.35mol/L的解离液氯化钠溶液进行解离，搅拌至溶液中无颗粒物，得到解离后药液；
(3)向步骤(2)得到的解离后药液中加入至少8倍体积量的稀释剂纯化水进行稀释至沉淀完全，再次得到沉淀物；
(4)重复步骤(2)和步骤(3)至少一次，得到玻璃酸钠沉淀物；
(5)向步骤(4)得到的玻璃酸钠沉淀物中加入解离液氯化钠溶液进行解离，搅拌至溶液中无颗粒物，经过后处理得到玻璃酸钠；
步骤(1)中所述十六烷基三甲基氯化铵的加入量不低于鸡冠酶解液质量的0.3wt％；
步骤(5)中所述解离液的加入量为玻璃酸钠产量的150倍～200倍体积量；步骤(5)中所述氯化钠溶液的浓度≥0.35mol/L。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中所述十六烷基三甲基氯化铵的加入量为鸡冠酶解液质量的0.3wt％～3wt％。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中所述沉淀络合反应的时间为10min～20min。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中所述沉淀络合反应的时间为15min。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中所述氯化钠溶液的浓度为0.35mol/L～0.6mol/L。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(4)中重复步骤(2)和步骤(3)一次。
7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(5)中所述氯化钠溶液的浓度为0.35mol/L～0.6mol/L。
8.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(5)中所述后处理为过滤、醇沉和真空干燥。
9.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(5)中制得的玻璃酸钠中蛋白质的含量＜0.05wt％。
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