CN111632015A

CN111632015A - 一种鸡冠提取物及其提取方法和应用

Info

Publication number: CN111632015A
Application number: CN202010583379.9A
Authority: CN
Inventors: 凌沛学; 陈勉; 袁丹丹; 陈磊; 郑亚军; 殷燕
Original assignee: Shandong Whole World Biotechnology Co ltd
Current assignee: Shandong Whole World Biotechnology Co ltd
Priority date: 2020-06-24
Filing date: 2020-06-24
Publication date: 2020-09-08

Abstract

本发明公开了一种鸡冠提取物及其提取方法和应用，其具体提取方法为：将鸡冠粉碎，加入1.5~4倍质量的水，35‑60℃保温匀浆0.5‑5h，加入500‑2000U/g鸡冠的透明质酸酶，在温度30‑60℃下酶解0.5‑5h，酶解液在85‑125℃加热15‑60min，冷却至40‑80℃，加入900‑6000U/g鸡冠的蛋白酶，搅拌水解3‑10h；固液分离，滤液经浓缩得15‑95 wt%固含量的鸡冠浓缩液，干燥得鸡冠提取物。本发明方法提取的鸡冠提取物及其提取方法和应用，不仅降低工艺能耗、缩短时间、提高收率，还获得了低分子量的糖胺聚糖和蛋白组合物，成分比例接近皮肤的透明质酸、胶原蛋白肽和弹性蛋白肽等成分的混合物，有利于机体吸收和合成皮肤中的糖蛋白，改善皮肤屏障功能，降低皮肤敏感性。

Description

一种鸡冠提取物及其提取方法和应用

技术领域

本发明属于生物材料提取领域，具体涉及一种鸡冠提取物及其提取方法和应用。

背景技术

随着社会进步和生活水平的逐步提高，美容护肤已成为人们日常生活的一部分。但由于环境污染、各类化妆品的过度使用、皮肤过度清洁，皮肤敏感者日趋增多。除了遗传因素，造成皮肤敏感的主要外因是皮肤免疫力下降和屏障功能下降，角质层变薄，外界刺激极易引起泛红、发热、瘙痒、刺痛、红肿等不适症状。治疗皮肤过敏症的关键是保持皮肤滋润，减少角质层的水分散失。皮肤物理性屏障功能依赖于表皮全层结构，皮肤屏障保护功能与表皮细胞的正常态休戚相关。

当皮肤屏障破坏和角质层含水量减少时，保湿剂可以模拟表皮功能改善和修复表皮屏障功能，保湿剂各成分散布于表皮层上部细胞间质内，可形成一个弥漫性疏水相而迅速降低水分散失。保湿是皮肤护理的关键基础，皮肤保湿功能下降也会导致皮肤屏障功能下降，反之，皮肤屏障功能损伤，会导致皮肤水分散失增高，进而产生干燥、粗糙、皱纹等肌肤问题；皮肤缺水，还会使细胞代谢和信息传导受到影响，增加皮肤疾病易感率，诱发皮炎、湿疹、痤疮等。对不同外源性和内源性因素造成角质层屏障受损引起皮肤水分丢失增加和角质层含水量减少引发的许多皮肤不良状态，保湿制剂是基础皮肤护理的重要组分，皮肤屏障功能的完善也有赖于皮肤的水合保湿能力。修复或增强皮肤的屏障保护功能可以降低皮肤敏感度，在一定程度上起着抗敏的作用。

传统的保湿剂作用通常局限于提高皮肤水分含量，而忽略了角质层屏障功能修复，不能从源头上解决皮肤缺水和敏感性问题。皮肤屏障功能的修复，需要平衡补充皮肤细胞外基质成分或促进内源性合成，这种皮肤细胞外基质成分包括透明质酸和硫酸皮肤素等硫酸化糖胺聚糖，以及胶原蛋白、弹性蛋白等成分。透明质酸是一种非硫酸化糖胺聚糖，是常见的主要保湿剂，可以通过细菌发酵法和动物组织提取法制备。细菌发酵法制备的发酵液中除透明质酸外，主要含有细菌代谢产物和培养基成分，与人类皮肤细胞外基质成分差别较大。鸡冠等动物组织含有透明质酸、胶原等皮肤细胞外基质成分，但目前的提取工艺以获得高分子量和高纯度透明质酸为目标，把小分子透明质酸以及其它皮肤糖胺聚糖和胶原蛋白等成分分离去除，不仅造成有益成分的浪费、增加废水处理困难，还没能使所得产品达到全面、平衡补充皮肤细胞外基质成分的效果，不能系统修复皮肤屏障功能，不能从根本上缓解该类型皮肤敏感问题。另外，现有鸡冠透明质酸提取工艺为了保持透明质酸高分子特征，生产过程中料液粘度通常很高，造成过滤困难、能耗高，需要引入特异性醇沉透明质酸的化学试剂，通常还引入了乙醇沉淀透明质酸，增加了生产成本和爆炸风险。同时，高分子量透明质酸也不利于口服消化吸收和外用吸收，不能高效发挥相应皮肤护理功效。

综上所述，研发一种含多种皮肤细胞外基质成分，且组成配比合理的低分子量产品，易于消化、吸收、有益于改善和修复皮肤屏障功能，降低皮肤敏感性的鸡冠提取物有着重要意义。

发明内容

针对现有技术中存在的鸡冠提取物成分单一、分子量高造成的对皮肤屏障修复功能差、资源浪费、加工困难问题，本发明提供了一种鸡冠提取物及其提取方法和应用，不仅降低工艺能耗、缩短时间、提高收率，还获得了低分子量的糖胺聚糖和蛋白组合物，成分比例接近皮肤的透明质酸、胶原蛋白肽和弹性蛋白肽等成分的混合物，有利于机体吸收和合成皮肤中的糖蛋白，改善皮肤屏障功能，降低皮肤敏感性。

本发明通过以下技术方案实现：

一种鸡冠提取物的提取方法：在鸡冠中加入透明质酸酶和蛋白酶进行酶解，分离得鸡冠提取物

进一步地，所述鸡冠提取物的提取方法具体包括以下步骤：

（1）鸡冠粉碎，加入1.5~4倍质量的水，35-60℃保温匀浆0.5-5h，加入500-2000U/g鸡冠的透明质酸酶，在温度30-60℃下酶解0.5-5h；

（2）步骤（1）中的酶解液在85-125℃加热15-60min，冷却至40-80℃，加入900-6000U/g鸡冠的蛋白酶，搅拌水解3-10h；

（3）固液分离，滤液经浓缩得15-95wt%固含量的鸡冠浓缩液，干燥得鸡冠提取物。

进一步地，在提取过程中，不断吸弃上层油脂。

进一步地，步骤（1）中所述的匀浆温度为39-43℃，匀浆时间为3h；步骤（2）中所述的冷却温度为48-58℃，所述的蛋白酶的添加量为1700-5100U/g鸡冠。

进一步地，步骤（2）中所述的蛋白酶为中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、无花果蛋白酶、菠萝蛋白酶、胰酶、碱性蛋白酶、胃蛋白酶中的一种以上。

进一步地，步骤（3）中所述的固液分离方式为过滤、微滤、超滤或离心分离中的一种；所述的浓缩方式为纳滤或减压浓缩；所述的干燥方式为喷雾干燥、鼓风干燥、真空干燥或冷冻干燥。

本发明中，所述的提取方法提取得到的鸡冠提取物。

进一步地，所述的鸡冠提取物干物质包括以下重量百分量的成分：糖胺聚糖38-64%，蛋白33~54%，灰分2.9~8.8%；

进一步地，所述的糖胺聚糖包括透明质酸和硫酸化糖胺聚糖，透明质酸的质量含量占糖胺聚糖的80~99wt%;

进一步地，所述的蛋白包括3-12wt%的羟脯氨酸和0.0002~0.09wt%的锁链素，余量为其它蛋白成分。

进一步地，所述的透明质酸的分子量为200~500000Da。

本发明中，所述的鸡冠提取物在皮肤护理中的应用。

进一步地，所述的鸡冠提取物添加到口服或外用的皮肤护理产品中。

透明质酸是由D-葡萄糖醛酸及N-乙酰葡糖胺组成的一种高分子聚合物，是皮肤中天然固有的保湿成分。但是仅靠透明质酸一种成分，不能达到系统修复皮肤屏障功能的作用，且高分子量透明质酸通过口服或外用难以被高效吸收进入皮肤内部发挥功效。本专利提取得到的鸡冠提取物富含低分子量糖胺聚糖和蛋白肽，可口服外用，吸收利用效果好；糖胺聚糖包括透明质酸和硫酸化糖胺聚糖等，蛋白肽包括胶原蛋白肽、弹性蛋白肽等，可被机体协同吸收；低分子量透明质酸具有抗炎作用，胶原肽具有缓解晒后损伤作用，综合达到在体内重新合成皮肤组织和皮肤细胞基质成分、促进修复的作用。

有益效果

1.本发明方法提取的鸡冠提取物，含有200~5×10⁵Da的小分子透明质酸，以及小分子胶原蛋白肽和弹性蛋白肽，能够通过口服和外用高效吸收和被皮肤利用；且产品成分组成更接近皮肤成分，有利于皮肤再生和修复、改善皮肤屏障功能；

2.本发明方法提取的鸡冠提取物，总收率提高，损失减少；

3.本发明方法提取的鸡冠提取物，加工粘度下降，提取时间缩短，不采用醇沉操作、降低防爆成本，能耗及工艺成本降低。

具体实施方式

为了使本领域的人员更好地理解本发明的技术方案，下面对本发明的技术方案进行清楚、完整的描述，基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的其它类同实施例，都应当属于本申请保护的范围。

以下实施例中使用的透明质酸酶和中性蛋白酶均为市售产品。

本发明实施例中新鲜鸡冠的含水量为30wt%，市售鲜鸡冠含水量约28-38%。

实施例1

取新鲜鸡冠100g，用清水冲洗干净，加入200g水，通过胶体磨41℃保温匀浆处理3h，匀浆速率为12000rpm，按1200U/g鸡冠加入透明质酸酶，37℃保温搅拌4h，加热至沸腾45min，静置1h，吸弃上层油脂，待温度降低至55℃时，按3400U/g鸡冠加入中性蛋白酶，保温搅拌5h，静置1h，吸弃上层残余油脂，板框过滤分离，得到澄清透明滤液243mL（固含量18.2%），减压浓缩，经冷冻干燥得到鸡冠提取物干粉46.5g，收率46.5%。

实施例2

取新鲜鸡冠100g，用清水冲洗干净，加入150g水，通过胶体磨35℃保温匀浆处理0.5h，匀浆速率为12000rpm，按500U/g鸡冠加入透明质酸酶，30℃保温搅拌0.5h，加热至85℃60min，静置0.5h，吸弃上层油脂，待温度降低至40℃时，按900U/g鸡冠加入木瓜蛋白酶，保温搅拌3h，静置1h，吸弃上层残余油脂，50K超滤滤膜过滤分离到澄清透明滤液207mL（固含量20.9%），200Da纳滤浓缩，经喷雾干燥得到鸡冠提取物干粉36.0g，收率36.0%。

实施例3

取新鲜鸡冠100g，用清水冲洗干净，加入250g水，通过胶体磨39℃保温匀浆处理1.5h，匀浆速率为10000rpm，按850U/g鸡冠加入透明质酸酶，44℃保温搅拌1h，加热至90℃35min，静置0.8h，吸弃上层油脂，待温度降低至48℃时，按1700U/g鸡冠加入无花果蛋白酶，保温搅拌4h，静置1h，吸弃上层残余油脂，超滤过滤分离到澄清透明滤液，纳滤浓缩，经鼓风干燥得到鸡冠提取物干粉35.7g，收率35.7%。

实施例4

取新鲜鸡冠100g，用清水冲洗干净，加入300g水，通过胶体磨43℃保温匀浆处理2.5h，匀浆速率为12000rpm，按1550U/g鸡冠加入透明质酸酶，51℃保温搅拌2.5h，加热至110℃25min，静置1.5h，吸弃上层油脂，待温度降低至58℃时，按5100U/g鸡冠加入菠萝蛋白酶，保温搅拌8h，静置1h，吸弃上层残余油脂，离心过滤分离到澄清透明滤液，减压浓缩，经真空干燥得到鸡冠提取物干粉48.2g，收率48.2%。

实施例5

取新鲜鸡冠100g，用清水冲洗干净，加入400g水，通过胶体磨60℃保温匀浆处理5h，匀浆速率为12000rpm，按2000U/g鸡冠加入透明质酸酶，60℃保温搅拌5h，加热至125℃15min，静置2h，吸弃上层油脂，待温度降低至80℃时，按6000U/g鸡冠加入胰酶、碱性蛋白酶、胃蛋白酶，保温搅拌10h，静置1h，吸弃上层残余油脂，微滤滤膜过滤分离到澄清透明滤液，纳滤浓缩，经真空干燥得到鸡冠提取物干粉37.0g，收率37.0%。

对比例1

（1）取新鲜鸡冠100g，清水洗净，丙酮浸泡使其变硬，干燥后粉碎，加入6倍体积的水，浸泡12小时，过滤，滤渣按同样方法浸泡2次，合并滤液；

（2）滤液加入鸡冠10%质量的固体乙酸钠，完全溶解后加入等体积的氯仿-正丁醇（氯仿：正丁醇 = 4:1），搅拌3小时，静置分层，分出水层，水层中加入2倍体积的95%乙醇醇沉，过滤得沉淀物；

（3）沉淀物溶于4倍体积的0.1mol/L的乙酸钠溶液，用三氟乙酸调节pH4.8，加入等体积的氯仿-正丁醇（氯仿：正丁醇 = 4:1）溶液，静置分层，吸出水相；

（4）用氢氧化钠溶液调节水相pH7.4，加入链霉蛋白酶，保温（37℃）过夜，酶解液中加入等体积的氯仿-正丁醇（氯仿：正丁醇 = 4:1）溶液，静置分层，吸出水相，水相加入等体积的1%的十六烷基三甲基溴化铵溶液，过夜，收集沉淀物；

（5）沉淀物用氯化钠溶液溶解，过滤，滤液加入95%乙醇醇沉，沉淀干燥得鸡冠提取物10.3g，收率10.3%。

对实施例和对比例得到的鸡冠提取物中的成分分析

实施例1提取得到的鸡冠提取物中糖胺聚糖含量：取鸡冠提取物检测水分（GB5009.3-2016食品中水分的测定）为5.0%，以扣除水分的干物质为以下含量计算基准。称量配成含鸡冠提取物干物质2%水溶液，用咔唑法检测总糖胺聚糖含量（YY 0308-2004 医用透明质酸钠凝胶），计算鸡冠提取物中糖胺聚糖含量51.9%；通过阿利新蓝法检测硫酸化糖胺聚糖含量（熊双丽等，硫酸化糖胺聚糖的简易分光光度测定法[J]. 光谱实验室, 2005, 022(006):1294-1297.），计算鸡冠提取物中硫酸化糖胺聚糖含量1.2%；透明质酸不含硫酸基，用总糖胺聚糖含量减去硫酸化糖胺聚糖含量，即50.7%，可见透明质酸占总糖胺聚糖的97.7%。蛋白成分含量：用福林酚试液检测蛋白含量（YY 0308-2004 医用透明质酸钠凝胶）：41.8%；胶原蛋白特征氨基酸羟脯氨酸（Hyp）含量（GBT 9695.23-2008 肉与肉制品羟脯氨酸含量测定）：3.3%，可见占蛋白含量8.0%，折算胶原蛋白占蛋白含量约80%；弹性蛋白特征锁链素含量（日立氨基酸分析仪）0.026%，可见占蛋白含量0.06%。将鸡冠提取物溶解配成水溶液，通过特性粘数测算分子量（YY 0308-2004 医用透明质酸钠凝胶）为1.6×10⁴Da。

实施例2提取得到的鸡冠提取物中糖胺聚糖含量：取鸡冠提取物检测水分为4.0%，以扣除水分的干物质为以下含量计算基准。鸡冠提取物中糖胺聚糖含量60.0%；硫酸化糖胺聚糖含量0.8%；透明质酸含量59.2%，占总糖胺聚糖的98.7%。蛋白成分含量33.7%；Hyp含量2.7%，可见占蛋白含量8.0%；锁链素含量0.013%，可见占蛋白含量0.04%。鸡冠提取物特性粘数测算分子量8.2×10⁴Da。

对比例1提取得到的鸡冠提取物中，水分含量8.9%，以下按干物质计算：提取物中糖胺聚糖含量79.4%；硫酸化糖胺聚糖未检测到；可见透明质酸含量79.4%，占总糖胺聚糖的100%。蛋白含量11.4%；Hyp含量0.8%，可见占蛋白含量7.0%；锁链素未检出。该提取物特性粘数分子量为1.73×10⁶Da。由此对比例提取物以透明质酸为主，不含其他硫酸化糖胺聚糖；蛋白含量低，不含锁链素；分子量大，不利于口服或外用吸收。

实施例1中糖胺聚糖（碳水化合物）：蛋白质量比约为1.2:1，实施例2为1.8:1，而对比例1中约为7.0:1；通过和猪头皮中各成分（碳水化合物12.7%，蛋白11.8%，脂肪44.6%，水约34%）质量含量比较，可见真实皮肤中的碳水化合物（透明质酸）：蛋白质量比约为1.1:1，因此本申请的产物组成更接近皮肤成分，更均衡补充皮肤细胞外基质成分，利于皮肤再生和修复。

从工艺方面比较，实施例1中对酶解后的料液过滤1次，平均过滤速度>520L/m²·h；实施例2超滤、纳滤共2次，都是切向流过滤，超滤平均过滤速度>300L/m²·h，纳滤膜平均过滤速度约240L/m²·h；而对比例中对大分子水溶媒料液过滤4次（对比例1的步骤（1）过滤3次，步骤（5）中过滤1次），平均过滤速度约130 L/m²·h，有时因粘稠似粥样出现膜堵无法过滤情形，比实施例的过滤速度慢。可见本专利所述的鸡冠提取物的提取方法与对比例1相比工艺简化，且提取耗时明显缩短。原因主要是本专利料液的粘度明显降低，降低了过滤的难度，蛋白和其它非透明质酸成分不再分离。提速的同时还提高产物收率，发挥更全面的皮肤保养营养功效。

鸡冠提取物的功能测试

（1）改善皮肤屏障功能评价

红细胞（RBC）溶血实验，先将红细胞在活性物质（实施例1提取的鸡冠提取物、对比例1提取的鸡冠提取物）条件下保存，再加入刺激物（SDS）测量溶血量，与未经活性物质处理直接加入刺激物的RBC的溶血率进行比较，评价鸡冠提取物是否具有保护细胞膜免受刺激物损伤的作用。

）样品对红细胞溶血的影响

配制pH7.4的PBS缓冲液（含葡萄糖1.8g/L）用于稀释或溶解样品（实施例1提取的鸡冠提取物、对比例1提取的鸡冠提取物）及SDS。

取2%绵羊红细胞的PBS混悬液1.0mL于24孔板内，加入PBS缓冲液200μL，再分别加入800μL样品溶液、0.5%SDS（阳性对照）和PBS缓冲液（阴性对照）。在酶标仪37℃摇动孵育10min，然后 11180g 离心 1min，取出 200μL 上清液于 530nm 处测吸光值。

样品溶血率(%)=（样品 A₅₃₀-样品本身A₅₃₀-阴性对照 A₅₃₀）/（阳性对照 A₅₃₀-阴性对照 A₅₃₀）×100% 。

）样品对SDS诱导的红细胞溶血的抑制作用

配置含SDS的受试样品溶液，向800μL不同样品溶液内分别加入40μL的2%SDS溶液。取2%绵羊红细胞的PBS混悬液1.0mL于24孔板，加入PBS缓冲液160μL，再分别加入配好的840μL含SDS的不同样品溶液。在酶标仪37℃摇动孵育 10min，然后 11180g 离心 1min，取出 200μL上清液于 530nm 处测吸光值。向800μL的PBS缓冲液内加入40μL的2%SDS溶液，同法操作可得终浓度为0.04%SDS，此时红细胞溶血率70%。

本申请的提取物和传统透明质酸为主的鸡冠提取物比较，在0.05%-2%的实验浓度下对绵羊红细胞均没有溶血作用，比较2种活性物质（实施例1提取的鸡冠提取物和对比例1提取的鸡冠提取物）对0.04%SDS造成的红细胞溶血现象的抑制作用，表示对细胞膜的不同保护作用。不同浓度的受试样品对SDS造成绵羊红细胞溶血的抑制率（%）见表1：

表1不同浓度的活性物质对SDS造成RBC溶血的抑制率

结果表明，实施例1提取的鸡冠提取物和对比例1提取的透明质酸均能保护由刺激物（0.04%SDS）诱导的溶血作用，但抑制能力为本申请鸡冠提取物（实施例1）>传统透明质酸为主的鸡冠提取物（对比例1）。

（2）对角质细胞结构功能蛋白表达量影响

1）细胞毒性抑制MTT实验

样品溶液的配制：实施例1中的鸡冠提取物的浓度分别为10μg/mL、20μg/mL、40μg/mL、60μg/mL和80μg/mL，对比例1中的鸡冠提取物的浓度40μg/mL、60μg/mL、80μg/mL和100μg/mL。

对冻存的HaCaT (永生化处理的人角质形成细胞)进行细胞复苏和传代培养，配制浓度为5×10⁵cell/ml的细胞悬液，在96孔板中培养12小时贴壁后，加入100μL/孔样品溶液或SDS溶液（阳性对照组）或PBS（空白对照组），培养24小时后，加入100μL/孔60μg/mL的SDS作为刺激物，继续培养24小时后计算细胞存活率。

表2 不同浓度的样品对细胞的保护作用

2）蛋白相对表达量的测定

丝聚蛋白（FLG）和半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白酶-14（Caspase-14）常被用作评价皮肤屏障功能状态的指标。FLG能够启动角质细胞终末分化，促进表皮形成；表皮中FLG还可以分解产生天然保湿因子，维持皮肤角质层水分含量和屏障结构。Caspase-14 是半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白酶家族中特异性分布于皮肤的一员，其活化与角质形成细胞的角化过程密切相关；Caspase-14是催化皮肤颗粒层FLG前体转化为FLG的关键酶。AQP3是皮肤主要水通道蛋白家族一员，具有维持皮肤水分和调节角质细胞的增殖、迁移及早期分化作用；当细胞处于炎症或者高渗透压条件时，细胞 AQP3 的表达量会应激上调，帮助皮肤抵御紫外线等外部刺激。

样品溶液的配制：根据表2筛选出在SDS刺激条件下具有细胞维护作用的浓度，实施例1中的鸡冠提取物的浓度分别为20μg/mL、40μg/mL、和60μg/mL，对比例1中的透明质酸的浓度60μg/mL、80μg/mL和100μg/mL。

刺激培养：按照MTT 实验确定的细胞浓度（5×10⁵cell/ml）将细胞按照3ml/孔接种于6 孔板，培养箱中培养12h 至细胞贴壁；加入3ml/孔样品溶液、70μg/mLSDS溶液（阳性对照组）或PBS（空白对照组），继续置于培养箱培养48h；去除上清液，用TRizol法提取贴壁细胞RNA，经RNA反转录和荧光定量实时PCR测算目的基因相对表达量，以空白样本组目的基因的相对表达量为1，结果见表3。

表 3 不同浓度样品对FLG、Caspase-14和AQP3基因表达量的影响

由表3可知，实施例1的鸡冠提取物对FLG、Caspase-14及AQP3的表达有剂量依赖性促进作用；对比例1的提取物也有一定促进效果，但不及实施例1的影响显著。

比较体外红细胞溶血抑制实验和体外细胞功能蛋白表达量实验的结果，鸡冠提取物在无毒性范围内都有抑制SDS造成红细胞溶血的效果，说明鸡冠提取物能够对外界刺激做出保护反应，且能够促进FLG、Caspase-14及AQP3的表达，对维持皮肤屏障的水分和结构的稳定方面具有良好的效果，而本专利方法提取的鸡冠提取物（含低分子量糖胺聚糖和胶原肽等细胞外基质成分）在修复皮肤屏障及发挥抗敏功效的效果都明显好于传统方法提取富含高分子透明质酸的提取物。

Claims

1.一种鸡冠提取物的提取方法，其特征在于，在鸡冠中加入透明质酸酶和蛋白酶进行酶解，分离得鸡冠提取物。

2.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于，具体包括以下步骤：

3.根据权利要求2所述的提取方法，其特征在于，在提取过程中，不断吸弃上层油脂。

4.根据权利要求2所述的提取方法，其特征在于，步骤（1）中所述的匀浆温度为39-43℃，匀浆时间为3h；步骤（2）中所述的冷却温度为48-58℃，所述的蛋白酶的添加量为1700-5100U/g鸡冠。

5.根据权利要求2所述的提取方法，其特征在于，步骤（2）中所述的蛋白酶为中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、无花果蛋白酶、菠萝蛋白酶、胰酶、碱性蛋白酶、胃蛋白酶中的一种以上；步骤（3）中所述的固液分离方式为过滤、微滤、超滤或离心分离中的一种；所述的浓缩方式为纳滤或减压浓缩；所述的干燥方式为喷雾干燥、鼓风干燥、真空干燥或冷冻干燥。

6.一种权利要求1-5任一项所述的提取方法提取得到的鸡冠提取物。

7.根据权利要求6所述的鸡冠提取物，其特征在于，干物质包括以下重量百分量的成分：糖胺聚糖38-64%，蛋白33~54%，灰分2.9~8.8%；

所述的糖胺聚糖包括透明质酸和硫酸化糖胺聚糖，透明质酸的质量含量占糖胺聚糖的80~99wt%;

所述的蛋白包括3-12wt%的羟脯氨酸和0.0002~0.09wt%的锁链素，余量为其它蛋白成分。

8.根据权利要求6所述的鸡冠提取物，其特征在于，所述的透明质酸的分子量为200~500000Da。

9.一种权利要求6~8任一项所述的鸡冠提取物在皮肤护理中的应用。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述的鸡冠提取物添加到口服或外用的皮肤护理产品中。