CN106916867A - 一种海参多肽及其制备方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于海洋生物技术领域，具体涉及一种海参多肽及其制备方法与应用。本发明所述海参多肽的制备方法为取海参体壁匀浆后依次经胰蛋白酶和木瓜蛋白酶水解后，加入乙醇沉淀多糖，离心取上清液。进一步对上清液收集截留分子量小于3kDa的组分获得分子量小于3kDa的海参多肽组分。实验结果表明本发明所述制备方法制得的海参多肽以及分子量小于3kDa的海参多肽组分均具有很好的抗氧化、抗衰老作用，可以用于制备成抗氧化、抗衰老药物或者保健品，具有良好的经济和社会效应。
Description
技术领域
本发明属于海洋生物技术领域，具体涉及一种海参多肽及其制备方法与应用。
背景技术
全球人口老龄化问题日趋严峻，衰老与衰老相关疾病已成为威胁人类死亡的重要影响因素，在国内外医疗保健领域中引起了广泛的关注。衰老机理极其复杂，其相关的学说有数十种，而“衰老的氧化自由基学说”与其他学说都有一定的关联性，也是最广为接受的衰老学说之一。衰老自由基理论认为，正常情况下体内自由基的产生与清除处于一种动态平衡状态，但当体内外有害因素、疾病和衰老状态的影响下，内源性活性氧自由基不断产生而清除能力明显下降，导致活性氧物质对细胞蛋白质、脂质和DNA产生伤害，产生氧化应激，最终引起机体老化和器官功能衰退的现象。
生物活性肽具有多种人体生理调节功能，有促进免疫、激素调节、抗氧化、抗菌、抗病毒、降血压、降血脂等作用，可以满足延缓衰老的全方位需要，且食用安全性高、易于消化吸收，是当前国际食品界最热门的研究课题和极具发展前景的功能因子。同时，有研究表明活性肽在化妆品中具有良好的兼容性和稳定性，小分子活性多肽可以减轻皱纹、使皮肤更光滑、淡化色斑。
我国海域面积辽阔，蕴藏着丰富的海洋生物资源，为研究和开发具有抗氧化、延缓衰老的生物活性物质提供了庞大的生物资源库。海参，属海参纲海参属的棘皮动物，生活在海边至8000米的海洋。海参营养丰富，是中国海产八珍之一，具有补肾壮阳、益肾补肺、温阳利水功效，可用于治肾阳虚衰所致的阳痿、腰膝酸软、遗精等症，也治肺痨、咳嗽、外咳虚喘、劳嗽有痰者。现代研究表明，海参具有提高记忆力、延缓性腺衰老，防止动脉硬化以及抗肿瘤等作用，尤其是海参体壁中胶原蛋白及其酶解后胶原肽在保健品和化妆品领域具有很好的开发应用价值。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种具有抗氧化、延缓衰老作用的海参多肽及其制备方法与应用。
为实现本发明的目的，本发明采用如下技术方案。
一种海参多肽的制备方法，取海参体壁匀浆后依次经胰蛋白酶和木瓜蛋白酶水解后，加入乙醇沉淀多糖，离心取上清液。
其中，所述海参体壁为新鲜的海参解刨，去内脏，体壁用水清洗3～4次得到。
在一些实施方案中，本发明所述海参多肽的制备方法中，所述胰蛋白酶水解前还包括将匀浆后得到的肉糜干燥后加水重溶的步骤。
其中，所述肉糜干燥后的重溶时水的加入量为干燥的肉糜的体积的20倍。
本领域技术人员还可以按照公知的干燥的方法对海参体壁匀浆后得到的肉糜进行干燥。优选采用冷冻干燥。
在一些实施方案中，所述胰蛋白酶水解具体为调节pH至8.0，加入胰蛋白酶37～55℃水解2～10小时，灭酶。
进一步的，作为优选，所述胰蛋白酶的酶活为2500U/mg，每克原料干粉中胰蛋白酶的加入量为3000U。
在一些实施方案中，所述木瓜蛋白酶水解具体为调节pH至5.5，加入木瓜蛋白酶50～80℃水解2～10小时，灭酶。
进一步的，作为优选，所述木瓜蛋白酶的酶活为6000U/mg，每克原料干粉中木瓜蛋白酶的加入量为3000U。
在一些实施方案中，所述乙醇沉淀多糖具体为先加入乙醇初步沉淀，然后加入乙醇至乙醇终浓度为60～80v/v％，静置12～20小时。
进一步的，所述加入乙醇初步沉淀为按乙醇：酶解液体积比为3:5的比例加入乙醇。
其中，所述乙醇沉淀多糖时加入的乙醇优选为95％乙醇。
静置后离心收集上清液即获得本发明所述海参多肽。
其中，所述离心为5000～10000rpm的转速离心10～20min。
作为优选，所述离心为4℃条件下6000rpm离心15min。
在一些优选实施方案中，本发明所述制备方法还包括上清液超滤，收集截留分子量小于3kDa的组分的步骤。
进一步的，所述超滤具体为上清液加入截留分子量为3kDa超滤离心管，在6000rpm～8000rpm下离心。
本领域技术人员还可以按照公知的方法对乙醇沉淀多糖后离心收集的上清液以及超滤收集的组分进行干燥。优选采用冷冻干燥。
在一些实施方案中，本发明所述海参多肽的制备方法中，所述超滤前还包括对干燥后海参多肽加水重溶的步骤。
其中，所述干燥后海参多肽的重溶优选为配制成浓度为10mg/mL的溶液。
本发明还提供了上述制备方法制得的海参多肽。
在一些实施方案中，所述海参多肽为分子量小于3kDa的海参多肽组分。
百草枯是一种联吡啶阳离子类除草剂，在体内能诱导产生活性氧自由基，从分子水平上氧化多种生命物质，使机体处于氧化胁迫环境，进而出现早衰现象。本发明将所述海参多肽以及分子量小于3kDa的海参多肽组分分别加入到成虫初期的野生型秀丽线虫中培养，加入百草枯对秀丽线虫进行氧化胁迫造模，定时统计秀丽线虫存活的比率，检测所述海参多肽对百草枯诱导的氧化胁迫的影响，结果显示本发明所述海参多肽以及分子量小于3kDa的海参多肽组分均可以显著延长秀丽线虫的氧化胁迫存活率，提高秀丽线虫耐氧化胁迫条件的能力，缓解机体因氧化胁迫而产生早衰的问题。
自由基是机体氧化反应中产生的有害化合物，具有强氧化性，可损害机体的组织和细胞，进而引起慢性疾病及衰老效应。因此，通过测定对自由基的清除率，可以反映以清除活性氧自由基为主的抗氧化能力。本发明分别将所述海参多肽以及分子量小于3kDa的海参多肽组分加水溶解配制成各受试浓度的多肽样品溶液，加入DPPH溶液，测定吸光度，计算DPPH自由基清除率。结果显示，本发明所述海参多肽能够有效地清除体外DPPH自由基，而且呈现浓度依赖性。表明本发明所述海参多肽以及分子量小于3kDa的海参多肽组分均有较好的体外抗氧化效果。
活性氧类(ROS)是生物有氧代谢过程中的一种副产品，具有较强的氧化活性，在体内主要包括超氧阴离子(O2-)、羟自由基(.OH)和过氧化氢(H2O2)等。过高的活性氧水平会损坏细胞和基因结构，在许多疾病及衰老的发生中起着重要作用。体内存在一道抗氧化防御系统，如超氧化物歧化酶(SOD)是机体内天然存在的超氧自由基清除因子，它通过上述反应可以把有害的超氧自由基转化为过氧化氢；过氧化氢酶(CAT)是一种酶类清除剂，又称为触酶，是以铁卟啉为辅基的结合酶，可促使H2O2分解为分子氧和水，清除体内的过氧化氢，从而使细胞免于遭受H2O2的毒害，是生物防御体系的关键酶之一；丙二醛(MDA)常用作膜脂过氧化程度的指标，能够间接测定膜系统受损程度及受试物的抗膜脂过氧化的能力。本发明利用相关的抗氧化检测试剂盒来测定体内抗氧化酶SOD、CAT的活力，以及膜脂过氧化产物MDA的含量，可评价海参多肽以及分子量小于3kDa的海参多肽组分的体内抗氧化能力。结果显示，海参多肽以及分子量小于3kDa的海参多肽组分均可增强秀丽线虫体内SOD、CAT酶活力，而使MDA含量显著降低。表明本发明所述海参多肽以及分子量小于3kDa的海参多肽组分可通过提高机体抗氧化防御系统的功能来达到抗氧化、延衰作用，从而缓解由氧化胁迫引起的衰老现象。
本发明分别将所述海参多肽以及分子量小于3kDa的海参多肽组分加入到成虫初期的野生型秀丽线虫中培养后统计一次秀丽线虫的存活情况，检测所述海参多肽对秀丽线虫寿命的影响。结果显示，本发明所述海参多肽以及分子量小于3kDa的海参多肽组分均能够延长秀丽线虫在自然条件下的存活时间，具有延缓衰老进程的作用。
线粒体可通过多种途径参与衰老的过程。在氧化应激的条件下，线粒体功能的下降，细胞因供能不足而受损，导致衰老和疾病的发生。因此，可以改善或中断其中的过程来延迟衰老，如增强线粒体呼吸链功能以合成更多的ATP等。因此，检测线粒体内ATP的含量可以反映机体衰老或病变的程度。本发明分别采用所述海参多肽以及分子量小于3kDa的海参多肽组分处理秀丽线虫然后利用百草枯进行氧化胁迫造模，利用BCA蛋白测定试剂盒和线粒体膜电位检测试剂盒分别检测各组秀丽线虫匀浆液中组织蛋白含量和ATP含量。结果显示在百草枯进行氧化胁迫造模的条件下，经本发明所述海参多肽以及分子量小于3kDa的海参多肽组分给药后，秀丽线虫体内ATP/蛋白含量均显著高于对照组，且ATP含量随着多肽浓度提高而增加。表明本发明所述海参多肽以及分子量小于3kDa的海参多肽组分具有延缓衰老进程的作用。本发明所述海参多肽具有增加线粒体内ATP的含量的作用，从而延缓由氧化胁迫引起的衰老进程。
线粒体膜电位的稳定有利于维持细胞的正常生理功能，线粒体膜电位的降低是细胞凋亡早期的不可逆事件。因此，在一定范围内线粒体膜电位越高，说明细胞活力状态越好，然而一旦处于某些急性应激条件(如氧化胁迫)下，其数值超过正常范围，也会对机体产生危害。本发明分别采用所述海参多肽以及分子量小于3kDa的海参多肽组分处理秀丽线虫然后利用百草枯进行氧化胁迫造模，利用线粒体膜电位检测试剂盒测定各组秀丽线虫匀浆液中线粒体膜电位水平。结果显示，造模未给药组秀丽线虫体内线粒体膜电位水平(Green/Red值)远高于实验组及空白对照，出现反常的高值。喂以本发明所述海参多肽以及分子量小于3kDa的海参多肽组分的秀丽线虫中Green/Red值则相较造模未给药组出现明显下降。表明本发明所述海参多肽以及分子量小于3kDa的海参多肽组分具有稳定线粒体膜电位的作用，从而缓解由氧化胁迫引起的衰老现象。
因此，本发明提供了所述海参多肽以及分子量小于3kDa的海参多肽组分在制备抗衰老的药物中的应用。
本领域技术人员可将本发明所述海参多肽以及分子量小于3kDa的多肽组分直接或间接加入制备不同剂型时所需的药学上可接受的各种常用辅料，如填充剂、崩解剂、润滑剂、粘合剂等，以常规药物制剂方法，制成常用制剂如片剂、胶囊剂、注射液、口服液、颗粒剂、丸剂、散剂和滴丸剂等。其中，填充剂如淀粉，乳糖，蔗糖，葡萄糖，甘露醇和硅酸；崩解剂如琼脂，碳酸钙，土豆淀粉或木薯淀粉，海藻酸，某些硅酸盐和碳酸钠，低取代羟丙基纤维素；润滑剂如滑石粉，硬脂酸钙，硬脂酸镁，固体聚乙二醇，月桂硫酸钠；粘合剂如羧甲基纤维素，藻酸盐，明胶，聚乙烯吡咯酮，蔗糖和阿拉伯胶。
本发明所述海参多肽以及分子量小于3kDa的海参多肽组分还可以制备成抗氧化、抗衰老的保健品。
由上述技术方案可知，本发明提供了一种海参多肽及其制备方法与应用。本发明所述海参多肽的制备方法为取海参体壁匀浆后依次经胰蛋白酶和木瓜蛋白酶水解后，加入乙醇沉淀多糖，离心取上清液。进一步对上清液收集截留分子量小于3kDa的组分获得分子量小于3kDa的海参多肽组分。本发明提供的制备方法，能够充分利用海参丰富资源得到具有抗氧化、抗衰老作用的海参多肽。实验结果表明本发明所述制备方法制得的海参多肽以及分子量小于3kDa的海参多肽组分均具有很好的抗氧化、抗衰老作用，可以用于制备成抗氧化、抗衰老药物或者抗氧化、抗衰老保健品，应用范围广泛，具有良好的经济和社会效应。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1示实施例3抗百草枯诱导的氧化胁迫实验中实施例1制备的海参多肽对秀丽线虫存活率影响的生存曲线；
图2示实施例3抗百草枯诱导的氧化胁迫实验中实施例2制备的分子量小于3kDa的海参多肽组分对秀丽线虫存活率影响的生存曲线；
图3示实施例4DPPH自由基清除实验中不同浓度的实施例1制备的海参多肽DPPH自由基清除率；
图4示实施例4DPPH自由基清除实验中不同浓度的实施例2制备的分子量小于3kDa的海参多肽组分DPPH自由基清除率；
图5示实施例5体内抗氧化防御系统的检测实验中实施例1制备的海参多肽对秀丽线虫匀浆液上清液中SOD、CAT活力和MDA含量影响的结果图；
图6示实施例5体内抗氧化防御系统的检测实验中实施例2制备的实施例2制备的分子量小于3kDa的海参多肽组分对秀丽线虫匀浆液上清液中SOD、CAT活力和MDA含量影响的结果图；
图7示实施例6秀丽线虫寿命实验中不同浓度的实施例1制备的海参多肽对秀丽线虫存活率影响的生存曲线；
图8示实施例6秀丽线虫寿命实验中不同浓度的实施例2制备的分子量小于3kDa的海参多肽组分对秀丽线虫存活率影响的生存曲线；
图9示实施例7线粒体ATP含量的检测实验中不同浓度的实施例1制备的海参多肽对秀丽线虫匀浆液中组织蛋白含量和ATP含量影响的结果图；
图10示实施例7线粒体ATP含量的检测实验中不同浓度的实施例2制备的分子量小于3kDa的海参多肽组分对秀丽线虫匀浆液中组织蛋白含量和ATP含量影响的结果图；
图11示实施例8线粒体膜电位的检测实验中不同浓度的实施例1制备的海参多肽对秀丽线虫匀浆液中线粒体膜电位水平影响的结果图；
图12示实施例8线粒体膜电位的检测实验中不同浓度的实施例2制备的分子量小于3kDa的海参多肽组分对秀丽线虫匀浆液中线粒体膜电位水平影响的结果图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
为了进一步理解本发明，下面结合具体实施例对本发明做详细阐述。
实施例1、海参多肽的制备
新鲜的海参解刨，去内脏，体壁用自来水和蒸馏水清洗3～4次，然后匀浆海参体壁组织材料，冷冻干燥后，称取5g于250mL烧杯中并加入80mL水浸润(1g干粉配20mL一级水，后期用酶液体积补足)，可用玻璃棒适当搅拌，然后于水浴锅中预热至45℃，用NaOH溶液调节pH值至8.0，胰蛋白酶活力为2500U/mg，以每克底物加3000U的量加入胰蛋白酶，于37～55℃，恒温水解2～10小时，100℃煮沸灭活；然后，待温度降至55℃左右，用0.1MHCl溶液将pH调至5.5，木瓜蛋白酶活力为6000U/mg，以每克底物加3000U的量加入木瓜蛋白酶，于50～80℃，恒温水解2～10小时，100℃煮沸灭活，得到海参蛋白酶解液。按乙醇：海参蛋白酶解液体积比为3:5的比例加入95％乙醇进行初步沉淀，然后边加入95％乙醇边搅拌，逐步调节乙醇含量为60％以使多糖逐步析出并形成沉淀，随后室温静置过夜(约为12h)以沉淀多糖，后经减压抽滤除去杂质，再于4℃条件下6000rpm离心15min获得含多肽的上清溶液，经真空冷冻干燥得海参多肽的粉末。
实施例2、海参多肽的制备
新鲜的海参解刨，去内脏，体壁用自来水和蒸馏水清洗3～4次，然后匀浆海参体壁组织材料，冷冻干燥后，称取5g于250mL烧杯中并加入80mL水浸润(1g干粉配20mL一级水，后期用酶液体积补足)，可用玻璃棒适当搅拌，然后于水浴锅中预热至45℃，用NaOH溶液调节pH值至8.0，胰蛋白酶活力为2500U/mg，以每克底物加3000U的量加入胰蛋白酶，于37～55℃，恒温水解2～10小时，100℃煮沸灭活；然后，待温度降至55℃左右，用0.1MHCl溶液将pH调至5.5，木瓜蛋白酶活力为6000U/mg，以每克底物加3000U的量加入木瓜蛋白酶，于50～80℃，恒温水解2～10小时，100℃煮沸灭活，得到海参蛋白酶解液。按乙醇：海参蛋白酶解液体积比为3:5的比例加入95％乙醇进行初步沉淀，然后边加入95％乙醇边搅拌，逐步调节乙醇含量为60％以使多糖逐步析出并形成沉淀，随后室温静置过夜(约为12h)以沉淀多糖，后经减压抽滤除去杂质，再于4℃条件下6000rpm离心15min获得含多肽的上清溶液，经真空冷冻干燥得海参多肽的粉末。
用一级水将海参多肽冻干粉配成浓度为10mg/mL的溶液，使用截留分子量为3kDa超滤离心管在6000～8000rpm下离心，收集分子量小于3kDa的多肽组分(MW<3kDa)，冻干后获得海参多肽冻干粉。
实施例3、抗百草枯诱导的氧化胁迫实验
将实施例1制备的海参多肽按照浓度为0.5mg/mL和2mg/mL加入到成虫初期的野生型秀丽线虫中，将实施例2制备的分子量小于3kDa的海参多肽组分按照浓度为1mg/mL和2mg/mL分别加入到成虫初期的野生型秀丽线虫中，对照组加入等体积的S Medium，置于20℃培养24h后，加入终浓度为70mM的百草枯对秀丽线虫进行氧化胁迫造模，并开始定时统计秀丽线虫存活的比率，直至全部虫子死亡。存活率以生存曲线表示，采用Kaplan-meier法分析比较实施例1和实施例2制备的海参多肽与对照组的差异性。结果如图1和图2所示。
结果显示，实施例1制备的海参多肽在0.5mg/mL和2mg/mL的浓度下，能够延长氧化胁迫条件下秀丽线虫的生存时间，提高存活率。而实施例2制备的海参多肽在1mg/mL和2mg/mL浓度时，也能够提高氧化胁迫条件下秀丽线虫的存活率。表明本发明所述海参多肽以及分子量小于3kDa的海参多肽组分能够提高秀丽线虫耐氧化胁迫条件的能力，缓解机体因氧化胁迫而产生早衰的问题。
实施例4、DPPH自由基清除试验
将实施例1制备的海参多肽和实施例2制备的分子量小于3kDa的海参多肽组分分别加水溶解配制成各受试浓度的多肽样品溶液，对照组为等体积的水。加入DPPH溶液，空白对照组以加入等体积水，室温下置于黑暗处反应30分钟后，于520nm波长下测定吸光度，计算DPPH自由基清除率，自由基清除率以mean±SD表示，采用T检验比较多肽组和对照组的差异性。结果如图3和图4所示。
其中，DPPH自由基清除率计算公式如下：
DPPH清除率(％)＝[1-(Asample-A0sanple)/(Acontrol-A0control)]×100％
式中，Asample、Acontrol表示多肽组和对照组的吸光值，A0sample和A0control表示多肽组和对照组的空白对照吸光度。
结果显示，实施例1制备的海参多肽在0.25～4.0mg/mL的浓度范围内能够有效地清除体外DPPH自由基，而且呈现浓度依赖性。而实施例2制备的分子量小于3kDa的海参多肽组分在0.25～2.0mg/mL的浓度范围内，也呈现出剂量依赖性清除DPPH自由基的能力。表明本发明所述海参多肽及其各组分均有较好的体外抗氧化效果。
实施例5、体内抗氧化防御系统的检测
经同步化处理的野生型秀丽线虫(N2)培养至L4期，调节虫密度后加入产卵抑制剂5-FUdR(终浓度为75μg/mL)，放置20℃摇床培养至成虫初期后，分别加入终浓度为1mg/mL的实施例1制备的海参多肽和实施例2制备的分子量小于3kDa的海参多肽组分，对照组为S Medium缓冲液。在20℃下继续培养48h后收集线虫，加IP细胞裂解液(P0013)，于冰水浴上超声破碎，将得到的匀浆液于13000×g，4℃下离心5分钟，收集上清液，利用碧云天检测试剂盒，分别测定匀浆上清液中SOD、CAT活力和MDA含量。结果如图5和图6所示：
结果显示，在经1mg/mL实施例1制备的海参多肽喂食后，秀丽线虫体内的SOD酶活力、H2O2酶活力较对照组有显著的提升，而脂质过氧化的标记物MDA含量显著性降低。而经1mg/mL实施例2制备的分子量小于3kDa的海参多肽组分喂食后同样可增强秀丽线虫体内SOD、CAT酶活力，而使MDA含量显著降低。表明本发明所述海参多肽可通过提高机体抗氧化防御系统的功能来达到抗氧化、延衰作用，从而缓解由氧化胁迫引起的衰老现象。
实施例6、秀丽线虫寿命实验
将实施例1制备的海参多肽和实施例2制备的分子量小于3kDa的海参多肽组分按照浓度为0.5mg/mL、1mg/ml和2mg/ml分别加入到成虫初期的野生型秀丽线虫中，对照组加入等体积的S Medium，放在20℃摇床中持续培养，在显微镜下每隔1天统计一次各组线虫的存活情况，直至所有线虫全部死亡。其存活率以生存曲线表示，采用Kaplan-meier法分析比较多肽组和对照组秀丽线虫寿命的差异。结果如图7和图8所示。
结果显示，相对于对照组，0.5～2.0mg/mL的海参多肽以及分子量小于3kDa的海参多肽组分均能延长自然条件下秀丽线虫的寿命。表明本发明所述海参多肽具有延缓衰老进程的作用。
实施例7、线粒体ATP含量的检测
将同步化后L4期的秀丽线虫分别喂以不同浓度的实施例1制备的海参多肽和实施例2制备的分子量小于3kDa的海参多肽组分，对照组加等量的SMedium缓冲液，置于20℃摇床培养，8h后，加入10mmol/L的百草枯溶液，24h后收集各组秀丽线虫，清洗3次后，加入细胞裂解液于冰水浴上进行组织匀浆，13300rpm转速下离心1min取上清液，利用BCA蛋白测定试剂盒和线粒体膜电位检测试剂盒，分别检测各组秀丽线虫匀浆液中组织蛋白含量和ATP含量。结果如下图9和图10所示。
结果显示在百草枯进行氧化胁迫造模的条件下，经1mg/mL和4mg/mL实施例1制备的海参多肽给药后，秀丽线虫体内ATP/蛋白含量显著高于对照组，且ATP含量随着多肽浓度提高而增加，在4.0mg/mL的给药浓度时效果最佳。而经1mg/mL和2mg/mL实施例2制备的分子量小于3kDa的海参多肽组分给药后，秀丽线虫体内ATP/蛋白含量显著高于对照组。
实施例8、线粒体膜电位的检测
将同步化后L4期的秀丽线虫分别喂以不同浓度的实施例1制备的海参多肽和实施例2制备的分子量小于3kDa的海参多肽组分，对照组加等量的SMedium缓冲液，置于20℃摇床培养8h后，加入10mmol/L的百草枯溶液，24h后收集各组秀丽线虫，清洗3次后，加入细胞裂解液于冰水浴上进行组织匀浆，8200rpm转速下离心1min取上清液，利用线粒体膜电位检测试剂盒测定各组秀丽线虫匀浆液中线粒体膜电位水平。结果如图11和12所示。
在检测膜电位水平时，加入了一种荧光探针JC-1，当线粒体膜电位较高时，JC-1聚集在线粒体的基质中，形成聚合物，可以产生红色荧光；在线粒体膜电位较低时，JC-1不能聚集在线粒体的基质中，此时JC-1为单体，可以产生绿色荧光。所以用红绿荧光的比例来衡量线粒体去极化的比例，而线粒体膜电位的下降是细胞凋亡早期的一个标志性事件。
结果显示，造模未给药组秀丽线虫体内线粒体膜电位水平(Green/Red值)远高于实验组及空白对照，出现反常的高值。喂以实施例1制备的海参多肽后实验组的秀丽线虫中Green/Red值则相较造模未给药组出现明显下降，仍高于阴性对照组，且以1mg/mL的作用效果最佳。而在给以实施例2制备的分子量小于3kDa的海参多肽组分处理的实验组，秀丽线虫体内的Green/Red值较造模未给药组也有显著降低，并且以0.5mg/mL浓度的效果最好。
Claims (10)
1.一种海参多肽的制备方法，其特征在于，取海参体壁匀浆后依次经胰蛋白酶和木瓜蛋白酶水解后，加入乙醇沉淀多糖，离心取上清液。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述制备方法还包括上清液超滤，收集截留分子量小于3kDa的组分的步骤。
3.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，胰蛋白酶水解具体为调节pH至8.0，加入胰蛋白酶37～55℃水解2～10小时，灭酶。
4.根据权利要求1-3任意一项所述的制备方法，其特征在于，所述木瓜蛋白酶水解具体为调节pH至5.5，加入木瓜蛋白酶50～80℃水解2～10小时，灭酶。
5.根据权利要求1-4任意一项所述的制备方法，其特征在于，所述乙醇沉淀多糖具体为先加入乙醇初步沉淀，然后加入乙醇至乙醇终浓度为60v/v％～80v/v％，静置12～20小时。
6.根据权利要求1-5任意一项所述的制备方法，其特征在于，所述离心为5000～10000rpm的转速离心10～20min。
7.根据权利要求2-6任意一项所述的制备方法，其特征在于，所述超滤具体为上清液加入截留分子量为3kDa超滤离心管，在6000～8000rpm下离心。
8.权利要求1-7任意一项所述制备方法制备得到的海参多肽。
9.权利要求8所述海参多肽在制备抗氧化、抗衰老的药物中的应用。
10.权利要求8所述海参多肽在制备抗氧化、抗衰老的保健品中的应用。
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