CN103304684A - 一种提取纯化透明质酸的生产方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种提取纯化透明质酸的生产方法,目的在于解决现有的CPC络合乙醇沉淀技术纯化存在工艺线路长、生产周期长、劳动强度大,影响产品质量的人为因素较多,产品收得率相对较低的问题,该方法包括如下步骤:发酵液灭活、一次醇沉、粗分、复溶、一次过滤除杂、二次过滤净化、醇沉结晶、干燥粉碎。本发明针对现有的CPC络合乙醇沉淀技术纯化存在的问题,提供一种用于兽疫链球菌发酵法生产透明质酸的发酵液的工业提取纯化方法,该方法具有工艺线路及生产周期短,适应性强,生产成本低,效果好的特点。该方法可以概括为“二次过滤二次醇沉提取工艺”,并经过实验室小试、中试以及实际生产的检验,证明切实可行,能够满足工业化生产需要。
Description
技术领域
本发明涉及微生物及生物制品领域,尤其是一种提取纯化透明质酸的生产方法。
背景技术
透明质酸,简称HA,是N-乙酰氨基葡萄糖和D-葡萄糖醛酸由β-1,4糖苷键链接而成的酸性高分子粘多糖。其具有良好的亲水性、生物相容性和保湿功能,已广泛应用于化妆品、食品、医药领域。透明质酸的生产方法主要包括:提取法和微生物发酵法,其中,提取法受原料来源制约,不能大规模生产,而发酵法则具有原料来源广泛的特点,因而已成为工业化生产HA的主流。发酵法生产透明质酸是利用兽疫链球菌将糖转化成HA,其具有原料易得、来源广泛的特点,适于工业化大规模生产。
发酵法生产透明质酸的发酵液中,除HA外,还含有大量的菌体蛋白(酸性蛋白、碱性蛋白)、核酸(DNA、RNA )、色素、金属离子及其它杂质,必须通过必要的手段和方法将HA分离纯化。分离纯化的目的就是将发酵液中的HA提取出来,并纯化达到一定质量标准。
目前,发酵法生产透明质酸的提取纯化技术通常采用CPC络合乙醇沉淀技术纯化,其具体工艺流程如下:HA复溶→CPC络合→离心分离→解离→过滤→醇沉絮凝→离心分离→溶解→醇沉结晶→离心分离→脱水→真空干燥→粉碎→包装。CPC络合乙醇沉淀技术是依据在特定浓度的NaCl溶液中,CPC络合和解离HA,再用乙醇沉淀分离,最终达到分离提纯透明质酸的目的。其中,CPC的中文名称为:氯化十六烷基吡啶,其是一种络合剂,其价格较高,国产CPC每公斤售价200元左右,进口的CPC每公斤售价400元左右。采用该工艺每生产1公斤透明质酸(HA)需要使用2—3公斤氯化十六烷基吡啶(CPC),仅CPC的原料成本就高达400—1200元,同时,解离过程需要在低温下进行,因此还需要配置冰水机组,进行降温、保温,增加了制冷机动力费用。
现有的CPC络合乙醇沉淀技术纯化存在如下缺点:工艺线路长、生产周期长、劳动强度大,影响产品质量的人为因素较多,产品收得率相对较低。该工艺的工艺线路、生产周期长,共17道生产工序,总用时为48个小时左右。同时,由于工序较多,产品收得率也相对较低。而且,采用该方式还存在另一质量风险问题,即:分子量降解。据生产试验验证,采用该方式的分子量损失为10-20%,有可能因为分子量降解而导致产品不合格。
现有的CPC络合乙醇沉淀技术纯化存在上述缺陷,因此需要对现有工艺进行改进和创新,克服现有技术的不足。
发明内容
本发明的发明目的在于:针对现有的CPC络合乙醇沉淀技术纯化存在工艺线路长、生产周期长、劳动强度大,影响产品质量的人为因素较多,产品收得率相对较低的问题,提供一种提取纯化透明质酸的生产方法。本发明针对现有的CPC络合乙醇沉淀技术纯化存在的问题,提供一种用于兽疫链球菌发酵法生产透明质酸的发酵液的工业提取纯化方法,该方法具有工艺线路及生产周期短,适应性强,生产成本低,效果好的特点。该方法可以概括为“二次过滤二次醇沉提取工艺”,并经过了实验室小试、中试以及实际生产的检验,证明该方法切实可行,能够满足工业化生产的需要。
为了实现上述目的,本发明采用如下技术方案:
一种提取纯化透明质酸的生产方法,包括如下步骤:
(1)发酵液灭活:将发酵液装入第一发酵罐中,搅拌,搅拌转速为40-100转/min,再向第一发酵罐中加入三氯乙酸,调节发酵液的pH值至4.0-4.5,搅拌30-80min,得灭活发酵液;
(2)一次醇沉:将灭活发酵液转移至第一沉淀罐中,向第一沉淀罐中缓慢加入灭活发酵液体积2-2.5倍浓度95%的乙醇,开启第一沉淀罐中的气浮装置,同时搅拌30-60min;
(3)粗分:搅拌完成后,收集灭活发酵液上浮的透明质酸粗产品和第一沉淀罐底部的透明质酸粗产品,混合得第一透明质酸粗产品;
(4)复溶:将第一透明质酸粗产品转移至第二沉淀罐中,向第二沉淀罐中加入第一透明质酸粗产品体积1.5-3倍的去离子水复溶,得复溶液,再向复溶液中加入NaCl,使复溶液中NaCl的摩尔浓度为0.2-0.6mol/L,再向其中加入复溶液质量1%-3%的助滤剂、复溶液质量0.1%-2%的活性炭、复溶液质量0.02%-0.04%的EDTA,搅拌10-30min后,得第二复溶液;
(5)一次过滤除杂:将第二复溶液用板框过滤机过滤,收集滤液,得一次滤液;
(6)二次过滤净化:向一次滤液中加入一次滤液质量1%-3%的珍珠岩,再向第一滤液中添加氢氧化钠,调节第一滤液的pH值至8.5-9.0,搅拌20-50min,得二次滤液;
(7)醇沉结晶:将二次滤液转移至结晶罐中,向结晶罐中加入氢氧化钠,调节二次滤液的pH值至6.5-8.0,搅拌,搅拌转速为120-200转/min,再向其中缓慢加入二次滤液2-2.5倍体积的浓度为95%的酒精,进行醇沉造粒,酒精加入完成后,静置至二次滤液澄清,抽取结晶罐上部酒精,然后将二次滤液剩余部分用滤布离心分离,得含水透明质酸;
(8)干燥粉碎:将含水透明质酸用丙酮或浓度为95%的酒精洗涤3-5次,再在40-60℃的条件下干燥,干燥后粉碎,即得产品;
所述步骤(4)中,助滤剂由硅藻土和珍珠岩按质量比1:1.5-4组成,活性炭为50-180目;
所述第一发酵罐、第一沉淀罐、第二沉淀罐、结晶罐的罐体内壁上分别设置有若干块挡流板。
所述第一发酵罐、第一沉淀罐、第二沉淀罐、结晶罐的罐体内壁上分别均布有三块挡流板。
所述步骤(1)中,将发酵液装入第一发酵罐中,搅拌,搅拌转速为60转/min,再向第一发酵罐中加入三氯乙酸,调节发酵液的pH值至4.0,搅拌60min,得灭活发酵液。
所述步骤(4)中,将第一透明质酸粗产品转移至第二沉淀罐中,向第二沉淀罐中加入第一透明质酸粗产品体积1.5-3倍的去离子水复溶,得复溶液,将复溶液升温至55℃,再向复溶液中加入NaCl,使复溶液中NaCl的摩尔浓度为0.2-0.6mol/L,再向其中加入复溶液质量1%-3%的助滤剂、复溶液质量0.1%-2%的活性炭、复溶液质量0.02%-0.04%的EDTA,搅拌10-30min后,得第二复溶液。
所述步骤(4)中,将第一透明质酸粗产品转移至第二沉淀罐中,向第二沉淀罐中加入第一透明质酸粗产品体积2倍的去离子水复溶,得复溶液,将复溶液升温至55℃,再向复溶液中加入NaCl,使复溶液中NaCl的摩尔浓度为0.2-0.6mol/L,再向其中加入复溶液质量2%的助滤剂、复溶液质量0.2%-0.3%的活性炭、复溶液质量0.025%的EDTA,搅拌20min后,得第二复溶液。
所述步骤(4)中,助滤剂由硅藻土和珍珠岩按质量比1:3组成,活性炭为180目。
所述步骤(8)中,将含水透明质酸用丙酮或浓度为95%的酒精洗涤3-5次,再用真空干燥机在60℃的条件下干燥,干燥后粉碎,即得产品。
本发明提供的生产方法包括如下步骤:发酵液灭活、一次醇沉、粗分、复溶、一次过滤除杂、二次过滤净化、醇沉结晶、干燥粉碎。干燥粉碎后,可以根据需要,对产品进行包装。
现有的酒精醇提工艺为絮凝,提取絮凝物靠人工收集,费事、费时、费力,难以适应大规模工业化生产的需要,同时损失消耗也比较大。而本发明在第一发酵罐、第一沉淀罐、第二沉淀罐、结晶罐的罐体内壁上分别设置有若干块挡流板,同时通过控制搅拌速度和乙醇的添加,通过挡流板、搅拌速度、酒精添加过程的相互配合,有效控制絮凝效果,使沉淀的透明质酸呈一定粒度的颗粒粉状物,而非成纤维絮状物,且有效避免粒状物太细不利于后期分离。
同时,本发明解决的另一技术难点在于透明质酸滤液过滤的问题。透明质酸的粘度大、流变性差,普通过滤方法很难过滤。而本发明通过以下三种措施的相互配合,达到采用常规设备过滤分离透明质酸的目的。这三种措施分别为:1)稀释原液浓度,使其粘度降低;2)添加氯化钠,提高离子强度;3)采用特定的由硅藻土和珍珠岩组成的助滤剂。作为进一步优选,本发明将复溶液升温至55℃,通过提高温度使透明质酸的粘度进一步降低。
本发明通过使用纯水与添加EDTA络合,减少和除去金属离子;通过活性炭、硅藻土、珍珠岩,吸附除去色素和蛋白质;通过乙醇萃取色素、沉淀蛋白质和分离HA;通过三氯乙酸和氢氧化钠调节pH值,使酸性蛋白和碱性蛋白达到等电点,而聚集沉淀,并除去蛋白。
与现有技术相比,本发明省略了CPC络合、解离环节,可有效节省CPC成本费用、解离制冷(制冷温度为14-16℃)运行费用,可缩短络合、解离环节时间24小时,设备利用率提高30%以上,极大提高了设备利用率,提取过程生产作业时间由48小时,缩短至24—30小时,有效缩短了生产周期,降低了生产成本。其中现有的CPC络合环节所起的作用,在本发明中,通过三氯乙酸、氢氧化钠调PH,蛋白质聚集沉淀及两次过滤去除,在滤液中添加EDTA和活性炭去除金属离子和色素,来实现。
本发明在现有设备的基础上,在第一发酵罐、第一沉淀罐、第二沉淀罐、结晶罐的罐体内壁上分别设置有若干块挡流板,通过“两次过滤和两次醇沉提取工艺”,达到与现有CPC络合乙醇沉淀技术纯化相同的技术效果,省略了CPC络合剂,且大大缩短了工艺线路、生产周期,有效降低了生产成本。本发明中,透明质酸的得率为60%以上,透明质酸的透光率为99.2%-99.5%,高于国家标准规定的透光率99.0%,分子量为1.0×106~1.5×106。
附图说明
图1是本发明实施例1制备的透明质酸产品。
图2是采用现有方法生产的透明质酸产品。
具体实施方式
本说明书中公开的所有特征,或公开的所有方法或过程中的步骤,除了互相排斥的特征和/或步骤以外,均可以以任何方式组合。
本说明书中公开的任一特征,除非特别叙述,均可被其他等效或具有类似目的的替代特征加以替换。即,除非特别叙述,每个特征只是一系列等效或类似特征中的一个例子而已。
实施例1
发酵液灭活:将发酵液装入第一发酵罐中,搅拌,搅拌转速为60转/min,再向第一发酵罐中加入三氯乙酸,调节发酵液的pH值至4.0,搅拌60min,发酵液中的酶失活,其中的酸性蛋白达到等电点聚集沉淀,得灭活发酵液。本步骤中,采用三氯乙酸调节发酵液的pH值能够起到使发酵液灭活,及酸性蛋白质沉淀的作用。
一次醇沉:将灭活发酵液转移至第一沉淀罐中,向第一沉淀罐中缓慢加入灭活发酵液体积2倍的浓度为95%的乙醇,开启第一沉淀罐中的气浮装置,同时搅拌30-60min。
粗分:搅拌完成后,收集灭活发酵液上浮的透明质酸粗产品和第一沉淀罐底部的透明质酸粗产品,混合得第一透明质酸粗产品。得到的第一透明质酸粗产品中,含有大量的菌体蛋白、色素、核酸等杂质,需要进一步除去纯化。
复溶:将第一透明质酸粗产品转移至第二沉淀罐中,向第二沉淀罐中加入第一透明质酸粗产品体积2倍的去离子水复溶,得复溶液,将复溶液升温至55℃。再向复溶液中加入NaCl,使复溶液中NaCl的摩尔浓度为0.5mol/L,再向其中加入复溶液质量2%的助滤剂、复溶液质量0.25%的活性炭、复溶液质量0.025%的EDTA,搅拌20min后,得第二复溶液。其中,助滤剂由硅藻土和珍珠岩按质量比1:3组成,活性炭为180目。其中,将复溶液升温至55℃,可以有效降低滤液粘度;NaCI浓度达到一定值时,可提高离子强度,大部分蛋白质和核酸已沉淀;活性炭、硅藻土和珍珠岩则可吸附色素和蛋白质,同时活性炭还能够起到助虑作用;EDTA可络合金属离子;且调整pH值,也可降低滤液粘度,有利于过滤。
一次过滤除杂:将第二复溶液用板框过滤机过滤,收集滤液,得一次滤液,初步除去其中的色素、蛋白质、核酸、金属离子等杂质。
二次过滤净化:向一次滤液中加入一次滤液质量2%的珍珠岩,再向第一滤液中添加氢氧化钠,调节第一滤液的pH值至9.0,搅拌30min,得二次滤液。该步骤能够进一步除去碱性蛋白。
醇沉结晶:将二次滤液转移至结晶罐中,向结晶罐中加入氢氧化钠,调节二次滤液的pH值至8.0,强烈搅拌,搅拌转速为120转/min,再向其中缓慢加入二次滤液2倍体积的浓度为95%的酒精,进行醇沉造粒,酒精加入完成后,静置至二次滤液澄清,抽取结晶罐上部酒精,然后将二次滤液剩余部分用滤布离心分离,得透明质酸。
干燥粉碎:将含水透明质酸用丙酮洗涤5次,再在双锥回转真空干燥机中干燥,干燥后粉碎,即得产品。粉碎后,可对产品进行包装。
其中第一发酵罐、第一沉淀罐、第二沉淀罐、结晶罐的罐体内壁上分别设置有三块挡流板,挡流板为不锈钢挡板,挡流板严罐体中心呈120°均匀分布。
本发明中,通过二次过滤达到去除杂质净化透明质酸的目的,其中助滤剂种类、规格、配比和添加量、添加方式、过滤方式的选择是本发明的关键,其能够保证滤除高粘度物料中的杂质,达到净化透明质酸的目的。
现有技术中的醇沉提取为气浮絮凝,通过人工方式收集透明质酸,劳动强度大,费时、费力,不利于大规模工业化生产。本发明通过在第一发酵罐、第一沉淀罐、第二沉淀罐、结晶罐的罐体内壁上分别设置挡流板,及控制酒精的添加调节、搅拌强度,有效控制絮凝物的性质、大小,以满足后续过滤及泵送的要求。
本发明在现有生产设备的基础上,在罐体内增加挡流板。设置在罐体内的挡流板能够提高搅拌强度,形成湍流效果。
本发明通过对工艺的改进,将现有的提取工序由17道缩短至12道,提取过程的生产时间由48小时缩短至30小时,有效缩短了生产周期,生产效率提高40%以上。同时,也是透明质酸的提取成本有2000元每公斤降低至1000元每公斤,极大得降低了生产成本。且生产的产品质量符合企业标准(透明质酸国家行业标准待批,企业标准参照国家行业标准报批稿起草。
实施例2
发酵液灭活:将发酵液装入第一发酵罐中,搅拌,搅拌转速为40转/min,再向第一发酵罐中加入三氯乙酸,调节发酵液的pH值至4.5,搅拌80min,发酵液中的酶失活,其中的酸性蛋白达到等电点聚集沉淀,得灭活发酵液。
一次醇沉:将灭活发酵液转移至第一沉淀罐中,向第一沉淀罐中缓慢加入灭活发酵液体积2.2倍的浓度为95%的乙醇,开启第一沉淀罐中的气浮装置,同时搅拌50min。
粗分:搅拌完成后,收集灭活发酵液上浮的透明质酸粗产品和第一沉淀罐底部的透明质酸粗产品,混合得第一透明质酸粗产品。得到的第一透明质酸粗产品中,含有大量的菌体蛋白、色素、核酸等杂质,需要进一步除去纯化。
复溶:将第一透明质酸粗产品转移至第二沉淀罐中,向第二沉淀罐中加入第一透明质酸粗产品体积1.5倍的去离子水复溶,得复溶液。再向复溶液中加入NaCl,使复溶液中NaCl的摩尔浓度为0.5mol/L,再向其中加入复溶液质量1%的助滤剂、复溶液质量0.15%的活性炭、复溶液质量0.02%的EDTA,搅拌30min后,得第二复溶液。其中,助滤剂由硅藻土和珍珠岩按质量比1:1.5组成,活性炭为180目。
一次过滤除杂:将第二复溶液用板框过滤机过滤,收集滤液,得一次滤液。
二次过滤净化:向一次滤液中加入一次滤液质量1%的珍珠岩,再向第一滤液中添加氢氧化钠,调节第一滤液的pH值至8.8,搅拌50min,得二次滤液。
醇沉结晶:将二次滤液转移至结晶罐中,向结晶罐中加入氢氧化钠,调节二次滤液的pH值至7.5,强烈搅拌,搅拌转速为200转/min,再向其中缓慢加入二次滤液2.5倍体积的浓度为95%的酒精,进行醇沉造粒,酒精加入完成后,静置120min,至二次滤液澄清,抽取结晶罐上部酒精,然后将二次滤液剩余部分用200目滤布离心分离,得含水65%左右的透明质酸。
干燥粉碎:将含水透明质酸用浓度为95%的酒精洗涤4次,再在双锥回转真空干燥机中干燥,干燥温度为55℃,干燥后粉碎,即得产品。粉碎后,可对产品进行包装。
其中第一发酵罐、第一沉淀罐、第二沉淀罐、结晶罐的罐体内壁上分别堆成设置有二块挡流板。
本实施例中,透明质酸的透光率为99.2%,分子量为1.27×106 Da,菌落数符合规定,霉菌和酵母菌总数符合规定,无粪大肠菌群,无铜绿假单胞菌,无金黄色葡萄球菌,汞含量符合规定,砷含量符合规定,铅含量符合规定,结论:产品合格。本实施例的生产时间为30h,生产的产品质量符合企业标准。
实施例3
发酵液灭活:将发酵液装入第一发酵罐中,搅拌,搅拌转速为100转/min,再向第一发酵罐中加入三氯乙酸,调节发酵液的pH值至4.0,搅拌30min,发酵液中的酶失活,其中的酸性蛋白达到等电点聚集沉淀,得灭活发酵液。
一次醇沉:将灭活发酵液转移至第一沉淀罐中,向第一沉淀罐中缓慢加入灭活发酵液体积2.5倍的浓度为95%的乙醇,开启第一沉淀罐中的气浮装置,同时搅拌30min。
粗分:搅拌完成后,收集灭活发酵液上浮的透明质酸粗产品和第一沉淀罐底部的透明质酸粗产品,混合得第一透明质酸粗产品。得到的第一透明质酸粗产品中,含有大量的菌体蛋白、色素、核酸等杂质,需要进一步除去纯化。
复溶:将第一透明质酸粗产品转移至第二沉淀罐中,向第二沉淀罐中加入第一透明质酸粗产品体积3倍的去离子水复溶,得复溶液,将复溶液升温至55℃。再向复溶液中加入NaCl,使复溶液中NaCl的摩尔浓度为0.3mol/L,再向其中加入复溶液质量3%的助滤剂、复溶液质量0.3%的活性炭、复溶液质量0.04%的EDTA,搅拌10min后,得第二复溶液。其中,助滤剂由硅藻土和珍珠岩按质量比1:4组成,活性炭为50目。
一次过滤除杂:将第二复溶液用板框过滤机过滤,收集滤液,得一次滤液。
二次过滤净化:向一次滤液中加入一次滤液质量3%的珍珠岩,再向第一滤液中添加氢氧化钠,调节第一滤液的pH值至8.6,搅拌20min,得二次滤液。
醇沉结晶:将二次滤液转移至结晶罐中,向结晶罐中加入氢氧化钠,调节二次滤液的pH值至7.8,强烈搅拌,搅拌转速为150转/min,再向其中缓慢加入二次滤液2倍体积的浓度为95%的酒精,进行醇沉造粒,酒精加入完成后,静置至二次滤液澄清,抽取结晶罐上部酒精,然后将二次滤液剩余部分用200目滤布离心分离,得透明质酸。
干燥粉碎:将含水透明质酸用浓度为95%的酒精洗涤3次,再在双锥回转真空干燥机中干燥,干燥温度为40℃,干燥后粉碎,即得产品。粉碎后,可对产品进行包装。
其中第一发酵罐、第一沉淀罐、第二沉淀罐、结晶罐的罐体内壁上分别均布有五块挡流板,挡流板为不锈钢挡板。
本实施例的生产时间为31h,生产的产品的质量符合企业标准。
本实施例中,透明质酸的透光率为99.4%,分子量为1.45×106 Da,菌落数符合规定,霉菌和酵母菌总数符合规定,无粪大肠菌群,无铜绿假单胞菌,无金黄色葡萄球菌,汞含量符合规定,砷含量符合规定,铅含量符合规定,结论:产品合格。本实施例的生产时间为30h,生产的产品质量符合企业标准。
对比试验
申请人采用现有的CPC络合乙醇沉淀技术对发酵液进行了纯化,作为对比例1,并与实施例1进行了比较。
对比例1与实施例1的比较结果如下。
1)对比例1的产品质量符合企业标准,为化妆品级,共17道工序,生产周期为48h,生产成本为2000元/kg;实施例1的产品质量符合企业标准,为化妆品级,共12道工序,生产周期为30h,生产成本为1200元/kg。
2)企业标准中的质量指标如下:外观为白色或淡黄色粉末,透明质酸的质量分数≥92.0,蛋白质的质量分数≤0.1,分子量Da为标准值±20%,在280nm的吸光度≤0.25,透光率≥99.0%,干燥失重≤10.0,pH值为6.0—8.0,菌落数≤100CUF/g,霉菌和酵母菌总数≤100CUF/g,不得检出粪大肠菌群,不得检出铜绿假单胞菌,不得检出金黄色葡萄球菌,汞含量≤1 mg/kg,砷含量≤2mg/kg,铅含量≤20mg/kg。
对比例1的外观为白色粉末,透明质酸的质量分数为92.5,蛋白质的质量分数为0.05,分子量为1.21×106Da,在280nm的吸光度为0.23,透光率为99.2%,干燥失重为6.94,pH值为6.9,菌落数符合规定,霉菌和酵母菌总数符合规定,无粪大肠菌群,无铜绿假单胞菌,无金黄色葡萄球菌,汞含量符合规定,砷含量符合规定,铅含量符合规定,结论:产品合格。
实施例1的外观为白色粉末,透明质酸的质量分数为92.1,蛋白质的质量分数为0.07,分子量为1.32×106Da,在280nm的吸光度为0.23,透光率为99.4%,干燥失重为8.21,pH值为7.5,菌落数符合规定,霉菌和酵母菌总数符合规定,无粪大肠菌群,无铜绿假单胞菌,无金黄色葡萄球菌,汞含量符合规定,砷含量符合规定,铅含量符合规定,结论:产品合格。
本发明并不局限于前述的具体实施方式。本发明扩展到任何在本说明书中披露的新特征或任何新的组合,以及披露的任一新的方法或过程的步骤或任何新的组合。
Claims (8)
1.一种提取纯化透明质酸的生产方法,其特征在于,包括如下步骤:
(1)发酵液灭活:将发酵液装入第一发酵罐中,搅拌,搅拌转速为40-100转/min,再向第一发酵罐中加入三氯乙酸,调节发酵液的pH值至4.0-4.5,搅拌30-80min,得灭活发酵液;
(2)一次醇沉:将灭活发酵液转移至第一沉淀罐中,向第一沉淀罐中缓慢加入灭活发酵液体积2-2.5倍浓度95%的乙醇,开启第一沉淀罐中的气浮装置,同时搅拌30-60min;
(3)粗分:搅拌完成后,收集灭活发酵液上浮的透明质酸粗产品和第一沉淀罐底部的透明质酸粗产品,混合得第一透明质酸粗产品;
(4)复溶:将第一透明质酸粗产品转移至第二沉淀罐中,向第二沉淀罐中加入第一透明质酸粗产品体积1.5-3倍的去离子水复溶,得复溶液,再向复溶液中加入NaCl,使复溶液中NaCl的摩尔浓度为0.2-0.6mol/L,再向其中加入复溶液质量1%-3%的助滤剂、复溶液质量0.1%-2%的活性炭、复溶液质量0.02%-0.04%的EDTA,搅拌10-30min后,得第二复溶液;
(5)一次过滤除杂:将第二复溶液用板框过滤机过滤,收集滤液,得一次滤液;
(6)二次过滤净化:向一次滤液中加入一次滤液质量1%-3%的珍珠岩,再向第一滤液中添加氢氧化钠,调节第一滤液的pH值至8.5-9.0,搅拌20-50min,得二次滤液;
(7)醇沉结晶:将二次滤液转移至结晶罐中,向结晶罐中加入氢氧化钠,调节二次滤液的pH值至6.5-8.0,搅拌,搅拌转速为120-200转/min,再向其中缓慢加入二次滤液2-2.5倍体积的浓度为95%的酒精,进行醇沉造粒,酒精加入完成后,静置至二次滤液澄清,抽取结晶罐上部酒精,然后将二次滤液剩余部分用滤布离心分离,得含水透明质酸;
(8)干燥粉碎:将含水透明质酸用丙酮或浓度为95%的酒精洗涤3-5次,再在40-60℃的条件下干燥,干燥后粉碎,即得产品;
所述步骤(4)中,助滤剂由硅藻土和珍珠岩按质量比1:1.5-4组成,活性炭为50-180目;
所述第一发酵罐、第一沉淀罐、第二沉淀罐、结晶罐的罐体内壁上分别设置有若干块挡流板。
2.根据权利要求1所述提取纯化透明质酸的生产方法,其特征在于,所述第一发酵罐、第一沉淀罐、第二沉淀罐、结晶罐的罐体内壁上分别均布有三块挡流板。
3.根据权利要求1或2所述提取纯化透明质酸的生产方法,其特征在于,所述步骤(1)中,将发酵液装入第一发酵罐中,搅拌,搅拌转速为60转/min,再向第一发酵罐中加入三氯乙酸,调节发酵液的pH值至4.0,搅拌60min,得灭活发酵液。
4.根据权利要求1-3任一项所述提取纯化透明质酸的生产方法,其特征在于,所述步骤(4)中,将第一透明质酸粗产品转移至第二沉淀罐中,向第二沉淀罐中加入第一透明质酸粗产品体积1.5-3倍的去离子水复溶,得复溶液,将复溶液升温至55℃,再向复溶液中加入NaCl,使复溶液中NaCl的摩尔浓度为0.2-0.6mol/L,再向其中加入复溶液质量1%-3%的助滤剂、复溶液质量0.1%-2%的活性炭、复溶液质量0.02%-0.04%的EDTA,搅拌10-30min后,得第二复溶液。
5.根据权利要求4所述提取纯化透明质酸的生产方法,其特征在于,所述步骤(4)中,将第一透明质酸粗产品转移至第二沉淀罐中,向第二沉淀罐中加入第一透明质酸粗产品体积2倍的去离子水复溶,得复溶液,将复溶液升温至55℃,再向复溶液中加入NaCl,使复溶液中NaCl的摩尔浓度为0.2-0.6mol/L,再向其中加入复溶液质量2%的助滤剂、复溶液质量0.2%-0.3%的活性炭、复溶液质量0.025%的EDTA,搅拌20min后,得第二复溶液。
6.根据权利要求1-4任一项所述提取纯化透明质酸的生产方法,其特征在于,所述步骤(4)中,助滤剂由硅藻土和珍珠岩按质量比1:3组成,活性炭为100-150目。
7.根据权利要求1所述提取纯化透明质酸的生产方法,其特征在于,所述步骤(4)中,助滤剂由硅藻土和珍珠岩按质量比1:3组成,活性炭为180目。
8.根据权利要求1所述提取纯化透明质酸的生产方法,其特征在于,所述步骤(8)中,将含水透明质酸用丙酮或浓度为95%的酒精洗涤3-5次,再用真空干燥机在60℃的条件下干燥,干燥后粉碎,即得产品。
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