CN114259995A - 一种沸石珍珠岩粉凝胶壳聚糖树脂吸附剂及其制备方法和透明质酸的纯化和生产方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于微生物提炼技术领域，涉及一种沸石珍珠岩粉凝胶壳聚糖树脂吸附剂及其制备方法和透明质酸的纯化和生产方法。所述沸石珍珠岩粉凝胶壳聚糖树脂吸附剂包括凝胶壳聚糖树脂以及负载于其上的沸石粉和珍珠岩粉；所述凝胶壳聚糖树脂的制备方法包括：将壳聚糖溶解于稀酸溶液中得到壳聚糖稀酸溶液；将金属氢氧化物溶液与交联剂混合均匀得到固化溶液；在搅拌条件下，将壳聚糖稀酸溶液缓慢滴加到固化溶液中，待滴加完毕后过滤，将过滤后所得湿树脂水洗至中性后脱色并干燥。采用以上沸石珍珠岩粉凝胶壳聚糖树脂吸附剂对透明质酸发酵液中的菌体、蛋白质、色素、金属离子等杂质进行去除时具有操作简便、安全、低污染、低成本、杂质去除率高的优势。
Description
技术领域
本发明属于微生物提炼技术领域，具体涉及一种沸石珍珠岩粉凝胶壳聚糖树脂吸附剂及其制备方法和透明质酸的纯化和生产方法。
背景技术
透明质酸(Hyaluronic acid，简称HA)又名玻璃酸或玻尿酸，其分子结构由D-葡萄糖醛酸和N-乙酰氨基-D-葡萄糖通过β-1,4和β-1,3糖苷键反复交替连接而成。透明质酸以其独特的分子结构和理化性质在机体内显示出多种重要的生理功能，如润滑关节、调节血管壁的通透性、调节蛋白质、水电解质扩散及运转、促进创伤愈合等。透明质酸也是人体内的一种固有成分，是一种葡聚糖醛酸，没有种属特异性，它广泛存在于胎盘、羊水、晶状体、关节软骨、皮肤真皮层等组织中，具有极好的保水性和协助渗透的特性，尤为重要的是，透明质酸具有特殊的保水作用，是目前发现的自然界中保湿性最好的物质，被称为理想的天然保湿因子。透明质酸被广泛应用于临床医学中作为粘结剂，化妆品工业中作为替代甘油的高级保水因子，其需求量日益增加，应用领域逐步扩展，已为世界各国所重视。
目前透明质酸通常以钠盐形式存在，透明质酸钠是一种更稳定的透明质酸，化学式为(C14H20NO11Na)n，具体结构如式(1)所示。透明质酸钠为白色纤维状或膏状粉末，无臭无味，具有很强的吸湿性、溶于水、不溶于有机溶剂，在氯化钠溶液中由于葡萄糖醛酸中的-COOH基解离，产生H+使得透明质酸呈现为酸性多聚阴离子状态，赋予了酸性粘多糖的特性。
目前透明质酸钠的生产工艺分为两大类：动物组织提取法和微生物发酵法。
所述动物组织提取法的特点是工艺流程简单，所得透明质酸分子量较大、粘度高且保湿性能好。但由于受原料来源有限的制约，且原料中透明质酸含量低，同时透明质酸又还与硫酸软骨素等粘多糖共存于生物组织中，故此法产量低、质量差、成本高，难以应用于大规模生产，较适用于原料来源分散的小规模生产。除此之外，动物源制品容易成为病毒传播的载体，会有引起交叉感染的风险，包括中国在内的许多国家，明令限制含有这些原料的化妆品、口服保健品及药品的销售与使用。这为微生物发酵法生产的发展带来了良机。
所述微生物发酵法是利用某些链球菌在生长繁殖的过程中，向胞外的荚膜中分泌代谢产物而形成透明质酸。与动物组织提取法相比，微生物发酵法具有生产规模不受原料限制、无动物来源的致病病毒的感染、低成本、高产量、高分子量、提取分离纯化过程简单、容易批量生产等特点，已经成为透明质酸生产的主要发展方向。但微生物发酵法产生的透明质酸发酵液属于典型的非牛顿凯松流体，粘度系数较大，这对后续提取纯化工作带来了很多技术上的难题，并且发酵产生的透明质酸发酵液中含有菌体、蛋白质、色素、金属离子等杂质，这些杂质的存在会导致透明质酸的提取率降低，使得透明质酸难以有效分离，阻碍了透明质酸的产业化生产。因此，必须对透明质酸发酵液进行预处理，减少杂蛋白和菌体等杂质对后期透明质酸钠盐提取的影响，才可获得高品质透明质酸钠产品。
此外，透明质酸发酵液中菌体及蛋白的存在会导致透明质酸用于化妆品或医药产品时出现过敏或发炎现象，因此必须尽可能地除去其中所含的菌体及蛋白。从现有专利文献和非专利文献的记载中可知，目前现有技术去除菌体及蛋白主要通过采用以下几种方法来实现：(1)高速离心法，可有效去除菌体，但由于发酵液中菌体等固体颗粒较小，在进行固液分离时需要相当高的转速才可行，因此，此法对设备要求很高；(2)利用氯仿和三氯乙酸沉淀法，使蛋白变性，有效分离蛋白，但菌体沉淀中夹带较多的透明质酸，导致透明质酸的回收率低，并且氯仿具有中等毒性，对环境不友好；(3)采用超滤膜技术分离法，可有效去除蛋白及菌体，过程无相变，易于连续操作，易规模化，但受膜本身特点的影响，易污染，易造成膜孔堵塞，通量下降快，并且由于浓缩后透明质酸粘度增加，物料易残留在膜中较难弄出，导致收率降低；(4)CPC、CTAB等季铵盐沉淀法，用于直接沉淀发酵液，纯化效率高，但该方法对季铵盐的需求量较大，价格昂贵，成本高；(5)酶解法，条件温和，可有效去除蛋白，但该法存在可能会引入新的蛋白质，导致分离速度变慢。上述几种菌体及蛋白的去除方法均有诸多不利因素，不适合投放到透明质酸工业化生产中。
同时微生物发酵法制备的透明质酸中通常含有一些多价的金属离子(如Fe3+、Mg2 +、Cu2+、Ca2+、Zn2+、As2+、Cd2+、Hg2+、Pb2+等)和一些有色杂质，若无法全部去除，会严重影响透明质酸的应用和感官品质。然而，从现有专利文件及非专利文献的记载可知，金属离子及有色物质的去除方式多数都是通过采用乙醇多次分级分离和超滤工艺进行去除，然而，采用乙醇多级分离工艺去除金属离子和有色物质时，过程过于繁琐，当用于大规模生产时处理量非常大，造成高额成本，不适合工业化生产；采用超滤工艺去除金属离子时，虽然对金属离子去除效果很好，但由于透明质酸粘度会随着过滤浓缩液的减少大幅度增加，从而会导致膜堵塞，难处理，这不仅成本高，且对膜的维护以及处理料液的要求也增高。
同时，现有公开技术表明，对透明质酸中有色物质的去除可采用一些吸附剂来完成，如活性炭、硅藻土、珍珠岩、氧化铝、硅胶、白土等。其中，活性炭是一种多孔性物质，内部具有发达的空隙结构和巨大的比表面积，对色、嗅、味、消毒副产品、微量有机污染物等都有一定的吸附能力，同时它也是市场最为理想的脱色剂，脱色效果显著，但由于活性炭中含有少量氧、氢、硫、氮、氯等元素，所以在脱色的基础上同时也会让溶液产生新的固体盐从而影响透明质酸的品质，并且活性炭市场价格昂贵，成本较高，不适合工业化采用。珍珠岩和硅藻土结合活性炭对透明质酸发酵液进行吸附脱色，珍珠岩和硅藻土性质基本相同，因具有多孔性性能，比表密度轻，而具有较强的吸附性，价格低廉，易再生，活性易控制，但珍珠岩和硅藻土由于在微酸性条件下对多价金属离子及蛋白的吸附性最高，所以针对本透明质酸中杂质的去除具有选择性、去除率较低，珍珠岩和硅藻土更多的作用是作为助滤剂使用，是目前为止市场上助滤剂最佳首选物料。氧化铝和硅胶也是常用的强极性吸附剂，但由于吸附性超强，在吸附杂质的同时也会造成营养成分的流失，不易选择。白土是脱色剂中的一种，但由于白土比表密度轻、粘度较大，不适合吸附粘性更大的透明质酸中的杂质，会造成吸附后过滤困难，且较难再生。
综上所述，采用微生物发酵工程技术大规模生产透明质酸时，目前需找到一个操作简捷、能够快速去除菌体、蛋白、金属离子及有色物质的方法来降低生产成本从而适用于大规模工业化生产。
发明内容
本发明的目的是为了克服采用现有的方法对透明质酸发酵液中的菌体、蛋白质、色素、金属离子等杂质进行去除时存在过程繁琐且杂质去除率较低的缺陷，而提供一种新的沸石珍珠岩粉凝胶壳聚糖树脂吸附剂及其制备方法和透明质酸的纯化和生产方法，采用该沸石珍珠岩粉凝胶壳聚糖树脂吸附剂对透明质酸发酵液中的菌体、蛋白质、色素、金属离子等杂质进行去除时具有操作简便、安全、低污染、低成本、杂质去除率高的优势。
具体地，本发明提供了一种沸石珍珠岩粉凝胶壳聚糖树脂吸附剂，其中，所述沸石珍珠岩粉凝胶壳聚糖树脂吸附剂包括凝胶壳聚糖树脂以及负载于凝胶壳聚糖树脂上的沸石粉和珍珠岩粉；
所述凝胶壳聚糖树脂的制备方法包括如下步骤：
S11、将壳聚糖溶解于稀酸溶液中，得到壳聚糖稀酸溶液；
S12、将金属氢氧化物溶液与交联剂混合均匀，得到固化溶液；
S13、在搅拌条件下，将壳聚糖稀酸溶液缓慢滴加到固化溶液中，待滴加完毕后过滤，将过滤后所得湿树脂水洗至中性后脱色，所得脱色树脂经干燥后得到凝胶壳聚糖树脂。
在一种优选实施方式中，步骤S11中，所述稀酸溶液选自盐酸溶液、醋酸溶液、草酸溶液和磷酸溶液中的至少一种。
在一种优选实施方式中，步骤S11中，所述稀酸溶液的浓度为0.5～5％v/v。
在一种优选实施方式中，步骤S11中，所述壳聚糖和稀酸溶液的用量使所得壳聚糖稀酸溶液的浓度为0.01～5％。
在一种优选实施方式中，步骤S12中，所述金属氢氧化物溶液中的金属氢氧化物为氢氧化钾和/或氢氧化钠。
在一种优选实施方式中，步骤S12中，所述金属氢氧化物溶液的浓度为1～30％w/v。
在一种优选实施方式中，步骤S12中，所述交联剂选自甲醛、戊二醛和环氧氯丙烷中的至少一种。
在一种优选实施方式中，步骤S12中，所述交联剂的加入量为固化溶液总体积的0.1～0.5倍。
在一种优选实施方式中，步骤S13中，所述脱色的方式为将水洗所得中性树脂采用丙酮浸渍。
在一种优选实施方式中，步骤S13中，所述丙酮的用量为中性树脂总体积的1～10％v/v。
在一种优选实施方式中，步骤S13中，所述浸渍的条件包括温度为室温，时间为1～5h。
本发明还提供了所述沸石珍珠岩粉凝胶壳聚糖树脂吸附剂的制备方法，其中，该方法包括将沸石粉和珍珠岩粉负载于凝胶壳聚糖树脂上。
在一种优选实施方式中，将沸石粉和珍珠岩粉负载于凝胶壳聚糖树脂上的方式包括以下步骤：
S21、将粒径为100目以下的沸石粉和珍珠岩粉共同置于稀酸溶液A中进行浸泡处理，待浸泡完毕后水洗至中性，烘干，得到沸石粉-珍珠岩粉复合物；
S22、将所述沸石粉-珍珠岩粉复合物与凝胶壳聚糖树脂于稀酸溶液B中搅拌混合均匀，再将所得混合物滴入碱性溶液中，之后将所得负载后凝胶壳聚糖沸石珍珠岩粉小球水洗至中性后烘干并过筛，即得沸石珍珠岩粉凝胶壳聚糖树脂吸附剂。
在一种优选实施方式中，步骤S21中，所述沸石粉和珍珠岩粉的质量比为1:(0.5～5)。
在一种优选实施方式中，步骤S21中，所述浸泡的条件包括温度为室温，时间为2～10h。
在一种优选实施方式中，步骤S21中，所述稀酸溶液A的浓度为0.1～10mol·L-1。
在一种优选实施方式中，步骤S22中，所述沸石粉-珍珠岩粉复合物、凝胶壳聚糖树脂与稀酸溶液B的用量比为(50～300)g:1g:(100～3000)mL。
在一种优选实施方式中，步骤S22中，所述稀酸溶液B的浓度为0.1～10mol·L-1。
在一种优选实施方式中，步骤S22中，所述搅拌混合均匀的条件包括温度为10～60℃，时间为1～10h。
在一种优选实施方式中，步骤S22中，所述碱性溶液为氢氧化钠溶液和/或氢氧化钾溶液。
在一种优选实施方式中，步骤S22中，所述碱性溶液的浓度为0.1～10mol·L-1。
本发明还提供了所述沸石珍珠岩粉凝胶壳聚糖树脂吸附剂在透明质酸纯化中的应用。
本发明还提供了一种透明质酸的纯化方法，其中，该方法包括以下步骤：
S31、透明质酸解离：将粘度为0.1～5Pa.s的透明质酸发酵液采用氯化钠进行解离，得到透明质酸钠解离液；
S32、除杂：将复合吸附剂A加入到步骤S31所得透明质酸钠解离液中进行搅拌吸附初次除杂，初次除杂完毕后进行第一次过滤，所述第一次过滤以复合吸附剂B作为过滤介质，得到除杂液；
S33、将所述除杂液的pH值调节至碱性进行降解，待降解完毕后，往所得降解液中加入复合吸附剂C进行搅拌吸附深度除杂，深度除杂完毕后进行第二次过滤，所得滤液的pH值调节至6～8，得到透明质酸精滤液；所述复合吸附剂A、复合吸附剂B和复合吸附剂C均为上述沸石珍珠岩粉凝胶壳聚糖树脂吸附剂。
在一种优选实施方式中，步骤S31中，所述氯化钠的用量与透明质酸发酵液的比例为(0.01～5.0)g:1mL。
在一种优选实施方式中，步骤S31中，所述解离的条件包括温度为30～60℃，时间为0.5～2h。
在一种优选实施方式中，步骤S32中，所述复合吸附剂A的用量为透明质酸钠解离液体积的0.01～10％。
在一种优选实施方式中，步骤S32中，所述搅拌吸附初次除杂的条件包括温度为30～60℃，时间为0.5～5h。
在一种优选实施方式中，步骤S32中，所述第一次过滤的条件包括过滤介质铺板量为反应液总体积的0.5～5％，过滤速率为20～30L/h，过滤压力为0.1～0.3MPa。
在一种优选实施方式中，步骤S33中，所述pH值调节所采用的试剂为碱液。
在一种优选实施方式中，步骤S33中，所述碱液为氢氧化钠溶液。
在一种优选实施方式中，步骤S33中，所述碱液的浓度为0.1～20mol·L-1。
在一种优选实施方式中，步骤S33中，所述降解的条件使所得降解液的数均分子量为1.0×106～2.0×106Da。
在一种优选实施方式中，步骤S33中，所述复合吸附剂C的用量为降解液体积的0.1～10％。
在一种优选实施方式中，步骤S33中，所述第二次过滤所采用的滤膜的孔径为0.1～10μm。
此外，本发明还提供了一种透明质酸的生产方法，其中，该方法包括以下步骤：
S41、将微生物发酵法所得透明质酸发酵液的粘度调节至0.1～5Pa.s；
S42、将粘度为0.1～5Pa.s的透明质酸发酵液采用上述方法进行纯化，得到透明质酸精滤液；
S43、将透明质酸精滤液进行浓缩，所得浓缩液进行醇沉析晶后过滤，所得滤饼烘干后得到透明质酸钠晶体。
在一种优选实施方式中，步骤S43中，所述浓缩在夹套式耦合MVR搅拌式多效蒸汽釜中进行，所述夹套式耦合MVR搅拌式多效蒸汽釜包括换热器、低压蒸汽釜、高压蒸汽釜、闪蒸罐-1、闪蒸罐-2和压缩机，所述换热器的出口与低压蒸汽釜的塔顶连接，所述低压蒸汽釜的塔釜与高压蒸汽釜的塔顶连接，所述低压蒸汽釜的夹套出口与闪蒸罐-2的入口相连，所述闪蒸罐-2的出口经由压缩机与高压蒸汽釜的夹套入口连接，所述高压蒸汽釜的夹套出口与闪蒸罐-1的入口相连，所述闪蒸罐-1的出口与低压蒸汽釜的夹套入口相连；所述透明质酸精滤液经换热器加热至45～55℃后依次送入低压蒸汽釜和高压蒸汽釜进行浓缩，所述低压蒸汽釜内的压力控制在50～60kPa，所述高压蒸汽釜内的压力控制在70～80kPa，最终所得浓缩液从高压蒸汽釜的塔釜排出进行醇沉析晶；所述低压蒸发釜产出的二次蒸汽先经由闪蒸罐-2回收部分蒸汽再经由压缩机加压升温后作为高压蒸汽釜内的发热源，所述高压蒸发釜产生的二次蒸汽经闪蒸罐-1回收部分蒸汽后作为低压蒸发釜的热源。
在一种优选实施方式中，步骤S43中，所述醇沉析晶的方式为往浓缩液中加入1～2倍体积的浓度为90％以上的乙醇搅拌醇沉后静置，待上清液清澈时将上层分出，剩余底料中加入1～1.5倍体积的浓度为70％～80％的乙醇搅拌醇沉后静置，待上清液清澈时将上层分出，剩余底料中再次加入1～1.5倍体积的浓度为90％以上的乙醇搅拌醇沉。
在一种优选实施方式中，所述烘干的条件包括温度为30℃～60℃，时间为8h～24h。
本发明的有益效果如下：
(1)本发明的关键在于将凝胶壳聚糖树脂、沸石粉和珍珠岩粉复配使用形成的复合吸附剂作为透明质酸发酵液纯化的吸附剂，该复合吸附剂可有效去除透明质酸发酵液中的色素和多价金属离子，并大幅度去除透明质酸发酵液中的菌体和蛋白。与同类技术方案相比，采用该复合吸附剂的优势在于：(a)对于未灭活的高粘度发酵液，对其菌体和蛋白仍有着较强的吸附除杂能力，普适性较广；(b)在协同了壳聚糖、沸石粉和珍珠岩粉三种吸附剂特性的基础上，三者复合后所形成的特殊结构能够使其得对蛋白、色素、重金属的吸附作用远远超越三者或者三者简单混合所带来的技术效果，同时仍保留着营养成分不被吸附、损失率最小的优势；(c)采用复合吸附剂处理效率较高，可以幅度缩短工艺流程，降低对工艺设备的要求，节约成本；(d)上述复合吸附剂原料价格便宜，寿命长，可再生后使用；(e)适合工业化生产使用，成本低，效率高。
(2)采用本发明提供的方法对透明质酸发酵液进行纯化，可以快速、有效并同时将透明质酸发酵液中蛋白、菌体、部分重金属、多价金属离子及有色杂质一并去除，避免采用三氯乙酸和氯仿让蛋白质变性后去除而造成对人和环境的不友好；无需采用酶解法造成新的蛋白质引入和分离速度降慢的问题；同时也能够避免使用酶解法、乙醇沉淀法、季铵盐沉淀法和膜分离法去除蛋白和金属离子时存在的高成本及低收率的问题。此外，本发明整个纯化和生产过程操作简捷、成本很低，适合大规模工业化生产。
(3)本发明提供的从微生物发酵液中提取透明质酸钠的方法，整个提取、纯化过程非常简单，整个过程中无有毒有害物质的加入，不会造成环境的污染，物耗、能耗低，同时整个过程中采用的设备要求比现有工艺简单，溶剂投用量显著减少，所制备的透明质酸钠成品含量可达95％以上，纯度＞99.0％，无重金属、无蛋白，很适合大规模工业化生产，具有广阔的应用前景。
在一种优选实施方式中，所述透明质酸精滤液的浓缩在夹套式耦合MVR搅拌式多效蒸汽釜中进行，所述夹套式耦合MVR搅拌式多效蒸汽釜的优势在于：(a)对所要提炼的透明质酸具有很强的实用性，因透明质酸为热敏性物质，该设备可实现在50℃下蒸发而无需冷冻，通过使用相对少的能量进行连续循环，在此情况下，不需要一次蒸汽作为加热介质，单位能量消耗低，操作成本低，同时设计的搅拌装置可防止物料在浓缩的过程中因出现结垢、传热系数下降而造成原料液浓缩很难继续进行等情况；(b)因温差低使产品的蒸发温和，实用性强，运行平稳，自动化程度高，节约了人员消耗；(c)蒸发效率高、操作简单、设备防腐性能高、除垢方便、系统整体运行费用低可在常压或负压工况下运行，负压工况下不仅降低了原料液的蒸发温度，而且降低了对系统相关设备以及管道的材质要求，同时又能保证系统的生产连续而稳定；(d)该设备相比单级MVR设备，由于在较低浓度下蒸发了部分进料水分，使得耦合MVR的多效蒸发系统压缩机处理的蒸汽流量大幅度下降，此外利用了闪蒸罐回收部分蒸汽能使得压缩机功耗大幅度下降；(e)在不消耗大量能耗的前提下缩小所述透明质酸滤液体积，从而节约了乙醇的消耗和大量乙醇回收造成的高成本。
附图说明
图1为本发明提供的夹套式耦合MVR搅拌式多效蒸汽釜的结构示意图；
图2为采用珍珠岩粉、沸石粉、制备例1所得凝胶壳聚糖树脂以及制备例1所得沸石珍珠岩粉凝胶壳聚糖树脂吸附剂对透明质酸发酵液的脱色结果图；
图3为制备例1所得凝胶壳聚糖树脂以及制备例1所得沸石珍珠岩粉凝胶壳聚糖树脂吸附剂的红外光谱图，其中，a为凝胶壳聚糖树脂对应的红外吸收谱图，b为沸石珍珠岩粉凝胶壳聚糖树脂吸附剂对应的红外吸收谱图；
图4为采用制备例1所得沸石珍珠岩粉凝胶壳聚糖树脂吸附剂对透明质酸进行过滤处理前后的红外光谱图；
图5为珍珠岩粉、沸石粉、制备例1所得凝胶壳聚糖树脂以及制备例1所得沸石珍珠岩粉凝胶壳聚糖树脂吸附剂对透明质酸的吸附结果图；
图6为珍珠岩粉、沸石粉、制备例1所得凝胶壳聚糖树脂以及制备例1所得沸石珍珠岩粉凝胶壳聚糖树脂吸附剂的空隙分布曲线图；
图7为制备例1所得壳聚糖凝胶颗粒以及制备例1所得沸石珍珠岩粉凝胶壳聚糖树脂吸附剂的表面形态图，其中，A为壳聚糖凝胶颗粒的表面形态图，B为沸石珍珠岩粉凝胶壳聚糖树脂吸附剂的表面形态图；
图8为制备例1所得壳聚糖凝胶颗粒以及制备例1所得沸石珍珠岩粉凝胶壳聚糖树脂吸附剂对金黄色葡萄球菌ATCC 6538(a)和大肠杆菌ATCC 8739(b)的抑菌效果图，其中，A为壳聚糖凝胶颗粒的抑菌效果图，B为沸石珍珠岩粉凝胶壳聚糖树脂吸附剂的抑菌效果图。
具体实施方式
本发明提供的沸石珍珠岩粉凝胶壳聚糖树脂吸附剂(复合吸附剂)包括凝胶壳聚糖树脂以及负载于凝胶壳聚糖树脂上的沸石粉和珍珠岩粉。这种特定的复合吸附剂能够提高对透明质酸这种非牛顿凯松流体中蛋白、金属离子及有色物质的吸附能力，从而将以上物质进行有效去除，同时具有价格低廉、易再生、对透明质酸营养成分损失小、抗菌等优点。
从分子结构可以看出，壳聚糖中含有丰富的氨基和羟基，对Pb2+、Cu2+、Cr2+、Cd2+、As2+、Hg2+、Pb2+、Mn2+等重金属离子具有配位、螯合的作用。由于壳聚糖分子中存在游离氨基，在稀溶液中被质子化使分子链上带大量正电荷成为一种典型的阳离子絮凝剂，因此它兼有电中和及吸附絮凝双重作用。
壳聚糖在吸附蛋白质上有较强的作用，因蛋白质分子链上带有碱性基团(如氨基)和酸性基团(如羧基)，在溶液中既能接受质子也能放出质子，是两性化合物。在等电点时蛋白质的溶解度最小，当溶液的值高于蛋白质的等电点时蛋白质带负电荷，反之当溶液的值低于蛋白质的等电点时该蛋白质带正电荷，壳聚糖对蛋白质吸附作用主要是电中和作用，即壳聚糖分子中带正电荷的氨基与蛋白质分子中带负电荷的基团相互吸引以后有效地中和了蛋白质的表面电荷使之凝聚下沉，所以壳聚糖对蛋白质的凝集能力很强，壳聚糖吸附蛋白机理如下式(2)和式(3)所示。
然而，壳聚糖还存在一些不足：直接把壳聚糖作为材料使用不太方便，适用的范围较窄、非多孔性且易流失，对此本发明需要将壳聚糖做成凝胶壳聚糖树脂。具体地，所述凝胶壳聚糖树脂的制备方法包括以下步骤：S11、将壳聚糖溶解于稀酸溶液中，得到壳聚糖稀酸溶液；S12、将金属氢氧化物溶液与交联剂混合均匀，得到固化溶液；S13、在搅拌条件下，将壳聚糖稀酸溶液缓慢滴加到固化溶液中，待滴加完毕后过滤，将过滤后所得湿树脂水洗至中性后脱色，所得脱色树脂经干燥后得到凝胶壳聚糖树脂。
步骤S11中，所述稀酸溶液的具体实例包括但不限于：盐酸溶液、醋酸溶液、草酸溶液和磷酸溶液中的至少一种，优选为盐酸溶液。所述稀酸溶液的浓度优选为0.5～5％v/v，更优选为0.5～2％v/v。所述壳聚糖和稀酸溶液的用量优选使所得壳聚糖稀酸溶液的浓度为0.01～5％(w/v，g/mL)，更优选为1～3％。
步骤S12中，所述金属氢氧化物溶液中的金属氢氧化物可以为氢氧化钾和/或氢氧化钠。所述金属氢氧化物溶液的浓度优选为1～30％w/v，更优选为2～8％w/v。步骤S12需要将碱性金属氢氧化物溶液与交联剂复配使用，其中，所述交联剂的具体实例包括但不限于：甲醛、戊二醛和环氧氯丙烷中的至少一种。其中，选取甲醇作为交联剂可使所制备的凝胶壳聚糖树脂支架孔径更规则，孔隙率、吸水率及溶胀率更高，孔间连接更为紧凑，大小也更加均匀。因此，所述交联剂优选为甲醇。此外，所述交联剂的加入量优选为固化溶液总体积的0.1～0.5倍，更优选为0.1～0.3倍。
步骤S13中，之所以需要在搅拌条件下进行是为了防止生成的壳聚糖湿树脂粘结。所述脱色的方式优选为将水洗所得中性树脂采用丙酮浸渍。其中，所述丙酮的用量优选为中性树脂总体积的1～10％v/v，更优选为2～8％v/v。此外，所述浸渍的条件通常包括温度可以为室温(20～40℃)，时间可以为1～5h。步骤S13所得湿凝胶壳聚糖树脂(湿树脂)为深黄色，有一些脂溶性不溶于水的物质粘附在凝胶壳聚糖树脂表面，为避免对后期透明质酸提取造成影响，进一步提高凝胶壳聚糖树脂的吸附性，本发明采用丙酮对该湿树脂进行脱色处理。丙酮是饱和脂肪酮系列中最简单的酮，是一种重要的有机溶剂，它可使凝胶壳聚糖树脂表面上不溶于水的脂类物质完全溶解，从而使凝胶壳聚糖树脂孔隙变宽，并起到脱色的作用。此外，所述干燥的温度可以为50～80℃。所述干燥优选为真空干燥。为了更有利于吸附性能的提高，优选地，所述干燥之后还包括研磨或粉碎过筛的步骤。
沸石是一种含骨架状结构的多孔硅铝酸盐矿物质，构成其骨架的最基本结构是硅氧四面体和铝氧四面体，是极性很强的吸附剂，对极性分子及不饱和分子有很强的亲和力，对非极性分子中极化率大的分子也有较高的选择吸附优势，沸石孔穴和通道中的阳离子还有较强的选择性离子交换性能，可将对动物有害的重金属离子和氰化物除掉。此外，沸石还具有独特耐酸性、热稳定性、抑菌性和很好的脱色作用等，再协同珍珠岩粉，能够对透明质酸这种酸性高分子粘多糖起到很好的吸附和助滤效果，同时对透明质酸物料中的色素能够产生较强的吸附和局部催化，对蛋白和金属离子具有非常强的吸附处理能力。经过试验的验证，本发明提供的沸石珍珠岩粉凝胶壳聚糖树脂吸附剂具有一定的抑菌能力，对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌均有一定的抗菌能力，并且经过多次再生后吸附性仍然可达到相同的水平，具有良好的应用前景。
本发明对将沸石粉和珍珠岩粉负载于凝胶壳聚糖树脂上的方式没有特别的限定，优选包括以下步骤：S21、将粒径为100目以下的沸石粉和珍珠岩粉共同置于稀酸溶液A中进行浸泡处理，待浸泡完毕后水洗至中性，烘干，得到沸石粉-珍珠岩粉复合物；S22、将所述沸石粉-珍珠岩粉复合物与凝胶壳聚糖树脂于稀酸溶液B中搅拌混合均匀，再将所得混合物滴入碱性溶液中，之后将所得负载后凝胶壳聚糖沸石珍珠岩粉小球水洗至中性后烘干并过筛，即得沸石珍珠岩粉凝胶壳聚糖树脂吸附剂。
步骤S21中，由于沸石粉和珍珠岩粉的粒径一般较大，在浸泡处理之前，通常需要进行过筛处理以将其粒径控制在100目以下。初始使用的沸石粉和珍珠岩粉的粒径可以各自独立地为20～600目，优选各自独立地为100～200目。所述沸石粉和珍珠岩粉的质量比优选为1:(0.5～5)，如1:0.5、1:1、1:1.5、1:2、1:2.5、1:3、1:3.5、1:4、1:4.5、1:5等。所述浸泡的条件优选包括温度为室温(20～40℃)；时间为2～10h。
步骤S22中，所述沸石粉-珍珠岩粉复合物、凝胶壳聚糖树脂与稀酸溶液B的用量比优选为(50～300)g:1g:(100～3000)mL，更优选为(80～120)g:1g:(800～1200)mL。具体地，以凝胶壳聚糖树脂的用量为1g计，所述沸石粉-珍珠岩粉复合物的用量优选为50～300g，如50、60、70、80、90、100、120、150、180、200、220、250、280、300g；所述稀酸溶液B的用量优选为100～3000mL，如100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1200、1500、1800、2000、2200、2500、2800、3000等。所述搅拌混合均匀的条件通常包括温度可以为10～60℃，优选为35～45℃；时间可以为1～10h，优选为2～6h。此外，所述碱性溶液可以为氢氧化钠溶液和/或氢氧化钾溶液。所述碱性溶液的浓度优选为0.1～10mol·L-1，更优选为0.5～1mol·L-1。
为了便于描述，将步骤S21中所采用的稀酸溶液称为“稀酸溶液A”，将步骤S22中所采用的稀酸溶液称为“稀酸溶液B”。所述稀酸溶液A和稀酸溶液B可以各自独立地选自盐酸溶液、醋酸溶液、草酸溶液和磷酸溶液中的至少一种。此外，所述稀酸溶液A和稀酸溶液B的浓度可以各自独立地为0.1～10mol·L-1，优选各自独立地为0.1～1mol·L-1。
本发明的发明人经过深入研究之后发现，当复合吸附剂在pH值为4.5～5.5的弱酸性条件下的吸附效果最好。
本发明还提供了所述沸石珍珠岩粉凝胶壳聚糖树脂吸附剂在透明质酸纯化中的应用。
本发明提供的透明质酸的纯化方法包括以下步骤：S31、透明质酸解离：将粘度为0.1～5Pa.s的透明质酸发酵液采用氯化钠进行解离，得到透明质酸钠解离液；S32、除杂：将复合吸附剂A加入到步骤S31所得透明质酸钠解离液中进行搅拌吸附初次除杂，初次除杂完毕后进行第一次过滤，所述第一次过滤以复合吸附剂B作为过滤介质，得到除杂液；S33、将所述除杂液的pH值调节至碱性进行降解，待降解完毕后，往所得降解液中加入复合吸附剂C进行搅拌吸附深度除杂，深度除杂完毕后进行第二次过滤，所得滤液的pH值调节至6～8，得到透明质酸精滤液。
由于透明质酸为酸性粘多糖，是一种特殊的非牛顿凯松流体，透明质酸发酵液中的粘度一般可达1～10Pa.s，高粘度不仅影响吸附剂的吸附效果，还对运输造成困扰，因此，要先将发酵液稀释至0.1～5Pa.s再纯化。
所述透明质酸常以钠盐形式存在，透明质酸钠是一种更稳定的透明质酸，因此在制备透明质酸结晶粉末前需对其采用一定量氯化钠进行解离，因透明质酸在氯化钠溶液中，葡萄糖醛酸中的-COOH进行解离，产生H+使透明质酸为酸性多聚阴离子状态，解离后的-COO与Na+重新结合成所需的透明质酸钠产品。
步骤S31中，所述解离所需NaCl质量根据总溶液中盐的浓度来定量。本发明的发明人经过广泛且深入研究之后发现，透明质酸在乙醇中析出，盐浓度需＞1.5％(w/v，g/mL)，同时本发明提供的复合吸附剂在pH为4.5～5.5范围内吸附效果最佳，从而可定夺盐的质量体积浓度优选为1.5％～5.0％(w/v，g/mL)，更优选为2％～3％(w/v，g/mL)。也即，所述氯化钠的用量与透明质酸发酵液的比例优选为(0.01～5.0)g:1mL，更优选为(0.01～3)g:1mL。此外，所述解离的条件通常包括温度可以为30～60℃，优选为45～55℃；时间可以为0.5～2h，优选为0.5～1h。
步骤S32中，将复合吸附剂A加入到透明质酸钠解离液中进行吸附除杂。所述复合吸附剂A的用量为透明质酸钠解离液体积的0.01～10％(w/v，g/mL)，更优选为0.01～3％(w/v，g/mL)。所述搅拌吸附初次除杂的条件通常包括温度可以为30～60℃，优选为45～55℃；时间可以为0.5～5h，优选为0.5～2h。此外，所述第一次过滤采用现代深层过滤工艺，以复合吸附剂B作为过滤介质，如此能够在助滤的同时继续对溶液中残留的少量蛋白、重金属及菌体进行二次吸附。所述过滤介质铺板量优选为反应液总体积的0.5～5％，更优选为反应液总体积的1～3％。此处所述的“反应液”是指经复合吸附剂A处理后的溶液。此外，所述过滤速率优选为20～30L/h，过滤压力优选为0.1～0.3MPa。
由于透明质酸钠为高分子链产物，为获得所要求分子量的目标产物，对此需要将步骤S32所得除杂液采用一定浓度碱液如氢氧化钠溶液调至碱性进行降解，待降解完毕后再次加入复合吸附剂C，进一步除去一些碱性蛋白杂质，吸附反应一段时间后进行过滤，滤液的pH值采用一定浓度酸液如稀盐酸溶液调节至6～8后优选再经过滤膜即为透明质酸精滤液。其中，所述碱液例如可以为氢氧化钾溶液和/或氢氧化钠溶液。所述碱液的浓度优选为0.1～20mol·L-1，更优选为0.5～5mol·L-1。所述降解的时间以及降解pH值随分子量大小而定，时间越长，pH值越高，所得透明质酸钠分子量越小，若想到获得数均分子量为1.0×106～2.0×106Da的高分子量透明质酸钠，降解pH值优选为10.5，降解温度优选为50℃。再则，所述复合吸附剂C的用量为降解液体积的0.1～10％(w/v，g/mL)，更优选为0.1～1％(w/v，g/mL)。此外，所述第二次过滤所采用的滤膜的孔径优选为0.1～10μm，更优选为0.2～0.6μm。
为了便于描述，将搅拌吸附初次除杂时所采用的吸附剂称为“复合吸附剂A”，将第一次过滤所采用的过滤介质称为“复合吸附剂B”，将搅拌吸附深度除杂时所采用的吸附剂称为“复合吸附剂C”。所述复合吸附剂A、复合吸附剂B和复合吸附剂C均为上述沸石珍珠岩粉凝胶壳聚糖树脂吸附剂。再则，为了获得更好的除杂效果，所述第二次过滤所采用的过滤介质也优选为上述沸石珍珠岩粉凝胶壳聚糖树脂吸附剂。
此外，为了使所得透明质酸精滤液具有更高的纯度，本发明提供的透明质酸的纯化方法中，最后将pH值调节至6～8之后，还包括过滤的步骤。此处过滤所采用的滤膜的孔径优选为0.1～10μm，更优选为0.2～0.6μm。
此外，本发明提供的透明质酸的生产方法包括以下步骤：S41、将微生物发酵法所得透明质酸发酵液的粘度调节至0.1～5Pa.s；S42、将粘度为0.1～5Pa.s的透明质酸发酵液采用上述方法进行纯化，得到透明质酸精滤液；S43、将透明质酸精滤液进行浓缩，所得浓缩液进行醇沉析晶后过滤，所得滤饼烘干后得到透明质酸钠晶体。
本发明提供的透明质酸的生产方法优选采用了一种夹套式耦合MVR搅拌式多效蒸汽釜对透明质酸精滤液进行浓缩，此时能够在不损耗太多能耗的前提下缩小透明质酸溶液体积，从而大幅度降低后期提纯溶剂的消耗量，进而显著降低溶剂回收造成的高能耗。该夹套式耦合MVR搅拌式多效蒸汽釜在浓缩整个过程中均不需要补热，完全符合工业蒸发浓缩的应用，能够达到很好的节能效果，且透明质酸为高粘度热敏性物质，而该夹套式耦合MVR搅拌式多效蒸汽釜可实现在40℃下蒸发而无需冷冻，通过使用相对少的能量，即在压缩热泵情况下的压缩机叶轮的机械能，能量被加入工艺加热介质中并进入连续循环，在此情况下，不需要一次蒸汽作为加热介质，单位能量消耗低，操作成本低。整个操作过程工艺简单，实用性强，运行平稳，自动化程度高，节约人员消耗。
由于本发明提供的透明质酸的生产方法需要采用乙醇进行醇沉析晶来实现透明质酸钠的提取，所以提取过程所得的透明质酸精滤液体积大小决定乙醇的投用量多少，同时透明质酸钠为高粘度热敏性物质，在高温下易发生降解，若采用现有传统浓缩设备(如单效真空浓缩、双效真空浓缩、多效真空浓缩等)，因其体积庞大、系统和操作复杂、在低温下蒸发会消耗较多能耗且时间消耗较大，需要选择不浓缩直接醇沉，这会导致大量的乙醇投用，对后期乙醇回收造成非常大的困扰和生产成本，不适合工业化生产，因此，本发明设计了一种夹套式耦合MVR多效蒸发釜，将所述透明质酸精滤液进行浓缩，该技术在不增加纯化工艺操作难度的基础上很大程度地节约了乙醇溶剂的投用并解决了大量溶剂回收造成的高能耗、高成本问题，同时又因透明质酸为高粘性物料，直接浓缩会造成物料粘壁、结块难弄出的可能，因此，设计了搅拌装置，将MVR薄膜蒸发器改为夹套式耦合MVR搅拌多效蒸发釜，可防止物料在浓缩的过程中因出现结垢、传热系数下降而造成原料液浓缩很难继续进行等情况。
与传统浓缩方法相比，MVR技术采用逆卡诺循环原理运行，二次蒸汽的潜热能够全部被回收再利用，与多效蒸发系统相比，MVR系统经压缩器出口的蒸汽会在进入蒸发器前，引入少量冷凝水，用于消除蒸汽过热度，从而不需要二次蒸汽冷却水系统，具有更显著的节能效果及更好的经济效益。
当前国内外学者大多对降膜式MVR蒸发系统进行了相关研究，而对夹套式耦合MVR搅拌多效蒸发系统很少有相关报道。
对于MVR蒸发浓缩工艺来说，如果沸点升高值过大，则使得换热器的有效传热温差降低，从而造成压缩机需要提高较高的温度来克服沸点升高的影响，使得系统能耗过高。据相关文献知：对于MVR蒸发系统，当溶液沸点升高超过15℃时，单级蒸汽压缩机提供的二次蒸汽温度不能维持蒸发过程中的有效传热温差，需要采用二级MVR或分级压缩系统。若低于15℃，可采用单级MVR蒸发系统，基于本发明提取的物料溶液在不同蒸发温度下沸点升高值变化规律可知，蒸发浓缩阶段沸点升高值不到10℃，因此采用单级MVR系统便可，但对于单级MVR系统，压缩机处理的蒸汽量为浓缩阶段需要产出的全部二次蒸汽，且废水沸点升高值较大，因此耗功会较大。
对此，本发明为了降低单级MVR系统的压缩机功率，设计了耦合MVR多效蒸发系统，在较低浓度下对进料液进行预浓缩，然后再经MVR系统进一步蒸发水分至设定浓度。考虑到系统热集成，采用两个闪蒸罐结合进料预热器来降低系统能耗，同时又因本产品黏性较大且为热敏性原料液，在浓缩的过程中可能会出现结垢、传热系数下降等现象，会造成原料液浓缩很难继续进行，本发明将耦合MVR多效蒸发系统应用于带搅拌装置的夹套式蒸发釜，使用单螺杆压缩机作为整个系统的驱动源，从而获得夹套式耦合MVR搅拌式多效蒸汽釜。
同时作为动力源的压缩机种类较多，近些年国内应用广泛的主要有三种：罗茨式蒸汽压缩机、离心式蒸汽压缩机、风机式蒸汽压缩机，而对单螺杆压缩机鲜少有用到。其中，罗茨式蒸汽压缩机在小型和中低沸点升物料蒸发应用广泛，但因结构特点，使用寿命较短，热交换性差，排量较小，机体笨重，结构复杂，连续运转性能不好，振动声音大，维护费用高。离心式蒸汽压缩机在大中型及较高沸点升物料蒸发单元应用较多，但因为转子转速较高，为了保证叶轮一定的宽度，离心式蒸汽压缩机必须用于大中流量场合，限制其在小型蒸发单元上的应用。风机式蒸汽压缩机在大中型蒸发单元及低沸点物料蒸发应用较多，中高沸点物料通过两级或三级串联使用，因风机式蒸汽压缩机单级压缩比较小，串级使用设备复杂，控制点多，占地面积大，对其应用也有限制。
而本发明的设备采用的是单螺杆压缩机来为夹套式耦合MVR多效蒸发釜提供动力源，相比双螺杆、罗茨式、离心式、风机式压缩机在运转时气流动脉小，排气量大，它可在高压下运行，一级压缩可达到6.16MPa，而其它压缩机最高不超过3MPa，因其螺杆受力完全平衡，可在很小间隙下工作，高速轻载、零部件少、泄露小，溶剂效率高，具有良好节能特效。从而很大程度降低了能耗，节约了成本，及其适合透明质酸钠工业化生产投用。
本设计以600MW燃煤机组为例，透明质酸精滤液处理量为10t/h，对预处理后精滤液不同热法蒸发结晶系统，利用流程模拟软件Aspen plus进行了流程模拟，获得了热法浓缩的物料和能量平衡。根据国内外常用的三种能源统计与折算方法(热值当量法、等价值法或发电煤耗法、等效电法)来计算各系统性能情况，不同浓缩工艺的模拟计算结果如表1所示，各方案性能计算结果均是在相同的进料流量、组分，相同的蒸发规模(9481kg/h)和相同的结晶过程下模拟获得。
经计算，对于传统的三效蒸发系统来说，需要生蒸汽耗量4551.7kg/h，即单位蒸汽消耗量(单位蒸发量消耗的蒸汽量)为0.48，三效蒸发系统的末效产生的二次蒸汽需要冷凝器冷凝，需要47904kg/h冷凝水(假设冷凝水温升为10℃)。对于单级MVR系统，由于利用压缩机对蒸发过程产出二次蒸汽加压提质，因此不需要消耗生蒸汽，同时也取消了冷凝器。与三效蒸发系统相比，其单位能耗大幅度下降；当采用不同能耗折算方法时，系统节能率67.7％～94.9％。与单级MVR系统相比，由于在较低浓度下蒸发了部分进料水分(总蒸发量的40％左右)，使得耦合MVR的多效蒸发系统压缩机处理的蒸汽流量大幅度下降；此外利用闪蒸罐回收部分蒸汽能相对于单级MVR系统，耦合MVR的多效蒸发系统的压缩机功耗下降了30％左右，系统能效系数提高了24.5％。
表1不同系统性能对比
本发明提供的夹套式耦合MVR搅拌式多效蒸汽釜的示意图如图1所示。具体地，参见图1，该夹套式耦合MVR搅拌式多效蒸汽釜包括换热器10、低压蒸汽釜20、高压蒸汽釜30、闪蒸罐-1 60、闪蒸罐-2 40和压缩机50，所述换热器10的出口与低压蒸汽釜20的塔顶连接，所述低压蒸汽釜20的塔釜与高压蒸汽釜30的塔顶连接，所述低压蒸汽釜20的夹套出口与闪蒸罐-2 40的入口相连，所述闪蒸罐-2 40的出口经由压缩机50与高压蒸汽釜30的夹套入口连接，所述高压蒸汽釜30的夹套出口与闪蒸罐-1 60的入口相连，所述闪蒸罐-1 60的出口与低压蒸汽釜20的夹套入口相连。其中，所述压缩机50为单螺杆压缩机。所述低压蒸汽釜20和高压蒸汽釜30均设置有搅拌装置。此外，所述夹套式耦合MVR搅拌式多效蒸汽釜还包括水箱70，所述水箱70的入口与换热器10的夹套出口连接，以回收换热器夹套中的换热介质(通常为水)。
相应地，所述夹套式耦合MVR搅拌式多效蒸汽釜的工作原理：将发酵液吸附除杂后提取所得精滤液经换热器被加热至45～55℃，然后送入低压蒸发釜中(50～60kPa)，产出的浓缩液送入高压蒸发釜(70～80kPa)中，最终得到浓缩液由釜底排出送至成品醇沉单元。其中，该夹套式耦合MVR搅拌式多效蒸汽釜设置了两个闪蒸罐(即闪蒸罐-1和闪蒸罐-2)，用于回收部分蒸汽热能，其中低压蒸发釜产出的二次蒸汽经闪蒸罐-2回收部分蒸汽后，经压缩机加压升温后作为高压蒸汽釜蒸发热源；高压蒸发釜产生的二次蒸汽经闪蒸罐-1回收部分蒸汽后，作为低压蒸发釜的热源。此外，优选地，换热器的热源为闪蒸罐-2出口冷凝水。与单级MVR系统相比，压缩机处理的蒸汽流量大大减小，系统压缩机功耗大幅度降低。在本发明中，所述压力均指绝对压力。
本发明提供的夹套式耦合MVR搅拌式多效蒸汽釜能够使原料液很好地加速传热，防止热敏性物料结垢等现象的产生，其具有蒸发效率高、操作简单、设备防腐性能高、除垢方便、系统整体运行费用低等优点，可在常压或负压工况下运行，负压工况下不仅可以降低原料液的蒸发温度，而且还可以降低对系统相关设备以及管道的材质要求，同时又能保证系统的生产连续而稳定。
本发明中，所述单螺杆压缩机采用变频调速三相异步电动机来为该夹套式耦合MVR带搅拌多效蒸发釜提供动力源，单螺杆压缩机在变频器的驱动下实现不同的转速与转矩，可以适应不同工作负载的需求。本发明中，系统能效系数为原料液蒸发结晶过程吸收的热量和系统能耗之比。
本发明的发明人经多次对该夹套式耦合MVR带搅拌多效蒸发釜进行运行试验，结果验证，每蒸发1m3水的耗电不超过25kW·h。冷凝液的均衡产出量约为浓缩液总量的92％～95％，通常温度为20℃～40℃，且无需再降温换热，可直接进入下步工艺处理工序。
所述夹套式耦合MVR带搅拌多效蒸发釜的蒸发温度通常控制在45～55℃。具体地，将发酵液吸附除杂后提取所得精滤液经换热器加热至浓缩所需温度45～55℃，再进入上述夹套式耦合MVR带搅拌多效蒸发釜进行浓缩，所得浓缩料液最终经由釜底部排到醇沉罐内待醇沉析晶，排出物料的温度通常为20～30℃。将二次蒸汽输送到单螺杆压缩机，按照蒸发装置加热室需要的蒸汽温度与压力(来自预过滤工序的过滤液，对应其蒸发浓缩时需要的沸点)，将加压后二次蒸汽返回到蒸发系统，作为热源循环利用(系统正常运行后，节约了一次蒸汽)。此外，所述浓缩倍数优选至发酵液体积的1～2倍。
步骤S43中经浓缩所得浓缩液进行醇沉析晶后过滤，所得滤饼烘干后得到透明质酸钠晶体。其中，醇沉析晶效果的好坏直接影响下一步干燥的最终效果，当脱水效果不好时，干燥后成品通常呈块状或粗纤维状；当脱水效果较好时，干燥后成品通常呈细纤维状或粉末状，这种状态符合商品化的标准。为了保证更好的脱水效果，优选地，所述醇沉析晶的过程采用不同浓度的乙醇进行分段处理。在最优选实施方式中，所述醇沉析晶的方式为往浓缩液中加入1～2倍体积的浓度为90％以上的乙醇搅拌醇沉后静置，待上清液清澈时将上层分出，剩余底料中加入1～1.5倍体积的浓度为70％～80％的乙醇搅拌醇沉后静置，待上清液清澈时将上层分出，剩余底料中再次加入1～1.5倍体积的浓度为90％以上的乙醇搅拌醇沉。所述醇沉析晶采用以上分段方式进行的目的是可以继续有效除去所述浓缩液中的淀粉、粘液质、蛋白质、蹂质、色素、无机盐等水溶性杂质。再则，所述醇沉析晶一般在搅拌条件下进行，其中，搅拌转速优选为10～1000r/h。此外，所述烘干可以在恒温真空烘箱中进行。所述烘干的条件通常包括温度可以为30℃～60℃，时间可以为8h～24h。
采用本发明的方法所得透明质酸钠成品为白色粉末晶体，纯度均≥99％，透明质酸钠含量＞95％，提取平均收率在95％以上，且蛋白、重金属均未检出，透光率高达99％以上。
以下将通过实施例对本发明进行详细描述。
制备例1
该制备例用于说明本发明提供的沸石珍珠岩粉凝胶壳聚糖树脂吸附剂及其制备方法。
(1)制备凝胶壳聚糖树脂：
S11、配制浓度为1％v/v的稀盐酸溶液1.5L，将30g壳聚糖加入该稀盐酸溶液中并搅拌至溶解，得到壳聚糖稀酸溶液。
S12、将200g NaOH固体加入500mL纯水中并搅拌至溶解得到氢氧化钠水溶液，待冷却后再加入200mL甲醇溶液搅拌均匀，得到固化溶液，待用。
S13、将步骤S11所得壳聚糖稀酸溶液采用注射器针头在缓慢搅拌的条件下缓慢滴入步骤S12所得固化溶液中，滴加完毕后搅拌10min过滤，将所得湿树脂水洗至中性，再将所得中性树脂采用丙酮在室温下浸泡2h进行脱色，脱色完毕后过滤，之后将所得固体产物在60℃下抽真空干燥，干燥品即为凝胶壳聚糖树脂，记为NZ-1。
(2)制备沸石珍珠岩粉凝胶壳聚糖树脂吸附剂：
S21、将沸石粉和珍珠岩粉均过100目筛，分别取筛下物沸石粉100g及珍珠岩粉150g共同加入2L浓度为1mol·L-1稀盐酸溶液中，在室温下浸泡4h，浸泡完毕后用蒸馏水洗涤至中性，过滤，所得固体产物置于60℃真空烘箱中烘干，得到沸石粉-珍珠岩粉复合物。
S22、将100g沸石粉-珍珠岩粉复合物和1g凝胶壳聚糖树脂加入1L浓度为0.2mol·L-1的盐酸溶液中，在40℃条件下搅拌3h，再将所得混合物用5#注射器缓慢滴入浓度为0.5mol·L-1的NaOH溶液中，即得负载质量为1％的凝胶壳聚糖沸石珍珠岩粉小球，小球用蒸馏水洗涤至中性后干燥，过120目筛即得到沸石珍珠岩粉凝胶壳聚糖树脂吸附剂D1。
制备例2
该制备例用于说明本发明提供的沸石珍珠岩粉凝胶壳聚糖树脂吸附剂及其制备方法。
(1)制备凝胶壳聚糖树脂：
S11、配制浓度为1％v/v的稀醋酸溶液2L，将50g壳聚糖加入该稀醋酸溶液中并搅拌至溶解，得到壳聚糖稀酸溶液。
S12、将250g NaOH固体加入1000mL纯水中并搅拌至溶解得到氢氧化钠水溶液，待冷却后再加入300mL甲醇溶液搅拌均匀，得到固化溶液，待用。
S13、将步骤S11所得壳聚糖稀酸溶液采用注射器针头在缓慢搅拌的条件下缓慢滴入步骤S12所得固化溶液中，滴加完毕后搅拌10min过滤，将所得湿树脂水洗至中性，再将所得中性树脂采用丙酮在室温下浸泡1h进行脱色，脱色完毕后过滤，之后将所得固体产物在60℃下抽真空干燥，干燥品即为凝胶壳聚糖树脂，记为NZ-2。
(2)制备沸石珍珠岩粉凝胶壳聚糖树脂吸附剂：
S21、将沸石粉和珍珠岩粉均过100目筛，分别取筛下物沸石粉100g及珍珠岩粉150g共同加入2L浓度为1mol·L-1稀醋酸溶液中，在室温下浸泡4h，浸泡完毕后用蒸馏水洗涤至中性，过滤，所得固体产物置于60℃真空烘箱中烘干，得到沸石粉-珍珠岩粉复合物。
S22、将100g沸石粉-珍珠岩粉复合物和2g凝胶壳聚糖树脂加入1L浓度为0.2mol·L-1的醋酸溶液中，在40℃条件下搅拌3h，再将所得混合物用5#注射器缓慢滴入浓度为0.2mol·L-1的NaOH溶液中，即得负载质量为2％的凝胶壳聚糖沸石珍珠岩粉小球，小球用蒸馏水洗涤至中性后干燥，过150目筛即得到沸石珍珠岩粉凝胶壳聚糖树脂吸附剂D2。
制备例3
该制备例用于说明本发明提供的沸石珍珠岩粉凝胶壳聚糖树脂吸附剂及其制备方法。
(1)制备凝胶壳聚糖树脂：
S11、配制浓度为0.5％v/v的稀草酸溶液2L，将80g壳聚糖加入该稀草酸溶液中并搅拌至溶解，得到壳聚糖稀酸溶液。
S12、将300g NaOH固体加入1000mL纯水中并搅拌至溶解得到氢氧化钠水溶液，待冷却后再加入300mL甲醇溶液搅拌均匀，得到固化溶液，待用。
S13、将步骤S11所得壳聚糖稀酸溶液采用注射器针头在缓慢搅拌的条件下缓慢滴入步骤S12所得固化溶液中，滴加完毕后搅拌10min过滤，将所得湿树脂水洗至中性，再将所得中性树脂采用丙酮在室温下浸泡2h进行脱色，脱色完毕后过滤，之后将所得固体产物在60℃下抽真空干燥，干燥品即为凝胶壳聚糖树脂，记为NZ-3。
(2)制备沸石珍珠岩粉凝胶壳聚糖树脂吸附剂：
S21、将沸石粉和珍珠岩粉均过120目筛，分别取筛下物沸石粉100g及珍珠岩粉200g共同加入2L浓度为1mol·L-1草酸溶液中，在室温下浸泡5h，浸泡完毕后用蒸馏水洗涤至中性，过滤，所得固体产物置于60℃真空烘箱中烘干，得到沸石粉-珍珠岩粉复合物。
S22、将200g沸石粉-珍珠岩粉复合物和3g凝胶壳聚糖树脂加入1L浓度为0.3mol·L-1的草酸溶液中，在50℃条件下搅拌3h，再将所得混合物用5#注射器缓慢滴入浓度为0.5mol·L-1的NaOH溶液中，即得负载质量为3％的凝胶壳聚糖沸石珍珠岩粉小球，小球用蒸馏水洗涤至中性后干燥，过120目筛即得到沸石珍珠岩粉凝胶壳聚糖树脂吸附剂D3。
测试例1
将珍珠岩粉、沸石粉、制备例1所得凝胶壳聚糖树脂NZ-1以及制备例1所得沸石珍珠岩粉凝胶壳聚糖树脂吸附剂(复合吸附剂D1)分别作为吸附剂应用于透明质酸发酵液提取工艺中，对各吸附剂的脱色情况进行表征。透明质酸发酵液在加入等量吸附剂后在相同条件下进行搅拌反应，并每间隔一定时间取样，用0.45μm的滤膜过滤，用分光光度计于265nm测定各时刻的吸光度，每个实验平行测定3次并取平均值作为结果。以去离子水作空白，用分光光度计于265nm测定各时刻的吸光度，计算脱色率，脱色率＝A0-A/A0*100％，其中，A0为未脱色透明质酸发酵液吸光度，A为透明质酸发酵液脱色某时刻的吸光度，结果见图2。
由图2可知，在最初的25min内，四种脱色剂的脱色率均迅速增大，随着时间延长，珍珠岩粉、沸石粉和凝胶壳聚糖树脂的脱色率基本不再增加，预示达到吸附平衡，最高脱色率分别为23.75％、32.15％和11.34％；而本发明提供的复合吸附剂D1在25～125min内脱色率仍有缓慢提高。当脱色时间为125min时，该复合吸附剂D1的脱除率最高，达到78.76％，此后脱色率基本不再上升，说明了该复合吸附剂D1对色素的吸附趋于饱和，即脱色达到平衡。
测试例2
采用8400S型傅立叶红外光谱仪分别对制备例1所得凝胶壳聚糖树脂NZ-1以及制备例1所得沸石珍珠岩粉凝胶壳聚糖树脂吸附剂(复合吸附剂D1)进行了红外光谱(IR)分析，其中，凝胶壳聚糖树脂NZ-1对应的结果见图3中a，复合吸附剂D1对应的结果见图3中b。由图3中a凝胶壳聚糖树脂NZ-1的红外吸收谱图可以看出，在3442.7cm-1处出现了壳聚糖所特有的-OH与-NH2的叠加伸缩振动峰，2923.9cm-1处出现了-CH2-基团的伸缩振动吸收峰，1604.4cm-1处出现的吸收峰为-C＝C键的面外振动吸收峰，1384.8cm-1处为-C-H键的弯曲振动峰，1089.7cm-1处为β-D吡喃葡萄糖苷的特征峰，553.5cm-1处出现了＝C-H键的面外弯曲振动。由图3中b复合吸附剂D1的红外吸收谱图可以看出，壳聚糖的主要特征峰没有发生变化，说明负载沸石粉和珍珠岩粉后凝胶壳聚糖树脂的化学结构未发生改变。
采用制备例1所得沸石珍珠岩粉凝胶壳聚糖树脂吸附剂(复合吸附剂D1)对透明质酸进行过滤处理，分别对过滤前后透明质酸的红外光谱(IR)进行表征。结果见图4。从图4可以看出，3500～3000cm-1较强的宽峰为-OH伸缩振动吸收峰；2923cm-1左右处为饱和C-H伸缩振动吸收峰；1604cm-1左右处为-C＝C的伸缩振动吸收；1243cm-1处为-OH的弯曲振动峰；1040～1070cm-1处为C-O-C伸缩振动吸收。这些特征峰与透明质酸标准品的结果基本相符，并且与透明质酸结构相吻合，表明本发明提供的复合吸附剂D1对透明质酸提炼过程中的吸附效果并未对透明质酸的结构产生影响。
测试例3
由于不具有选择特异性，珍珠岩粉、沸石粉、凝胶壳聚糖树脂及本发明提供的复合吸附剂均会对透明质酸有一定的吸附，造成产物的损失。将珍珠岩粉、沸石粉、制备例1所得凝胶壳聚糖树脂以及制备例1所得复合吸附剂D1应用于透明质酸发酵液提取工艺中，对各吸附剂的吸附情况进行表征。在加入等量吸附剂后的透明质酸发酵液在相同条件下进行搅拌反应，分别采用平板过滤器在一定压力下进行过滤，过滤后分别取其滤液采用紫外分光光度检测仪检测滤液中透明质酸含量并计算收率，从而可知各吸附剂对透明质酸吸附量情况，每个实验平行测定2次，结果见图5和表2，同时对各吸附剂的比表面积和孔结构进行了表征，所得孔隙分布曲线结果见图6。
表2各吸附剂对透明质酸吸附情况
| 序号 | 吸附剂 | 添加量(g/L) | 透明质酸损失量(％) |
| 1 | 沸石粉 | 10 | 20.3 |
| 2 | 珍珠岩粉 | 10 | 7.9 |
| 3 | 凝胶壳聚糖树脂 | 10 | 5.8 |
| 4 | 复合吸附剂D<sub>1</sub> | 10 | 1.3 |
由图5可知，在相对压力为0.4～1.0处的滞后现象表明样品的组织孔隙率较高，这四种吸附剂都符合Ⅳ型吸附等温线，表明其都是介孔材料；在相对压力为0.9～1.0处，复合吸附剂D1产生了H3型滞回环，说明了它是由片状粒子挤压形成的狭缝孔；在相对压力为0.5～1.0处，凝胶壳聚糖树脂、珍珠岩粉和沸石粉产生了H4型滞回环，说明了是由层状粒子挤压形成的狭缝孔；由表2可知，本发明提供的复合吸附剂D1损失量最少1.3％，其次是凝胶壳聚糖树脂5.8％，珍珠岩7.9％，沸石粉20.3％。
用BJH法从等温线的解吸分支得到四种吸附剂的孔隙分布曲线如图6所示。由图6可知，经对比珍珠岩粉、沸石粉、复合吸附剂D1的比表面积，本发明提供的复合吸附剂D1孔径分布比较宽，主要以介孔(峰在5～6nm)为主，还有少量的大孔(峰分布在126～148nm)，微孔所占比例较小，平均孔径较大，比表面积相对较小；而壳聚糖凝胶颗粒、珍珠岩粉和沸石粉主要以微孔(峰在1～2nm)为主，孔径分布均较窄，比表面积很大，但由于孔径较小，因此对略大色素类杂质吸附较差。
测试例4
采用S-530型透射电子显微镜对制备例1所得壳聚糖凝胶颗粒和制备例1所得复合吸附剂D1的表面形态进行观察，结果见图7，图7中A为壳聚糖凝胶颗粒的表面形态，图7中B为复合吸附剂D1的表面形态。由图7可以看出，复合吸附剂D1的表面形态孔隙较壳聚糖凝胶颗粒明显变大。对沸石粉、珍珠岩粉、制备例1所得壳聚糖凝胶颗粒和制备例1所得复合吸附剂D1的孔结构参数进行测试。从图7中A和B以及表3的结果进一步证实了上述结论，经复合后的新型吸附剂孔径较大，孔径分布较宽。
表3
测试例5
采用牛津杯法分别测试制备例1所得壳聚糖凝胶颗粒和制备例1所得复合吸附剂D1对金黄色葡萄球菌ATCC 6538(a)和大肠杆菌ATCC 8739(b)的抑菌效果，并通过采用S-530型透射电子显微镜进行观察，结果见图8。其中，图8中A为壳聚糖凝胶颗粒的抗菌能力；图8中B为复合吸附剂D1的抗菌能力。
由图8可知，负载了沸石粉和珍珠岩粉的壳聚糖凝胶复合吸附剂D1的抑菌圈更大，说明本发明提供的复合吸附剂D1对大肠杆菌和金葡萄球菌相比单一的壳聚糖凝胶颗粒有更好的抑菌效果。此外，该复合吸附剂对金黄色葡萄球菌的抑制效果比大肠杆菌的抑制效果更好，所形成抑菌环的直径最小为9mm，最大可达到14mm，远远大于所形成抑菌环的直径≥7mm的抗菌性能认定标准。研究表明，壳聚糖凝胶本身就具有一定的抑菌性，经与沸石粉复配后，具有了协同抑菌效果，抗菌能力明显增强。
综上研究表征结果，本发明提供的复合吸附剂，经一系列负载改性后，壳聚糖本身具有的化学结构未发生改变，且对透明质酸结构也并未产生影响；与其他吸附剂(壳聚糖凝胶、珍珠岩粉、沸石粉)相比，本发明提供的复合吸附剂在具备三者作用的同时孔径结构发生了明显改变，孔径发生变大、变宽现象，应用于透明质酸提取时损失率很小，经与沸石粉和珍珠岩粉复配后，具有了协同作用的抑菌效果，抗菌能力明显增强。
实施例1(采用本发明制备例1所得复合吸附剂D1)
从一种微生物发酵液中提取制备透明质酸钠的方法，具体步骤如下：
(1)往1000mL透明质酸发酵液中加入4倍体积去离子水搅拌30min以将透明质酸发酵液的粘度控制在2.5Pa.s，加入总盐浓度2.0％的NaCl固体102.04g，升温至40℃，搅拌2h，溶液pH＝5.0，加入总体积1.0％(w/v)的复合吸附剂D1 51.02g，于60℃下搅拌0.5h后过滤，所述过滤以复合吸附剂D1作为过滤介质，复合吸附剂D1的铺板量为反应液体积的4％，在压力0.2MPa下以20L/h的速率进行过滤，所得滤液体积5010mL，蛋白质未检出，Gu2+、Zn2+、As2+、Hg2+、Mg2+、Ca2+、Fe3+未检出，Cd2+：0.002ppm，Pb2+：0.005ppm，滤液为乳白色。
(2)在步骤(1)所得滤液中采用浓度为2.5mol/L的NaOH溶液调pH至10.5，50℃条件下搅拌降解15min，加入滤液体积0.5％复合吸附剂D1 25.05g，在50℃下继续搅拌1h过滤，滤液用浓度5％(v/v)盐酸溶液调pH至6.5，再次采用0.22μm滤膜过滤，得精滤液4995mL，Gu2 +、Zn2+、As2+、Cd2+、Hg2+、Mg2+、Ca2+、Fe3+未检出，Pb2+：0.001ppm，蛋白质未检出，滤液清澈透亮，透光率99.9％。
(3)将步骤(2)所得精滤液采用实验室夹套式MVR蒸发釜进行浓缩，浓缩至体积为原发酵液体积的1倍，浓缩液中加入体积1.5倍95％乙醇搅拌30min后进行静置醇沉，至上清液清澈将上层分出，底料加入体积1.2倍75％乙醇搅拌30min后进行静置醇沉，再弃去上清液，底料再次加入1.3倍93％乙醇搅拌30min进行静置醇沉，脱水后进行抽滤，滤饼放入50℃恒温真空烘箱烘18h，所得成品折干含量95.8％，透光率99.5％，收率95.5％，水分7.8％，透明质酸钠分子量：1.5×106DA，蛋白、重金属均未检出，精滤液体积与浓缩前相比缩小了5倍，进而醇沉步骤乙醇用量减少了80％。
实施例2(采用本发明制备例2所得复合吸附剂D2)
从一种微生物发酵液中提取制备透明质酸钠的方法具体步骤如下：
(1)往1000mL透明质酸发酵液中加入3倍体积去离子水搅拌30min以将透明质酸发酵液的粘度控制在3.3Pa.s，加入总盐浓度1.5％的NaCl固体45.92g，升温至60℃，搅拌0.5h，溶液pH＝5.13，加入总体积1.5％(w/v)新型复合吸附剂D2 45.69g，于50℃下搅拌1h后过滤，所述过滤以复合吸附剂D2作为过滤介质，复合吸附剂D2的铺板量为反应液体积的2％，在压力0.25MPa下以30L/h的速率进行过滤，所得滤液体积3050mL，蛋白质未检出，Gu2+、As2+、Hg2+、Mg2+、Ca2+、Fe3+未检出，Cd2+：0.003ppm，Pb2+：0.002ppm，Zn2+：0.001ppm，滤液为乳白色。
(2)在步骤(1)所得滤液中采用浓度为2.5mol/L的NaOH溶液调pH至10.3，50℃条件下搅拌降解30min，加入总体积1％复合吸附剂D2 30.5g，在50℃下继续搅拌1h过滤，滤液用浓度5％(v/v)盐酸溶液调pH至6.45，再次采用0.22μm滤膜过滤，得精滤液3000mL，Gu2+、Zn2 +、As2+、Cd2+、Hg2+、Mg2+、Ca2+、Fe3+未检出，Pb2+：0.001ppm，蛋白质未检出，滤液清澈透亮，透光率99.8％。
(3)将步骤(2)所得精滤液采用实验室夹套式MVR蒸发釜进行浓缩，浓缩至体积为原发酵液体积的1倍，浓缩液中加入体积1.5倍95％乙醇搅拌30min后进行静置醇沉，至上清液清澈将上层分出，底料加入体积1.2倍80％乙醇搅拌30min后进行静置醇沉，再弃去上清液，底料再次加入1.2倍95％乙醇搅拌30min进行静置醇沉，脱水后进行抽滤，滤饼放入50℃恒温真空烘箱烘18h，所得成品折干含量95.2％，透光率99.7％，收率94％，水分7.5％，透明质酸钠分子量：1.2×106DA，蛋白、重金属均未检出，精滤液体积与浓缩前相比缩小了3倍，进而醇沉步骤乙醇用量减少了67％。
实施例3(采用本发明制备例3所得新型复合吸附剂D3)
从一种微生物发酵液中提取制备透明质酸钠的方法具体步骤如下：
(1)往5L透明质酸发酵液中加入3倍体积去离子水搅拌1h以将透明质酸发酵液的粘度控制在3.3Pa.s，加入总盐浓度2.0％的NaCl固体306g，升温至50℃，搅拌1h，溶液pH＝5.13，加入总体积2.0％(w/v)的复合吸附剂D3 306g，于30℃下搅拌5h后过滤，所述过滤以复合吸附剂D3作为过滤介质，复合吸附剂D3的铺板量为反应液体积的4％，在压力0.25MPa下以25L/h的速率进行过滤，所得滤液体积15.5L，蛋白质未检出，Gu2+、As2+、Cd2+、Hg2+、Mg2+、Ca2 +、Fe3+未检出，Pb2+：0.005ppm，Zn2+：0.007ppm，滤液为乳白色。
(2)在步骤(1)所得滤液中采用浓度为2.5mol/L的NaOH溶液调pH至10.8，50℃条件下搅拌降解30min，加入总体积1％复合吸附剂D3 155g，在50℃下继续搅拌1.5h过滤，滤液用浓度5％(v/v)盐酸溶液调pH至6.5，再次采用0.22μm滤膜过滤，得精滤液15L，Gu2+、Zn2+、Pb2+、Cd2+、Hg2+、Mg2+、Fe3+、Ca2+、As2+未检出，蛋白质未检出，滤液清澈透亮，透光率100％。
(3)将步骤(2)所得精滤液采用实验室夹套式MVR蒸发釜进行浓缩，浓缩至体积为原发酵液体积的1倍，浓缩液中加入体积1.5倍95％乙醇搅拌30min后进行静置醇沉，至上清液清澈将上层分出，底料加入体积1.2倍75％乙醇搅拌30min后进行静置醇沉，再弃去上清液，底料再次加入1.2倍95％乙醇搅拌30min进行静置醇沉，脱水后进行抽滤，滤饼放入50℃恒温真空烘箱烘18h，所得成品折干含量96.1％，透光率99.6％，收率93.5％，水分7.0％，透明质酸钠分子量：1.1×106DA，蛋白、重金属均未检出，精滤液体积与浓缩前相比缩小了3倍，醇沉步骤乙醇用量从而减少了67％。
实施例4(采用本发明制备例1所得复合吸附剂D1)
从一种微生物发酵液中提取制备透明质酸钠的方法，具体步骤如下：
(1)往1000mL透明质酸发酵液中加入4倍体积去离子水搅拌30min以将透明质酸发酵液的粘度控制在2.5Pa.s，加入总盐浓度2.0％的NaCl固体102.04g，升温至40℃，搅拌2h，溶液pH＝5.01，将溶解液pH用10％稀盐酸调至4.5，加入总体积1.0％(w/v)的复合吸附剂D151.02g，于60℃下搅拌0.5h后过滤，所述过滤以复合吸附剂D1作为过滤介质，复合吸附剂D1的铺板量为反应液体积的4％，在压力0.2MPa下以20L/h的速率进行过滤，所得滤液体积5010mL，蛋白质未检出，Gu2+、Zn2+、As2+、Cd2+、Hg2+、Mg2+、Ca2+、Fe3+未检出，Pb2+：0.002ppm，滤液为乳白色。
(2)在步骤(1)所得滤液中采用浓度为2.5mol/L的NaOH溶液调pH至10.5，50℃条件下搅拌降解15min，加入滤液体积0.5％复合吸附剂D1 25.05g，在50℃下继续搅拌1h过滤，滤液用浓度5％(v/v)盐酸溶液调pH至6.5，再次采用0.22μm滤膜过滤，得精滤液4995mL，Gu2 +、Zn2+、As2+、Cd2+、Hg2+、Mg2+、Ca2+、Fe3+未检出，Pb2+：0.001ppm，蛋白质未检出，滤液清澈透亮，透光率100％。
(3)将步骤(2)所得精滤液采用实验室夹套式MVR蒸发釜进行浓缩，浓缩至体积为原发酵液体积的1倍，浓缩液中加入体积2倍90％乙醇搅拌30min后进行静置醇沉，至上清液清澈将上层分出，底料加入体积1.5倍70％乙醇搅拌30min后进行静置醇沉，再弃去上清液，底料再次加入1.5倍90％乙醇搅拌30min进行静置醇沉，脱水后进行抽滤，滤饼放入50℃恒温真空烘箱烘18h，所得成品折干含量96.2％，透光率99.7％，收率95.8％，水分7.5％，透明质酸钠分子量：1.35×106DA，蛋白、重金属均未检出，精滤液体积与浓缩前相比缩小了5倍，进而醇沉步骤乙醇用量减少了80％。
实施例5(采用再生后的复合吸附剂D1)
将实施例4使用后的新型复合吸附剂D1进行再生后套用，再生方法为：将使用后的复合吸附剂D1放入钳干锅中，先在低温下加热至蒸汽除尽后，再放入750℃马弗炉内烧5h，取出放入干燥器中晾凉后使用。反复再生套用10批，实验条件同实施例4，结果如表4所示。
表4
对比例1(采用普通硅藻土吸附除杂、CATB络合以及树脂去除金属离子)
采用普通硅藻土进行吸附除杂、CATB络合、树脂分离纯化，从透明质酸发酵液中提取制备透明质酸钠产品的方法，具体步骤如下：
(1)往500mL透明质酸发酵液中加入3倍体积去离子水搅拌均匀以将透明质酸发酵液的粘度控制在3.3Pa.s，在溶解液中加入3g/L的硅藻土和2g/L的活性炭，在50℃条件下搅拌两小时后，过滤，得到滤液，向滤液中加入10％CTAB进行络合，加入量为HA:CTAB＝1:2.5(g/g)，搅拌络合后，过滤得到络合物。
(2)加入0.8M的氯化钠溶液至原发酵液体积，200rpm下搅拌解离24h，将解离液以2.0BV/h过层析柱后，收集过柱液，过柱液检测结果：蛋白0.03mg/mL，Hg2+、Gu2+、Fe3+、Mg2+未检出，Zn2+：0.97mg/mL，As2+：3.8mg/mL，Cd2+：1.6mg/mL，Pb2+：0.24mg/mL，Ca2+：6.62ppm，透光率96.23％。
(3)向过柱液中流加95％乙醇1500mL，加量为HA溶液:乙醇＝1:3(v/v)，同时以150rpm搅拌，流加15～20％(质量百分比)氯化钠溶液，直至有白色小絮状物出现，搅拌30min后离心干燥，干燥后得到透明质酸钠成品，固体坚硬，所得成品折干含量92.3％，透光率98.1％，收率84.2％，水分7.8％，蛋白0.08％、重金属Zn2+：5ppm，As2+：2.5ppm，Cd2+：2ppm，Pb2+：3.9ppm，Ca2+：2.21ppm，其它均未检出，透明质酸钠分子量：1.1×106DA。
对比例2(采用硅藻土吸附除菌体蛋白、超滤膜过滤除金属离子)
采用硅藻土吸附除菌体蛋白、超滤膜过滤除金属离子，从透明质酸发酵液中提取制备透明质酸钠产品的方法，具体步骤如下：
量取1000mL透明质酸发酵液，缓慢加入2L 95％乙醇，并搅拌，静置沉淀2～3h；取出沉淀物透明质酸，加入乙醇充分脱水，乙醇用量2L，将所得粗品加入6倍蒸馏水溶成0.1％浓度，溶解后体积6.6L，待沉淀完全溶解后加入1％活性炭，50℃下搅拌2h，再加入1％的硅藻土搅拌均匀，用预铺有硅藻土的板框压滤至澄清，在0.2MPa下采用截留分子量为30,000nm的PVDF超滤膜进行超滤，将超滤后的浓缩液排出，浓缩液体积5.05L，浓缩液检测结果：蛋白0.05mg/mL，Hg2+、Mg2+、Ca2+、Fe3+未检出，As2+：3.8mg/mL，Cu2+：1.8mg/mL，Cd2+：1.6ppm，Pb2+：0.24ppm，Zn2+：0.8mg/mL，透光率97.08％。
在浓缩液中加入0.8mol氯化钠搅拌至溶解，再加入浓缩液体积的1.5倍乙醇沉淀至酒精度52％，静置分出上层清液，底料用底料体积80％乙醇洗涤两次，再用无水乙醇脱水两次后烘干即得透明质酸钠，所得成品折干含量93.8％，透光率97.9％，收率70.8％，水分7.4％，蛋白：0.02％，重金属Zn2+：10ppm，Gu2+：11ppm，透明质酸钠分子量：1.4×106DA，透明质酸产品色泽为偏暗，为坚硬颗粒状。
对比例3(采用珍珠岩粉)
将实施例1中的复合吸附剂D1置换为同等质量的珍珠岩粉，其余条件同实施例1。步骤(1)所得滤液体积4850mL，蛋白质：0.57mg/mL，Gu2+、Zn2+、As2+未检出，Hg2+：0.98mg/mL，Mg2+：0.52mg/mL，Ca2+：0.72mg/mL，Cd2+：0.01mg/mL，Pb2+：0.3mg/mL，Fe3+：0.73mg/mL，透光率95.08％，滤液为深黄色。步骤(2)得精滤液体积4680mL，蛋白质：0.48mg/mL，Gu2+、Zn2+、As2+、Cd2+未检出，Hg2+：0.88mg/mL，Mg2+：0.45mg/mL，Ca2+：0.66mg/mL，Pb2+：0.25mg/mL，Fe3+：0.63mg/mL，透光率96.38％，滤液为黄色。步骤(3)所得成品折干含量80.02％，透光率95.5％，收率78％，水分7.5％，透明质酸钠分子量：1.45×106DA，蛋白质：1.2mg/g，重金属：Gu2+、Zn2+、As2+、Cd2+未检出，Hg2+：20.5ppm，Mg2+：23.3ppm，Ca2+：6ppm，Pb2+：1.51ppm，Fe3+：4.8ppm，透明质酸钠结晶品色泽为淡黄色，颗粒坚硬。
对比例4(采用沸石粉)
将实施例1中的复合吸附剂D1置换为同等质量的沸石粉，其余条件同实施例1。步骤(1)所得滤液体积4700mL，蛋白质：0.66mg/mL，Gu2+、Zn2+、As2+未检出，Hg2+：0.68mg/mL、Mg2 +：0.48mg/mL，Ca2+：0.59mg/mL，Cd2+：0.05mg/mL，Pb2+：0.22mg/mL，Fe3+：0.55mg/mL，透光率96.13％，滤液为黄色，过滤速率慢。步骤(2)所得精滤液体积4530mL，蛋白质：0.44mg/mL，Gu2+、Zn2+、As2+、Cd2+未检出，Hg2+：0.32mg/mL，Mg2+：0.25mg/mL，Ca2+：0.55mg/mL，Pb2+：0.18mg/mL，Fe3+：0.14mg/mL，透光率97.33％，滤液为黄色，过滤速率较慢步骤(3)所得成品折干含量84.22％，透光率96.25％，收率65％，水分7.3％，透明质酸钠分子量：1.43×106DA，蛋白质：1.15mg/g，重金属：Gu2+、Zn2+、As2+、Cd2+、Pb2+未检出，Hg2+：18.3ppm，Mg2+：21.5ppm，Ca2+：15.3ppm，Pb2+：5.60ppm，Fe3+：4.52ppm，透明质酸钠结晶品微带黄色。
对比例5(采用制备例1步骤(2)所得的凝胶壳聚糖树脂)
将实施例1中的复合吸附剂D1置换为同等质量的制备例1步骤(2)制备得到的凝胶壳聚糖树脂，其余条件同实施例1。步骤(1)所得滤液体积4900mL，蛋白质：0.36mg/mL，Gu2+、Zn2+、As2+、Cd2+未检出，Hg2+：0.49mg/mL，Mg2+：0.48mg/mL，Ca2+：0.50mg/mL，Pb2+：0.21mg/mL，Fe3+：0.35mg/mL，透光率96.43％，滤液为黄色。步骤(2)所得精滤液体积4850mL，蛋白质：0.40mg/mL，Gu2+、Zn2+、As2+、Cd2+未检出，Hg2+：0.32mg/mL，Mg2+：0.32mg/mL，Ca2+：0.31mg/mL，Pb2+：0.10mg/mL，Fe3+：0.24mg/mL，透光率97.93％，滤液为黄色。步骤(3)所得成品折干含量89.92％，透光率97.95％，收率80.23％，水分7.3％，透明质酸钠分子量：1.42×106DA，蛋白质：1.15mg/g，重金属：Gu2+、Zn2+、As2+、Cd2+未检出，Hg2+：12.8ppm，Mg2+：16.5ppm，Ca2+：3.3ppm，Pb2+：0.52ppm，Fe3+：0.31ppm，透明质酸钠结晶品微带黄色。
对比例6(同时采用未经复合的沸石粉、珍珠岩粉、制备例1步骤(2)所得的凝胶壳聚糖树脂三种吸附剂)
将实施例1中的复合吸附剂D1置换为同等质量的混合吸附剂，所述混合吸附剂由沸石粉、珍珠岩粉和制备例1步骤(2)所得的凝胶壳聚糖树脂按质量比40:60:1简单干混而得，实验条件同实施例1。步骤(1)所得滤液体积4780mL，蛋白质：1.58mg/mL，Zn2+、As2+、Cd2+未检出，Cu2+：0.32mg/mL，Hg2+：0.49mg/mL，Mg2+：0.88mg/mL，Ca2+：0.90mg/mL，Pb2+：0.91mg/mL，Fe3+：1.22mg/mL，透光率93.5％，滤液为深黄色，过滤速率慢。步骤(2)所得精滤液体积4650mL，蛋白质：0.91mg/mL，Zn2+、As2+、Cd2+未检出，Gu2+：0.11mg/mL，Hg2+：0.38mg/mL，Mg2+：0.82mg/mL，Ca2+：0.71mg/mL，Pb2+：0.02mg/mL，Fe3+：0.44mg/mL，透光率94.54％，滤液为黄色，过滤速率慢。步骤(3)所得成品折干含量77.92％，透光率96.85％，收率81.23％，水分7.9％，透明质酸钠分子量：1.45×106DA，蛋白质：1.02mg/g，重金属：Gu2+、Zn2+、As2+、Cd2+、Pb2+未检出，Hg2+：22.8ppm，Mg2+：26.5ppm，Ca2+：15.3ppm，Fe3+：2.31ppm，透明质酸钠结晶品微带黄色，颗粒坚硬。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。
Claims (10)
1.一种沸石珍珠岩粉凝胶壳聚糖树脂吸附剂，其特征在于，所述沸石珍珠岩粉凝胶壳聚糖树脂吸附剂包括凝胶壳聚糖树脂以及负载于凝胶壳聚糖树脂上的沸石粉和珍珠岩粉；
所述凝胶壳聚糖树脂的制备方法包括以下步骤：
S11、将壳聚糖溶解于稀酸溶液中，得到壳聚糖稀酸溶液；
S12、将金属氢氧化物溶液与交联剂混合均匀，得到固化溶液；
S13、在搅拌条件下，将壳聚糖稀酸溶液缓慢滴加到固化溶液中，待滴加完毕后过滤，将过滤后所得湿树脂水洗至中性后脱色，所得脱色树脂经干燥后得到凝胶壳聚糖树脂。
2.根据权利要求1所述的沸石珍珠岩粉凝胶壳聚糖树脂吸附剂，其特征在于，
步骤S11中，所述稀酸溶液选自盐酸溶液、醋酸溶液、草酸溶液和磷酸溶液中的至少一种；优选地，所述稀酸溶液的浓度为0.5～5％v/v；优选地，所述壳聚糖和稀酸溶液的用量使所得壳聚糖稀酸溶液的浓度为0.01～5％；
任选地，步骤S12中，所述金属氢氧化物溶液中的金属氢氧化物为氢氧化钾和/或氢氧化钠；优选地，所述金属氢氧化物溶液的浓度为1～30％w/v；优选地，所述交联剂选自甲醛、戊二醛和环氧氯丙烷中的至少一种；优选地，所述交联剂的加入量为固化溶液总体积的0.1～0.5倍；
任选地，步骤S13中，所述脱色的方式为将水洗所得中性树脂采用丙酮浸渍；优选地，所述丙酮的用量为中性树脂总体积的1～10％v/v；优选地，所述浸渍的条件包括温度为室温，时间为1～5h。
3.权利要求1或2所述的沸石珍珠岩粉凝胶壳聚糖树脂吸附剂的制备方法，其特征在于，该方法包括将沸石粉和珍珠岩粉负载于凝胶壳聚糖树脂上。
4.根据权利要求3所述的沸石珍珠岩粉凝胶壳聚糖树脂吸附剂的制备方法，其特征在于，将沸石粉和珍珠岩粉负载于凝胶壳聚糖树脂上的方式包括以下步骤：
S21、将粒径为100目以下的沸石粉和珍珠岩粉共同置于稀酸溶液A中进行浸泡处理，待浸泡完毕后水洗至中性，烘干，得到沸石粉-珍珠岩粉复合物；
S22、将所述沸石粉-珍珠岩粉复合物与凝胶壳聚糖树脂于稀酸溶液B中搅拌混合均匀，再将所得混合物滴入碱性溶液中，之后将所得负载后凝胶壳聚糖沸石珍珠岩粉小球水洗至中性后烘干并过筛，即得沸石珍珠岩粉凝胶壳聚糖树脂吸附剂。
5.根据权利要求4所述的沸石珍珠岩粉凝胶壳聚糖树脂吸附剂的制备方法，其特征在于，步骤S21中，所述沸石粉和珍珠岩粉的质量比为1:(0.5～5)；优选地，所述浸泡的条件包括温度为室温，时间为2～10h；优选地，所述稀酸溶液A的浓度为0.1～10mol·L-1；
任选地，步骤S22中，所述沸石粉-珍珠岩粉复合物、凝胶壳聚糖树脂与稀酸溶液B的用量比为(50～300)g:1g:(100～3000)mL；优选地，所述稀酸溶液B的浓度为0.1～10mol·L-1；优选地，所述搅拌混合均匀的条件包括温度为10～60℃，时间为1～10h；优选地，所述碱性溶液为氢氧化钠溶液和/或氢氧化钾溶液；优选地，所述碱性溶液的浓度为0.1～10mol·L-1。
6.权利要求1或2所述的沸石珍珠岩粉凝胶壳聚糖树脂吸附剂在透明质酸纯化中的应用。
7.一种透明质酸的纯化方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：
S31、透明质酸解离：将粘度为0.1～5Pa.s的透明质酸发酵液采用氯化钠进行解离，得到透明质酸钠解离液；
S32、除杂：将复合吸附剂A加入到步骤S31所得透明质酸钠解离液中进行搅拌吸附初次除杂，初次除杂完毕后进行第一次过滤，所述第一次过滤以复合吸附剂B作为过滤介质，得到除杂液；
S33、将所述除杂液的pH值调节至碱性进行降解，待降解完毕后，往所得降解液中加入复合吸附剂C进行搅拌吸附深度除杂，深度除杂完毕后进行第二次过滤，所得滤液的pH值调节至6～8，得到透明质酸精滤液；所述复合吸附剂A、复合吸附剂B和复合吸附剂C均为权利要求1或2所述的沸石珍珠岩粉凝胶壳聚糖树脂吸附剂。
8.根据权利要求7所述的透明质酸的纯化方法，其特征在于，
步骤S31中，所述氯化钠的用量与透明质酸发酵液的比例为(0.01～5.0)g:1mL；优选地，所述解离的条件包括温度为30～60℃，时间为0.5～2h；
任选地，步骤S32中，所述复合吸附剂A的用量为透明质酸钠解离液体积的0.01～10％；所述搅拌吸附初次除杂的条件包括温度为30～60℃，时间为0.5～5h；优选地，所述第一次过滤的条件包括过滤介质铺板量为反应液总体积的0.5～5％，过滤速率为20～30L/h，过滤压力为0.1～0.3MPa；
任选地，步骤S33中，所述pH值调节所采用的试剂为碱液；优选地，所述碱液为氢氧化钠溶液；优选地，所述碱液的浓度为0.1～20mol·L-1；优选地，所述降解的条件使所得降解液的数均分子量为1.0×106～2.0×106Da；优选地，所述复合吸附剂C的用量为降解液体积的0.1～10％；优选地，所述第二次过滤所采用的滤膜的孔径为0.1～10μm。
9.一种透明质酸的生产方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：
S41、将微生物发酵法所得透明质酸发酵液的粘度调节至0.1～5Pa.s；
S42、将粘度为0.1～5Pa.s的透明质酸发酵液采用权利要求7或8所述的方法进行纯化，得到透明质酸精滤液；
S43、将透明质酸精滤液进行浓缩，所得浓缩液进行醇沉析晶后过滤，所得滤饼烘干后得到透明质酸钠晶体。
10.根据权利要求9所述的透明质酸的生产方法，其特征在于，
步骤S43中，所述浓缩在夹套式耦合MVR搅拌式多效蒸汽釜中进行，所述夹套式耦合MVR搅拌式多效蒸汽釜包括换热器、低压蒸汽釜、高压蒸汽釜、闪蒸罐-1、闪蒸罐-2和压缩机，所述换热器的出口与低压蒸汽釜的塔顶连接，所述低压蒸汽釜的塔釜与高压蒸汽釜的塔顶连接，所述低压蒸汽釜的夹套出口与闪蒸罐-2的入口相连，所述闪蒸罐-2的出口经由压缩机与高压蒸汽釜的夹套入口连接，所述高压蒸汽釜的夹套出口与闪蒸罐-1的入口相连，所述闪蒸罐-1的出口与低压蒸汽釜的夹套入口相连；所述透明质酸精滤液经换热器加热至45～55℃后依次送入低压蒸汽釜和高压蒸汽釜进行浓缩，所述低压蒸汽釜内的压力控制在50～60kPa，所述高压蒸汽釜内的压力控制在70～80kPa，最终所得浓缩液从高压蒸汽釜的塔釜排出进行醇沉析晶；所述低压蒸发釜产出的二次蒸汽先经由闪蒸罐-2回收部分蒸汽再经由压缩机加压升温后作为高压蒸汽釜内的发热源，所述高压蒸发釜产生的二次蒸汽经闪蒸罐-1回收部分蒸汽后作为低压蒸发釜的热源；
步骤S43中，所述醇沉析晶的方式为往浓缩液中加入1～2倍体积的浓度为90％以上的乙醇搅拌醇沉后静置，待上清液清澈时将上层分出，剩余底料中加入1～1.5倍体积的浓度为70％～80％的乙醇搅拌醇沉后静置，待上清液清澈时将上层分出，剩余底料中再次加入1～1.5倍体积的浓度为90％以上的乙醇搅拌醇沉；
优选地，所述烘干的条件包括温度为30℃～60℃，时间为8h～24h。
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