BR102016030092A2 - processo de produção de exopolissacarídeo a partir de mortierella ssp por fermentação submersa utilizando meio de cultura de baixo custo - Google Patents

Abstract

a presente invenção consiste na utilização de um meio de cultura de baixo custo contendo ureia, sulfato de amõnio e nitrato de amõnio como fontes de nitrogênio numa relação c/n de 10-20 com relação a glicose como fontes de carbono, para a produção de exopolissacarídeo de potencial uso nas indústrias farmacêutica, alimentícia e cosmética. a biomassa obtida nesses cultivos pode usada diretamente como um componente de alto teor de pifas para outros fins (nutrição animal) ou ser processado para a extração de óleos, sendo usado como ingrediente para a formulação de alimentos ou suplementos nutracêuticos.

Description

(54) Título: PROCESSO DE PRODUÇÃO DE EXOPOLISSACARÍDEO A PARTIR DE MORTIERELLA SSP POR FERMENTAÇÃO SUBMERSA UTILIZANDO MEIO DE CULTURA DE BAIXO CUSTO (51) Int. Cl.: C12P 19/04; C12P 1/02; C12R 1/645 (73) Titular(es): UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARANÁ (72) Inventor(es): CARLOS RICARDO SOCCOL; JÚLIO CÉSAR DE CARVALHO; LUIS DANIEL GOYZUETA MAMANI (85) Data do Início da Fase Nacional:

21/12/2016 (57) Resumo: A presente invenção consiste na utilização de um meio de cultura de baixo custo contendo ureia, sulfato de amõnio e nitrato de amõnio como fontes de nitrogênio numa relação C/N de 10-20 com relação a glicose como fontes de carbono, para a produção de exopolissacarídeo de potencial uso nas indústrias farmacêutica, alimentícia e cosmética. A biomassa obtida nesses cultivos pode usada diretamente como um componente de alto teor de PIFAS para outros fins (nutrição animal) ou ser processado para a extração de óleos, sendo usado como ingrediente para a formulação de alimentos ou suplementos nutracêuticos.

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PROCESSO DE PRODUÇÃO DE EXOPOLISSACARÍDEO A PARTIR DE MORTIERELLA SPP POR FERMENTAÇÃO SUBMERSA UTILIZANDO MEIO DE CULTURA DE BAIXO CUSTO.

Campo da Invenção (01) A presente invenção trata da produção de exopolissacarídeo (EPS) produzido peio fungo filamentoso Mortierella alpina por fermentação submersa utilizando meio de cultura de baixo custo, sendo um processo adequado para produção industrial devido ao grande potencial do EPS para diversas aplicações na indústria médica, farmacêutica, alimentar e cosmética. O processo proposto também apresenta como vantagem a utilização de outros produtos gerados, tais como biomassa rica em ácidos graxos poli-insaturados (PUFAs)

Histórico da Invenção (02) O uso de EPSs de diversos microrganismos, especialmente bactérias, tem sido muito bem estudado nos últimos cinquenta anos: mas são poucos os EPSs caracterizados e bem estudados produzidos por fungos filamentosos, Nesta patente relata-se a produção pelo zygomiceto Mortierella spp.

(03) Os polissacarídeos são macromoléculas compostas por unidades de carboidratos, exopolissacarídeos são polissacarídeos extracelulares ligados à superfície celular e/ou que são excretados. Podem ser divididos em dois tipos de acordo a sua composição: Heteropolissacarídeos e Homopolissacarídeos (Barbosa, Cunha, Pigatto, & Corradi, 2004). A atividade do exopolissacarídeos pode ser afetada por determinadas características químicas como a sua composição, ligação glicosídica, grau de ramificação.

2/9 (04) As aplicações atribuídas aos exopolissacarídeos são numerosas, entre os mais comercialmente conhecidas na indústria alimentícia são: os ágares, xantanas, dextranas, alginatos, e gelanas que são produzidos por bactérias e são usados como agentes espessantes, gelificantes e emulsificantes. EPS de fontes fúngicas ligninolítica são utilizados para a imobilização de enzimas e fármacos (Maziero, Cavazzoni, Lúcia, Bononi, & Industriale, 1999). A aplicação dos EPS como agentes anti-tumorais (como por exemplo as D-glucanas do tipo β(1—>3)) tem sido foco de pesquisas desde o seu descobrimento (Chan, Chan, & Sze, 2009) assim como as suas propriedades anticarcinogênicas, anti-inflamatorias, cosmética e imunológicas.

(05) Entre os fungos filamentos estudados encontram-se o

Aurobasideum pulíulans que produz pululana em uma concentração de 23 g/L em cultivo submerso (Roukas & Liakopoulou-kyriakides, 1999). Este EPS apresenta uma resistência ao óleo e forma filmes com baixa permeabilidade ao oxigênio, aplicado para o revestimento de alimentos para a sua preservação. Atualmente é utilizado também como um alimento prebiótico. Paeciiomyces japonica produz EPS com características antitumorais, hipoglicemicas e immuno-estimuladoras, aumentando os níveis de histamina no sangue (Shin, Lim, Lee, & Lee, 2001). O fungo filamentoso Sclerotium rolfsíi produz um tipo de EPS ramificado (β-D-glucana 1—>3:1—>6) estudada por (Molina & Perotti, 1998) devido às suas propriedades imunológicas assim como sua utilidade na recuperação de óleos. Estudos de produção de ramnagalactana pelo fungo endofítico Fusarium solani SDS5, foram executados por (Mahapatra & Banerjee, 2012) concluindo com um potencial na atividade anti-inflamatoria e antialérgica in vltro.

(0ó) É por esses motivos e benefícios que surge a presente invenção, que apresenta uma alternativa de produção de exopolissacarídeo

3/9 para múltiplos propósitos, como os mencionados anteriormente, empregando um meio de cultura de baixo custo através do cultivo de Mortierella spp.

Descrição do Estado da Técnica (07) O exopolissacarídeo de fungo do gênero Mortierella spp.

tem sido pouco estudado, caracterizado e aplicado, na pesquisa de Ruiter, Lugt, & Rombouts, 1993, diferentes EPSs de diversas cepas de Mortierefla foram caracterizados determinando uma composição de ácido glicurónico e fucose, importantes para desintoxicação das células. (Campos-Takaki & Díetrich, 2009) caracterizaram polissacarídeos componentes da parede celular de M. alpina, determinando quitina e quitosana - o segundo mais importante polissacarídeo produzido no mundo - como principais constituintes, que são atualmente utilizadas na formulação de suplementos alimentícios (agente espessante, preservante) , tratamento de águas residuais (agente floculante) , cosmética (tratamento de acne, umectante, etc) e biofarmacêutico (antitumoral, imunológico, anticoagulante, hemostático e bacteriostático).

(08) O gênero Mortierella é atualmente a fonte clássica de óleos ricos em ácidos graxos poli-insaturados (PUFAS), mas pouco se conhece sobre a produção de EPS. O óleo de M. alpina é rico em ácido docosahexaenóico (DHA) e ácido araquidônico (ARA) e obteve o grau GRAS - do inglês Generally Recognized as Safe - em maio de 2001 pela Food and Drug Administration (FDA) para seu uso em alimentos nos Estados Unidos da América.

(09) Mortierella alpina cultivada em meio com base em glicose e extrato de levedura (GY) por 7 dias a 28°C a 240 RPM numa incubadora agitada apresenta a seguinte composição: 10,75% de fibra crua, 40,95% de proteína, 3,98% de cinzas totais, 3,88% de umidade, 3,57% de carboidratos e 36,87% de ácidos graxos totais dos quais 35,6% é ácido araquidônico (Nisha, A., Rastogi, N. K., &Venkateswaran, G. 2011). Segundo (Campos-Takaki & Díetrich, 2009) o teor médio de quitina/quitosana e de polifosfato inorgânico na parede celular de Mortierella é de 40% e 20% aproximadamente. A composição de ácidos graxos em Mortierella alpina pode ser manipulada variando as condições de fermentação (por exemplo, agitação, oxigenação, pH, etc.).

(10) Os ácidos graxos, especialmente os PUFAs, desempenham um rol importante no desenvolvimento e funcionamento do cérebro, precursores de mediadores biológicos como os envolvidos na modulação da resposta inflamatória, liberação de citocinas, agregação plaquetária, resposta imune e trombose (Uauy, Mena, & Rojas: 2000).

(11) Quanto à segurança no consumo direto da biomassa de M. alpina, existe um estudo crítico subcrônico sobre sua administração em cobaias (Nisha, Muthukumar, & Venkateswaran, 2009), onde os autores confirmam a inocuidade da administração da biomassa após processo de esterilização, nestes resultados indicam uma influência positiva no desenvolvimento devido aos ácidos graxos constituintes, sem efeitos tóxicos.

(12) Para a produção de EPS, é necessário o correto desenvolvimento da biomassa, isto é conseguido empregando o meio de cultura propício. Após este processo é necessário a remoção da biomassa do meio de cultura líquido, por exemplo por filtração. O filtrado (meio de cultura que contém o EPS) é submetido a um processo de evaporação, para conseguir concentrar o EPS e remover água. Em seguida, o EPS é recuperado por um processo de precipitação utilização solventes tais como etanol, acetona, propanona, metanol. O EPS precipitado é recuperado após processo de centrifugação, ressuspendido e purificado por processo de diálise. Finalmente, o EPS resultante é desidratado empregando técnicas de liofilização, spray-drying ou outra técnica não térmica (com a finalidade de conservar a sua composição) e formulada para a sua correspondente analise, avaliação e aplicação.

(13) A biomassa resultante após processo de filtração, é lavada para remoção de restos do meio de cultura, filtrada a vácuo, e secada

5/9 para a determinação do perfil lipídico e obtenção do óleo bruto do fungo filamentoso.

Citação das Figuras (14) A figura 1 ilustra os passos para a produção de EPS de Mortierelia spp. assim como da produção de biomassa rica em PUFAs.

(15) Representa o inóculo necessário para iniciar o processo de fermentação submersa; (2) o meio de cultura propício para o correto desenvolvimento da biomassa e produção de EPS; (3) processo de fermentação submersa; (4) remoção da biomassa; (5) concentração do EPS; (6) água evaporada resultante da concentração; (7) Precipitação do EPS; (8) centrifugação do EPS; (9) Solvente recuperado após processo de centrifugação; (10) purificação do EPS; (11) secagem; (12), formulação; (13) lavagem da biomassa; (14) sais e resíduos do meio de cultura remanescentes após processo de lavagem; (15) secagem da biomassa; (16) extrusão da biomassa; (17) extração de lipídeos por solventes; (18) biomassa remanescente após extração por solventes; (19) processo de dessolventização do óleo bruto; (20) solvente recuperado e (21) Óleo bruto de Mortierelia spp.

Descrição Detalhada da Invenção (16) Nessa seção são detalhadas as fases para a produção de EPS de Mortierelia spp.

(17) A partir de culturas estoque das cepas do gênero Mortierelia, são produzidos inóculos (1) em escala laboratorial, de acordo com particularidades do gênero, em frascos de erlenmeyer de 250 ml contendo 100

6/9 ml de meio contendo de glicose (de 0,2 α 20% da composição) e de extrato de levedura (constituindo 0,1 a 10% da composição), pH ajustado a 6,0 e esterilização por autoclavagem a 121°C por 15 minutos, Esse meio é inoculado com 3 discos de culturas estoques (placas de petri com o microrganismo ativado) e incubados a 25°C por 72 horas em um shaker orbital com uma agitação de 120 rpm. Após o processo de incubação, 10% v/v da suspensão obtida da homogeneização mecânica assepticamente, é utilizado como inóculo nas fermentações. O inóculo pode ser armazenado em refrigeração por até 5 dias. O meio de cultura (2) é fundamental para a produção e rendimento de EPS, porém, o meio de cultura foi otimizado, determinando as fontes de carbono, nitrogênio, fosfato e potássio como fatores significativos para o rendimento total. A glicose foi selecionada como melhor fonte de carbono, nitrogênio (sulfato de amônio, ureia, nitrato de amônio), fósforo (fosfato monobássico e dibássico de potássio, fosfato de amônio) e potássio (cloreto de potássio, nitrato de potássio); todos estes componentes foram dissolvidos em água, ajustados a pH 6,5, autoclavados a 120^aC por 15 minutos. O processo de fermentação submersa (3) é realizado usando um ajuste do teor de umidade de forma que a atividade água se situe entre 0,7 e 1. Após a fermentação submersa, reaiiza-se uma etapa de separação de sólidos (4), resultando uma solução de EPS que segue para concentração (5) e biomassa que segue para posterior processamento (13). A solução de EPS é concentrada (5) por evaporação, ultrafiltraçâo outra etapa de remoção de solvente, preferencialmente a baixa temperatura. O EPS da solução resultante é precipitado (7) usando solvente escolhido entre metanol, etanol, propanol, ou acetona, a frio, por um período de 18h. Após a precipitação, remove-se o sobrenadante (9) que pode ser concentrado e reutilizado, e procede-se à ressolubilização do EPS e purificação por diálise (10) para evitar contaminação por qualquer sal mineral remanescente do processo de fermentação. Finalmente, o EPS é concentrado e desidratado por liofilização ou spray-drying, e caracterizado para a sua correspondente formulação.

7/9 (18) Paralelamente a este processo, a biomassa remanescente da produto da filtração (4), com alto teor lipídico, majoritariamente PUFAS, é desidratada em secador (biomassa apta para formulação de suplementos nutricionais para ração animal ou de peixes) ou pode ser pós-processada para extração por solventes de óleo rico em PUFAs.

Exemplos (19) A produção de EPS de Mortierella spp. ê realizada em bioreatores de bancada de uma capacidade volumétrica de 10-L com um volume de 5,4 L do meio de cultura contendo como fonte de nitrogênio (sulfato de amônio, ureia ou nitrato de amônio) e glicose como fonte de carbono, em uma relação de C/N de 10-20. Sais minerais foram suplementados de acordo ao meio de cultura Hasson e Dostalek (1988) modificado por Mamani (2014); O meio de cultura final é autoclavado a 121°C por 45 minutos, previa adição de anti-espumante, pH ajustado a 6,0 com uma taxa de inoculação de 10% v/v, agitação de 120 rpm, e aeração de 1 VVM, a 25°C por 7 dias. Após o processo de fermentação obtêm-se uma concentração de EPS de 1 g/L de meio de cultura e um total de biomassa superior a 25 g/L, com um teor lipídico superior a 20% correspondendo 40% deste teor à concentração de PUFAS, (20) 10 L de meio de cultura previamente filtrados a vácuo após o processo de fermentação, são concentrados por técnicas de evaporação utilizando um rota-evaporador a 45° C por 3h ou ultrafiltração empregando membranas de 10000 a 20000 Da. A água filtrada (aproximadamente 3L) é descartada e o retido é submetido a um processo de precipitação utilizando 28 L de etanol frio por 18h. Seguidamente, a suspensão é centrifugada a 4600xg, 10°C por 10 minutos, o EPS sedimentado é retirado, dialisado e liofilizado até obter um produto sólido livre de sais minerais. Finalmente 10 g de EPS de

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Mortierella spp. são obtidos para a sua posterior caracterização, por analise de FT-IR, DRX, DSC, TGA, MEV, RMN e formulação. A biomassa resultante do processo de filtração anteriormente mencionada é desidratada a 60°C até alcançar peso constate, tendo seu teor lipídico avaliado por uma extração pelo método de Bligh-dyer (1959) e os ácidos graxos por cromatografia gasosa. Essa biomassa de M. alpina é triturada e submetida a uma extração sólidolíquido empregando hexano de grau alimentício numa proporção de 1 L por cada 200 gramas de biomassa seca a temperatura ambiente a agitação constante, por duas horas. A suspensão é filtrada, o filtrado é evaporado para a recuperação do solvente obtendo óleo cru do microrganismo oleaginoso. A biomassa retida pode ser lavada e disponibilizada para ser adicionada na formulação de ração para nutrição animal.

REFERÊNCIAS

Barbosa, A. M., Cunha, P. D. T., Pigatto, M. M„ &. Corradi, L. (2004). Produção e Aplicações de Exopolissacarídeos Fúngicos Production and Applications of Fungai Exopolysaccharides. Ciências Exatas E Tecnológicas, 25(1), 29-41.

Campos-Takaki, M., & Dietrich, S. (2009). Characterization of cell walls from Mucoralean fungi by biochemical composition, transmission electron microscopy and X-ray microanalysis. In A. Mendez-Vilas (Ed.), Applied microbiology and microbiol biotechnofogy (pp. 121-125). Singapore: World Scientific.

Chan, G. C., Chan, W. K., & Sze, D. M. (2009). The effects of (3 -glucan on human immune and câncer cells, 11, 1-11. http://doi.org/10J 186/1756-8722-2-25 Mahapatra, S., & Banerjee, D. (2012). Structural elucidation and bioactivity of a novel exopolysaccharide from endophytic Fusarium solani SD5. Corbohydrate Polymers, 90(1), 683-689.

http://doi.org/10.1016/j.carbpol.2012.05.097

Maziero, R., Cavazzoni, V., Lúcia, V., Bononi, R., & Industriale, S. M. (1999).

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SCREENING OF BASIDIOMYCETES FOR THE PRODUCTION OF EXOPOLYSACCHARIDE AND BIOMASS IN SUBMERGED CULTURE, 77-84.

Molina, O. E., & Perotti, N. I. (1998). High scleroglucan production by Sclerotium rolfsiin: Influence of médium, 20(9), 825-831.

Nisha, a., Muthukumar, S. P„ & Venkateswaran, G. (2009). Safety evaluation of arachidonic acid rich Mortierella alpina biomass in albino rats-A subchronic study. Regulatory Toxicology and Pharmacology, 53(3), 186-194.

http://doi.org/10.101 ó/j.yrtph.2009.01.002

Roukas, T., & Líakopoulou-kyriakides, M. (1999). Production of pullulan from beet molasses by Aureobasidium pullulans in a stirred tank fermentor, 40, 89-94. Ruiter, G. A. D. E., Lugt, A. W. V. A. N. B. D. E. R., & Rombouts, F. M. (1993).

Approaches to the classification of the Mortievella isabellina groupd: antigenic extracellular polysaccharides. Mycological Research (An International Journal of Fungai Biology), 97(6), 690-696, http://doi.org/10.1016/50953-7562(09)80149-4

Shin, K. U. K. H., Lím, S. S., Lee, S. H., & Lee, Y. S. I. L. (2001). Antioxidant and Immunostimulating Activities of the Fruiting Bodies of Paecilomyces japonica , a New Type of Cordyceps sp . Annals of the New York Acodemy of Science, 928, 261-273. http://doi.Org/10.l 111/j. 1749-6632.200l.tb05655.x

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Claims (14)

1. REIVINDICAÇÕES

   1. PROCESSO DE PRODUÇÃO DE EXOPOL1SSACARÍDEO A PARTIR DE MORTIERELLA SPP POR FERMENTAÇÃO SUBMERSA UTILIZANDO MEIO DE CULTURA DE BAIXO CUSTO, caracterizado pelo fato de que compreende as seguintes etapas e características:

   a. Preparação do inóculo

   b. Formulação do meio de cultura de baixo custo

   c. Fermentação submersa

   d. Separação da biomassa

   e. Concentração do EPS dissolvido

   f. Precipitação do EPS

   g. Centrifugação do EPS

   h. Recuperação do EPS

   i. Purificação do EPS

   j. Formulação

   k. Secagem da biomassa

   l. Extrusão da biomassa

   m. Extração da biomassa

   n. Dessolventização do óleo bruto

   o. Processamento do óleo bruto
2. 2. Processo, diferenciado pelo fato de que emprega-se fontes de nitrogênio e carbono de baixo custo.
3. 3. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de ser um processo de fermentação submersa.
4. 4. Processo, de acordo com as reivindicações 1 e 2, caracterizado pelo fato de que a biomassa obtida da fermentação pode ser utilizada para outros fins.

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5. 5. Processo, de acordo com as reivindicações 1 e 2, caracterizado pelo fato de utilizar como inóculo suspensão de microrganismos do gênero Mortierelía spp.
6. 6. Processo, de acordo com as reivindicações 1, 2 e 4, caracterizado pela adição de uma fonte de nitrogênio complementar de baixo custo, escolhida entre uréia, amônia, ou um sal contendo cátion amônio, ou um sal contendo ânion nitrato, ao meio de fermentação,
7. 7. Processo, de acordo com as reivindicações 1, 2 e 5, caracterizado pelo fato de que microrganismos filamentosos podem ser homogeneizados mecanicamente antes da inocuiação, de forma a aumentar a quantidade de unidades formadoras de colônias.
8. 8. Processo, de acordo com a reivindicação 1, em que o processo fermentativo é executado por um tempo de 3 a 10 dias, a uma temperatura entre 0 e 30°C , a um pH de 5 a 8, tensão de oxigênio de 20 a 90% da saturação, e agitação de 0 a lOOOrpm.
9. 9. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o EPS dissolvido é concentrado por evaporação ou ultrafiltração.
10. 10. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o EPS é precipitado utilizando um solvente escolhido entre acetona, metanol, etanol ou propanol.
11. 11. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o EPS é recuperando mediante centrifugação a 2000 a 20000xg, a -30 a 30°C.
12. 12. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o processo de purificação de EPS é realizado utilizando diafiltração.
13. 13. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o EPS é desidratado por liofilização ou spray-drying.

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14. 14. Processo, de acordo com as reivindicações 1, 2 e 4, caracterizada pelo fato de as células microbianas/biomassa produzidas terem teor lipídico superior a 25%.

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    FIGURA 1

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