TWI549970B - Purification of hyaluronic acid - Google Patents

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TWI549970B
TWI549970B TW100109192A TW100109192A TWI549970B TW I549970 B TWI549970 B TW I549970B TW 100109192 A TW100109192 A TW 100109192A TW 100109192 A TW100109192 A TW 100109192A TW I549970 B TWI549970 B TW I549970B
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Masanobu Kohsaka
Katsumi Ishige
Kazutoshi Hioki
Tsuyoshi Tsuji
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Denka Company Ltd
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    • C08B37/0072—Hyaluronic acid, i.e. HA or hyaluronan; Derivatives thereof, e.g. crosslinked hyaluronic acid (hylan) or hyaluronates

Description

玻尿酸之純化方法
本發明係關於玻尿酸類之純化方法、該純化方法所用之純化劑及活性碳、該等之製造方法。
玻尿酸除作為化妝品之保濕劑以外，亦作為眼科、整形外科、皮膚科等之醫藥品而使用。玻尿酸可藉由來自動物組織例如雞之雞冠、牛眼之玻璃體等之萃取物製造而成，但因混入作為夾雜物之硫酸軟骨素等，或因組織內所包含之玻尿酸酶(hyaluronidase)等易造成分子量降低，因此亦進行培養具有玻尿酸生產能力之微生物而由培養液製造玻尿酸(醱酵法)(非專利文獻1及專利文獻1)。
藉由萃取法或醱酵法所製造之玻尿酸中，存在作為雜質之蛋白質或發熱性物質等，因此研究將該等分離去除而獲取高純度之製品之方法。尤其是製造之初始階段的雜質之去除能減輕後序之純化步驟之負荷，而期待開發獲取亦可作為醫藥品使用之高純度之製品的方法。作為其例，例如揭示有藉由於醱酵液中添加醇等有機溶劑而析出玻尿酸並分離雜質之純化法，或使用陰離子交換樹脂自醱酵液中去除發熱性物質或蛋白質等之玻尿酸之純化法(專利文獻2)。
[非專利文獻1]Journal of General Microbiology,85,372-375,1976
[專利文獻1]日本專利特公平4-12960號公報
[專利文獻2]日本專利特開昭63-12293號公報
然而，於以工業規模獲取可作為注射液等醫藥品使用之高純度之玻尿酸類時，存在以下期望進一步改善之問題：(1)因於初始階段中雜質之去除不充分，而導致後序步驟之負荷較大；(2)操作煩雜而且玻尿酸類之回收率較低等。
本發明係鑒於上述情況而完成者，其目的在於提供一種簡便且高產率、以工業規模純化高純度之玻尿酸類之方法。另外，目的在於提供該純化方法所使用之純化劑、活性碳等及該等之製造方法。
本發明者等人為達成上述目的，對自玻尿酸類含有液高效率地分離去除雜質，簡便且高效率地純化高純度之玻尿酸類之方法進行各種研究，結果發現藉由使用利用特定預處理方法所製備之活性碳，可高效率地吸附去除雜質，最終完成本發明。
即，根據本發明，提供一種玻尿酸及/或其鹽之純化方法，其包括：使含有玻尿酸及/或其鹽及雜質之玻尿酸類溶液與活性碳懸浮液相接觸之步驟。利用該純化方法，藉由使用活性碳，可高效率地吸附去除雜質。
即，根據本發明，提供一種玻尿酸類之純化方法，其包括：使活性碳懸浮於水性液中而獲取活性碳懸浮液之步驟；將該活性碳懸浮液於100℃以上加熱20分鐘以上之步驟；將該加熱後之活性碳懸浮液攪拌冷卻之步驟；使包含玻尿酸類及雜質之玻尿酸類溶液與攪拌冷卻後之活性碳懸浮液相接觸之步驟。利用該純化方法，藉由使用已預處理成適合於玻尿酸類之純化之狀態的活性碳，可高效率地吸附去除雜質。
另外，根據本發明，提供一種玻尿酸類之純化劑之製造方法，其包括：使活性碳懸浮於水性液中而獲取活性碳懸浮液之步驟；將該活性碳懸浮液於100℃以上加熱20分鐘以上之步驟；將該加熱後之活性碳懸浮液攪拌冷卻之步驟。利用該製造方法，藉由將活性碳預處理成適合於玻尿酸類之純化之狀態，而可製造能高效率地吸附去除雜質之玻尿酸類之純化劑。
另外，根據本發明，提供一種活性碳之預處理方法，其包括：使活性碳懸浮於水性液中而獲取活性碳懸浮液之步驟；將該活性碳懸浮液於100℃以上加熱20分鐘以上之步驟；將該加熱後之活性碳懸浮液攪拌冷卻之步驟。利用該預處理方法，可將活性碳預處理成適合於玻尿酸類之純化之狀態。
另外，根據本發明，提供一種玻尿酸類之純化劑，其包含藉由包括以下步驟之方法而製造之活性碳：使活性碳懸浮於水性液中而獲取活性碳懸浮液之步驟；將該活性碳懸浮液於100℃以上加熱20分鐘以上之步驟；將該加熱後之活性碳懸浮液攪拌冷卻之步驟。該純化劑藉由包含已預處理成適合於玻尿酸類之純化之狀態的活性碳，而可高效率地吸附去除雜質。
 [術語之說明]
本說明書中之「玻尿酸類」包括：游離之玻尿酸及不損害本發明之目的之範圍內的可使用之任意玻尿酸鹽(例如鈉鹽、鉀鹽、鈣鹽、鋰鹽等金屬鹽，或鹽酸鹽、磷酸鹽、檸檬酸鹽等酸加成物等，但並不限定於此)或水合物、其等之混合物。此處，所謂玻尿酸，係指N-乙醯-D-葡糖胺與D-葡糖醛酸鍵結之二糖單元重複連鏈而成之高分子量多糖類，各種鹽主要指葡糖醛酸部分形成鹽之形態者。玻尿酸藉由可摺疊之鏈部分與D-葡糖醛酸部分之羧基的負電荷之相互作用，而容易於空間內展開，藉此可與大量之水結合而形成凝膠。另外，即便為低濃度，但分子間力亦較強，故仍具有相對較高之黏性。由於此種作用，例如具有濕潤關節之作用、柔軟皮膚之作用等，於生理性上亦發揮該等作用。
已知於玻尿酸類之中，分子量約200萬Da之玻尿酸鈉與分子量約80萬Da者相比，作為醫藥品，對治療變形性膝關節病、肩周炎、慢性類風濕性關節炎等發揮出優異之效果(藥理與治療，Vol.22、No.9、289(1994)；藥理與治療，Vol.22、No.9、319(1994))。另外，除此之外，已知有：作為外科手術後之防止黏連用之效果，進而亦於皮膚科領域、眼科領域中作為醫藥品之效果，一部分於臨床上普遍使用。於作為醫藥品使用之情形時，較理想為使用平均分子量為100萬以上之玻尿酸類。進而，考慮到獲取或操作之容易性，作為醫藥品較理想為平均分子量為100萬~500萬Da之玻尿酸類，尤其理想為平均分子量為150萬~400萬Da之玻尿酸類。另外，此種高分子量之玻尿酸類作為化妝品之用途使用時，亦因其較高之保濕力而發揮優異之效果。
溶解玻尿酸類作為醫藥品之注射用溶解液可適當使用：於注射用水、生理鹽水等中添加含有如酸、鹼、磷酸鹽之緩衝劑之pH值調整劑的普遍使用之注射用溶解液(例如各國藥典中所確認者)。
該等玻尿酸類可為藉由自動物組織萃取之萃取法所製造者，亦可為藉由使用玻尿酸生產微生物菌株醱酵而得之醱酵法所製造者。然而，於自動物組織萃取者中，其他黏多糖等雜質相對較多、分子量亦較小，故較理想為使用藉由醱酵法所獲取者。作為適合於本發明之醱酵法之一例，例如可使用鏈球菌屬之微生物以已知之方法獲取玻尿酸類。
本發明之方法等所使用之溶液較理想為原樣地使用培養液，當然，亦可使用藉由已知之方法例如離心分離或過濾處理等除菌之溶液。根據情況，亦可進行藉由透析處理去除低分子化合物、藉由微濾處理去除水不溶微粒子等操作，亦可使用添加醇等水溶性有機溶劑而析出純化玻尿酸者。另外，亦可使用藉由氧化鋁等所處理者。
本說明書中之「鏈球菌」包括：可生產玻尿酸之鏈球菌(Streptococcus)屬之任意的細菌‧其變異株。尤其較理想為使用如專利文獻2所揭示之馬鏈球菌FM-100(微工研菌寄第9027號)、日本專利特開平2-234689號公報所揭示之馬鏈球菌FM-300(微工研菌寄第2319號)之類高產率且穩定地生產玻尿酸之變異株。作為適合於生產玻尿酸之鏈球菌屬之細菌之例子，其他例如可列舉：馬鏈球菌(Streptococcus equi)、動物流行鏈球菌(Streptococcus zooepidemicus)、類馬鏈球菌(Streptococcus equisimilis)、壞乳鏈球菌(Streptococcus dysgalactiae)、釀膿鏈球菌(Streptococcus pyogenes)及該等之變異株等，但並不僅限定於此。
關於本說明書中之「平均分子量」，只要無特別鈙述，於表示玻尿酸類之平均分子量時，係指黏度平均分子量。可藉由業者通常進行之方法求得。較佳為可藉由各國之藥典等所普遍使用之測定方法求得，更佳為可藉由日本藥典所使用之測定方法求得。作為一例，例如其平均分子量可利用極限黏度[η]藉由下式求得，但並不限定於此。
[式1]
本說明書中之「活性碳」係指市售、普遍所使用之分離‧去除‧純化用之多孔狀碳，不限定於煤或木材等原料之來源或化學活化或水蒸氣活化等製法。進而，亦不限定於粉末活性碳、粒狀活性碳等形狀，或乾式、濕式等性狀。於本發明之方法等中，較理想為使用來源於木材之活性碳，但並不限定於此。另外，同樣較理想為使用藉由水蒸氣活化所製造者。另外，同樣較理想為使用粉末活性碳。
作為活性碳之具體例子，例如可列舉：Tsurumi Coal GL-30S、Tsurumi Coal HC-30S[以上為粒狀，鶴見煤炭(Tsurumi Coal)(股)製造]；白鷺WH5C8/32、白鷺LH2C20/48、白鷺WH2C8/32SS[以上為粒狀，武田藥品工業(股)製造]；白鷺A、白鷺P、純化白鷺、特性白鷺、Carbonraffin[以上為粉狀，武田藥品工業(股)製造]；北越SD、北越GSA[以上為粉狀，北越碳素工業(股)製造]；SLIVER-A、花F、雪A[以上為粉狀，大三工業(股)製造]等，但並不限定於此。
本說明書中之「雜質」係指除玻尿酸類、水以外之其他溶劑成分、無機鹽以外之物質，尤其係指於使用作為最終製品之玻尿酸類時可帶來不利之物質(發熱性物質等)。作為主要之雜質源，可列舉：於玻尿酸類之生產階段中來源於組織、微生物或培養液(培養基)者，或其後之純化階段中所混入者。作為本說明書中之雜質之例子，可列舉：組織或菌體、蛋白質、核酸、多糖類、低分子化合物、或內毒素等，但並不限定於此。作為雜質之組織或菌體分別包括：來源於萃取法中所使用之作為萃取原料之組織的組織片等，及醱酵法中所使用之微生物之菌體或菌體片等，但並不限定於此。作為雜質之蛋白質包括：來源於上述組織、菌之蛋白質，或生產後之步驟中所混入之蛋白質等，但並不限定於此。作為雜質之內毒素包括來源於上述菌之脂多糖類等，但並不限定於此。
本說明書中之「低分子化合物」係指較之玻尿酸類，分子量相對較小之化合物，例如指分子量為2000Da以下，或分子量1000Da，或分子量500Da以下之化合物，但並不限定於此。此種低分子化合物包括各種胺基酸、有機酸(例如乳酸)、糖(例如葡萄糖)等。
本說明書中之「水性液」係指將水作為主體(溶劑)之液體者，亦包括含有各種鹽、緩衝劑、少量有機溶劑等者。作為水性液，只要不損害本發明之目的，則可使用任意者，但就於使用作為最終製品之玻尿酸類時防止混入不必要之物質之觀點而言，較理想為水。
本說明書中之「攪拌冷卻」係指藉由將對象之液體連續攪拌而進行冷卻。此處，將完成攪拌冷卻後之溫度設為冷卻結束溫度。
本說明書中之「無塵環境」係指藉由進行空氣調節管理，使來源於環境之菌或內毒素等雜質對製品進行污染之可能性為極低之環境，尤其係指相當於醫藥(無菌、無內毒素)製品之製造環境。
作為無塵環境之一例，例如可列舉按以下方式規定對象物質之環境。
本說明書中之「去除」除將對象物質完全去除以外，亦包括部分去除(使該物質之量減少)。本說明書中之「純化」包括去除任意或特定之雜質。
本說明書中之「純化劑」係指吸附劑等用於純化之藥劑，所謂「物質A之純化劑」之表述係指用於純化物質A之藥劑。純化劑亦可為純化用組合物之形態。另外，同樣地去除劑、分離劑等亦分別係指用於去除之藥劑、用於分離之藥劑，例如，可為包括吸附劑或載體等之術語，亦可為去除用組合物、分離用組合物等形態。
關於本說明書中之各個數值範圍，分別包含「~」所表示之上限值及下限值。例如，「A~B」之表述係指A以上且B以下。另外，「含有...」包括「實質上由...形成」及「包含」。
[實施之形態]
本發明係關於例如以下之實施形態，但並不限定於此。
實施形態1
一種玻尿酸及/或其鹽之純化方法，其包括：使活性碳懸浮於水性液中而獲取活性碳懸浮液之步驟；將該活性碳懸浮液於100℃以上加熱20分鐘以上之步驟；將該加熱後之活性碳懸浮液攪拌冷卻之步驟；使包含玻尿酸及/或其鹽及雜質之玻尿酸類溶液與攪拌冷卻後之活性碳懸浮液相接觸之步驟。
實施形態2
一種玻尿酸及/或其鹽之純化劑之製造方法，其包括：使活性碳懸浮於水性液中而獲取活性碳懸浮液之步驟；將該活性碳懸浮液於100℃以上加熱20分鐘以上之步驟；將該加熱後之活性碳懸浮液攪拌冷卻之步驟。
實施形態3
一種活性碳之預處理方法，其包括：使活性碳懸浮於水性液中而獲取活性碳懸浮液之步驟；將該活性碳懸浮液於100℃以上加熱20分鐘以上之步驟；將該加熱後之活性碳懸浮液攪拌冷卻之步驟。
實施形態4
如實施形態1至3中任一項之方法，其中於上述攪拌冷卻之步驟中，冷卻結束溫度為60℃以下。
實施形態5
如實施形態1至4中任一項之方法，其中於上述攪拌冷卻之步驟中，攪拌冷卻係於溫度10~60℃下進行1小時以上。
實施形態6
如實施形態1至5中任一項之方法，其中上述步驟之至少一步驟以上係於無塵環境下進行。
實施形態7
如實施形態1至6中任一項之方法，其中玻尿酸及/或其鹽係藉由醱酵法而製造者。
實施形態8
如實施形態1至7中任一項之方法，其中上述玻尿酸及/或其鹽之分子量為350萬~700萬Da。
實施形態9
一種玻尿酸及/或其鹽之純化劑，其包含藉由包括以下步驟而製造之活性碳：使活性碳懸浮於水性液中而獲取活性碳懸浮液之步驟；將該活性碳懸浮液於100℃以上加熱20分鐘以上之步驟；將該加熱後之活性碳懸浮液攪拌冷卻之步驟。
以下就本發明之形態進行說明。
本發明之第一形態(例如實施形態1)係一種玻尿酸類之純化方法，其包括：使活性碳懸浮於水性液中而獲取活性碳懸浮液之步驟；將該活性碳懸浮液於100℃以上加熱20分鐘以上之步驟；將該加熱後之活性碳懸浮液攪拌冷卻之步驟；使包含玻尿酸及/或其鹽及雜質之玻尿酸類溶液與攪拌冷卻後之活性碳懸浮液相接觸之步驟。根據該純化方法，藉由使用已預處理成適合於玻尿酸類之純化之狀態的活性碳，而可高效率地吸附去除雜質。
本發明之第二形態(例如實施形態2)係一種玻尿酸類之純化劑之製造方法，其包括：使活性碳懸浮於水性液中而獲取活性碳懸浮液之步驟；將該活性碳懸浮液於100℃以上加熱20分鐘以上之步驟；將該加熱後之活性碳懸浮液攪拌冷卻之步驟。根據該製造方法，藉由將活性碳預處理成適合於玻尿酸類之純化之狀態，而可製造能高效率地吸附去除雜質之玻尿酸類之純化劑。
本發明之第三形態(例如實施形態3)係一種活性碳之預處理方法，其包括：使活性碳懸浮於水性液中而獲取活性碳懸浮液之步驟；將該活性碳懸浮液於100℃以上加熱20分鐘以上之步驟；將該加熱後之活性碳懸浮液攪拌冷卻之步驟。根據該預處理方法，可將活性碳預處理成適合於玻尿酸類之純化之狀態。
本發明之第四形態(例如實施形態9)係一種玻尿酸類之純化劑，其包含藉由包括以下步驟而製造之活性碳：使活性碳懸浮於水性液中而獲取活性碳懸浮液之步驟；將該活性碳懸浮液於100℃以上加熱20分鐘以上之步驟；將該加熱後之活性碳懸浮液攪拌冷卻之步驟。該純化劑藉由包含已預處理成適合於玻尿酸類之純化之狀態的活性碳，而可高效率地吸附去除雜質。
藉由上述第一形態之純化方法、第二形態之製造方法而製造之純化劑，藉由第三形態之預處理方法而預處理之活性碳或使用第四形態之純化劑之純化方法(以下稱為「上述形態之純化方法」)，較之使用未經處理之活性碳之純化方法，具有更高之雜質吸附力，故可進行更為有效的雜質去除。
即，若使用上述形態之純化方法，則可將玻尿酸類之消失抑制在較低水平，並且不僅可將作為雜質之通常藉由活性碳而可去除之高分子化合物(例如菌體、蛋白質、核酸、內毒素)，甚至連低分子化合物(例如胺基酸、糖、有機酸)亦可高效地分離‧去除。另外，上述形態之純化方法較之使用未經處理之活性碳之純化方法，尤其對於活菌、蛋白質、內毒素有顯著之去除效果。
另外，上述形態之純化方法與使用未經處理之活性碳之情形相比，可減少玻尿酸類之分子量之降低。可減少純化時之玻尿酸類之分子量之降低，尤其於高分子量(例如350萬~700萬Da)之玻尿酸類之純化時，發揮優異之效果。另外，對於先前難以處理之濃度相對較高(例如1 g/L~10 g/L)之玻尿酸類溶液，亦可高效地處理。
進而，若使用上述形態之純化方法，則可不進行除菌處理、透析處理、純化處理等，而將培養液本身作為對象而進行純化(去除雜質‧菌體等)，於自培養液本身分離‧純化玻尿酸類時亦發揮優異之效果。藉由不進行離心分離或過濾處理等煩雜之操作，而直接使用培養液，從而可獲取更加效率化及削減成本等效果。
進行上述形態之純化方法時之玻尿酸類溶液之玻尿酸類濃度，就因溶液黏度高引起之操作之困難度及玻尿酸類之溶解度的觀點而言，較理想為0.1~20 g/L，更理想為0.5~15 g/L，最理想為1~10 g/L，但並不限定於此。
成為上述形態之純化方法之對象的玻尿酸類溶液之pH值，就防止玻尿酸分解、防止分子量降低之觀點而言，較理想為3~12，最理想為3~9，但並不限定於此。進而，就進一步提高純化(吸附)效果之觀點而言，pH值較理想為3.5以上及/或7以下，但並不限定於此。
使用上述形態之純化方法時之玻尿酸類溶液之溫度，較理想為0~80℃，但並不限定於此。若溫度為80℃以下，則可強力抑制處理中之玻尿酸類之分解及分子量之降低。
上述形態之純化方法中，將活性碳懸浮液與純化對象之玻尿酸溶液相接觸時，雖可一次性懸浮並保持原樣，但較理想為持續懸浮‧攪拌。進行攪拌之情形時，較理想為攪拌10分鐘~1小時，更理想為攪拌20~40分鐘，但並不限定於此。
於上述形態之各方法中之活性碳懸浮液之加熱處理中，藉由將活性碳懸浮液於100℃以上加熱20分鐘以上而提高去除雜質之能力。然而，為了提高加熱處理之效果，溫度更理想為120℃以上，最理想為121℃或其以上，但並不限定於此。另外，為提高加熱處理之效果，較理想為加熱時之氣壓較高。作為此種較高之氣壓，例如較理想為0.1 MPa以上，更理想為0.2 MPa以上，但並不限定於此。另外，為了提高加熱處理之效果，加熱時間更理想為30分鐘以上，最理想為1小時以上，但並不限定於此。另外，加熱時較理想為持續攪拌並且進行加熱，此時，較理想為以50~1000 rpm進行攪拌、更理想為以100~600 rpm進行攪拌，但並不限定於此。
於上述形態之各方法中，將加熱後之活性碳懸浮液攪拌冷卻時，藉由將經加熱之活性碳懸浮液連續攪拌而進行冷卻。於預處理中進行攪拌並且冷卻之情形，與不進行攪拌而冷卻之情形相比，可更大地減少玻尿酸類於純化時之分子量之降低。攪拌冷卻時之周圍之溫度較理想為0℃~80℃，更理想為10℃~60℃，最理想為15~40℃，但並不限定於此。另外，尤其亦可於不進行操作之溫度即室溫下操作。攪拌時間較理想為1小時以上，更佳理想為2小時以上，尤其理想為3小時以上，最理想為4小時以上，但並不限定於此。即便冷卻結束溫度為同一溫度，以適當之攪拌時間進行攪拌，則用於純化時之玻尿酸類的分子量之降低效果較大。另外，就冷卻結束溫度對玻尿酸之分子量降低等所造成之影響而言，較理想為較低。較理想之冷卻結束溫度為80℃以下，更理想之冷卻結束溫度為60℃以下(0℃以上)，但並不限定於此。
上述形態之純化方法所使用之活性碳之量，相對於玻尿酸類溶液100重量%，較理想為0.5~20.0重量%，更理想為5.0~20.0重量%，但並不限定於此。於該等範圍內，可期望更高之純化(吸附)作用。
進而，作為活性碳之原料，尤其就用於生物體時能引發問題之雜質等之觀點而言，較理想為來源於木材，其形狀就分散性或吸附效率之觀點而言，較理想為粉末狀。
另外，本發明之進一步之形態係於上述形態中玻尿酸類係藉由馬鏈球菌FM-100(微工研條寄第9027號)或馬鏈球菌FM-300(微工研條寄第2319號)而生產。藉由使用由該等微生物所生產之玻尿酸類作為純化對象，可獲取雜質更少、高分子量之玻尿酸類純化物，尤其於作為醫藥而使用時會發揮優異之效果。
藉由使用上述形態之純化方法，可減輕玻尿酸類之分離‧純化步驟之負荷，因此，上述形態之相關純化方法尤其有效的是於製造之工業製程之相對較為初始階段中使用。
進而，藉由於無塵環境下進行上述形態之純化方法，而可實現先前難以實現之醫藥品所要求的高品質之玻尿酸類以工業規模之高效純化。此種純化方法於醫藥品用之玻尿酸類之生產中，具有極高之產業有用性。
再者，上述實施形態、藉由形態所說明之純化方法等並不限定本發明，而係旨在例示而進行揭示者。本發明之技術範圍係由申請專利範圍之揭示所規定，業者可於申請專利範圍所揭示之發明之技術範圍內，進行各種設計變更。
例如，上述純化方法等亦可為進一步包含其他步驟、或繼上述純化方法而進一步實施其他步驟‧方法而製造玻尿酸類等之方法。作為此種步驟‧方法，例如可列舉同時地或分開進行：培養玻尿酸生產微生物菌株之步驟、由玻尿酸產生微生物菌株培養液製造培養濾液之步驟、將純化對象液離心分離之步驟、將對象液中和之步驟、將鹽添加於對象液之步驟、將純化對象液進行微濾之步驟、將對象液進行透析處理之步驟、將芳香族系吸附樹脂添加於純化對象液之步驟、將對象液進行超濾之步驟、利用層析法將對象液進行純化之步驟、將活性碳之吸附劑添加於對象液之步驟、將活性碳自對象液中分離之步驟、將活性碳自對象液中去除之步驟、添加有機溶劑而使玻尿酸類沈澱之步驟、使玻尿酸類結晶化之步驟、使玻尿酸類乾燥之步驟等。
[實施例]
以下，藉由實施例更具體地說明本發明，但本發明並不限定於該等。
將使用馬鏈球菌FM-100(微工研菌寄第9027號)所培養之醱酵液150 ml(玻尿酸鈉濃度3.5 g/L、pH值4.0)採集至300 mL之玻璃燒杯中，藉由以表1或2所示之條件所製備之吸附劑(活性碳等)進行處理，使用磁力攪拌器以400 rpm進行30分鐘懸浮攪拌處理。將該處理液使用濾紙過濾，將氯化鈉4.5 g(3.0重量%)添加於150 mL濾液中之後，利用乙醇600 mL使玻尿酸鈉析出。將該析出之玻尿酸鈉利用乙醇300 mL清洗後，於40℃下進行真空乾燥而獲取玻尿酸鈉0.5 g。
使用表4所示之評價項目、評價基準，對以此方式所獲取之玻尿酸鈉進行評價。將純化條件及評價結果示於表2及3(實驗例1~17)。
根據以上實驗之結果可確定：藉由使用以一定之預處理方法所預處理之活性碳進行純化，可自玻尿酸類溶液將雜質有效地吸附去除而進行純化。
以上，基於實施例對本發明進行說明。業者應理解：該實施例僅僅為例示，可實施各種變形例，另外該等之變形例亦屬於本發明範圍。

Claims (9)

  1. 一種玻尿酸及/或其鹽之純化方法，其包括：使活性碳懸浮於水性液中而獲取活性碳懸浮液之步驟；將該活性碳懸浮液於100℃以上加熱20分鐘以上之步驟；將該加熱後之活性碳懸浮液攪拌冷卻之步驟；及使包含玻尿酸及/或其鹽及雜質之玻尿酸類溶液與該攪拌冷卻後之活性碳懸浮液相接觸之步驟；且上述攪拌冷卻之步驟中，係攪拌冷卻1小時以上。
  2. 一種玻尿酸及/或其鹽之純化劑之製造方法，其包括活性碳之預處理步驟，該活性碳處理步驟包含：使活性碳懸浮於水性液中而獲取活性碳懸浮液之步驟；將該活性碳懸浮液於100℃以上加熱20分鐘以上之步驟；及將該加熱後之活性碳懸浮液攪拌冷卻之步驟；且上述攪拌冷卻之步驟中，係攪拌冷卻1小時以上。
  3. 一種活性碳之預處理方法，其包括：使活性碳懸浮於水性液中而獲取活性碳懸浮液之步驟；將該活性碳懸浮液於100℃以上加熱20分鐘以上之步驟；及將該加熱後之活性碳懸浮液攪拌冷卻之步驟；且上述攪拌冷卻之步驟中，係攪拌冷卻1小時以上。
  4. 如請求項1至3中任一項之方法，其中於上述攪拌冷卻之步驟中，冷卻結束溫度為60℃以下。
  5. 如請求項1至3中任一項之方法，其中於上述攪拌冷卻之步驟中，攪拌冷卻係於溫度10~60℃下進行1小時以上。
  6. 如請求項1至3中任一項之方法，其中上述步驟之至少一步驟以上係於無塵環境下進行。
  7. 如請求項1或2之方法，其中玻尿酸及/或其鹽係藉由醱酵法而製造者。
  8. 如請求項1或2之方法，其中上述玻尿酸及/或其鹽之分子量為350萬~700萬Da。
  9. 一種玻尿酸及/或其鹽之純化劑，其包含藉由包括活性碳之預處理步驟之方法而製造之攪拌冷卻後之活性碳懸浮液；該活性碳之預處理步驟包括：使活性碳懸浮於水性液中而獲取活性碳懸浮液之步驟；將該活性碳懸浮液於100℃以上加熱20分鐘以上之步驟；及將該加熱後之活性碳懸浮液攪拌冷卻之步驟；且上述攪拌冷卻之步驟中，係攪拌冷卻1小時以上。
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