WO2011114472A1 - ヒアルロン酸の精製方法 - Google Patents

ヒアルロン酸の精製方法 Download PDF

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hyaluronic acid
purification
hyaluronic
impurities
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昌信 香坂
克己 石毛
和利 日置
強志 辻
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電気化学工業株式会社
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08B—POLYSACCHARIDES; DERIVATIVES THEREOF
    • C08B37/00—Preparation of polysaccharides not provided for in groups C08B1/00 - C08B35/00; Derivatives thereof
    • C08B37/0003—General processes for their isolation or fractionation, e.g. purification or extraction from biomass
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08B—POLYSACCHARIDES; DERIVATIVES THEREOF
    • C08B37/00—Preparation of polysaccharides not provided for in groups C08B1/00 - C08B35/00; Derivatives thereof
    • C08B37/006—Heteroglycans, i.e. polysaccharides having more than one sugar residue in the main chain in either alternating or less regular sequence; Gellans; Succinoglycans; Arabinogalactans; Tragacanth or gum tragacanth or traganth from Astragalus; Gum Karaya from Sterculia urens; Gum Ghatti from Anogeissus latifolia; Derivatives thereof
    • C08B37/0063—Glycosaminoglycans or mucopolysaccharides, e.g. keratan sulfate; Derivatives thereof, e.g. fucoidan
    • C08B37/0072—Hyaluronic acid, i.e. HA or hyaluronan; Derivatives thereof, e.g. crosslinked hyaluronic acid (hylan) or hyaluronates

Definitions

  • the present invention relates to a purification method of hyaluronic acids, a purification agent and activated carbon used in the purification method, and a production method thereof.
  • Hyaluronic acid is used as a medicine in cosmetics, moisturizers, ophthalmology, orthopedics, dermatology and the like.
  • Hyaluronic acid can be produced from extracts from animal tissues such as chicken crowns, vitreous bodies of cattle eyes, etc., but chondroitin sulfate etc. are mixed as contaminants, hyaluronidase contained in the tissues, etc. Therefore, it is easy to reduce the molecular weight by culturing microorganisms capable of producing hyaluronic acid, and producing hyaluronic acid from the culture solution (fermentation method) (Non-patent Document 1 and Patent Document 1).
  • hyaluronic acid produced by an extraction method or fermentation method contains proteins, pyrogens, and the like as impurities
  • a method for obtaining a high-purity product by separating and removing these has been studied.
  • the removal of impurities in the initial stage of production is expected to be developed as a method for obtaining a high-purity product that can be used as a pharmaceutical because it can reduce the load of the subsequent purification process.
  • exothermic substances, proteins, and the like are removed from the fermentation broth using, for example, a purification method in which hyaluronic acid is precipitated and separated from impurities by adding an organic solvent such as alcohol to the fermentation broth, or an anion exchange resin.
  • a method for purifying hyaluronic acid is disclosed (Patent Document 2).
  • the present invention has been made in view of the above circumstances, and an object of the present invention is to provide a method for purifying hyaluronic acids with high purity and purity on an industrial scale. It is another object of the present invention to provide a purification agent, activated carbon, etc. used in the purification method and a method for producing them.
  • the present inventors have conducted various studies on methods for efficiently separating and removing impurities from a hyaluronic acid-containing liquid and purifying high-purity hyaluronic acid simply and efficiently. It has been found that impurities can be efficiently adsorbed and removed by using activated carbon prepared using a treatment method, and the present invention has been completed.
  • a method for purifying hyaluronic acid and / or a salt thereof comprising a step of bringing a hyaluronic acid and / or a salt thereof and a hyaluronic acid solution containing impurities into contact with an activated carbon suspension.
  • impurities can be efficiently adsorbed and removed by using activated carbon.
  • the step of suspending activated carbon in an aqueous liquid to obtain an activated carbon suspension the step of heating the activated carbon suspension at 100 ° C. or higher for 20 minutes or more, and the activated carbon suspension after the heating.
  • a method for purifying hyaluronic acid comprising a step of stirring and cooling a suspension, and a step of bringing a hyaluronic acid solution containing hyaluronic acid and impurities into contact with an activated carbon suspension after stirring and cooling.
  • impurities can be efficiently adsorbed and removed by using activated carbon pretreated in a state suitable for purification of hyaluronic acids.
  • the step of suspending activated carbon in an aqueous liquid to obtain an activated carbon suspension the step of heating the activated carbon suspension at 100 ° C. or more for 20 minutes or more, and the activated carbon suspension after the heating.
  • a method for producing a purification agent for hyaluronic acid comprising the step of stirring and cooling the suspension. According to this production method, a purification agent for hyaluronic acid capable of efficiently adsorbing and removing impurities can be produced by pretreating activated carbon into a state suitable for purification of hyaluronic acid.
  • the step of suspending activated carbon in an aqueous liquid to obtain an activated carbon suspension the step of heating the activated carbon suspension at 100 ° C. or more for 20 minutes or more, and the activated carbon suspension after the heating.
  • a method for pretreatment of activated carbon comprising the step of stirring and cooling the suspension. According to this pretreatment method, the activated carbon can be pretreated to a state suitable for purification of hyaluronic acids.
  • the step of suspending activated carbon in an aqueous liquid to obtain an activated carbon suspension the step of heating the activated carbon suspension at 100 ° C. or more for 20 minutes or more, and the activated carbon suspension after the heating.
  • a purification agent for hyaluronic acid comprising activated carbon produced by a method comprising stirring and cooling a suspension.
  • hyaluronic acid includes free hyaluronic acid and any hyaluronic acid salt that can be used within the range not impairing the object of the present invention (for example, but not limited to, sodium salt)
  • Metal salts such as potassium salt, calcium salt and lithium salt, acid adducts such as hydrochloride, phosphate and citrate) and hydrates, and mixtures thereof.
  • hyaluronic acid refers to a high molecular weight polysaccharide in which disaccharide units in which N-acetyl-D-glucosamine and D-glucuronic acid are linked are repeated, and various salts are mainly composed of glucuronic acid moieties.
  • Hyaluronic acid is easy to expand into space due to the interaction between the foldable chain moiety and the negative charge of the carboxyl group of the D-glucuronic acid moiety, and can bind to a large amount of water to form a gel. Even at low concentrations, the intermolecular force is strong, so it has a relatively high viscosity. From such an action, it has, for example, a joint wetting action, a skin softening action and the like, and physiologically plays these roles.
  • hyaluronic acids sodium hyaluronate with a molecular weight of about 2 million Da is more effective for treating osteoarthritis of the knee, periarthritis, rheumatoid arthritis, etc. (Pharmacology and treatment, Vol. 22, No. 9, 289 (1994); Pharmacology and treatment, Vol. 22, No. 9, 319 (1994)).
  • hyaluronic acids having an average molecular weight of 1 million or more.
  • hyaluronic acids having an average molecular weight of 1 million to 5 million Da are desirable as pharmaceuticals, and hyaluronic acids having an average molecular weight of 1.5 to 4 million Da are particularly desirable. Further, such high molecular weight hyaluronic acids exhibit excellent effects due to their high moisturizing power even when used as cosmetics.
  • an injectable solution for dissolving hyaluronic acids as pharmaceuticals water for injection, physiological saline, etc. are generally used for injection in which pH adjusting agents including buffers such as acids, alkalis and phosphates are added.
  • a solution (for example, one recognized by the pharmacopoeia of each country) can be used as appropriate.
  • hyaluronic acids may be produced by an extraction method extracted from animal tissue or may be produced by a fermentation method obtained by fermentation using a hyaluronic acid-producing microbial strain.
  • those extracted from animal tissues are relatively rich in impurities such as other mucopolysaccharides and have a small molecular weight, so it is desirable to use those obtained by fermentation.
  • hyaluronic acids can be obtained by a known method using, for example, a Streptococcus microorganism.
  • the culture solution used in the method of the present invention it is desirable to use the culture solution as it is.
  • a solution sterilized by a known method such as centrifugation or filtration may be used.
  • operations such as removal of low molecular weight compounds by dialysis treatment, removal of water-insoluble fine particles by microfiltration treatment, etc. may be performed, and a solution obtained by precipitating hyaluronic acid by adding a water-soluble organic solvent such as alcohol is used. May be used.
  • Streptococcus in the present specification includes any bacterium belonging to the genus Streptococcus capable of producing hyaluronic acid and its mutant strain.
  • Streptococcus equi FM-100 described in Patent Document 2 (Microtechnical Laboratories No. 9027) and Streptococcus ex FM-300 described in Japanese Patent Application Laid-Open No. Hei 2-23489 It is desirable to use a mutant that stably produces hyaluronic acid with a high yield such as No. 2319).
  • bacteria belonging to the genus Streptococcus suitable for the production of hyaluronic acid include, but are not limited to, for example, Streptococcus equi, Streptococcus zooepidemicus, and Streptococcus zooepidemicus (Streptococcus equisimilis), Streptococcus dysgalactiee, Streptococcus pyogenes (Streptococcus pyogenes), and mutants thereof.
  • average molecular weight in this specification refers to the viscosity average molecular weight when indicating the average molecular weight of hyaluronic acids.
  • the viscosity average molecular weight can be determined by a method usually performed by those skilled in the art. Preferably, it can be determined by a measurement method generally used in the pharmacopoeia of each country, and more preferably by a measurement method used in the Japanese pharmacopoeia. For example, the present invention is not limited to this.
  • the average molecular weight can be obtained by the following equation using the intrinsic viscosity [ ⁇ ].
  • activated carbon refers to porous carbon that is commercially available and generally used for separation, removal, and purification. It is derived from raw materials such as coal or wood, activated chemicals, or water vapor. It is not limited to manufacturing methods, such as activation. Furthermore, it is not limited to shapes such as powdered activated carbon and granular activated carbon, and properties such as dry and wet. Although it is not limited to this in the method of this invention, etc., it is desirable to use activated carbon derived from wood. Similarly, it is desirable to use one produced by steam activation. Similarly, it is desirable to use powdered activated carbon.
  • the activated carbon include, but are not limited to, for example, Tsurumi Coal GL-30S, Tsurumi Coal HC-30S (more granular, manufactured by Tsurumi Co.), white birch WH5C8 / 32, white birch LH2C20 / 48, white birch WH2C8 / 32SS [above, granular, manufactured by Takeda Pharmaceutical Co., Ltd.], white birch A, white birch P, purified white birch, characteristic white birch, carborafine [over, powdered, manufactured by Takeda Pharmaceutical Co., Ltd.], Hokuetsu SD, Hokuetsu GSA [above, powdered, manufactured by Hokuetsu Carbon Industry Co., Ltd.], silver A, flower F, snow A [above, powdered, manufactured by Daisan Industry Co., Ltd.], and the like.
  • Tsurumi Coal GL-30S Tsurumi Coal HC-30S (more
  • impurities refers to substances other than hyaluronic acids, water and other solvent components, inorganic salts, particularly substances that can give disadvantages when using hyaluronic acids as final products (such as pyrogenic substances). That means.
  • main impurity sources include those derived from tissues, microorganisms, or culture solutions (medium) in the production stage of hyaluronic acids, or those mixed in subsequent purification stages.
  • impurities in the present specification include, but are not limited to, tissues or cells, proteins, nucleic acids, polysaccharides, low molecular compounds, endotoxins, and the like.
  • the tissue or fungus body as an impurity is not limited to this, but a tissue piece derived from a tissue as an extraction raw material used in the extraction method or the fungus body or fungus body of a microorganism used in the fermentation method, respectively. Includes pieces.
  • Proteins as impurities include, but are not limited to, proteins derived from the tissues and fungi, and proteins mixed in the post-production process.
  • Endotoxins as impurities include, but are not limited to, lipopolysaccharides derived from the above bacteria.
  • the “low molecular weight compound” in the present specification refers to a compound having a relatively small molecular weight as compared to hyaluronic acids.
  • the molecular weight is not limited to 2000 Da or less, or a molecular weight of 1000 Da, Alternatively, it refers to a compound having a molecular weight of 500 Da or less.
  • Such low molecular weight compounds include various amino acids, organic acids (for example, lactic acid), sugars (for example, glucose) and the like.
  • the “aqueous liquid” refers to a liquid mainly composed of water (solvent), and includes liquids containing various salts, buffers, and small amounts of organic solvents.
  • any liquid can be used as long as the object of the present invention is not impaired.
  • water is preferable from the viewpoint of preventing unnecessary substances from being mixed when using the hyaluronic acid as a final product.
  • stirring cooling refers to cooling the target liquid by continuing stirring.
  • the temperature achieved after stirring and cooling is defined as a cooling completion temperature.
  • “Clean environment” in this specification refers to the production of products that are extremely unlikely to contaminate products with impurities such as bacteria and endotoxins derived from the environment, especially products that are equivalent to pharmaceuticals (bacteria and endotoxins) by air conditioning management. It refers to the environment.
  • the clean environment for example, an environment in which the target substance is regulated as follows can be given.
  • Removal in this specification includes not only removing the target substance completely but also removing it partially (decreasing the amount of the substance).
  • purification includes removing any or specific impurities.
  • purifying agent refers to an agent used for purification, such as an adsorbent
  • the expression “purifier for substance A” refers to an agent for purifying substance A.
  • the purification agent may be in the form of a purification composition.
  • the removal agent, the separation agent, and the like refer to a drug used for removal and a drug used for separation, respectively, for example, a term including an adsorbent, a carrier, etc.
  • the composition may be in the form of a composition for separation or a composition for separation.
  • each numerical range in this specification includes the upper limit value and the lower limit value indicated by “to”.
  • the description “A to B” means greater than A and less than B.
  • “Contains” includes “consisting essentially of” and “consisting of”.
  • Embodiment 1 Suspending activated carbon in an aqueous liquid to obtain an activated carbon suspension; Heating the activated carbon suspension at 100 ° C. or higher for 20 minutes or more; Stirring and cooling the activated carbon suspension after the heating; A method for purifying hyaluronic acid and / or a salt thereof, comprising a step of contacting a hyaluronic acid solution containing hyaluronic acid and / or a salt thereof and impurities with an activated carbon suspension after stirring and cooling.
  • Embodiment 2 Suspending activated carbon in an aqueous liquid to obtain an activated carbon suspension; Heating the activated carbon suspension at 100 ° C. or higher for 20 minutes or more; A method for producing a purification agent for hyaluronic acid and / or a salt thereof, comprising a step of stirring and cooling the activated carbon suspension after the heating.
  • Embodiment 3 Suspending activated carbon in an aqueous liquid to obtain an activated carbon suspension; Heating the activated carbon suspension at 100 ° C. or higher for 20 minutes or more; A pretreatment method for activated carbon, comprising a step of stirring and cooling the activated carbon suspension after the heating.
  • Embodiment 4 FIG. The method according to any one of Embodiments 1 to 3, wherein in the stirring and cooling step, the cooling completion temperature is 60 ° C. or lower.
  • Embodiment 5 The method according to any one of Embodiments 1 to 4, wherein in the step of stirring and cooling, the stirring and cooling is performed at a temperature of 10 to 60 ° C. for 1 hour or longer.
  • Embodiment 6 FIG. Embodiment 6. The method according to any one of Embodiments 1 to 5, wherein at least one of the above steps is performed in a clean environment.
  • Embodiment 7 FIG. The method according to any one of Embodiments 1 to 6, wherein hyaluronic acid and / or a salt thereof is produced by a fermentation method.
  • Embodiment 8 FIG. The method according to any one of the embodiments 1 to 7, wherein the hyaluronic acid and / or salt thereof after purification has an average molecular weight of 3.5 to 7 million Da.
  • Embodiment 9 Suspending activated carbon in an aqueous liquid to obtain an activated carbon suspension; Heating the activated carbon suspension at 100 ° C. or higher for 20 minutes or more; A purification agent for hyaluronic acid and / or a salt thereof, comprising activated carbon produced by a method comprising a step of stirring and cooling the activated carbon suspension after the heating.
  • the first aspect of the present invention includes a step of suspending activated carbon in an aqueous liquid to obtain an activated carbon suspension, and heating the activated carbon suspension at 100 ° C. or higher for 20 minutes or longer.
  • a method of purifying hyaluronic acid comprising: a step of stirring and cooling the activated carbon suspension after heating; and a step of bringing the hyaluronic acid solution containing hyaluronic acid and impurities into contact with the activated carbon suspension after stirring and cooling. It is.
  • impurities can be efficiently adsorbed and removed by using activated carbon pretreated in a state suitable for purification of hyaluronic acids.
  • the second aspect of the present invention includes a step of suspending activated carbon in an aqueous liquid to obtain an activated carbon suspension, and heating the activated carbon suspension at 100 ° C. or higher for 20 minutes or longer.
  • purification agent of hyaluronic acid including the process and the process of stirring and cooling the activated carbon suspension after the heating. According to this production method, a purification agent for hyaluronic acid capable of efficiently adsorbing and removing impurities can be produced by pretreating activated carbon into a state suitable for purification of hyaluronic acid.
  • the third aspect of the present invention is a step of suspending activated carbon in an aqueous liquid to obtain an activated carbon suspension, and heating the activated carbon suspension at 100 ° C. or higher for 20 minutes or longer.
  • a pretreatment method of activated carbon including a step and a step of stirring and cooling the activated carbon suspension after the heating. According to this pretreatment method, the activated carbon can be pretreated to a state suitable for purification of hyaluronic acids.
  • the fourth aspect of the present invention includes a step of suspending activated carbon in an aqueous liquid to obtain an activated carbon suspension, and heating the activated carbon suspension at 100 ° C. or higher for 20 minutes or longer.
  • a purification agent for hyaluronic acids comprising activated carbon produced by a method comprising a step and a step of stirring and cooling the activated carbon suspension after the heating.
  • the purification method of the above embodiment has a higher impurity adsorption power than the purification method using untreated activated carbon, more effective impurity removal can be performed. .
  • the purification method of the above embodiment when used, only high molecular compounds (for example, bacterial cells, proteins, nucleic acids, endotoxins) that can generally be removed by activated carbon as impurities while suppressing the disappearance of hyaluronic acids to a low level.
  • high molecular compounds for example, bacterial cells, proteins, nucleic acids, endotoxins
  • low molecular weight compounds for example, amino acids, sugars, organic acids
  • the purification method of the above aspect can also reduce the decrease in the molecular weight of hyaluronic acids compared to the case where untreated activated carbon is used. It is possible to reduce the decrease in the molecular weight of hyaluronic acids during purification, in particular, the hyaluronic acids having a high molecular weight (for example, an average molecular weight after purification (for example, after filtration following the adsorption treatment) of 3.5 to 7 million Da). Excellent effect in purification.
  • a hyaluronic acid solution having a relatively high concentration for example, 1 g / L to 10 g / L, which has conventionally been difficult to process, can be processed efficiently.
  • the culture solution itself can be purified (impurities / cells etc. are removed) without performing sterilization treatment, dialysis treatment, purification treatment, etc., and the culture solution itself It also has an excellent effect when separating and purifying hyaluronic acids from sucrose.
  • the culture solution By using the culture solution as it is without performing complicated operations such as centrifugation and filtration, it is possible to obtain further efficiency and cost reduction effects.
  • the hyaluronic acid concentration of the hyaluronic acid solution when performing the purification method of the above embodiment is not limited to this from the viewpoint of difficulty in handling due to the high solution viscosity and the solubility of hyaluronic acid, 0.1 to 20 g / L is desirable, 0.5 to 15 g / L is more desirable, and 1 to 10 g / L is most desirable.
  • the pH of the hyaluronic acid solution to be subjected to the purification method of the above embodiment is not limited to this from the viewpoint of preventing the degradation of hyaluronic acid and preventing the molecular weight from being lowered, but is preferably 3 to 12. ⁇ 9 are most desirable. Furthermore, from the viewpoint of further enhancing the purification (adsorption) effect, the pH is preferably 3.5 or more and / or 7 or less, although not limited thereto.
  • the temperature of the hyaluronic acid solution when using the purification method of the above embodiment is not limited to this, but is preferably 0 to 80 ° C. If temperature is 80 degrees C or less, decomposition
  • the activated carbon suspension when brought into contact with the hyaluronic acid solution to be purified, it may be suspended once and kept as it is, but it is desirable to continuously suspend and stir. .
  • stirring although not limited thereto, stirring for 10 minutes to 1 hour is desirable, and stirring for 20 to 40 minutes is more desirable.
  • the ability to remove impurities is improved by heating the activated carbon suspension at 100 ° C. or higher for 20 minutes or longer.
  • the temperature is not limited to this, but is more preferably 120 ° C. or higher, and most preferably 121 ° C. or higher.
  • the atmospheric pressure during heating is high.
  • Such high atmospheric pressure is not limited to this, but is preferably 0.1 MPa or more, and more preferably 0.2 MPa or more.
  • the heating time is not limited to this, but is more preferably 30 minutes or more, and most preferably 1 hour or more.
  • the heating is preferably performed at 50 to 1000 rpm, and more preferably at 100 to 600 rpm. desirable.
  • the heated activated carbon suspension is cooled by continuing stirring.
  • the ambient temperature at the time of stirring and cooling is not limited to this, but is preferably 0 ° C. to 80 ° C., more preferably 10 ° C. to 60 ° C., and most preferably 15 to 40 ° C.
  • the stirring time is not limited to this, but is preferably 1 hour or more, more preferably 2 hours or more, still more preferably 3 hours or more, and 4 hours or more. Is most desirable. Even if the cooling completion temperature is the same temperature, the effect of reducing the molecular weight of hyaluronic acids when used for purification is greater when stirring for an appropriate stirring time. Further, the cooling completion temperature is desirably lower because of the influence on the molecular weight reduction of hyaluronic acid. Although not limited to this, the cooling completion temperature is desirably 80 ° C. or less, and the cooling completion temperature is more desirably 60 ° C. or less (0 ° C. or more).
  • the amount of the activated carbon used in the purification method of the above embodiment is not limited to this, but is desirably 0.5 to 20.0% by weight with respect to 100% by weight of the hyaluronic acid solution. More desirably, it is ⁇ 20.0% by weight. Within these ranges, higher purification (adsorption) action can be expected.
  • the raw material for activated carbon is preferably derived from wood, particularly from the viewpoint of impurities that can be a problem when applied to a living body, and its shape is preferably powder from the viewpoint of dispersibility and adsorption efficiency.
  • the hyaluronic acid is Streptococcus ex FM-100 (Mikken Kenjo No. 9027) or Streptococcus ex FM-300 (Maiko Kenjo No. 2319). Produced by.
  • hyaluronic acid produced by these microorganisms as a purification target, a purified product with high molecular weight hyaluronic acid can be obtained with less impurities, and exhibits an excellent effect particularly when used as a medicine.
  • the purification method of the above aspect it is possible to reduce the load of the separation / purification process of hyaluronic acids. Therefore, the purification method according to the above aspect is particularly used at a relatively early stage of the industrial process of production. It is effective.
  • the purification method or the like may include another step, or may be a method of producing hyaluronic acid or the like by performing another step or method subsequent to the purification method.
  • processes and methods include a step of culturing a hyaluronic acid-producing microbial strain, which is performed simultaneously or separately, a step of producing a culture filtrate from a hyaluronic acid-producing microbial strain culture solution, and centrifuging a solution to be purified.
  • Process neutralizing the target liquid, adding salt to the target liquid, microfiltration of the target liquid to be purified, dialysis of the target liquid, adding aromatic adsorption resin to the target liquid to be purified, target
  • a step of precipitating hyaluronic acid, a step of crystallizing hyaluronic acid, a step of drying hyaluronic acid and the like can be mentioned.
  • the sodium hyaluronate thus obtained was evaluated using the evaluation items and evaluation criteria shown in Table 4.
  • the purification conditions and evaluation results are shown in Tables 2 and 3 (Experimental Examples 1 to 17).

Abstract

【課題】簡便かつ高収率で高純度のヒアルロン酸類を工業的規模で精製するための方法を提供することを目的とする。 【解決手段】ヒアルロン酸及び／又はその塩と不純物を含むヒアルロン酸類溶液を、活性炭懸濁液と接触させる工程とを含む、ヒアルロン酸及び／又はその塩の精製方法が提供される

Description

ヒアルロン酸の精製方法
　本発明は、ヒアルロン酸類の精製方法、その精製方法に用いる精製剤及び活性炭、それらの製造方法に関する。
　ヒアルロン酸は、化粧品の保湿剤の他、眼科、整形外科、皮膚科等で医薬品として用いられている。ヒアルロン酸は、動物組織、例えば、鶏の鶏冠、牛の眼の硝子体等からの抽出物により製造することができるが、夾雑物としてコンドロイチン硫酸等が混入したり、組織内に含まれるヒアルロニダーゼ等によって低分子量化されやすいため、ヒアルロン酸生産能を有する微生物を培養し、培養液からヒアルロン酸を製造すること（発酵法）も行なわれている（非特許文献１及び特許文献１）。
　抽出法や発酵法によって製造されるヒアルロン酸には、タンパク質や発熱性物質等が不純物として存在するため、これらを分離除去して高純度の製品を得る方法が検討されている。特に製造の初期段階での不純物の除去は、以降の精製工程の負荷の軽減を可能とし、医薬品としても使用可能な高純度な製品を得る方法としての開発が期待されている。その例として、例えば、発酵液にアルコール等の有機溶剤を加えることによりヒアルロン酸を析出し不純物と分離する精製法や、アニオン交換樹脂を用いて、発酵液から発熱性物質やタンパク質等を除去するヒアルロン酸の精製法が開示されている（特許文献２）。
Journal of General Microbiology, 85, 372-375, 1976 特公平４－１２９６０号公報 特開昭６３－１２２９３号公報
　しかしながら、工業的規模で注射液等の医薬品として使用できる高純度のヒアルロン酸類を得るには（１）初期段階での不純物の除去が十分に為されていないために、後工程への負荷が大きい（２）操作が煩雑な上に、ヒアルロン酸類の回収率が低い等のさらに改善の望まれる点が存在していた。
　本発明は上記事情に鑑みてなされたものであり、簡便かつ高収率で高純度のヒアルロン酸類を工業的規模で精製するための方法を提供することを目的とする。また、その精製方法に使われる精製剤、活性炭等や、それらの製造方法を提供することも目的とする。
　本発明者らは、上記目的を解決するために、ヒアルロン酸類含有液から不純物を効率よく分離除去し、高純度のヒアルロン酸類を簡便にかつ効率よく精製する方法について種々検討した結果、特定の前処理方法を用いて調製した活性炭を用いることにより、不純物を効率よく吸着除去することができることを見いだし本発明を完成するに至った。
　すなわち、本発明によれば、ヒアルロン酸及び／又はその塩と不純物を含むヒアルロン酸類溶液を、活性炭懸濁液と接触させる工程とを含む、ヒアルロン酸及び／又はその塩の精製方法が提供される。この精製方法によると、活性炭を用いることにより、不純物を効率よく吸着除去することができる。
　すなわち、本発明によれば、活性炭を水性液中に懸濁させて活性炭懸濁液を得る工程と、その活性炭懸濁液を１００℃以上で２０分間以上加熱する工程と、その加熱後活性炭懸濁液を攪拌冷却する工程と、ヒアルロン酸類と不純物とを含むヒアルロン酸類溶液を、該攪拌冷却後活性炭懸濁液と接触させる工程とを含む、ヒアルロン酸類の精製方法が提供される。この精製方法によると、ヒアルロン酸類の精製に適した状態に前処理された活性炭を用いることにより、不純物を効率よく吸着除去することができる。
　また、本発明によれば、活性炭を水性液中に懸濁させて活性炭懸濁液を得る工程と、その活性炭懸濁液を１００℃以上で２０分間以上加熱する工程と、その加熱後活性炭懸濁液を攪拌冷却する工程とを含む、ヒアルロン酸類の精製剤の製造方法が提供される。この製造方法によると、活性炭をヒアルロン酸類の精製に適した状態に前処理することで、不純物を効率よく吸着除去することのできるヒアルロン酸類の精製剤を製造することができる。
　また、本発明によれば、活性炭を水性液中に懸濁させて活性炭懸濁液を得る工程と、その活性炭懸濁液を１００℃以上で２０分間以上加熱する工程と、その加熱後活性炭懸濁液を攪拌冷却する工程とを含む、活性炭の前処理方法が提供される。この前処理方法によると、活性炭をヒアルロン酸類の精製に適した状態に前処理することができる。
　また、本発明によれば、活性炭を水性液中に懸濁させて活性炭懸濁液を得る工程と、その活性炭懸濁液を１００℃以上で２０分間以上加熱する工程と、その加熱後活性炭懸濁液を攪拌冷却する工程とを含む方法により製造された活性炭を含む、ヒアルロン酸類の精製剤が提供される。この精製剤は、ヒアルロン酸類の精製に適した状態に前処理された活性炭を含むことで、不純物を効率よく吸着除去することができる。
発明の実施の形態
〔用語の説明〕
　本明細書における「ヒアルロン酸類」には、遊離のヒアルロン酸、及び、本発明の目的を損なわない範囲で使用可能な任意のヒアルロン酸塩（これに限定されるものではないが、例えば、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、リチウム塩などの金属塩や、塩酸塩、リン酸塩、クエン酸塩などの酸付加物など）や水和物、それらの混合物が含まれる。ここで、ヒアルロン酸とは、Ｎ－アセチル－Ｄ－グルコサミンとＤ－グルクロン酸とが結合した２糖単位がくりかえし連鎖してなる高分子量の多糖類をいい、各種塩は主にグルクロン酸部分が塩の形となったものをいう。ヒアルロン酸は、折り畳み可能な鎖部分と、Ｄ－グルクロン酸部分のカルボキシル基の負電荷の相互作用によって、空間に展開しやすく、これにより大量の水と結合してゲルを形成することができる。また、低濃度であっても、分子間力が強いため、比較的高い粘性を有する。このような作用から、例えば、関節の湿潤作用、皮膚の柔軟作用などを有し、生理的にもそれらの役割を担っている。
　ヒアルロン酸類の中でも、分子量約２００万Ｄａのヒアルロン酸ナトリウムは、分子量約８０万Ｄａのものに比べて医薬品として、変形性膝関節症、肩関節周囲炎、慢性関節リウマチ等の治療に優れた効果を発揮することが知られている（薬理と治療、Ｖｏｌ．２２、Ｎｏ．９、２８９（１９９４）；薬理と治療、Ｖｏｌ．２２、Ｎｏ．９、３１９（１９９４））。また、その他に、外科手術後の癒着防止用として、さらに皮膚科領域、眼科領域においても医薬品としての効果が知られており、一部は臨床的に一般に使用されている。医薬品として用いる場合には、平均分子量が１００万以上のヒアルロン酸類を用いることが望ましい。さらに、入手や取り扱いの容易さを勘案すると、平均分子量１００万～５００万Ｄａのヒアルロン酸類が医薬品としては望ましく、平均分子量１５０万～４００万Ｄａのヒアルロン酸類が特に望ましい。また、このような高分子量のヒアルロン酸類は、化粧品用途として使用した際にも、その高い保湿力から優れた効果を発揮する。
　医薬品として、ヒアルロン酸類を溶解する注射用溶解液としては、注射用水、生理食塩水等に、酸、アルカリ、リン酸塩のような緩衝剤を含むｐＨ調整剤等を加えた一般に用いられる注射用溶解液（例えば、各国薬局方で認められているもの）を適宜使用することができる。
　これらのヒアルロン酸類は、動物組織から抽出する抽出法により製造したものでも、ヒアルロン酸生産微生物菌株を用いて発酵させて得る発酵法で製造したものでもよい。しかしながら、動物組織から抽出したものには、他のムコ多糖などの不純物が比較的多く、分子量も小さいため、発酵法で得られるものを用いることが望ましい。本発明に適した発酵法の一例では、例えばストレプトコッカス属の微生物を使用して既知の方法でヒアルロン酸類を得ることができる。
　本発明の方法等に用いる溶液は、培養液をそのまま用いることが望ましいが、当然ながら、既知の方法、例えば、遠心分離やろ過処理等で除菌した液を使用してもよい。場合によっては、透析処理による低分子化合物の除去、精密ろ過処理による水不溶微粒子の除去等の操作を行ってもよく、アルコール等の水溶性有機溶媒を添加してヒアルロン酸を析出精製したものを使用してもよい。また、アルミナ等で処理したものを用いてもよい。
　本明細書における「ストレプトコッカス」には、ヒアルロン酸を生産することのできるストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属の任意の細菌・その変異株が含まれる。特に、特許文献２に記載されたストレプトコッカス・エキＦＭ－１００（微工研菌寄第９０２７号）、特開平２－２３４６８９号公報に記載されたストレプトコッカス・エキＦＭ－３００（微工研菌寄第２３１９号）のような高収率で安定にヒアルロン酸を生産する変異株を用いることが望ましい。ヒアルロン酸の生産に適したストレプトコッカス属の細菌の例としては、他に、これに限定されるものではないが、例えば、ストレプトコッカス・エキ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｅｑｕｉ）、ストレプトコッカス・ズーエピデミカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｚｏｏｅｐｉｄｅｍｉｃｕｓ）、ストレプトコッカス・エキシミリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｅｑｕｉｓｉｍｉｌｉｓ）、ストレプトコッカス・ディスガラクティエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｄｙｓｇａｌａｃｔｉａｅ）、ストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｐｙｏｇｅｎｅｓ）及びこれらの変異株などが挙げられる。
　本明細書における「平均分子量」について、特記しない限り、ヒアルロン酸類の平均分子量を示す際は、粘度平均分子量のことをいう。粘度平均分子量は、当業者が通常行う方法により求めることができる。好ましくは、各国の薬局方等で一般的に用いられている測定方法により求めることができ、より好ましくは、日本薬局方で用いられている測定方法により求めることができる。一例としては、これに限定されるものではないが、例えば、その平均分子量は、極限粘度［η］を用いて、次式により求めることができる。
式１
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000001
　本明細書における「活性炭」とは、市販され、一般に用いられている、分離・除去・精製用の多孔質の炭素のことをいい、石炭又は木材等の原料の由来や、薬晶賦活又は水蒸気賦活等の製法に限定されるものではない。さらに、粉末活性炭、粒状活性炭等の形状や、乾式、湿式などの性状に限定されるものでもない。本発明の方法等においては、これに限定されるものではないが、木材由来の活性炭を用いることが望ましい。また、同様に、水蒸気賦活により製造されたものを用いることが望ましい。また、同様に、粉末活性炭を用いることが望ましい。
　活性炭の具体例としては、これに限定されるものではないが、例えば、ツルミコールＧＬ－３０Ｓ、ツルミコールＨＣ－３０Ｓ［以上粒状・（株）ツルミコール製］、白鷺ＷＨ５Ｃ８／３２、白鷺ＬＨ２Ｃ２０／４８、白鷺ＷＨ２Ｃ８／３２ＳＳ［以上、粒状・武田薬品工業（株）製］、白鷺Ａ、白鷺Ｐ、精製白鷺、特性白鷺、カルボラフィン［以上、粉状・武田薬品工業（株）製］、北越ＳＤ、北越ＧＳＡ［以上、粉状・北越炭素工業（株）製］、シルバーＡ、花Ｆ、雪Ａ［以上、粉状・大三工業（株）製］などが挙げられる。
　本明細書における「不純物」とは、ヒアルロン酸類、水その他の溶媒成分、無機塩以外の物質、特に、最終製品としてのヒアルロン酸類を用いる際に不利益を与え得る物質（発熱性物質など）のことをいう。主な不純物源としては、ヒアルロン酸類の生産段階での組織、微生物又は培養液（培地）由来のもの、あるいは、その後の精製段階で混入したものが挙げられる。本明細書における不純物の例としては、これに限られるものではないが、組織又は菌体、タンパク質、核酸、多糖類、低分子化合物、あるいはエンドトキシンなどが挙げられる。不純物としての組織又は菌体には、これに限られるものではないが、それぞれ、抽出法で用いた抽出原料としての組織由来の組織片などや、発酵法で用いた微生物の菌体あるいは菌体片などが含まれる。不純物としてのタンパク質には、これに限られるものではないが、上記組織、菌由来のタンパク質や、生産後の工程で混入したタンパク質などが含まれる。不純物としてのエンドトキシンには、これに限られるものではないが、上記菌由来のリポ多糖類などが含まれる。
　本明細書における「低分子化合物」とは、ヒアルロン酸類と比較して、分子量の比較的小さな化合物のことをいい、例えば、これに限られるものではないが、分子量２０００Ｄａ以下、あるいは、分子量１０００Ｄａ、あるいは分子量５００Ｄａ以下の化合物のことをいう。このような低分子化合物には、各種アミノ酸、有機酸（例えば、乳酸）、糖（例えば、グルコース）などが含まれる。
　本明細書における「水性液」とは、水を主体（溶媒）とする液体のことをいい、各種塩、緩衝剤、少量の有機溶媒などが含まれたものも含む。水性液としては、本発明の目的を損なわない限り、任意のものを用いることができるが、最終製品としてのヒアルロン酸類を用いる際に不必要な物質の混入を防ぐ観点から、水が望ましい。
　本明細書における「攪拌冷却」とは、対象の液体を、攪拌を継続することにより、冷却することをいう。ここで、攪拌冷却後に達成された温度を、冷却完了温度とする。
　本明細書における「クリーン環境」とは、空調管理することで、環境由来の菌やエンドトキシンなどの不純物が製品にコンタミする可能性の極めて低い環境、特に医薬（菌、エンドトキシンフリー）相当製品の製造環境のことをいう。
　クリーン環境の一例として、例えば、対象物質が以下のように規制された環境が挙げられる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　本明細書における「除去」には、対象の物質を完全に除き去ることに加え、部分的に除き去る（その物質の量を減少させる）ことも含まれる。本明細書における「精製」には、任意の又は特定の不純物を除去することが含まれる。
　本明細書における「精製剤」とは、吸着剤などの、精製のために使われる薬剤のことをいい、「物質Ａの精製剤」という表現は、物質Ａを精製するための薬剤のことを意味するものとする。精製剤は、精製用組成物の形態であってもよい。また、同様に、除去剤、分離剤等も、それぞれ、除去のために用いられる薬剤、分離のために用いられる薬剤のことをいい、例えば、吸着剤や担体等を含む用語であって、除去用組成物、分離用組成物などの形態であってもよい。
　本明細書におけるそれぞれの数値範囲については、「～」で示された上限値及び下限値をそれぞれ含むものとする。例えば、「Ａ～Ｂ」なる記載は、Ａ以上でありＢ以下であることを意味する。また、「を含有する」には、「から実質的になる」および「からなる」が含まれるものとする。
〔実施の形態〕
　本発明は、これに限られるものではないが、例えば、以下の実施態様に関する。
実施態様１．
　活性炭を水性液中に懸濁させて活性炭懸濁液を得る工程と、
　該活性炭懸濁液を１００℃以上で２０分間以上加熱する工程と、
　該加熱後活性炭懸濁液を攪拌冷却する工程と、
　ヒアルロン酸及び／又はその塩と不純物とを含むヒアルロン酸類溶液を、該攪拌冷却後活性炭懸濁液と接触させる工程とを含む、ヒアルロン酸及び／又はその塩の精製方法。
実施態様２．
　活性炭を水性液中に懸濁させて活性炭懸濁液を得る工程と、
　該活性炭懸濁液を１００℃以上で２０分間以上加熱する工程と、
　該加熱後活性炭懸濁液を攪拌冷却する工程を含む、ヒアルロン酸及び／又はその塩の精製剤の製造方法。
実施態様３．
　活性炭を水性液中に懸濁させて活性炭懸濁液を得る工程と、
　該活性炭懸濁液を１００℃以上で２０分間以上加熱する工程と、
　該加熱後活性炭懸濁液を攪拌冷却する工程を含む、活性炭の前処理方法。
実施態様４．
　上記攪拌冷却する工程において、冷却完了温度が６０℃以下である、実施態様１ないし３の何れか一態様に記載の方法。
実施態様５．
　上記攪拌冷却する工程において、攪拌冷却が温度１０～６０℃で１時間以上行われる、実施態様１ないし４の何れか一態様に記載の方法。
実施態様６．
　上記工程の少なくとも一つ以上がクリーン環境下で行われる、実施態様１ないし５の何れか一態様に記載の方法。
実施態様７．
　ヒアルロン酸及び／又はその塩が発酵法で製造されたものである、実施態様１ないし６の何れか一態様に記載の方法。
実施態様８．
　精製後の上記ヒアルロン酸及び／又はその塩の平均分子量が３５０万～７００万Ｄａである、実施態様１ないし７の何れか一態様に記載の方法。
実施態様９．
　活性炭を水性液中に懸濁させて活性炭懸濁液を得る工程と、
　該活性炭懸濁液を１００℃以上で２０分間以上加熱する工程と、
　該加熱後活性炭懸濁液を攪拌冷却する工程を含む方法により製造された活性炭を含む、ヒアルロン酸及び／又はその塩の精製剤。
　以下、本発明の態様について説明する。
　本発明の第一の態様（例えば、実施態様１）は、活性炭を水性液中に懸濁させて活性炭懸濁液を得る工程と、その活性炭懸濁液を１００℃以上で２０分間以上加熱する工程と、その加熱後活性炭懸濁液を攪拌冷却する工程と、ヒアルロン酸類と不純物とを含むヒアルロン酸類溶液を、該攪拌冷却後活性炭懸濁液と接触させる工程とを含む、ヒアルロン酸類の精製方法である。この精製方法によると、ヒアルロン酸類の精製に適した状態に前処理された活性炭を用いることにより、不純物を効率よく吸着除去することができる。
　本発明の第二の態様（例えば、実施態様２）は、活性炭を水性液中に懸濁させて活性炭懸濁液を得る工程と、その活性炭懸濁液を１００℃以上で２０分間以上加熱する工程と、その加熱後活性炭懸濁液を攪拌冷却する工程とを含む、ヒアルロン酸類の精製剤の製造方法である。この製造方法によると、活性炭をヒアルロン酸類の精製に適した状態に前処理することで、不純物を効率よく吸着除去することのできるヒアルロン酸類の精製剤を製造することができる。
　本発明の第三の態様（例えば、実施態様３）は、活性炭を水性液中に懸濁させて活性炭懸濁液を得る工程と、その活性炭懸濁液を１００℃以上で２０分間以上加熱する工程と、その加熱後活性炭懸濁液を攪拌冷却する工程とを含む、活性炭の前処理方法である。この前処理方法によると、活性炭をヒアルロン酸類の精製に適した状態に前処理することができる。
　本発明の第四の態様（例えば、実施態様９）は、活性炭を水性液中に懸濁させて活性炭懸濁液を得る工程と、その活性炭懸濁液を１００℃以上で２０分間以上加熱する工程と、その加熱後活性炭懸濁液を攪拌冷却する工程とを含む方法により製造された活性炭を含む、ヒアルロン酸類の精製剤である。この精製剤は、ヒアルロン酸類の精製に適した状態に前処理された活性炭を含むことで、不純物を効率よく吸着除去することができる。
　上記第一の態様の精製方法、第二の態様の製造方法により製造された精製剤、第三の態様の前処理方法により前処理された活性炭、あるいは第四の態様の精製剤を用いた精製方法（以下、「上記態様の精製方法」と称する）は、無処理の活性炭を用いた精製方法と比較して、より高い不純物吸着力を有するため、より効果的な不純物除去を行うことができる。
　すなわち、上記態様の精製方法を用いると、ヒアルロン酸類の消失は低く抑えながらも、不純物として、一般的に活性炭により除去可能とされる高分子化合物（例えば、菌体、タンパク質、核酸、エンドトキシン）のみならず、低分子化合物（例えば、アミノ酸、糖、有機酸）までも効率的に分離・除去することが可能であった。また、上記態様の精製方法は、無処理の活性炭を用いた精製方法と比較して、特に、生菌、タンパク質、エンドトキシンに対して顕著な除去効果を奏する。
　また、上記態様の精製方法は、無処理の活性炭を用いる場合に比べ、ヒアルロン酸類の分子量の低下を軽減することもできる。精製時におけるヒアルロン酸類の分子量の低下を低減させることができ、特に、高分子量（例えば、精製後（例えば、吸着処理に続く濾過後）の平均分子量が３５０万～７００万Ｄａ）のヒアルロン酸類の精製において、優れた効果を発揮する。また、従来は処理が困難であった比較的高濃度（例えば、１ｇ／Ｌ～１０ｇ／Ｌ）のヒアルロン酸類溶液についても、効率的に処理することができる。
　さらに、上記態様の精製方法を用いると、除菌処理、透析処理、精製処理等行うことなく、培養液そのものを対象として精製する（不純物・菌体等を除去する）ことができ、培養液そのものからヒアルロン酸類を分離・精製する際にも優れた効果を奏する。遠心分離や濾過処理等の煩雑な操作を行うことなく、培養液をそのまま用いることで、さらなる効率化と、コスト削減等の効果を得ることが出来る。
　上記態様の精製方法を行う際のヒアルロン酸類溶液のヒアルロン酸類濃度は、溶液粘度の高さに起因する取り扱いの困難さ及びヒアルロン酸類の溶解度の観点からは、これに限定されるものではないが、０．１～２０ｇ／Ｌが望ましく、０．５～１５ｇ／Ｌがさらに望ましく、１～１０ｇ／Ｌが最も望ましい。
　上記態様の精製方法の対象となるヒアルロン酸類溶液のｐＨは、ヒアルロン酸の分解を防ぎ、分子量の低下を防ぐという観点からは、これに限定されるものではないが、３～１２が望ましく、３～９が最も望ましい。さらに、精製（吸着）効果をさらに高めるという観点からは、これに限定されるものではないが、ｐＨが３．５以上及び／又は７以下であることが望ましい。
　上記態様の精製方法を用いる際のヒアルロン酸類溶液の温度は、これに限定されるものではないが、０～８０℃であることが望ましい。温度が８０℃以下であれば、処理中のヒアルロン酸類の分解及び分子量の低下を、強く抑えることができる。
　上記態様の精製方法において、活性炭懸濁液を、精製対象のヒアルロン酸溶液と接触させる際には、一回懸濁し、そのまま保持してもよいが、持続して懸濁・攪拌することが望ましい。攪拌を行う場合は、これに限定されるものではないが、１０分間～１時間の攪拌が望ましく、２０～４０分間の攪拌がさらに望ましい。
　上記態様の各方法における活性炭懸濁液の加熱処理においては、活性炭懸濁液を１００℃以上で２０分間以上加熱することにより不純物の除去能力が向上する。しかしながら、加熱処理の効果を高めるために、温度は、これに限定されるものではないが、１２０℃以上が更に望ましく、１２１℃かまたはそれ以上であることが最も望ましい。また、加熱処理の効果を高めるために、加熱時の気圧が高いことが望ましい。そのような高い気圧としては、これに限定されるものではないが、例えば、０．１ＭＰａ以上が望ましく、０．２ＭＰａ以上がさらに望ましい。また、加熱処理の効果を高めるために、加熱時間は、これに限定されるものではないが、３０分以上であることが更に好ましく、１時間以上であることが最も好ましい。また、加熱時には、攪拌を持続しながら加熱することが望ましく、その際には、これに限定されるものではないが、５０～１０００ｒｐｍで攪拌することが望ましく、１００～６００ｒｐｍで攪拌することがさらに望ましい。
　上記態様の各方法において、加熱後活性炭懸濁液を攪拌冷却する際には、加熱した活性炭懸濁液を、攪拌を継続することにより、冷却する。前処理において攪拌を行いつつ冷却した場合、攪拌を行わないで冷却する場合と比較して、ヒアルロン酸類の精製時の分子量低下をより大きく低減することができる。攪拌冷却時の周囲の温度は、これに限定されるものではないが、０℃～８０℃が望ましく、１０℃～６０℃がさらに望ましく、１５～４０℃が最も望ましい。また、特に操作を行わない温度である室温で操作してもよい。攪拌時間は、これに限定されるものではないが、１時間以上であることが望ましく、２時間以上であることがさらに望ましく、３時間以上であることがよりさらに望ましく、４時間以上であることが最も望ましい。冷却完了温度が同一の温度であっても、適切な攪拌時間で攪拌する方が、精製に用いた際のヒアルロン酸類の分子量の低減抑制効果が大きい。また、冷却完了温度は、ヒアルロン酸の分子量低下などに与える影響から、低い方が望ましい。これに限られるものではないが、冷却完了温度は８０℃以下が望ましく、冷却完了温度は６０℃以下がさらに望ましい（０℃以上）。
　上記態様の精製方法で用いられる活性炭の量は、これに限定されるものではないが、ヒアルロン酸類溶液１００重量％に対し、０．５～２０．０重量％であることが望ましく、５．０～２０．０重量％であることがさらに望ましい。これらの範囲内では、より高い精製（吸着）作用が期待できる。
　さらに、活性炭の原料としては、特に生体に適用する際に問題となり得る不純物等の観点からは、木材由来が望ましく、その形状は、分散性や吸着効率の観点からは、粉末状が望ましい。
　また、本発明の更なる態様では、上記態様において、ヒアルロン酸類がストレプトコッカス・エキＦＭ－１００（微工研条寄第９０２７号）あるいはストレプトコッカス・エキＦＭ－３００（微工研条寄第２３１９号）により生産される。これらの微生物により生産されたヒアルロン酸類を精製対象として用いることで、より不純物が少なく、高分子量のヒアルロン酸類精製物を得ることができ、特に医薬として用いる際には優れた効果を発揮する。
　上記態様の精製方法を用いることで、ヒアルロン酸類の分離・精製工程の負荷を軽減することができるため、上記態様に関する精製方法は、製造の工業的なプロセスの比較的初期段階で用いることが特に有効的である。
　さらに、上記態様の精製方法を、クリーン環境下で行うことにより、従来は困難であった、医薬品に要求される高品質のヒアルロン酸類の工業的規模での効率的な精製が可能となる。このような精製方法は、医薬品用のヒアルロン酸類の生産において、極めて高い産業的有用性を有する。
　なお、上記実施態様、態様により説明される精製方法等は、本発明を限定するものではなく、例示することを意図して開示されているものである。本発明の技術的範囲は、特許請求の範囲の記載により定められるものであり、当業者は、特許請求の範囲に記載された発明の技術的範囲において種々の設計的変更が可能である。
　例えば、上記精製方法等は、更なる他の工程を含むか、あるいは、上記精製方法に引き続いて更なる他の工程・方法が実施され、ヒアルロン酸類等を製造する方法であってもよい。そのような工程・方法としては、例えば、同時あるいは別々に行われる、ヒアルロン酸生産微生物菌株を培養する工程、ヒアルロン酸産生微生物菌株培養液から培養濾液を製造する工程、精製対象液を遠心分離する工程、対象液を中和する工程、対象液に塩を添加する工程、精製対象液を精密濾過する工程、対象液を透析処理する工程、精製対象液に芳香族系吸着樹脂を加える工程、対象液を限外濾過する工程、対象液をクロマトグラフィーで精製する工程、対象液に活性炭の吸着剤を加える工程、活性炭を対象液から分離する工程、活性炭を対象液から除去する工程、有機溶媒を加えてヒアルロン酸類を沈殿させる工程、ヒアルロン酸類を結晶化する工程、ヒアルロン酸類を乾燥させる工程などが挙げられる。
　以下、本発明を実施例により更に具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
　ストレプトコッカス・エキＦＭ－１００（微工研菌寄第９０２７号）を用いて培養した発酵液１５０ｍｌ（ヒアルロン酸ナトリウム濃度３．５ｇ／ｌ、ＰＨ４．０）を３００ｍｌのガラスビーカーに採取し、表２又は３に示す条件で調製した吸着剤（活性炭等）による処理を行い、マグネチックスターラーを用い４００ｒｐｍで３０分間懸濁攪拌処理した。その処理液を濾紙を用いて濾過紙し、濾液１５０ｍｌに塩化ナトリウム４．５ｇ（３．０重量％）を添加後、エタノール６００ｍｌでヒアルロン酸ナトリウムを析出させた。この析出ヒアルロン酸ナトリウムを、エタノール３００ｍｌで洗浄した後、４０℃で真空乾燥させてヒアルロン酸ナトリウム０．５ｇを得た。
　このようにして得られたヒアルロン酸ナトリウムを、表４に示す評価項目、評価基準を用いて評価した。精製条件及び評価結果を表２及び３（実験例１～１７）に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
 *ET：エンドトキシン
　以上の実験の結果から、一定の前処理方法で前処理された活性炭を用いて精製することにより、ヒアルロン酸類溶液から、不純物を効果的に吸着除去し、精製できることが確認された。
　以上、本発明を実施例に基づいて説明した。この実施例はあくまで例示であり、種々の変形例が可能なこと、またそうした変形例も本発明の範囲にあることは当業者に理解されるところである。

Claims (1)

  1. 　ヒアルロン酸及び／又はその塩と不純物を含むヒアルロン酸類溶液を、活性炭懸濁液と接触させる工程とを含む、ヒアルロン酸及び／又はその塩の精製方法。
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