JP2007063400A - アオヤギ由来のコンドロイチン硫酸 - Google Patents
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Abstract
【課題】より安価に、且つ大量に製造でき、尚かつ種々の有用な用途が期待できる新規なコンドロイチン硫酸およびその製造方法の提供。
【解決手段】アオヤギ(バカ貝)から得られ、非硫酸化GalNAc(%):22.0±3.3、C6位一硫酸化GalNAc(%):10.7±15.8、C4位一硫酸化GalNAc(%):12.5±10.5、C4,C6位二硫酸化GalNAc(%):54.8±5.3、C2位一硫酸化GlcA(%)23.6±8.7であるが、好ましくは、 非硫酸化GalNAc(%):22.0±2.2、C6位一硫酸化GalNAc(%):10.7±10.6、C4位一硫酸化GalNAc(%):12.5±5.7、C4,C6位二硫酸化GalNAc(%):54.8±1.6、C2位一硫酸化GlcA(%)23.6±1.7を含んでなるコンドロイチン硫酸およびその製造方法。
【選択図】なし
Description
acidと命名された。その後、硫酸エステルを持つことがわかりchondroitin sulfateと呼ばれるようになった。さらに1951年、Meyerらによって、コンドロイチン硫酸には3種類有り(A,B,C)軟骨中にはAとCが存在することが明らかにされた。コンドロイチン硫酸鎖を持つプロテオグリカンとしては、アグリカン、バーシカン、デコリンなどがあるが、これらの機能は不明なものも多い。しかし、アグリカンの軟骨組織機能を制御する活性や、バーシカンの抗細胞接着活性は、コンドロイチナーゼ処理により完全に消失するので、コンドロイチン硫酸鎖がそれらの活性を担っていると考えられる。さらに、網膜神経細胞に対する神経栄養因子や、神経突起伸張因子としてコンドロイチン硫酸プロテオグリカンが単離されたが、これらの活性もコンドロイチナーゼ処理により消失した。最近では、コンドロイチン硫酸由来の二糖がナチュラルキラー細胞の活性化を抑えるという報告もある。また、コンドロイチン硫酸、カラギーナン、硫酸化デキストランなどの硫酸化多糖がインフルエンザウイルスや単純ヘルペスウイルスなど多数のウイルスの細胞への感染を阻害することは、ヒト免疫不全ウイルス(HIV)の出現以前から知られていた。このように、コンドロイチン硫酸には多様な生理活性や物性が認められることから、抗炎症剤などの医薬品をはじめ、保湿剤として化粧品あるいは目薬に、ゲル化剤・ゼリー化剤等の食品添加物として、また最近では関節炎に有効な健康食品として利用されており、日常生活において意外に広い範囲で見かけることができる。また、これら通常の用途以外にも、その特性から様々な目的の医薬品などとして潜在的な利用価値が期待されている。
C6位一硫酸化GalNAc(%):10.7±10.6 C4位一硫酸化GalNAc(%):12.5±5.7 C4,C6位二硫酸化GalNAc(%):54.8±1.6、C2位一硫酸化GlcA(%)23.6±1.7である。
(1)バカ貝(アオヤギ)の加工工程中に排出される残渣部及び粘液、あるいは熱水抽出物のみを分離して、液体窒素下−120℃で粉砕・乾燥したものを原料とした。
1)約100mgの粉体を2000mlの三角フラスコに入れ、アセトン700mlを加え、10分間攪拌した。熱水抽出物の場合はこの工程を省略することができる。
2)5分間放置し上澄み液を除去した。
3)1)−2)の操作をさらに3回繰り返した。
4)残った沈殿を減圧デシケーターで乾燥した。
5)得られた試料は−30℃で保存した。
2)37℃の湯浴中で、3時間攪拌した。
3)酢酸でpH7.0に中和した。
2)酢酸カルシウムを終濃度0.02Mになるように加えた。
3)防腐のためメタノール5mlを加えた。
4)アクチナーゼE50mgを加えた。
5)37℃の湯浴中で、48時間ゆっくりと攪拌した。
2)上澄を0.45μmメンブランフィルターを用いて吸引濾過した。
3)濾過液に5%相当の酢酸カルシウムを加えた。
4)酢酸でpH4.5に調整した。
5)2倍量のエタノールに加えて、48時間放置した。
2)沈殿を回収し80%エタノール300mlを加え、12時間ゆっくり攪拌した。
3)10,000rpm×30分間、4℃にて遠心分離した。
4)2)−3)の操作を繰り返した。
5)沈殿に100%エタノール200mlを加え、6時間ゆっくり攪拌した。
6)10,000rpm×30分間、4℃にて遠心分離した。
7)得られた沈殿(酸性ムコ多糖)を減圧デシケーターで乾燥した。(脱脂済バカ貝(アオヤギ)粉からの見掛歩留:14.0%)
HCl中で2時間攪拌し、水洗後、2M NaOH中で2時間攪拌した。
2)上記の操作を3回繰り返した後、水洗した。
3)2.5×40cmのカラムの下に脱脂綿を詰め、空気が入らないように樹脂を詰めた。
(6−2)DOWEX 50W×2陽イオン交換樹脂処理1)上記(5)で得られた酸性ムコ多糖を、ごく少量の脱イオン水に溶解した。
2)カラムに1)を流し、20分間放置した。
3)カラムに400ml(樹脂体積の約4倍)の脱イオン水を流した。
4)流出液をすぐに1M NaOHで中和した。
(6−3)精製1)中和液を脱イオン水中で3日間透析した。
2)エバポレーターにて20ml程に濃縮した。
3)0.22mメンブランフィルターにより濾過後、凍結乾燥し乾燥標品とした。
(150MHz)及び 1H−NMR(600MHz)を使用した。また硫酸置換位置の決定、その分布はChS−SのコンドロイチナーゼABC、コンドロイチナーゼAC2による二段階脱離酵素分解によって得られる不飽和二糖のHPLC、二次元NMR(COSY1H−NMR水素核シフト相関など)分析により行った。対照サンプルとしては市販のコンドロイチン4−硫酸(ChS−A、鯨軟骨由来)及びコンドロイチン6−硫酸(ChS−C、鮫軟骨由来)(何れも生化学工業(株)製)を使用した。
50WX2)による処理(以下、プロトン交換処理と略す。)が純度及び収率に与える影響を表2にそれぞれ示した。なお、標準コンドロイチン硫酸のウロン酸含量は37%である。これらの結果から、本法により非常に高純度のコンドロイチン硫酸を得られることがわかった。また、プロトン交換処理前後で純度が大幅に増加している。このことからプロトン交換処理によって、ヒアルロン酸やデルマタン硫酸などの他の酸性ムコ多糖は完全に除去できたものと考えられる。
Claims (9)
- 非硫酸化GalNAc(%):22.0±3.3
C6位一硫酸化GalNAc(%):10.7±15.8 C4位一硫酸化GalNAc(%):12.5±10.5 C4,C6位二硫酸化GalNAc(%):54.8±5.3、C2位一硫酸化GlcA(%)23.6±8.7であるが、好ましくは、 非硫酸化GalNAc(%):22.0±2.2
C6位一硫酸化GalNAc(%):10.7±10.6 C4位一硫酸化GalNAc(%):12.5±5.7 C4,C6位二硫酸化GalNAc(%):54.8±1.6、C2位一硫酸化GlcA(%)23.6±1.7を含んでなるコンドロイチン硫酸。 - 非硫酸化N−アセチル−D−ガラクトサミンを含む二糖単位、C6位一硫酸化N−アセチル−D−ガラクトサミンを含む二糖単位、C4位一硫酸化N−アセチル−D−ガラクトサミンを含む二糖単位、C4,C6位二硫酸化N−アセチル−D−ガラクトサミン、及びC4,C6位二硫酸化N−アセチル−D−ガラクトサミンとC2位一硫酸化−D−グルクロン酸を含む二糖単位がランダムに並んだ構造を有する請求項1に記載のコンドロイチン硫酸。
- バカ貝(アオヤギ)およびその熱抽出物から得られた請求項1に記載のコンドロイチン硫酸。
- バカ貝(アオヤギ)を低温粉砕し、脱脂した後、またはバカ貝(アオヤギ)の熱抽出物を凍結乾燥後アルカリ及びプロナーゼで処理し、得られた消化液を遠心分離後エタノール沈殿させることを特徴とするコンドロイチン硫酸の製造方法。
- 前記コンドロイチン硫酸は、請求項1に記載のものであることを特徴とする請求項4記載のコンドロイチン硫酸の製造方法。
- 更に、得られた沈殿を、陽イオン交換樹脂で処理する請求項4に記載のコンドロイチン硫酸の製造方法。
- 請求項1に記載のコンドロイチン硫酸を含んでなる抗炎症剤。
- 請求項1に記載のコンドロイチン硫酸を含んでなる保湿剤。
- 請求項1に記載のコンドロイチン硫酸を含んでなる抗血液凝固剤。
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