TW202320812A - 一種透明質酸寡糖組合物及其製備方法和用途 - Google Patents
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Abstract
本發明提供一種透明質酸寡糖組合物及其製備方法和用途,其中所述透明質酸寡糖組合物包括還原端爲糖醛酸結構的透明質酸寡糖。該透明質酸寡糖組合物可以提高神經醯胺的合成和或透明質酸合成酶1(HAS1)和/或透明質酸合成酶3(HAS3)的表達,同時可以顯著促進真皮成纖維細胞膠原蛋白的生成,使真皮中的膠原蛋白含量增加,減少皺紋的產生,具有一定的抗衰老活性。本發明通過將酶解反應耦聯超濾、納濾可以使酶解得到的寡糖及時從酶解體系中分離出來,減少寡糖對酶解的抑制作用,提高酶解效率,縮短酶解時間。
Description
本發明屬生物工程技術領域,具體地,涉及一種透明質酸寡糖組合物及其製備方法和用途。
透明質酸(hyaluronic acid,HA)是一種酸性粘多糖,是由N-乙醯葡糖胺和D-葡糖醛酸雙糖重複單位通過β-(1→4)糖苷鍵和β-(1→3)糖苷鍵構成的無分支高分子糖胺聚糖,存在於動物組織細胞間質和某些細菌的莢膜中。透明質酸廣泛用於醫藥、化妝品、食品等領域,分子量一般爲10
5~ 10
7道爾頓(Da)。
不同分子量的透明質酸表現出不同的生物活性,低分子量透明質酸甚至表現出與高分子量透明質酸完全相反的活性。很多文獻都對透明質酸在創傷修復中發揮的作用進行了報導,尤其是低分子量及透明質酸寡糖作爲活性物質受到更多關注。因利用酸法、鹼法等製備透明質酸寡糖如果應用於大規模生產的話,有較高的風險,可能對操作人員或設備造成傷害,利用酶切法製備寡糖有著更大的優勢。
對於還原端爲糖醛酸的透明質酸四糖,尤其是包含HA2-12的透明質酸寡糖混合物(糖醛酸還原端)製備及功效研究報導較少。專利CN 111040048A公開了一種超低分子量透明質酸及其製備方法,該專利沒有及時將酶解過程產生的寡糖分離出來,而這存在的寡糖會對酶解正向反應造成一定的抑制,造成酶解時間的延長,增加了後期純化的難度。該專利同時也沒披露其在促進透明質酸合成酶以及神經醯胺合成方面的作用。
另外,物質的結構對其生物活性會產生影響,寡糖類物質亦是如此。
非專利文獻1披露了硫酸化透明質酸 (sHA) 具有良好的生物學功能,特定的硫酸化模式在調節糖胺聚糖和蛋白質之間的結合模式中起著關鍵作用,證明了帶有 6-O-硫酸化 (sHA-6S) 的 sHA 四糖,在體外促進大鼠 E18 海馬神經元軸突生長方面具有重要作用。
非專利文獻2採用螢光偏振競爭測定來分析合成化合物的相對結合親和力,並揭示了合成硫酸軟骨素樣四糖和中期因子之間具有相互作用。可以看出透明質酸寡糖(HAOs)聚合度或者殘基的不同,會產生不同的生物活性功能。這是值得去深入研究的。現有技術中,尚未有具有糖醛酸端基的超小分子量透明質酸對神經醯胺和透明質酸酶合成方面影響的研究。
非專利文獻3通過改變鹽酸濃度,選擇性地產生具有不同聚合度和還原端的透明質酸寡糖(HAOs),使用MOE軟件對HAOs與CD44和TLR4進行分子對接模擬的數據表明,HAOs與CD44和TLR4的結合能力隨著HAOs的聚合度增加而增加,同時當HAOs的還原端爲GlcNAc殘基時結合能力顯著增加,而當還原端爲GlcA殘基時結合能力沒有顯著變化。
非專利文獻1:Unravel a neuroactive sHA sulfation pattern with neurogenesis activity by a library of defined oligosaccharides. Yao, W., Chen, M., Dou, X., Jin, H., Zhang, X., Zhu, Y., ... & Li, Z. (2019). Unravel a neuroactive sHA sulfation pattern with neurogenesis activity by a library of defined oligosaccharides. European journal of medicinal chemistry, 163, 583-596.
非專利文獻2:Chondroitin Sulfate Tetrasaccharides: Synthesis, Three-Dimensional Structure and Interaction with Midkine. Solera, C., Macchione, G., Maza, S., Kayser, M., Corzana, F., Paz, J. L. D., & Nieto, P. M. (2016). Chondroitin sulfate tetrasaccharides: synthesis, three-dimensional structure and interaction with midkine.
非專利文獻3:Preparation, Characterization, and Inhibition of Hyaluronic Acid Oligosaccharides in Triple-Negative Breast Cancer. Han, W., Song, L., Wang, Y., Lv, Y., Chen, X., & Zhao, X. (2019). Preparation, characterization, and inhibition of hyaluronic acid oligosaccharides in triple-negative breast cancer. Biomolecules, 9(9), 436.
因此繼續研究不同結構或組成HA寡糖產品或者開發新功效是非常有意義的。
針對現有技術存在的問題,本發明提供一種透明質酸寡糖組合物及其製備方法。
具體來說,本發明涉及如下方面:
1. 一種透明質酸寡糖組合物,其中,所述透明質酸寡糖組合物包括式(I)所示結構的透明質酸寡糖:
式(I)
其中,n爲選自0-5的整數,X選自H、K、Na、Ca或Zn,較佳爲Na;
在所述透明質酸寡糖組合物中,
n=1的透明質酸寡糖的質量占比爲35-70%;
n=0的透明質酸寡糖的質量占比爲5-40%;
n=2的透明質酸寡糖的質量占比爲0-50%;
n=3的透明質酸寡糖的質量占比爲0-15%;
n=4的透明質酸寡糖的質量占比爲0-10%;
n=5的透明質酸寡糖的質量占比爲0-5%。
2. 根據項1所述的透明質酸寡糖組合物,其中,在所述透明質酸寡糖組合物中,
n=1的透明質酸寡糖的質量占比爲35-70%;
n=0的透明質酸寡糖的質量占比爲5-40%;
n=2的透明質酸寡糖的質量占比爲1-50%;
n=3的透明質酸寡糖的質量占比爲1-15%;
n=4的透明質酸寡糖的質量占比爲1-10%;
n=5的透明質酸寡糖的質量占比爲0.01-1.5%。
3. 根據項1所述的透明質酸寡糖組合物,其中,在所述透明質酸寡糖組合物中,
n=1的透明質酸寡糖的質量占比爲40-60%;
n=0的透明質酸寡糖的質量占比爲5-15%;
n=2的透明質酸寡糖的質量占比爲20-40%;
n=3的透明質酸寡糖的質量占比爲1-10%;
n=4的透明質酸寡糖的質量占比爲1-5%;
n=5的透明質酸寡糖的質量占比爲0.01-1.5%。
4. 根據項1所述的透明質酸寡糖組合物,其中,在所述透明質酸寡糖組合物中,
n=1的透明質酸寡糖的質量占比爲35-70%;
n=0的透明質酸寡糖的質量占比爲5-40%;
n=2的透明質酸寡糖的質量占比爲10-50%;
n=3的透明質酸寡糖的質量占比爲1-15%;
n=4的透明質酸寡糖的質量占比爲0.1-10%;
n=5的透明質酸寡糖的質量占比爲0.01-5%。
5. 根據項1所述的透明質酸寡糖組合物,其中,在所述透明質酸寡糖組合物中,
n=1的透明質酸寡糖的質量占比爲40-60%;
n=0的透明質酸寡糖的質量占比爲5-20%;
n=2的透明質酸寡糖的質量占比爲20-40%;
n=3的透明質酸寡糖的質量占比爲3-8%;
n=4的透明質酸寡糖的質量占比爲1-5%;
n=5的透明質酸寡糖的質量占比爲0.01-1.5%。
6. 根據項1所述的透明質酸寡糖組合物,其中,所述透明質酸寡糖組合物的重均分子量小於等於1 kDa。
7. 根據項1-3、6任一項所述的透明質酸寡糖組合物,其中,所述透明質酸寡糖組合物用於化妝品或保健品,較佳在所述化妝品或保健品中的質量濃度爲0.001-10%。
8. 一種如項1-7任一項所述的透明質酸寡糖組合物的製備方法,其中,所述製備方法包括以下步驟:
將透明質酸用透明質酸酶進行酶解反應,
分離酶解反應物以得到產物原液,
對所述產物原液進行濃縮以得到產物濃縮液;
去除所述產物濃縮液中的雜質,乾燥得到透明質酸寡糖組合物,
其中,所述透明質酸酶爲酶切β-1,3糖苷鍵的透明質酸酶,
較佳的,所述透明質酸酶爲利用畢赤酵母工程菌表達的水蛭透明質酸水解酶,
進一步較佳的,所述分離爲超濾;
進一步較佳的,所述濃縮爲納濾;
進一步較佳的,使用活性炭吸附來去除雜質。
9. 根據項8所述的方法,其中,在所述酶解反應中,所述透明質酸的初始濃度爲5-150g/L,較佳的,所述透明質酸的分子量爲1000-2000 kDa,進一步較佳的所述透明質酸酶的初始含量爲1×10
4-3×10
5U/mL。
10. 根據項8所述的方法,其中,超濾採用截留分子量爲600-1000Da的超濾膜,納濾採用截留分子量爲100-300Da的納濾膜。
11. 項1-3、6中任一項所述的透明質酸寡糖組合物在促進神經醯胺和/或透明質酸合成酶1(HAS1)和/或透明質酸合成酶3(HAS3)的合成中的用途。
12. 項4-6中任一項所述的透明質酸寡糖組合物在抗皮膚衰老中的用途。
13. 根據項12所述的用途,其中,所述透明質酸寡糖組合物通過促進膠原蛋白生成和/或表皮細胞增殖與分化而抗皮膚衰老。
14. 根據項12所述的用途,其中,所述透明質酸寡糖組合物施用於皮膚。
15. 根據項12所述的用途,其中,所述施用於皮膚的方式爲通過化妝品或醫療器械,所述透明質酸寡糖組合物在所述化妝品或醫療器械中的質量濃度爲0.0001%-5%。
16. 根據項12所述的用途,其中,所述透明質酸寡糖組合物在所述化妝品或醫療器械中的質量濃度爲0.001%-1%。
17. 項4-6中任一項所述透明質酸寡糖組合物在促進膠原蛋白生成中的用途。
18. 根據項17所述的用途,其中,所述透明質酸寡糖組合物用於製備促進膠原蛋白生成的保健品,或者用於製備保護、强化臟器的保健品,或者用於製備保護胃粘膜的保健品,或者用於製備補充鈣質的保健品,或者用於製備關節潤滑注射液。
19. 根據項18所述的用途,其中,所述透明質酸寡糖組合物在所述保健品或注射液中的質量濃度爲0.0001%-5%。
20. 根據項19所述的用途,其中,所述透明質酸寡糖組合物在所述保健品或注射液中的質量濃度爲0.001%-1%。
本發明通過將酶解反應耦聯超濾、納濾可以使酶解得到的寡糖及時從酶解體系中分離出來,減少寡糖對酶解的抑制作用,提高酶解效率,縮短酶解時間。酶解完後,利用超濾把酶截留下來可以再重複利用1-2次,提高酶的重複利用度,同時省掉了加熱滅酶活階段,減少了加熱對寡糖活性的影響,使寡糖的活性得到最大化的保留。減少活性炭加入量,減少了對操作人員的炭污染,簡化了純化製程。進一步的,本發明獲得的透明質酸寡糖組合物可以促進神經醯胺和/或透明質酸合成酶1(HAS1)和/或透明質酸合成酶3(HAS3)的合成。本發明對於透明質酸寡糖組合物工業化生產,具有重大應用價值。
本發明的透明質酸寡糖組合物分子量較小,在還原端具有糖醛酸,可以顯著促進真皮成纖維細胞膠原蛋白的生成,使真皮中的膠原蛋白含量增加,減少皺紋的產生,具有一定的抗衰老活性。同時,膠原蛋白獨有的三螺旋結構,能强力鎖住30倍的水分,使皮膚持久水潤、光澤、細嫩人體。本發明的透明質酸寡糖組合物可用於製備抗衰老和保濕的化妝品、醫療器械。本發明的透明質酸寡糖組合物具有促進膠原蛋白生成的用途,可進一步用於製備促進膠原蛋白生成的保健品,或者用於製備保護、强化臟器的保健品,或者用於製備保護胃粘膜的保健品,或者用於製備補充鈣質的保健品,或者用於製備關節潤滑注射液。
下面結合實施例進一步說明本發明,應當理解,實施例僅用於進一步說明和闡釋本發明,並非用於限制本發明。
除非另外定義,本說明書中有關技術的和科學的術語與所屬技術領域中具有通常知識者所通常理解的意思相同。雖然在實驗或實際應用中可以應用與此間所述相似或相同的方法和材料,本文還是在下文中對材料和方法做了描述。在相衝突的情况下,以本說明書包括其中定義爲准,另外,材料、方法和例子僅供說明,而不具限制性。以下結合具體實施例對本發明作進一步的說明,但不用來限制本發明的範圍。
透明質酸寡糖或透明質酸寡聚糖(oligosaccharides of HA,簡稱oligo-HA)爲分子量在10
4Da以下,單糖殘基數量爲2~25(一般爲4~16)的透明質酸分子片段。oligo-HA屬小分子多糖,其性質與普通透明質酸有很大不同。研究表明,Oligo-HA具有抗氧化、免疫調節、抗炎症和促進傷口愈合、促血管生成和抗腫瘤等生物活性。尤爲重要的是,因其分子尺寸較小,可滲入到皮膚角質層發揮深層保濕和滋潤的功效,可廣泛應用到化妝品中。
由式(I)可以看出,本發明的透明質酸寡糖的還原端爲糖醛酸結構。
其中,n選自0-5的整數,例如n可以爲0、1、2、3、4或5,X選自H、K、Na、Ca或Zn,較佳爲Na。在所述透明質酸寡糖組合物中,n=1的透明質酸寡糖的質量占比爲35-70%;n=0的透明質酸寡糖的質量占比爲5-40%;n=2的透明質酸寡糖的質量占比爲0-50%;n=3的透明質酸寡糖的質量占比爲0-15%;n=4的透明質酸寡糖的質量占比爲0-10%;n=5的透明質酸寡糖的質量占比爲0-5%。
當n=0時,透明質酸寡糖爲二糖,當n=1時,透明質酸寡糖爲四糖,當n=2時,透明質酸寡糖爲六糖,當n=3時,透明質酸寡糖爲八糖,當n=4時,透明質酸寡糖爲十糖,當n=5時,透明質酸寡糖爲十二糖。所以,在本發明的透明質酸寡糖組合物中,四糖的質量占比爲35-70%;二糖的質量占比爲5-40%;六糖的質量占比爲0-50%;八糖的質量占比爲0-15%;十糖的質量占比爲0-10%;十二糖的質量占比爲0-5%。
其中,透明質酸四糖的質量占比爲35-70%,例如可以爲35%、36%、37%、38%、39%、40%、41%、42%、43%、44%、45%、46%、47%、48%、49%、50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%,較佳爲40-60%。
透明質酸二糖的質量占比爲5-40%,例如可以爲5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%、20%、21%、22%、23%、24%、25%、26%、27%、28%、29%、30%、31%、32%、33%、34%、35%、36%、37%、38%、39%、40%,較佳爲5-15%。
透明質酸六糖的質量占比爲0-50%,例如可以爲0%、1%、5%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%、20%、21%、22%、23%、24%、25%、26%、27%、28%、29%、30%、31%、32%、33%、34%、35%、36%、37%、38%、39%、40%、41%、42%、43%、44%、45%、46%、47%、48%、49%、50%,較佳1-50%,進一步較佳20-40%。
透明質酸八糖的質量占比爲0-15%,例如可以爲0%、1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%,較佳1-15%,進一步較佳1-10%。
透明質酸十糖的質量占比爲0-10%,例如可以爲0%、1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%,較佳1-10%,進一步較佳1-5%。
透明質酸十二糖的質量占比爲0-5%,例如可以爲0%、0.01%、0.05%、0.1%、1%、2%、3%、4%、5%,較佳0.01-1.5%。
在一個具體的實施方式中,在所述透明質酸寡糖組合物中,透明質酸二糖的質量占比爲5-40%,透明質酸四糖的質量占比爲35-70%,透明質酸六糖的質量占比爲0-50%,透明質酸八糖的質量占比爲0-15%,透明質酸十糖的質量占比爲0-10%,透明質酸十二糖的質量占比爲0-5%。
在一個具體的實施方式中,在所述透明質酸寡糖組合物中,透明質酸二糖的質量占比爲5-40%,透明質酸四糖的質量占比爲35-70%,透明質酸六糖的質量占比爲1-50%,透明質酸八糖的質量占比爲1-15%,透明質酸十糖的質量占比爲1-10%,透明質酸十二糖的質量占比爲0.01-1.5%。
在一個具體的實施方式中,在所述透明質酸寡糖組合物中,透明質酸二糖的質量占比爲5-15%,透明質酸四糖的質量占比爲40-60%,透明質酸六糖的質量占比爲20-40%,透明質酸八糖的質量占比爲1-10%,透明質酸十糖的質量占比爲1-5%,透明質酸十二糖的質量占比爲0.01-1.5%。
在一個具體的實施方式中,在所述透明質酸寡糖組合物中,透明質酸二糖的質量占比爲5-10%,透明質酸四糖的質量占比爲45-55%,透明質酸六糖的質量占比爲30-40%,透明質酸八糖的質量占比爲2-8%,透明質酸十糖的質量占比爲1-2%,透明質酸十二糖的質量占比爲0.01-1%。
在一個具體的實施方式中,在所述透明質酸寡糖組合物中,透明質酸二糖的質量占比爲10%,透明質酸四糖的質量占比爲49.5%,透明質酸六糖的質量占比爲33%,透明質酸八糖的質量占比爲5%,透明質酸十糖的質量占比爲1.5%,透明質酸十二糖的質量占比爲1%。
在一個具體的實施方式中,在所述透明質酸寡糖組合物中,透明質酸二糖的質量占比爲9%,透明質酸四糖的質量占比爲49%,透明質酸六糖的質量占比爲32%,透明質酸八糖的質量占比爲7%,透明質酸十糖的質量占比爲2%,透明質酸十二糖的質量占比爲1%。
進一步地,所述透明質酸寡糖組合物的重均分子量小於等於1 kDa,例如可以爲1kDa、990Da、980Da、970Da、960Da、950Da、940Da、930Da、920Da、910Da、900Da、890Da、880Da、870Da、860Da、850Da、840Da、830Da、820Da、810Da、800Da、790Da、780Da、770Da、760Da、750Da、740Da、730Da、720Da、710Da、700Da。
本發明的透明質酸寡糖組合物可以促進神經醯胺和/或透明質酸合成酶1和/或透明質酸合成酶3的表達。其中,神經醯胺(Ceramide)是以神經醯胺爲骨架的一類磷脂,主要有神經醯胺磷酸膽鹼和神經醯胺磷酸乙醇胺,磷脂是細胞膜的主要成分,角質層中40%~50%的皮脂由神經醯胺構成,神經醯胺是細胞間基質的主要部分,在保持角質層水分的平衡中起著重要作用。神經醯胺具有很强締合水分子能力,它通過在角質層中形成網狀結構維持皮膚水分。因此,神經醯胺具有保持皮膚水分作用。
皮膚中的透明質酸(Hyaluronic Acid,HA)主要由透明質酸合成酶(Hyaluronan Synthases,HAS)催化合成。已在哺乳動物中鑒定出三種HAS亞型(HAS1,HAS2 ,HAS3)。HAS參與質膜內側不同分子量的透明質酸鏈的合成,同時將合成的透明質酸分泌到細胞外基質中。據報導,HAS1和HAS2合成透明質酸鏈長度相似,約爲2000 KDa,HAS3催化合成透明質酸分子量在200-300kDa之間。細胞外的大分子HA被透明質酸酶酶解或發生氧化反應降解可以獲得小分子 HA。小分子HA 能夠刺激細胞激增, 啓動信號級聯反應, 同時還參與血管生成。100-300Ka的透明質酸具有軟化角質、鎖水、立體保濕的作用。進一步地,文獻“Expression of Hyaluronan Synthase and Collagen Type I mRNA by Hyaluronan Tetrasaccharides in Normal Human Dermal Fibroblasts”披露透明質酸四糖能促進HAS1的表達,但對HAS2和HAS3的表達無影響。
本發明的透明質酸寡糖組合物可用於化妝品或保健品,較佳在所述化妝品或保健品中的質量濃度爲0.001-10%,例如可以爲0.001%、0.005%、0.01%、0.1%、0.5%、1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%。可以根據所述透明質酸寡糖組合物在化妝品或保健品中的不同用途進一步調整其在化妝品或保健品中的質量濃度。例如,當所述透明質酸寡糖組合物在化妝品或保健品中用於促進神經醯胺表達時,其質量濃度可以爲0.001-1%。當所述透明質酸寡糖組合物在化妝品或保健品中用於促進透明質酸合成酶1(HAS1)和/或透明質酸合成酶3(HAS3)的表達時,其質量濃度可以爲0.01-10%,所述透明質酸寡糖組合物用於細胞中促進透明質酸合成酶1(HAS1)和/或透明質酸合成酶3(HAS3)的表達時,其質量濃度可以爲0.001-1%。
本發明還提供一種透明質酸寡糖組合物的製備方法,所述製備方法包括以下步驟:將透明質酸用透明質酸酶進行酶解反應,分離酶解反應物以得到產物原液,對所述產物原液進行濃縮以得到產物濃縮液;去除所述產物濃縮液中的雜質,乾燥得到透明質酸寡糖組合物,其中,所述透明質酸酶爲酶切β-1,3糖苷鍵的透明質酸酶,較佳,所述分離爲超濾;進一步較佳,所述濃縮爲納濾;進一步較佳,使用活性炭吸附來去除雜質。
製備方法中所使用的透明質酸酶爲酶切β-1,3糖苷鍵的透明質酸酶,保證透明質酸酶切得到的寡糖的還原端爲糖醛酸結構。
在一個具體的實施方式中,所述透明質酸酶爲利用畢赤酵母工程菌表達的水蛭透明質酸水解酶。其製備方法可以參照CN103695448A所描述的方法。
其中超濾是一種膜分離技術,(UItrafil-tration,簡稱UF)。能夠將溶液淨化,分離或者濃縮。超濾是介於微濾與納濾之間,且三者之間無明顯的分界線。一般來說,超濾膜的孔徑在0.05 μm–1 nm之間,操作壓力爲0.1–0.5 Mpa。主要用於截留去除水中的懸浮物、膠體、微粒、細菌和病毒等大分子物質。超濾膜根據膜材料,可分爲有機膜和無機膜。按膜的外型,又可分爲:平板式、管式、毛細管式、中空纖維和多孔式。目前家用超濾淨水器,多以中空膜爲主。
納濾(NF)是一種介於反滲透和超濾之間的壓力驅動膜分離過程,納濾膜的孔徑範圍在幾個納米左右。納濾(NF)用於將相對分子質量較小的物質,如無機鹽或葡萄糖、蔗糖等小分子有機物從溶劑中分離出來。納濾又稱爲低壓反滲透,是膜分離技術的一種新興領域,其分離性能介於反滲透和超濾之間,允許一些無機鹽和某些溶劑透過膜,從而達到分離的效果。
通過控制酶解反應的條件,如底物和酶的用量、底物的分子量、反應溫度和反應時間等,以及超濾和納濾所採用的不同型號的膜,可以獲得不同分子量,不同寡糖占比的透明質酸寡糖組合物。
在一個具體的實施方式中,在酶解反應中,所述透明質酸的初始濃度爲5-150g/L,例如可以爲5 g/L、10 g/L、20 g/L、30 g/L、40 g/L、50g/L、60 g/L、70 g/L、80 g/L、90 g/L、100 g/L、110 g/L、120 g/L、130 g/L、140 g/L、150g/L。例如,反應體系爲1L,則透明質酸的初始含量爲5-150 g,即沒有發生水解時的含量爲5-150 g。
在一個具體的實施方式中,所述透明質酸的初始分子量爲1000-2000 kDa,例如可以爲1000 kDa、1100 kDa、1200 kDa、1300 kDa、1400 kDa、1500 kDa、1600 kDa、1700 kDa、1800 kDa、1900 kDa、2000 kDa。
在一個具體的實施方式中,在酶解反應中,所述透明質酸酶的初始含量爲1×10
4-3×10
5U/mL,例如可以爲1×10
4U/mL、2×10
4U/mL、4×10
4U/mL、6×10
4U/mL、8×10
4U/mL、1×10
5U/mL、1.5×10
5U/mL、2×10
5U/mL、2.5×10
5U/mL、3×10
5U/mL。其中,透明質酸酶活力單位定義(U)爲:在pH 5.5和38℃條件下,每小時從透明質酸糖鏈中釋放出1 μg葡萄糖還原當量的還原糖所需的酶量。
在一個具體的實施方式中,在酶解反應中,所述透明質酸酶與所述透明質酸的初始比值爲1-5U/mg,例如可以爲1 U/mg、2 U/mg、3 U/mg、4 U/mg、5 U/mg。
在一個具體的實施方式中,超濾採用截留分子量爲600-1000Da的超濾膜,例如截留分子量可以爲600Da、700Da、800Da、900Da、1000Da,納濾採用截留分子量爲100-300Da的納濾膜,例如截留分子量可以爲100Da、200Da、300Da。
在一個較佳的實施方式中,超濾採用截留分子量爲1000Da的超濾膜,納濾採用截留分子量爲200Da的納濾膜。
本發明所述的截留分子是使用分子量大小表示的超濾膜的截留性能,又稱作切割分子量。由於直接測定超濾膜或納濾膜的孔徑相當困難,所以使用已知分子量的球狀物質進行測定。如膜對被截留物質的截留率大於90%時,就用被截留物質的分子量表示膜的截留性能,稱爲膜的截留分子量。例如截留分子量爲10 kDa的膜可以截留分子量大於10 kDa的物質,而允許分子量小於10 kDa的物質通過。
所述方法中的乾燥可以採用現有技術中的各種方式的乾燥。在一個具體的實施方式中,所採用的乾燥爲噴霧乾燥。噴霧乾燥中所採用的進風溫度爲120℃-160℃,出風溫度60℃-80℃。
進一步地,所述方法得到的透明質酸寡糖組合物爲上述的透明質酸寡糖組合物,即式(I)所示結構的透明質酸寡糖:
其中,n爲選自0-5的整數,X選自H、K、Na、Ca或Zn,較佳爲Na。
其中,透明質酸寡糖產物的平均分子量可以通過多角度激光光散射儀測得。透明質酸寡糖產物中各種寡糖的鑒定可以採用質譜進行檢測,各種寡糖的含量可以採用高效液相色譜進行檢測。
本發明還提供上述透明質酸寡糖組合物在促進透明質酸合成酶1(HAS1)和/或透明質酸合成酶3(HAS3)的表達中的用途。
本發明的透明質酸寡糖組合物具有還原端爲糖醛酸結構的透明質酸二糖、透明質酸四糖、透明質酸六糖、透明質酸八糖、透明質酸十糖、透明質酸十二糖等多種類型的的透明質寡糖。該寡糖組合物無細胞毒性,對人體皮膚無潜在的不良反應;能顯著促進成纖維細胞中透明質酸合酶HAS1、HAS3表達,尤其是促進HAS3的表達;可顯著促進神經醯胺的合成。
人類的皮膚隨年齡增長自然老化或隨著環境刺激而衰老,導致皮膚衰老。自然老化爲內源性老化,表現爲皮膚變白,出現細小皺紋、彈性下降、皮膚鬆弛等,環境刺激爲外源性老化,如日曬所致的光老化。如果皮膚得不到良好的保養或隨著年齡增長而衰退,死皮就會附著在皮膚表面而不脫落,因而造成一系列問題,嚴重影響美容。
其中,n爲選自0-5的整數;
X選自H、K、Na、Ca或Zn,較佳爲Na。
在所述透明質酸寡糖組合物中,
n=1的透明質酸寡糖的質量占比爲35-70%,n=0的透明質酸寡糖的質量占比爲5-40%,n=2的透明質酸寡糖的質量占比爲10-50%,n=3的透明質酸寡糖的質量占比爲1-15%,n=4的透明質酸寡糖的質量占比爲0.1-10%,n=5的透明質酸寡糖的質量占比爲0.01-5%。
皮膚衰老的原因主要由以下幾點體現:1.真皮層細胞外基質的改變。膠原是真皮細胞外基質的主要成分,在人體真皮中約占蛋白質的90%。膠原蛋白種類較多,常見類型爲Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型、Ⅴ型和Ⅺ型。真皮中的蛋白主要由Ⅰ型膠原(80%)和少量的Ⅲ型膠原(10%)組成,膠原使皮膚有强度和彈性。隨著年齡的增長,皮膚中膠原纖維減少,使皮膚失去彈性,產生皺紋。真皮中的膠原蛋白主要由成纖維細胞分泌,成纖維細胞分泌的膠原蛋白減少也是引起衰老、產生皺紋的一大原因之一。2.基底層結構的改變。人的皮膚在衰老後,基底層結構鬆弛,細胞連接稀鬆,使得真皮-表皮間的物質交換效率降低。從而導致表皮營養不足,表皮細胞不能正常地增殖與分化。進而使得表皮變薄,產生鬆弛等現象。
針對上述皮膚衰老的主要原因,所述透明質酸寡糖組合物可以通過促進膠原蛋白生成和/或表皮細胞增殖與分化而抗皮膚衰老。
在一個具體的實施方式中,所述透明質酸寡糖組合物通過促進膠原蛋白生成而抗皮膚衰老。
在一個具體的實施方式中,所述透明質酸寡糖組合物通過促進表皮細胞增殖與分化而抗皮膚衰老。
在一個具體的實施方式中,所述透明質酸寡糖組合物可以通過促進膠原蛋白生成和表皮細胞增殖與分化而抗皮膚衰老。
在本發明的抗皮膚衰老的用途中,所述透明質酸寡糖組合物可以直接或間接地施用於皮膚,例如可以通過外敷、注射或口服等方式施用。
在本發明的抗皮膚衰老的用途中,所述透明質酸寡糖組合物可用於化妝品、醫療器械,進一步適用於皮膚。例如,所述透明質酸寡糖組合物可以單獨或與其他活性成分一起配製成化妝品,用於抗皮膚衰老。
進一步地,當所述透明質酸寡糖組合物用於化妝品、醫療器械時,透明質酸寡糖組合物用於細胞中的質量濃度爲0.0001%-0.1%。根據細胞-人體面部皮膚的表面積換算及所述透明質酸寡糖組合物的透皮情况,所述透明質酸寡糖組合物在所述化妝品或醫療器械中的質量濃度爲0.0001%-5%,例如可以爲0.0001%、0.001%、0.01%、0.05%、0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%、0.7%、0.8%、0.9%、1%、2%、3%、4%、5%,較佳爲0.001%-1%。
本發明還提供上述透明質酸寡糖組合物在促進膠原蛋白生成中的用途。
內臟器官及組織都含有膠原蛋白,在這些臟器表皮結構的下方是膠原蛋白,膠原蛋白能夠保護及强化臟器,因此所述透明質酸寡糖組合物可用於製備保護、强化臟器的保健品。
膠原蛋白是肌肉組織的主要成分,可以爲肌肉提供所需營養,保護胃粘膜,因此所述透明質酸寡糖組合物可用於製備保護胃粘膜的保健品。
膠原蛋白同時也是組成鈣質附著網架,鎖定骨鈣,防止鈣流失,因此所述透明質酸寡糖組合物可用於製備補充鈣質的保健品。
膠原蛋白還能有效修復關節軟骨,恢復關節軟骨表面的潤滑,減少摩擦。因此所述透明質酸寡糖組合物可用於製備關節潤滑注射液。
在一個具體的實施方式中,所述透明質酸寡糖組合物在所述保健品或注射液中的質量濃度爲0.0001%-5%,例如可以爲0.0001%、0.001%、0.01%、0.05%、0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%、0.7%、0.8%、0.9%、1%、2%、3%、4%、5%,較佳爲0.001%-1%。
實施例
實施例1 透明質酸寡糖組合物製備
於5L反應器中,加入4L水,控制溫度40℃,加入透明質酸酶(該酶爲利用畢赤酵母工程菌表達的水蛭透明質酸酶,製備方法參照CN 103695448 A中描述的方法)4×10
8U,體系酶活爲1×10
5U/mL,加入40g透明質酸(分子量150kDa),待其完全溶解後,採用超濾分離酶解反應物以得到產物原液,採用納濾對所述產物原液進行濃縮以得到產物濃縮液。保持體系40℃攪拌反應18h。其中超濾採用截留分子量爲1 kDa的超濾膜,納濾採用截留分子量爲200 Da的納濾膜。反應結束,收集納濾濃縮液,加入活性炭吸附後,過濾收集濾液,進行噴霧乾燥,其中進風溫度140℃,出風溫度70℃。得到透明質酸寡糖組合物,產品收率爲86%。
將透明質酸寡糖組合物使用高效液相色譜儀分析其寡糖分布,具體的色譜條件爲:
色譜柱:SUPERDEX 200 10/300 GL
柱溫:40℃
檢測器:紫外-可見分光檢測器
流動相:1mol/L硫酸銨溶液
進樣濃度:0.5%
進樣量:20 μL
流速:2 ml/min
檢測波長:200nm
結果如圖1所示,在透明質酸寡糖組合物中,透明質酸二糖的質量占比爲9.12%,透明質酸四糖的質量占比爲47.73%,透明質酸六糖的質量占比爲32.83%,透明質酸八糖的質量占比爲6.05%,透明質酸十糖的質量占比爲1.49%,透明質酸十二糖的質量占比爲0.42%。
使用激光光散射儀(DAWN HELEOS-II)測量透明質酸寡糖組合物的平均分子量爲890 Da。
實施例2 透明質酸寡糖組合物製備
於5L反應器中,加入4L水,控制溫度30℃,加入透明質酸酶(該酶爲利用畢赤酵母工程菌表達的水蛭透明質酸酶,製備方法參照CN 103695448 A中描述的方法)4×10
7U,體系酶活爲1×10
4U/mL,加入5g透明質酸(分子量100kDa),待其完全溶解後,採用超濾分離酶解反應物以得到產物原液,採用納濾對所述產物原液進行濃縮以得到產物濃縮液。保持體系30℃攪拌反應12h。其中超濾採用截留分子量爲1 kDa的超濾膜,納濾採用截留分子量爲200 Da的納濾膜。反應結束,收集納濾濃縮液,加入活性炭吸附後,過濾收集濾液,進行噴霧乾燥,其中進風溫度120℃,出風溫度60℃。得到透明質酸寡糖組合物,產品收率爲84%。
將透明質酸寡糖組合物使用高效液相色譜儀分析其寡糖分布,具體的色譜條件同實施例1。結果如圖2所示,在透明質酸寡糖組合物中,透明質酸二糖的質量占比爲9.35%,透明質酸四糖的質量占比爲47.84%,透明質酸六糖的質量占比爲32.92%,透明質酸八糖的質量占比爲6.04%,透明質酸十糖的質量占比爲1.48%,透明質酸十二糖的質量占比爲0.42%。
使用激光光散射儀測量透明質酸寡糖組合物的平均分子量爲920 Da。
實施例3 透明質酸寡糖組合物製備
於5L反應器中,加入4L水,控制溫度46℃,加入透明質酸酶(該酶爲利用畢赤酵母工程菌表達的水蛭透明質酸酶,製備方法參照CN 103695448 A中描述的方法)1.2×10
9U,體系酶活爲3×10
5U/mL,加入150g透明質酸(分子量200kDa),待其完全溶解後,採用超濾分離酶解反應物以得到產物原液,採用納濾對所述產物原液進行濃縮以得到產物濃縮液。保持體系46℃攪拌反應24h。其中超濾採用截留分子量爲1 kDa的超濾膜,納濾採用截留分子量爲200 Da的納濾膜。反應結束,收集納濾濃縮液,加入活性炭吸附後,過濾收集濾液,進行噴霧乾燥,其中進風溫度160℃,出風溫度80℃。得到透明質酸寡糖組合物,產品收率爲87%。
將透明質酸寡糖組合物使用高效液相色譜儀分析其寡糖分布,具體的色譜條件同實施例1。結果如圖3所示,在透明質酸寡糖組合物中,透明質酸二糖的質量占比爲8.94%,透明質酸四糖的質量占比爲52.80%,透明質酸六糖的質量占比爲29.00%,透明質酸八糖的質量占比爲4.71%,透明質酸十糖的質量占比爲1.5%,透明質酸十二糖的質量占比爲0.40%。
使用激光光散射儀測量透明質酸寡糖組合物的平均分子量爲915 Da。
對比例1
於5L反應器中,加入4L水,控制溫度40℃,加入透明質酸酶(該酶爲利用畢赤酵母工程菌表達的水蛭透明質酸酶,製備方法參照CN 103695448 A中描述的方法)8×10
8U,體系酶活爲2×10
5U/mL,加入100g透明質酸(分子量150KDa),待其完全溶解後,保持體系40℃攪拌反應20h。反應結束,收集反應液,加入活性炭吸附後,過濾收集濾液,進行噴霧乾燥,其中進風溫度140℃,出風溫度70℃。得到透明質酸水解產物,產品收率爲90%。
將透明質酸水解產物使用高效液相色譜儀分析其寡糖分布,具體的色譜條件同實施例1。結果如圖4所示,在透明質酸寡糖組合物中,透明質酸二糖的質量占比爲0.00%,透明質酸四糖的質量占比爲0.98%,透明質酸六糖的質量占比爲2.10%,透明質酸八糖的質量占比爲2.67%,透明質酸十糖的質量占比爲3.31%,透明質酸十二糖的質量占比爲3.97%。
使用激光光散射儀測量透明質酸寡糖組合物的平均分子量爲7580Da。
對比例2透明質酸寡糖組合物製備
參考CN112646055A中描述的方法製備得到更高分子量的透明質酸寡糖組合物,具體製備方法如下:
1)預處理:將50g分子量爲1000kDa的高分子量透明質酸溶於30倍重量份的水中,用0.1mol/L甲醇鈉溶液調節溶液pH至8.5,在室溫下充分攪拌溶脹,緩慢升溫至90℃,恒溫水解4h,然後將經浸提抽濾,濾渣重複上述浸提操作,合併兩次濾液備用;
2)中性鹽分級沉澱:將步驟1)得到的溶液加熱至40℃,加入溶液重量的25%的硫酸鎂固體,攪拌完全溶解後用0.1μm的磺化聚碸超濾膜進行超濾,接著向濾液中再次加入溶液重量的43%的硫酸鎂固體,攪拌至完全溶解後靜置沉澱,然後進行過濾、超濾、乾燥,再然後將乾燥後的沉澱物加入6倍的純化水複溶;
3)過濾純化:將步驟2)得到的溶液經截留分子質量爲4KDa的磺化聚碸微濾膜在0.3MPa透膜壓力下進行超濾預處理;滲出液再經截留分子質量爲2KDa的磺化聚碸納濾膜進行納濾濃縮,最終所得濃縮液經真空冷凍乾燥得到透明質酸寡糖組合物。
使用激光光散射儀(型號:DAWN HELEOS-II)測量透明質酸寡糖組合物的平均分子量爲2682Da。
試驗例
試驗例1
採用ESI-MS對實施例2得到的透明質酸寡糖組合物進行表徵,質譜檢測的條件爲:
色譜儀:Waters Acquity UPLC;分析色譜柱:BEH Amide 2.1 mm×100 mm 1.7 μm,柱溫:45℃,流速 0.3 mL/min,進樣量 1 μL,流動相:A:甲酸銨,B:乙腈,按照表1所示的條件進行程序洗脫,離子方式:ESI。離子源參數 ESI,霧化器壓力:30 psi;脫溶劑氣體流速 50 L/h;溫度 400℃;負離子模式。
表1
流動相種類 | 甲酸銨(V/V) | 乙腈(V/V) | 時間(min) |
流動相比例 | 5% | 95% | 3 |
40% | 60% | 9 | |
5% | 95% | 12 |
結果如圖5-10所示,在質譜總離子流峰圖上1.380 min出現的質譜峰 [M]爲397.1,鑒定爲透明質酸二糖(圖6);在質譜總離子流峰圖上3.649min出現的質譜峰 [M]爲776.2,鑒定爲透明質酸四糖(圖7);在質譜總離子流峰圖上5.612min出現的質譜峰 [M]爲1155.3,鑒定爲透明質酸六糖(圖8);在質譜總離子流峰圖上6.724 min出現的質譜峰 [M]爲1535.5,鑒定爲透明質酸八糖(圖9);在質譜總離子流峰圖上7.257 min出現的質譜峰 [M]爲1913.5,鑒定爲透明質酸十糖(圖10),在其後出現的質譜峰[M]爲2292.6,鑒定爲透明質酸十二糖(圖10)。
試驗例2透明質酸寡糖組合物的還原端鑒定
對實施例2和對比例2得到的透明質酸寡糖組合物進行還原端鑒定。
利用Morgan–Elson反應,根據比色法確定透明質酸寡糖組合物的還原端。如果變紅證明還原端爲N-乙醯葡糖胺,如果不變紅證明還原端爲糖醛酸。
反應緩衝液:鹼性硼酸溶液(在10ml水中溶解1.73 g H3BO3和0.78 g KOH,在使用前加入其體積十分之一的0.8 g ml-1 K2CO3。)對二甲基氨基苯甲醛溶液 (將2克對二甲基氨基苯甲醛溶液溶於2.5 ml 濃鹽酸和7.5 ml 冰醋酸中,使用前用4倍體積冰醋酸稀釋)。
取400μl 10g/L的透明質酸寡糖組合物溶液,加入110μl鹼性硼酸溶液,煮沸4min,加入了1.5ml的對二甲基氨基苯甲醛,在37℃下培養20min。
使用透明質酸(分子量1500KDa)、透明質酸四糖(HA4,購自Sigma,還原端爲N-乙醯葡糖胺)溶液作爲對照。
結果如表2所示,實施例2和對比例2製備的透明質酸寡糖組合物經Moran-Elson反應沒有顯紅色,證明還原端爲糖醛酸。
表2
Morgan–Elson反應結果 | |
實施例2 | 不變紅 |
對比例2 | 不變紅 |
試驗例3細胞毒性評價及斑貼實驗
對實施例2得到的透明質酸寡糖組合物進行細胞毒性評價及斑貼實驗
細胞毒性測試
1)鋪板:取對數生長期人表皮角質形成細胞HaCaT,以5×10
4個/mL密度接種於96孔板,每孔100μL,培養體系是DMEM高糖培養液添加10%胎牛血清。接種的細胞置二氧化碳培養箱37℃、5% CO
2常規培養24h。
2)樣品溶液配製:樣品以無血清培養液配成一定濃度的儲備液,併0.22µm 濾膜過濾除菌,用時用無血清培養液稀釋至所需的質量濃度爲1%、0.5%和0.05%終濃度。
3)加藥:常規培養24h後,弃去舊培養液,實驗組換成100μL樣品,正常對照組(control)加入等量無血清培養液,每個水平6個平行孔。
4)檢測:繼續培養24h後,弃去樣品溶液,每孔加入用無血清培養液配製的10%WST-1溶液,放入細胞培養箱中繼續培養3h,於450nm波長處用酶標儀測定吸光度。相對增殖率(RGR)爲實驗組吸光度與正常對照組吸光度的比值。按照GB/T16886.5-2017的要求,RGR低於70%時,認爲樣品具有細胞毒性。
結果如表3所示。
表3 細胞相對增殖率(%)
對照組 | 100±1.71 | |
透明質酸寡糖組合物 | 樣品濃度 | |
0.05% | 0. 5% | 1% |
101±0.37 | 97±1.35 | 96.56±0.72 |
表3顯示,透明質酸寡糖組合物在0.05%-1%的質量濃度範圍內,細胞相對增殖率均遠大於70%,表明透明質酸寡糖組合物無明顯細胞毒性。
斑貼試驗
1)招募健康受試者30名,男女不限。具有下列情况者作應被排除:a 近一周使用抗組胺藥或近一個月內使用免疫抑制劑者;b近兩個月內受試部位應用任何抗炎藥物者;c受試者患有炎症性皮膚病臨床未愈者;d胰島素依賴性糖尿病患者;e 正在接受治療的哮喘或其它慢性呼吸系統疾病患者; f在近 6 個月內接受抗癌化療者; g 免疫缺陷或自身免疫性疾病患者; h 哺乳期或妊娠婦女; i 雙側乳房切除及雙側腋下淋巴結切除者; j 在皮膚待試部位由於瘢痕、色素、萎縮、鮮紅斑痣或其它瑕疵而影響試驗結果的判定者; k 參加其它的臨床試驗研究者; l 體質高度敏感者; m 非志願參加者或不能按實驗要求完成規定內容者。
2)樣品的製備
實施例2的透明質酸寡糖組合物用純化水稀釋至1%的質量濃度後使用,純化水作爲對照。
3)皮膚斑貼試驗 撕開斑試器的包裝,量取配置好的樣品各 0.025mL 加入小室內。將斑試器貼敷於受試者的前臂屈側,用手掌輕壓使之均勻地貼敷於皮膚上,持續 24h。
4)結果分析 去除斑試器後 30min、24h和48h 按表4觀察記錄反應結果。
得到的結果如表5所示。
表4皮膚封閉斑貼試驗皮膚反應分級標準
反應程度 | 評分等級 | 皮膚反應 |
- | 0 | 陰性反應 |
± | 1 | 可疑反應,僅有微弱紅斑 |
+ | 2 | 弱陽性反應(紅斑反應);紅斑、浸潤、水腫、可有丘疹 |
++ | 3 | 强陽性反應(疱疹反應);紅斑、浸潤、水腫、丘疹、疱疹;反應可超出受試區 |
+++ | 4 | 極强陽性反應(融合性疱疹反應);明顯紅斑、嚴重浸潤、水腫、融合性疱疹;反應超出受試區 |
表5斑貼試驗結果統計(總例數:30)
分級 | 透明質酸寡糖組合物 | 純化水 |
0級 | 30 | 30 |
1級 | 0 | 0 |
2級 | 0 | 0 |
3級 | 0 | 0 |
4級 | 0 | 0 |
結果顯示,質量濃度爲1%的透明質酸寡糖組合物的斑貼試驗均沒有不良反應,表明透明質酸寡糖組合物對人體皮膚無潛在的不良反應。
試驗例4 寡糖組合物功效活性評價-對內源性透明質酸酶及透明質酸的影響
細胞的透明質酸合成酶1(Hylauronic acid synthase I,HAS1)、透明質酸合成酶3(Hylauronic acid synthase III,HAS3)基因表達量和透明質酸(Hylauronic acid,HA)分泌量,評價待測樣品的保濕功效。具體方法爲:
細胞接種:按 2.2×10
5個/孔的接種密度接種成纖維細胞至6孔板,培養箱(37℃、5%CO2) 中培養過夜。當6孔板中細胞鋪板率達到50%~60%時,進行分組給藥,給藥濃度分別爲0.01mg/ml 、1mg/ml和10mg/ml,每組設3個複孔。給藥完成後將6孔板放置在培養箱(37℃、5% CO2)中孵育培養24 h。ELISA 檢測:根據Hyaluronan Quantikine ELISA Kit的操作說明書進行檢測。基因檢測:2mL/孔PBS清洗兩次,每孔加入1mL RNAiso Plus,吹打裂解細胞後,收樣。依據試劑盒說明書,開展RNA提取、反轉錄及螢光定量PCR檢測,採用2 -
△△ CT方法進行結果計算。
空白對照指的是不加入樣品,其餘同試驗組同步進行。透明質酸合成酶的促進效果和內源性透明質酸的促進效果分別如表6和表7所示。
表6透明質酸合成酶的促進效果
備注:採用2 -
△△ CT方法進行結果計算,用t-test方法進行統計分析時,將空白對照組mRNA擴增倍數歸一處理。
樣品名稱 | HAS1 | HAS3 |
空白對照 | 1.01 | 1.00 |
透明質酸寡糖組合物(0.01mg/ml) | 1.06 | 1.15 |
透明質酸寡糖組合物(1mg/ml) | 3.15 | 6.15 |
透明質酸寡糖組合物(10mg/ml) | 14.44 | 25.22 |
表7內源性透明質酸的促進效果
樣品名稱 | 平均濃度(ng/mL) | 促進效果(%) |
空白對照 | 8222.51 | —— |
透明質酸寡糖組合物(0.01mg/ml) | 8253.34 | 0.4 |
透明質酸寡糖組合物(1mg/ml) | 8816.39 | 7.2 |
透明質酸寡糖組合物(10mg/ml) | 9997.42 | 21.6 |
結果表明,本發明製備的透明質酸寡糖組合物能顯著提升成纖維細胞中透明質酸合酶HAS1、HAS3,尤其是HAS3的生成。透明質酸合酶的增加,有助於提升成纖維細胞中內源性透明質酸的合成。通過對成纖維細胞中內源性透明質酸的檢測表明,其確實得到了增加,與空白組相比顯著增加。人體皮膚中的真皮層含有豐富的成纖維細胞,而透明質酸寡糖組合物分子量非常小,這表明,透明質酸寡糖組合物具有增加人體皮膚真皮層中內源性透明質酸的潜在功效。
試驗例5 透明質酸寡糖組合物功效活性評價-對神經醯胺表達量的影響
基於3D表皮皮膚模型(購自廣東博溪生物科技有限公司),測試實施例2給培養液裏面添加透明質酸寡糖組合物樣品(分別爲0.01mg/ml、1mg/ml和10mg/ml)連續作用6天後,通過皮膚模型中神經醯胺總含量除以水溶性總蛋白來歸一化後,以評估樣品對神經醯胺的促合成能力。
1. 水溶性總蛋白提取:將每組的三個模型分別剪爲兩半,其中1/2片置於一個1.5mL EP管中,並加入250μL的0.2mg/mL蛋白酶K溶液,50℃水浴2h。水浴結束後用鑷子夾取角質層於去離子水中漂洗,將角質層置於新的EP管中。在每個管中加125μL蛋白提取液;超聲震蕩 30min。超聲震蕩結束後,4℃,14000rpm離心10min。離心結束後,吸取提蛋白管中上清液至新的EP 管中,採用BCA試劑盒檢測濃度。
2. 使用BCA蛋白濃度測定試劑盒對蛋白濃度進行檢測,反應完畢後,於酶標儀562nm處讀數。
脂質提取液配製:1. 量取甲醇,氯仿各50mL,混勻;2.神經醯胺提取:將提取完蛋白剩餘的1/2模型放入裝有脂質提取液的EP管中,冰水浴超聲震蕩 2min 後,過渡到甲醇:氯仿=1:2的體系,再次在冰水浴中超聲2min;結束後,過渡到甲醇:氯仿=2:1的體系,冰浴超聲兩分鐘;結束後,夾出模型,提取液氮氣吹乾。
3. 在氮吹乾的樣品瓶中加乙腈:異丙醇=1:1的混合溶液(含神經醯胺內標),超聲 10min,震搖溶解30min,轉移到離心管中,12000 rpm 離心10min,取上層清液,待測。
空白對照指的是不加入樣品,其餘同試驗組同步進行。
結果如表8、表9和表10所示。
表8水溶性總蛋白含量測定結果
樣品名稱 | 蛋白總含量(μg) | 下降率(%) |
空白對照 | 193.17 | —— |
透明質酸寡糖組合物(0.01mg/ml) | 188.3 | 2.5 |
透明質酸寡糖組合物(1mg/ml) | 152.15 | 21.2 |
透明質酸寡糖組合物(10mg/ml) | 132.34 | 31.5 |
表8的結果表明,與對照組相比,使用過透明質酸寡糖組合物的表皮模型中水溶性蛋白含量顯著降低,該結果推測可能是因爲透明質酸寡糖組合物能夠促進皮膚模型分化,使活細胞層向角質層推進,使角質層增厚,表現出活細胞層可溶性總蛋白含量下降,從而反映出樣品寡糖組合物能夠提升表皮模型屏障。
表9神經醯胺總含量
樣品名稱 | 神經醯胺總含量(μg) | 提升率(%) |
空白對照 | 15.398 | —— |
透明質酸寡糖組合物(0.01mg/ml) | 15.732 | 2.2 |
透明質酸寡糖組合物(1mg/ml) | 22.531 | 46.3 |
透明質酸寡糖組合物(10mg/ml) | 26.562 | 72.5 |
表9的結果表明,與對照組相比,使用過透明質酸寡糖組合物的表皮模型中神經醯胺的總含量顯著提升,該結果說明了寡糖組合物能夠提升表皮模型中的神經醯胺含量。
表10神經醯胺總含量與蛋白總含量比值
樣品名稱 | 神經醯胺總含量/蛋白總含量 | 提升率(%) |
空白對照 | 0.080 | —— |
透明質酸寡糖組合物(0.01mg/ml) | 0.083 | 3.8 |
透明質酸寡糖組合物(1mg/ml) | 0.148 | 85.0 |
透明質酸寡糖組合物(10mg/ml) | 0.200 | 150.0 |
神經醯胺總含量/蛋白總含量的計算可以將皮膚中的神經醯胺進行歸一化,能更科學地反應皮膚中神經醯胺的變化。如表10所示,歸一化後的結果表明,加入寡糖組合物後,皮膚中神經醯胺含量得到顯著提升,表明透明質酸寡糖組合物可顯著促進神經醯胺的合成。
試驗例6
稱取實施例2和對比例2的透明質酸寡糖組合物各10mg,分散於10mL的DMEM培養基中,0.22μm濾膜除菌過濾,分別得到質量濃度爲0.1%的樣品1和樣品2。
試驗例6-1 膠原蛋白含量測定
膠原蛋白决定著包括皮膚在內的人體組織的物理特性。真皮中的膠原蛋白主要由成纖維細胞分泌。本發明通過評估透明質酸組合物對成纖維細胞分泌表達膠原蛋白的能力的影響來評估其對促進膠原蛋白生成的影響。
1、樣品準備
取20μL樣品1和樣品2分別加入1.98mL的10%FBS-DMEM培養基中,製成終質量濃度爲0.001%的溶液得樣品1-1、2-1。
取樣品1加入10%FBS-DMEM培養基中,製成終質量濃度分別爲0.001%、0.01%、0.0001%的溶液得樣品1-1、1-2、1-3。
2、人成纖維細胞膠原Ⅰ分泌實驗
將人成纖維細胞以1萬/孔的密度鋪於96孔板中,置於培養箱中培養24h。弃上清,將樣品1、1-1、1-2、1-3、2-1加入孔板中,每孔200μL。置於培養箱中培養48h。收集上清,將上清用DMEM培養基稀釋十倍後,使用Human ColⅠ Elisa Kit對上清中的膠原蛋白Ⅰ進行定量。結果如圖11和圖12所示。其中,對照組爲不加入任何樣品的試驗組。
3、結果顯示
如圖11所示,雖然樣品1-1和2-1均有一定的促進膠原生成的作用,但是小分子量的樣品1-1促膠原蛋白生成效果更爲顯著。其中樣品1-1使得膠原蛋白I的分泌量提高33%,而樣品2-1促膠原蛋白I的分泌量與對照組相比無顯著性差異。
如圖12所示,樣品1、樣品1-1、樣品1-2、1-3均有顯著的促進膠原生成的作用,說明實施例2的透明質酸寡糖組合物在質量濃度爲0.0001%-0.1%時均有促進成纖維細胞分泌膠原的作用。尤其是當質量濃度爲0.001%時效果最佳。
試驗例6-2 3D皮膚模型
本發明通過評估透明質酸組合物對3D全層皮膚模型的組織結構影響來評估其對表皮細胞增殖與分化的作用。
3D全層皮膚模型是利用組織工程技術,採用適當的培養基將正常人皮膚細胞在體外重建而成的類似於人體皮膚結構的活性組織。通過評估3D皮膚模型的組織結構可以判斷樣品在抗衰老方面的作用。基底層爲真皮-表皮之間的物質交換屏障,基底層的結構越穩定,表示表皮層可吸收的養分越多,則表皮細胞能更好地增殖分化,從而達到抗衰老的作用。
1、3D全層皮膚模型的構建
通過將膠原與人真皮成纖維細胞組合構建成3D全層皮膚模型的真皮層,再於真皮層上接種人角質形成細胞形成表皮層,得到完整的具有真皮-表皮結構的皮膚模型。再分別加入樣品1、樣品2對其進行處理。
2、3D全層皮膚模型石蠟組織切片
將組織放入包埋盒中,分別放入4%多聚甲醛、70%乙醇-水溶液、80%乙醇-水溶液、90%乙醇-水溶液、95%乙醇-水溶液、無水乙醇Ⅰ、無水乙醇Ⅱ、甲基環己烷Ⅰ、甲基環己烷Ⅱ中進行梯度脫水,每缸溶液1h。脫水完畢,將組織放入石蠟中包埋,修片,切成厚度爲5μm的石蠟切片。
3、3D全層皮膚模型蘇木精-伊紅染色
將石蠟切片分別放入甲基環己烷Ⅰ、甲基環己烷Ⅱ、無水乙醇、95%乙醇-水溶液、80%乙醇-水溶液、70%乙醇-水溶液、蒸餾水中浸泡10 min進行脫蠟、複水後。放入蘇木精染液中染色8 min後,依次放入鹽酸-乙醇溶液中分化2s、氨水溶液中複藍1min。接著用伊紅溶液染色1min,最後放入70%乙醇-水溶液、95%乙醇-水溶液、無水乙醇、甲基環己烷溶液中脫水,中性樹膠封片。顯微鏡下拍照。結果見圖13。其中,對照組爲不加入任何樣品的試驗組。
4、結果顯示
如圖13所示,與對照組和樣品2相比,在加入樣品1後,3D全層皮膚模型基底層細胞連接緊密,表皮層分化良好、結構完整,棘層和顆粒層結構清晰。說明樣品1具有良好的抗衰老作用。
試驗例7 透明質酸寡糖組合物透皮驗證
1. 樣品螢光標記
取實施例2的透明質酸寡糖組合物2g分散於40mL的水中配製成濃度爲50mg/mL的溶液,加入20mLDMSO溶液混勻。向上述60mL溶液中加入500μL的50mg/mL 5-羥基螢光素溶液,25μL的環己基異腈,100μL的25%乙醛溶液,在室溫下攪拌反應5小時。移取40mL螢光標記過的溶液,取飽和氯化鈉的冰乙醇溶液上層清液560mL加入,使之產生螢光標記的透明質酸沉澱。將上述溶液轉移至離心管中,置於離心機以4000*g的離心力離心10分鐘,弃去上層液體,取下螢光素標記的實施例2。
2. 螢光標記物透皮
取15mg螢光標記過的實施例2溶解於1mL的水中,製成終質量濃度爲1.5%的樣品4。以15mL的1×PBS爲接收液,25mm直徑猪皮裝載在手動透皮儀上。接收液在(32.0±0.1)℃水浴加熱,在定速磁力攪拌(300±5)r/min條件下平衡1小時。在皮膚上層加入500μL的樣品4,加蓋。經20h後結束,取下猪皮晾乾。
3.猪皮冰凍切片
取晾乾的猪皮,置於OCT中於液氮中迅速冷却。置於冰凍切片機中切成厚度爲10μM的切片,於螢光顯微鏡下觀察。
4.結果顯示
如圖14所示,樣品4在表皮層和真皮層都有螢光亮度,這說明樣品4能很好的滲透表皮層和真皮層。以上結果說明實施例2可滲透並停留在真皮和表皮發揮作用。
無
圖1爲實施例1中透明質酸寡糖的高效液相色譜圖。
圖2爲實施例2中透明質酸寡糖的高效液相色譜圖。
圖3爲實施例3中透明質酸寡糖的高效液相色譜圖。
圖4爲對比例1中透明質酸寡糖的高效液相色譜圖。
圖5爲實施例2中透明質酸寡糖的質譜總離子流峰圖。
圖6爲透明質酸二糖(HA2)的離子强度圖。
圖7爲透明質酸四糖(HA4)的離子强度圖。
圖8爲透明質酸六糖(HA6)的離子强度圖。
圖9爲透明質酸八糖(HA8)的離子强度圖。
圖10爲透明質酸十糖(HA10)和十二糖(HA12)的離子强度圖。
圖11所示爲使用樣品1-1、2-1後成纖維細胞分泌膠原蛋白Ⅰ的含量。
圖12所示爲使用樣品1、1-1、1-2、1-3後成纖維細胞分泌膠原蛋白Ⅰ的含量。
圖13所示爲使用樣品1、樣品2後3D全層皮膚模型的結構。
圖14所示爲樣品4透皮情况的顯微鏡下照片。
無
Claims (10)
- 一種透明質酸寡糖組合物,其中,所述透明質酸寡糖組合物包括式(I)所示結構的透明質酸寡糖: 式(I) 其中,n爲選自0-5的整數,X選自H、K、Na、Ca或Zn,較佳爲Na; 在所述透明質酸寡糖組合物中, n=1的透明質酸寡糖的質量占比爲35-70%; n=0的透明質酸寡糖的質量占比爲5-40%; n=2的透明質酸寡糖的質量占比爲0-50%; n=3的透明質酸寡糖的質量占比爲0-15%; n=4的透明質酸寡糖的質量占比爲0-10%; n=5的透明質酸寡糖的質量占比爲0-5%。 較佳的,在所述透明質酸寡糖組合物中, n=1的透明質酸寡糖的質量占比爲35-70%; n=0的透明質酸寡糖的質量占比爲5-40%; n=2的透明質酸寡糖的質量占比爲1-50%; n=3的透明質酸寡糖的質量占比爲1-15%; n=4的透明質酸寡糖的質量占比爲1-10%; n=5的透明質酸寡糖的質量占比爲0.01-1.5%。 較佳的,在所述透明質酸寡糖組合物中, n=1的透明質酸寡糖的質量占比爲40-60%; n=0的透明質酸寡糖的質量占比爲5-15%; n=2的透明質酸寡糖的質量占比爲20-40%; n=3的透明質酸寡糖的質量占比爲1-10%; n=4的透明質酸寡糖的質量占比爲1-5%; n=5的透明質酸寡糖的質量占比爲0.01-1.5%。 較佳的,所述透明質酸寡糖組合物的重均分子量小於等於1 kDa。
- 如請求項1所述的透明質酸寡糖組合物,其中,在所述透明質酸寡糖組合物中, n=1的透明質酸寡糖的質量占比爲35-70%; n=0的透明質酸寡糖的質量占比爲5-40%; n=2的透明質酸寡糖的質量占比爲10-50%; n=3的透明質酸寡糖的質量占比爲1-15%; n=4的透明質酸寡糖的質量占比爲0.1-10%; n=5的透明質酸寡糖的質量占比爲0.01-5%。 較佳的,在所述透明質酸寡糖組合物中, n=1的透明質酸寡糖的質量占比爲40-60%; n=0的透明質酸寡糖的質量占比爲5-20%; n=2的透明質酸寡糖的質量占比爲20-40%; n=3的透明質酸寡糖的質量占比爲3-8%; n=4的透明質酸寡糖的質量占比爲1-5%; n=5的透明質酸寡糖的質量占比爲0.01-1.5%。
- 一種如請求項1或2所述的透明質酸寡糖組合物的製備方法,其中,所述製備方法包括以下步驟: 將透明質酸用透明質酸酶進行酶解反應, 分離酶解反應物以得到產物原液, 對所述產物原液進行濃縮以得到產物濃縮液; 去除所述產物濃縮液中的雜質,乾燥得到透明質酸寡糖組合物, 其中,所述透明質酸酶爲酶切β-1,3糖苷鍵的透明質酸酶, 較佳,所述透明質酸酶爲利用畢赤酵母工程菌表達的水蛭透明質酸水解酶, 進一步較佳,所述分離爲超濾; 進一步較佳,所述濃縮爲納濾; 進一步較佳,使用活性炭吸附來去除雜質。
- 如請求項3所述的方法,其中,在所述酶解反應中,所述透明質酸的初始濃度爲5-150 g/L,較佳,所述透明質酸的分子量爲1000-2000 kDa,進一步較佳所述透明質酸酶的初始含量爲1×10 4-3×10 5U/mL。
- 如請求項3所述的方法,其中,超濾採用截留分子量爲600-1000Da的超濾膜,納濾採用截留分子量爲100-300Da的納濾膜。
- 一種如請求項1所述的透明質酸寡糖組合物在促進神經醯胺和/或透明質酸合成酶1(HAS1)和/或透明質酸合成酶3(HAS3)的合成中的用途。
- 一種如請求項2所述的透明質酸寡糖組合物在抗皮膚衰老中的用途。
- 如請求項7所述的用途,其中,所述透明質酸寡糖組合物通過促進膠原蛋白生成和/或表皮細胞增殖與分化而抗皮膚衰老。
- 一種如請求項2所述透明質酸寡糖組合物在促進膠原蛋白生成中的用途。
- 如請求項9所述的用途,其中,所述透明質酸寡糖組合物用於製備促進膠原蛋白生成的保健品,或者用於製備保護、强化臟器的保健品,或者用於製備保護胃粘膜的保健品,或者用於製備補充鈣質的保健品,或者用於製備關節潤滑注射液。
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