JP4881246B2 - 発毛効果増強剤 - Google Patents
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Description
特許文献8には、ヘパリン、ヘパラン硫酸、デルマタン硫酸、コンドロイチン硫酸A+B、ケラタン硫酸、ヒアルロン酸、核酸及びタンパク質を含有する、毛髪刺激活性を有する組成物が記載されている。
すなわち本発明は、下記物質群(A)から選ばれる1種以上の物質を含有する発毛促進剤(以下、本発明の発毛剤という)を提供する。
物質群(A):重量平均分子量20万〜40万のヒアルロン酸、重量平均分子量が2万〜5万のデルマタン硫酸、及び低分子化ケラタン硫酸。
物質群(B):ササ抽出物、田七ニンジン抽出物、ケラタン硫酸、及びコンドロイチン硫酸。
(a) 重量平均分子量20万〜40万のヒアルロン酸、及び重量平均分子量が2万〜5万のデルマタン硫酸、(b) 重量平均分子量20万〜40万のヒアルロン酸、及び田七ニンジン抽出物、(c) 重量平均分子量20万〜40万のヒアルロン酸、及びササ抽出物、(d) 重量平均分子量20万〜40万のヒアルロン酸、重量平均分子量が2万〜5万のデルマタン硫酸、田七ニンジン抽出物、及びササ抽出物、(e) 重量平均分子量20万〜40万のヒアルロン酸、重量平均分子量が2万〜5万のデルマタン硫酸、ケラタン硫酸、田七ニンジン抽出物、ササ抽出物、及びコンドロイチン硫酸、(f) 低分子化ケラタン硫酸。
また本発明の発毛剤は、狭い適用面積で広範囲への発毛効果が及ぶことから使用量を減少させることができ、安全性がさらに高まり、かつ経済性も高い。
<1> 本発明の発毛剤の構成成分
本発明の発毛剤は、下記物質群(A)から選択される1種以上の物質を含有する発毛促進剤である。
物質群(A):重量平均分子量20万〜40万のヒアルロン酸、重量平均分子量が2万〜5万のデルマタン硫酸、及び低分子化ケラタン硫酸。
物質群(B):ササ抽出物、田七ニンジン抽出物、ケラタン硫酸、及びコンドロイチン硫酸。
(1-1) 重量平均分子量20万〜40万のヒアルロン酸
本発明の発毛剤に用いる重量平均分子量20万〜40万のヒアルロン酸の由来は特に限定されず、鶏冠、臍帯、ヒアルロン酸を産生する微生物等から分離・精製されたヒアルロン酸を用いることができるが、鶏冠由来のものが好ましい。
本発明の発毛剤に用いる重量平均分子量が2万〜5万のデルマタン硫酸の由来は特に限定されず、鳥類や哺乳類等の肉冠(例えば鶏冠等)、皮膚、臍帯、内臓等の生物由来原料から分離、精製されたデルマタン硫酸を用いることができるが、鶏冠由来のものが好ましい。
・2−アセトアミド−2−デオキシ−3−O−(4−デオキシ−α−L−スレオ−ヘキシ−4−エノピラノシルウロン酸)−4−O−スルホ−D−ガラクトース(ΔDi−4S)の含量が、約63%〜約85%、好ましくは約68%〜約84%である。
・2−アセトアミド−2−デオキシ−3−O−(4−デオキシ−2−O−スルホ−α−L−スレオ−ヘキシ−4−エノピラノシルウロン酸)−4−O−スルホ−D−ガラクトース(ΔDi−diSB)の含量が、約2%〜約8%、好ましくは約3%〜約7%である。
・2−アセトアミド−2−デオキシ−3−O−(4−デオキシ−α−L−スレオ−ヘキシ−4−エノピラノシルウロン酸)−4,6−ビス−O−スルホ−D−ガラクトース(ΔDi−diSE)の含量が、約0%〜約2%である。
GPC−HPLC法による平均分子量(kDa) 38
多角度光散乱法による平均分子量(kDa) 35.1
極限粘度(dl/g) 1.06
コンドロイチナーゼB消化抵抗性部分(%) 5.3
二糖部分(%) 25.4
二糖組成比(%)
ΔDi-0S 6.8
ΔDi-6S 12.0
ΔDi-4S 74.1
ΔDi-diSD 1.3
ΔDi-diSB 4.4
ΔDi-diSE 1.4
ΔDi-triS 0.0
鶏冠1重量に対して水約2〜3倍量を加えてミンチした後に煮沸し、冷却後プロテアーゼ(プロナーゼ、科研製薬(株))を添加して一晩加水分解する。加水分解液に、塩化ベンザルコニウム溶液を加えた後、珪藻土で濾過し、濾過上清を捨て、残った珪藻土を得る。この珪藻土を塩化ナトリウム溶液に懸濁し、エタノールを加え、生じた沈殿を静置し、得られた沈殿を乾燥させて粉体を得る。
(a) GPC−HPLC法による平均分子量の測定
DS1の平均分子量は、Araiらの方法(Biochem. Biophys. Acta, 1117, 60-70, 1992)に準拠して測定でき、分子量が既知のコンドロイチン硫酸(分子量39100、18000、8050)及びヒアルロン酸ナトリウム(分子量104000)を標準品として高速液体クロマトグラフィーを用いたゲル濾過(GPC−HPLC)での溶出時間により決定できる。カラムはTSK gel G4000PWXL、G3000PWXL及びG2500PWXL(各φ7.8X300mm、東ソー(株))を連結したものを用いることができる。溶媒は、0.2 mol/L 塩化ナトリウム溶液を用い、流速は0.6ml/分とし、検出器は示差屈折率検出器(RI-8000、東ソー(株))を用いることができる。
検出器に示差屈折率検出器(Shodex RI-71、昭和電工(株))及び多角度光散乱検出器(DAWN, Wyatt Technology CORPORATION)を使用し、ASTRAソフトウェア(Wyatt Technology CORPORATION)のジムプロットモジュールを用いて解析を行う。
DS1溶液100μLに、緩衝液A(0.001mol/L 酢酸カルシウム、0.02mol/L Tris-HCl、pH7.5)10μLに0.03UのコンドロイチナーゼB(生化学工業(株))を溶解したものを加え、37℃で2時間消化する。沸騰湯浴中で1分加熱して反応を止め、消化物100μg相当10μLを、40℃でGPC−HPLCを用いて分析する。カラムはTSK gel G4000PWXL、G3000PWXL及びG2500PWXL(各φ7.8X300mm、東ソー(株))を連結したものを用いる。溶媒は0.2mol/L塩化ナトリウム溶液を用い、流速は0.6 mL/分とし、検出器は示差屈折率検出器(RI-8020、東ソー(株))及び紫外可視検出器(UV-8020、A230nm、東ソー(株))を使用できる。
1%DS1溶液50μLに、緩衝液B(0.01 mol/L 酢酸ナトリウム、0.05 mol/L Tris-HCl、pH7.5)10μLに0.5UのコンドロイチナーゼABCを溶解したものを加え、37℃で2時間消化する。沸騰湯浴中で1分間加熱して反応を止め、遠心して不溶物を除去する。
上記(c)の消化物100μg相当に対し、緩衝液C(0.02mol/L Tris-AcOH、pH7.0)50μLに0.25Uのコンドロ−6−スルファターゼを溶解したものを加え、37℃で24時間消化し、不溶物を除去する。
上記(d)あるいは(e)の消化物を、それぞれHPLCを用いて各々分析する。カラムはYMC−Pack PA-120-S5イオン交換カラム(φ2.6X250mm、YMC(株))を用いることができる。流速は1.5mL/分で60分間に0.8mol/L リン酸水素ナトリウムを2%から100%までの直線濃度勾配で流す。不飽和コンドロ−二糖キット(生化学工業(株))の溶出位置を基準として、この間に溶出する各種不飽和二糖を232nmで同定し、不飽和二糖と同定されたピーク面積の総和を100%として計算して二糖組成比を求めることができる。
DS1の極限粘度の測定は、第13改正日本薬局方に準拠して行うことができる。測定装置には自動粘度測定装置(VMC−052、離合社(株))を用いることができる。溶媒は0.2mol/L 塩化ナトリウム溶液を用い、ウベローデ型粘度管の流下時間の測定にも同じ溶液を用いることができる。粘度の測定は30±0.1℃で行い、流下時間の1/100秒を四捨五入し、差が3回連続して0.1秒以内である測定値を極限粘度算出に用いる。
本発明の発毛剤に用いる低分子化ケラタン硫酸は、ケラタン硫酸を分解して低分子化した物質であり、ケラタン硫酸を構成するガラクトース残基(Gal)とN−アセチルグルコサミン残基(GlcNAc)とがβ−グリコシド結合した構造単位(Gal-GlcNAc)の1〜10個、好ましくは1〜4個からなり、すなわち2〜20個、好ましくは2〜8個の糖残基からなる物質である(ガラクトース残基及びN−アセチルグルコサミン残基の6位は一部または全部が硫酸化されている)。この低分子化ケラタン硫酸の非還元末端は、N−アセチルノイラミン酸残基がグリコシド結合を介して付加されていてもよい。
Gal(6S)β1-4GlcNAc(6S)・・・(1)
Gal(6S)β1-4GlcNAc(6S)β1-3Gal(6S)β1-4GlcNAc(6S)・・・(2)
NeuAc〜Gal(6S)β1-4GlcNAc(6S)β1-3Gal(6S)β1-4GlcNAc(6S)・・・(3)
式中、Galはガラクトース残基を、GlcNAcはN−アセチルグルコサミン残基を、NeuAcはN−アセチルノイラミン酸残基を、β1-4はβ1,4グリコシド結合を、β1-3はβ1,3グリコシド結合を、(6S)は6-O-硫酸エステルを、〜はα2,3グリコシド結合またはα2,6グリコシド結合を表す。
(2-1) ササ抽出物
本発明の発毛剤に使用するササ抽出物は、ササの抽出物であれば特に限定されないが、クマザサの抽出物を用いることが好ましい。その抽出に用いる溶媒も特に限定されない。例えば水、エタノールやメタノール等のアルコール類、アセトンやメチルエチルケトン等のケトン類、ジエチルエーテルやテトラヒドロフラン等のエーテル類、ジクロロメタンやクロロホルム等のハロゲン化炭化水素類、アセトニトリル等のニトリル類から選ばれる1種または2種以上の溶媒が例示される。これらの溶媒によれば本発明の発毛剤に所望される成分がササから抽出されるが、溶媒の毒性等の点からこれらのなかでもアルコールが好ましく、エタノールが特に好ましい。
本発明の発毛剤に使用する田七ニンジン抽出物は、田七ニンジンの抽出物であれば特に限定されない。その抽出に用いる溶媒も特に限定されず、例えば水、エタノールやメタノール等のアルコール類、アセトンやメチルエチルケトン等のケトン類、ジエチルエーテルやテトラヒドロフラン等のエーテル類、ジクロロメタンやクロロホルム等のハロゲン化炭化水素類、アセトニトリル等のニトリル類から選ばれる1種または2種以上の溶媒が例示される。これらの溶媒によれば本発明の発毛剤に所望される成分が田七ニンジンから抽出されるが、溶媒の毒性等の点からこれらのなかでも水またはアルコールが好ましく、水またはエタノールが特に好ましい。
本発明の発毛剤に使用される成分において、物質群(B)に包含されるケラタン硫酸は、上記物質群(A)に包含される低分子化ケラタン硫酸とは異なり、より大きい分子量を有するポリマー状のケラタン硫酸である。その分子量は特に限定されないが、好ましくは重量平均分子量が5000〜15000程度、より好ましくは5000〜10000程度のものである。
本発明の発毛剤に用いるコンドロイチン硫酸の種類は特に限定されず、コンドロイチン硫酸B(デルマタン硫酸)を除き、コンドロイチン硫酸A、コンドロイチン硫酸Cのいずれでもよい。
本発明の発毛剤には、皮膚や毛髪等に対して悪影響を与えず、かつ上述の本発明の発毛剤中の成分に対して悪影響を与えない限りにおいて、上記以外の物質を添加してもよい。このような物質としては、通常の頭髪用化粧料に使用される炭化水素類、ロウ類、油脂類、エステル類、高級脂肪酸類、高級アルコール類、界面活性剤類、香料、色素、防腐剤、抗酸化剤、紫外線吸収剤、アルコール類、pH調整剤、各種薬効成分等が例示され、これらから選ばれる1種以上の物質を適宜選択して配合することができる。もちろん本発明の発毛剤以外の発毛、育毛成分をさらに配合してもよい。
本発明の発毛剤は、上記の物質群(A)から選ばれる1種または2種以上の物質をそのままの形態で提供してもよく、また上記の物質群(B)から選ばれる1種または2種の物質との混合物の形態、さらにこれらとその他の必要に応じて添加できる成分をさらに混合した混合物の形態で提供することもできる。その提供形態も、溶液状態、凍結状態、凍結乾燥状態等、特に限定されない。本発明の発毛剤は、これらの提供形態に応じて、それ自体公知の方法で製造することができる。
(b) HA(20万〜40万)+田七
(c) HA(20万〜40万)+ササ
(d) HA(20万〜40万)+DS(2万〜5万)+田七+ササ
(e) HA(20万〜40万)+DS(2万〜5万)+KS+田七+ササ+CS
(f) LMKS
(c) HA(20万〜40万)+ササ
(d) HA(20万〜40万)+DS(2万〜5万)+田七+ササ
(e) HA(20万〜40万)+DS(2万〜5万)+KS+田七+ササ+CS
(f) LMKS
(d) HA(20万〜40万)+DS(2万〜5万)+田七+ササ
(e) HA(20万〜40万)+DS(2万〜5万)+KS+田七+ササ+CS
本発明の発毛剤の適用対象者としては、発毛を望む者や脱毛の防止を望む者であれば特に限定されず、例えば円形のような局部的または頭全体の脱毛、薄毛、無毛に悩む者が例示される。
実施例において共通して用いた物質について以下に説明する。
(1-1) ヒアルロン酸
鶏冠から抽出・精製したヒアルロン酸(重量平均分子量80万)を121℃で60分間オートクレーブ処理することにより、重量平均分子量30万のヒアルロン酸を製造した(以下、このヒアルロン酸を「HA(30万)」という)。
デルマタン硫酸は、前記の「発明を実施するための最良の形態」に記載した方法により製造した。このデルマタン硫酸の重量平均分子量は3.5万であった(以下、このデルマタン硫酸を「DS(3.5万)」という)
低分子化ケラタン硫酸は、サメ軟骨から抽出・精製したケラタンポリ硫酸を、ケラタナーゼII(生化学工業(株))を用いて37℃で12時間消化することにより製造した。この低分子化ケラタン硫酸は、下記式(1)〜(3)で示される糖鎖を含有していた。
Gal(6S)β1-4GlcNAc(6S) ・・・(1)
Gal(6S)β1-4GlcNAc(6S)β1-3Gal(6S)β1-4GlcNAc(6S) ・・・(2)
NeuAc〜Gal(6S)β1-4GlcNAc(6S)β1-3Gal(6S)β1-4GlcNAc(6S)・・・(3)
ケラタン硫酸は、サメ軟骨から抽出・精製することにより製造した。このケラタン硫酸はケラタンポリ硫酸であり、重量平均分子量は0.6万であった(以下、このケラタン硫酸を「KPS」という)。
田七ニンジン水抽出物は、田七ニンジンを粉砕し、これに水を加えて室温で5時間撹拌し、これを濾過後乾燥することにより製造した(以下、この抽出物を「田七水抽出物」という)。
田七ニンジンエタノール抽出物は、水の代わりにエタノールを用いた以外は、上記田七水抽出物と同様に製造した(以下、この抽出物を「田七Et抽出物」という)。
クマザサエタノール抽出物は、クマザサを粉砕し、これに大過剰のエタノールを加えて室温で1時間撹拌し、この抽出液を濾過後、エバポレーターを用いて抽出された成分が抽出液中に析出する直前まで濃縮することにより製造した(以下、この抽出液を「クマザサEt抽出物」という)。
コンドロイチン硫酸は、サメ軟骨から抽出・精製することにより製造した。このコンドロイチン硫酸の重量平均分子量は3万であった(以下、このコンドロイチン硫酸を「CS」という)。
(2-1) 被検液の調製
下記処方により、被検液を調製した。
・試料(用いた物質は後述の実験1〜4で詳述する。なお被検液中の終濃度は、特にことわらない限り1%(W/V)とした)
・オリーブ油5% (2.5mL)
・エタノール60% (30mL)
・グリセリン5% (2.5mL)
精製水を加えて50mLとする。
実験は小川らのマウスを使用した発毛効果判定試験(Fragrance Journal, 17(5), 20(1989))に準じて行った。すなわち、C3H/HeN雄性マウス(7週齢)を各群6匹用意し、7日間予備飼育した。その後、電気眉剃り及び電気カミソリを用いて背部を剃毛した。剃毛翌日より、被検液を毎日0.2mL/匹ずつ剃毛部位(約2cm×約5cm)に塗布した。判定日に各個体の背部の剃毛部位をデジタルカメラで撮影し、この画像をもとに発毛面積を視覚的に評価して、下記の表1に示す判定方法に従って各個体について発毛スコアを付した。なお視覚による発毛面積の評価は、客観性を考慮して2名の判定員により行った。
上記に従い、発毛実験1を春期〜初夏に行った。用いた被検液は下記の通りである。
・被検液2:HA(5万)(終濃度0.75%(W/V))
・コントロール:試料を含まない液(基剤のみ)
塗布後17日目(判定日)の平均発毛スコアの結果を表2に示す。なおコントロールの平均発毛スコアを100%とした時の比も算出し、併せて表2に示した。
同様に発毛実験2を夏期に行った。用いた被検液は下記の通りである。
・被検液4:田七水抽出物
・被検液5:クマザサEt抽出物 (終濃度1%(V/V))
・被検液6:LMKPS
・コントロール:試料を含まない液(基剤のみ)
発毛実験3は春期〜初夏に行った。用いた被検液は下記の通りである。
・被検液8:HA(30万)(終濃度0.75%)+田七水抽出物
・被検液9:HA(30万)(終濃度0.75%)+クマザサEt抽出物 (終濃度1%(V/V))
・被検液10:HA(30万)(終濃度0.75%)+DS(3.5万)
・被検液11:HA(30万)(終濃度0.75%)+KPS
・コントロール:試料を含まない液(基剤のみ)
発毛実験4は夏期に行った。なお発毛実験4においては、マウスの背部左右(2ヶ所)をほぼ同一面積(1ヶ所あたり約2cm×約5cm)に剃毛した。剃毛翌日より、被検液を毎日0.2mL/匹ずつ背部右の剃毛部位に塗布し、塗布後21日目(判定日)に各個体の背部左右の剃毛部位をデジタルカメラで撮影し、この画像をもとに前述の方法で発毛スコアを付した。
・被検液13:HA(30万)+DS(3.5万)+田七水抽出物+クマザサEt抽出物 (終濃度1%(V/V))
・被検液14:HA(30万)+DS(3.5万)+KPS+田七水抽出物+クマザサEt抽出物 (終濃度1%(V/V))+CS
・コントロール:試料を含まない液(基剤のみ)
(3-1) 被検液の調製
下記処方により、被検液を調製した。
・パンテノール1%
・ビタミンE誘導体0.05%
・エタノール50%
精製水を加えて100%とする。
発毛または育毛を望む14人に、1日1回、洗髪後に被検液2〜3mLを頭皮につけてマッサージしてもらった。これを6〜7ヶ月間続けてもらった後、下記の質問に対する回答を得た。
1)髪が増加した(6名)
2)変化なし(8名)
3)髪が減少した(0名)
項目2.抜け毛について
1)抜け毛が少くなった(10名)
2)変化なし(4名)
3)抜け毛が増えた(0名)
項目3.フケについて
1)減少した(7名)
2)変化なし(7名)
3)増加した(0名)
・整髪料かわりにできる(セットできる、乱れない)。
・毛が太くなった。
Claims (2)
- ヒアルロニダーゼを有効成分とする発毛効果増強剤であって、
重量平均分子量30万のヒアルロン酸及び田七ニンジン抽出物を有効成分として含有する発毛促進剤を塗布する1日前に塗布する態様で使用することを特徴とする、発毛効果増強剤。 - 重量平均分子量30万のヒアルロン酸及び田七ニンジン抽出物を有効成分として含有する発毛促進剤と、請求項1に記載の発毛効果増強剤とを含む発毛促進用のキット。
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