JP7105888B2

JP7105888B2 - 低分子ヒアルロン酸又はその塩及びその調製方法

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Publication number: JP7105888B2
Application number: JP2020533114A
Authority: JP
Inventors: シゥユンハン
Original assignee: Shandong Awa Biopharm Co Ltd
Current assignee: Shandong Awa Biopharm Co Ltd
Priority date: 2019-03-05
Filing date: 2019-12-25
Publication date: 2022-07-25
Anticipated expiration: 2039-12-25
Also published as: EP3730623A1; EP3730623A4; CN109897876A; JP2021517452A; CN109897876B; WO2020177455A1

Description

CGMCC

16836

［関連出願への相互参照］
本開示は、２０１９年０３月０５日に中国国家知識産権局に提出された特許出願番号がＣＮ２０１９１０１６４８８１．３であり、発明の名称が「低分子ヒアルロン酸又はその塩を調製する方法」である中国特許出願の優先権を主張するものであり、当該中国特許出願の全内容は参照により本開示に組み入れられる。

本開示は、生物工学技術分野に関し、具体的には、低分子ヒアルロン酸又はその塩及びその調製方法に関する。

ヒアルロン酸（ｈｙａｌｕｒｏｎｉｃａｃｉｄ、ＨＡ）は、酸性ムコ多糖の一つであって、Ｎ－アセチルグルコサミン及びＤ－グルクロン酸二糖の繰り返し単位からなる非分岐高分子グリコサミノグリカンであり、動物組織細胞間物質及びいくつかの細菌的莢膜に存在し、化粧品、食べ物や医薬品等の産業分野に広く応用される。

近年の研究により、低分子ヒアルロン酸は、非常に強い生物学的活性を示し（ＨｕｉＺＭ、ａｂｉｏａｃｔｉｖｅｈｙａｌｕｒｏｎｉｃａｃｉｄｆｒａｇｍｅｎｔ、ｉｔｓｍａｎｕｆａｃｔｕｒｅｍｅｈｔｏｄ、ｉｔｓｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎａｎｄｉｔｓａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、Ｐａｔｅｎｔｎｕｍｂｅｒ２０１４１０１５５３５９３．５．）、皮膚免疫機能の向上、及び皮膚の炎症の消散、創傷治癒の促進、急性および慢性咽頭炎の治療、歯肉炎の治療等の作用を有し、免疫細胞及びサイトカインの活性化剤であることを発見した。低分子ヒアルロン酸は、浸透吸収性が良好であり、真皮及び腸管によって非常に吸収されやすく、体内で失われたヒアルロン酸を速く補給することができる。そのため、低分子ヒアルロン酸は、保健用食品、化粧品及び臨床医学分野で広い使用見通しを有する。

低分子ヒアルロン酸に関する研究と応用の進展に伴い、近年、国内外では、ＨＡの分解及びその分解生成物の調製についての検討が重要視されてきた。現在、分解方法には、主に物理的分解、化学的分解及び生分解の３種類がある。物理的分解方法には、主に加熱、機械的せん断力、紫外線、超音波、６０Ｃ照射やγ線放射等の要素があり、いずれもＨＡを分解させることができる。しかしながら、物理的方法で調製された分子量が１万を超え、得られた分子量範囲が広く分散し、製品の安定性が悪い。ＨＡの化学的分解方法には、加水分解法及び酸化分解法があり、加水分解法は、酸加水分解（ＨＣＬ）と塩基（ＮａＯＨ）加水分解に分けて、酸化分解での一般的な酸化剤は、次亜塩素酸ナトリウム及び過酸化水素である。化学的分解方法では、分解された生成物の相対分子量が酸、塩基又は酸化剤の添加量及び反応時間を変更することにより制御することができ、分解コストが低く、量産しやすいものの、化学試薬を取り入れ、反応条件が複雑であり、ＨＡの特性に影響を与え、製品の精製が困難になり、また、大量の産業廃水が生成してしまう。生体酵素分解は、ヒアルロニダーゼの作用下でβ－グリコシド結合を切断して発生する分解である。酵素法によれば、分解が穏やかであり、低分子ヒアルロン酸を調製する最適な技術的手段である。ヒアルロニダーゼは、ヒアルウロニダーゼとも呼ばれ、ＨＡが低分子化作用させるグリコシダーゼであり、他の有機体や組織体中の酸性ムコ多糖を分解することもでき、真核生物と原核生物中に広く存在し、特異的な生理的活性を有する。

出願番号がＣＮ２０１６１１１２７８８１．９である発明特許では、固液二相性酵素分解と限外濾過とを併用する超低分子量ヒアルロン酸オリゴ糖及びその塩を調製する方法を提供し、酵素法でヒアルロン酸への酵素分解を実現する。しかしながら、現在のヒアルロニダーゼは、通常に動物組織から抽出調製され、高価であり、産業化応用に適合ではない。そのため、コストが低く、プロセスが簡単であり、産業化量産に適合な低分子ヒアルロン酸を調製する方法は、重要な応用潜在能力を有する。

また、ヒアルロン酸抽出プロセスは、有機試薬沈殿法である場合が多く、この方法は、環境汚染を引き起こし、エネルギー消費量が大きく、かつ、低分子のヒアルロン酸の抽出収率が低い。さらに、噴霧乾燥を利用してヒアルロン酸を抽出することがあるが、一般的な噴霧乾燥機は、吸気温度が１８０℃以上であり、サーマル素材、物理的特性又は化学的特性が変化しやすく、特に、細菌や活性酵素等の生物活性材料が不活性化されてしまう。

本開示の目的は、例えば、低分子ヒアルロン酸又はその塩及びその調製方法を提供することにより、上述の欠点を克服することを含む。

本開示の実施例によって提供される方法は、主に植物性乳酸菌によって産生されるヒアルロニダーゼと低温噴霧乾燥とを併用して、分解して低分子ヒアルロン酸又はその塩を取得する。

本開示の実施例は、例えば以下の形態によって実現することができる。

本開示の実施例によって提供される低分子ヒアルロン酸又はその塩を調製する方法によれば、以下のステップを含む。

（１）酵素分解反応液：精製水にヒアルロニダーゼを加え、攪拌し、ヒアルロン酸又はその塩の固体粉末をゆっくり加え、酵素分解反応で酵素分解液を取得し、前記ヒアルロニダーゼは、植物性乳酸菌突然変異株ＣｎＴ０１２－５６が発酵生産して得られ；当該菌株がＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｐｌａｎｔａｒｕｍに分類命名され、その寄託機関が中国微生物菌種保蔵管理委員会普通微生物センター（ＣｈｉｎａＧｅｎｅｒａｌＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌＣｕｌｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎＣｅｎｔｅｒ）であり、住所が北京朝陽区北辰西路１号院３号であり、寄託日が２０１８年１１月２８日であり、受託番号がＣＧＭＣＣＮＯ．１６８３６である；
（２）ヒアルロニダーゼの不活性化：ステップ（１）での前記酵素分解液に対して昇温処理を行い、前記酵素分解液におけるヒアルロニダーゼが変性して不活性化される；
（３）吸着：ステップ（２）での前記酵素分解液を吸着し、混合液を取得する；
（４）濾過精製：ステップ（３）での混合液から吸着剤及び変性ヒアルロニダーゼを除去し、濾過して純粋な低分子ヒアルロン酸及びその塩溶液を取得する；
（５）低温噴霧乾燥：ステップ（４）での前記低分子ヒアルロン酸及びその塩溶液に対して低温噴霧乾燥を行い、所望の分子量の低分子ヒアルロン酸及びその塩の固体粉末を取得する。

任意に、上述した低分子ヒアルロン酸又はその塩を調製する方法において、ステップ（１）で、まず、精製水にヒアルロニダーゼを加え、攪拌し、ｐＨが５－８、温度が３０－４０℃になるまで調節し、質量対体積濃度が５０－１００ｇ／Ｌになるように、ヒアルロン酸又はその塩の固体粉末をゆっくり加え、０．５－１．５ｈ分解反応させた後、質量対体積濃度が１００－２００ｇ／Ｌになるように、ヒアルロン酸又はその塩の固体粉末をゆっくり添加し続け、５－８ｈ酵素分解し続ける。

任意に、上述した低分子ヒアルロン酸又はその塩を調製する方法において、ステップ（１）での前記ヒアルロニダーゼの添加量は、１グラムのヒアルロン酸又はその塩あたり１０２－１０５ＩＵの前記ヒアルロニダーゼである。

任意に、上述した低分子ヒアルロン酸又はその塩を調製する方法において、ステップ（２）での前記ヒアルロニダーゼが変性して不活性化される条件は、酵素分解液を４５－８０℃に昇温して５－６０ｍｉｎ維持する。

任意に、上述した低分子ヒアルロン酸又はその塩を調製する方法において、ステップ（３）での前記酵素分解液の吸着条件は、０．０１％－１％の活性炭を用いて３０－９０ｍｉｎ吸着し、ステップ（４）で、孔径が０．２２μｍであるセルロースフィルター濾過を用いる。

任意に、上述した低分子ヒアルロン酸又はその塩を調製する方法において、ヒアルロン酸塩は、ヒアルロン酸ナトリウムであり、ｐＨ調節は、塩酸又は水酸化ナトリウム溶液を用いる。

任意に、上述した低分子ヒアルロン酸又はその塩を調製する方法において、ステップ（４）での前記低分子ヒアルロン酸又はその塩溶液の最終濃度は、１０％－２０％である。

任意に、上述した低分子ヒアルロン酸又はその塩を調製する方法において、ステップ（５）での前記低温噴霧乾燥法の条件は、吸気温度が４０℃－８０℃であり、吹き出し温度が４０℃であり、仕込み速度が１００ｍＬ／ｈ－３００ｍＬ／ｈである。

任意に、上述した低分子ヒアルロン酸又はその塩を調製する方法において、ステップ（１）での前記酵素分解に用いられるヒアルロン酸又はその塩の分子量は、５００ｋＤａ－７００ｋＤａであり、ステップ（５）で調製された前記低分子ヒアルロン酸又はその塩の分子量は、１ｋＤａ－６０ｋＤａである。

任意に、上述した低分子ヒアルロン酸又はその塩を調製する方法において、前記ヒアルロニダーゼの生産方法は、以下のステップを含む。

（ａ）ＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｐｌａｎｔａｒｕｍＣｎＴ０１２－５６菌種を殺菌された種培地に接種し、培養温度が３０℃－３７℃であり、回転速度が０－１００ｒｐｍであり、８－２４ｈ培養し、種培養液を取得する；
（ｂ）ステップ（１）での前記種培養液を殺菌された発酵培養基に接種し、培養温度が３０℃－３７℃であり、回転速度が０－１５０ｒｐｍであり、２０－４８ｈ培養し、ヒアルロニダーゼ発酵液を取得する；
（ｃ）ステップ（２）での前記ヒアルロニダーゼ発酵液に対して遠心を行い、上澄みを取得する；
（ｄ）孔径分画分子量が２００ｋＤａである限外濾過膜を用いて、ステップ（３）での前記ヒアルロニダーゼの上澄みに対して限外濾過を行い、ろ液を取得する；
（ｅ）孔径分画分子量が２０ｋＤａである限外濾過膜を用いて、ステップ（４）での前記ろ液に対して限外濾過を行い、低分子不純物を除去し、精製したヒアルロニダーゼを取得する。

任意に、上述した低分子ヒアルロン酸又はその塩を調製する方法において、ステップ（ａ）での前記種培地の成分は、ペプトン１０ｇ／Ｌ、酵母浸漬パウダー５ｇ／Ｌ、ヒアルロン酸５ｇ／Ｌ、グルコース３ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム０．１ｇ／Ｌ、硫酸アンモニウム２ｇ／Ｌ、硫酸第一鉄０．０５ｇ／Ｌ、硫酸マグネシウム０．２ｇ／Ｌ、トウェイン－８０１ｍＬであり、ｐＨが６．５である。

任意に、上述した低分子ヒアルロン酸又はその塩を調製する方法において、ステップ（ｂ）での前記発酵培養基の成分は、ペプトン１０ｇ／Ｌ、酵母浸漬パウダー５ｇ／Ｌ、ヒアルロン酸５ｇ／Ｌ、グルコース３ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム０．１ｇ／Ｌ、硫酸アンモニウム２ｇ／Ｌ、硫酸第一鉄０．０５ｇ／Ｌ、硫酸マグネシウム０．２ｇ／Ｌ、トウェイン－８０１ｍＬであり、ｐＨが６．５である。

本開示の実施例によって提供される低分子ヒアルロン酸又はその塩は、上述の方法で調製される。

本開示の実施例的有益な効果は、例えば以下のことを含む。

（１）本開示の実施例は、ヒアルロン酸の酵素分解反応系の築造を提供する。本開示の実施例に係るヒアルロニダーゼは、植物性乳酸菌に由来し、植物性乳酸菌は、プロバイオティクスとして食べ物に応用でき、それより生産されるヒアルロニダーゼは、安全性が高く、分解して調製される低分子ヒアルロン酸又はその塩は、安全で信頼性があり、食べ物、化粧品及び医薬品産業に非常に適用する。

（２）本開示の実施例は、さらに酵素分解液の不活性化精製方法を提供し、ヒアルロニダーゼの不活性化方法は、酵素分解液を昇温し、ヒアルロニダーゼが変性して不活性化され、酵素分解液精製方法は、まず、活性炭で吸着し、その後、セルロースフィルターで酵素分解液を濾過し、当該方法は、便利であり、効率的な不活性化精製を実現する。

（３）本開示の実施例は、さらに低分子ヒアルロン酸の固体粉末を調製する方法、即ち、低温噴霧乾燥法を提供する。従来のアルコール沈殿方式に比べると、当該方法は、収率が高く、汚染がなく、エネルギー消費が低く、有機溶剤が残留しない長所があり；かつ、従来の乾燥法に比べると、当該方法での噴霧乾燥は、素材温度が８０℃以下で行い、その吸気温度が最低４０℃程度であり、当該方法を採用して低分子ヒアルロン酸を調製する場合に、分子構造の完成性と生物活性を最大限保証することができる。

（４）また、本開示の実施例の方法によって調製される低分子ヒアルロン酸の品質が良好であり、かつ、ヒアルロン酸の固体粉末の白色度が９３％以上であり、水分含有量が６．３％よりも小さくてもよく、分子量が１ｋＤａ－６０ｋＤａであり；低分子ヒアルロン酸の純度が高く、含有量は、９７％以上と高い可能性があり；収率が９０％と高い可能性がある。

当業者が本開示の技術案をよりよく理解するために、以下、本開示の実施例を参照しながら、技術案をより明確且つ完全に説明する。なお、説明される実施例は、単に本開示の一部の実施例に過ぎず、すべての実施例ではない。当業者が本開示の実施例に基づいて、創造的な労働をしていない前提で獲得する他のすべての実施例は、本発明の保護範囲に属する。

本開示の実施例に用いられるヒアルロニダーゼは、植物性乳酸菌に由来し、任意に、当該植物性乳酸菌は、以下のように取得される植物性乳酸菌ＣｎＴ０１２－５６である。細菌汚染後のヒアルロン酸発酵液から、ヒアルロニダーゼを生産する植物性乳酸菌を分離取得し、その後、多機能プラズマ突然変異誘発システム（ｍｕｌｔｉｆｕｎｃｔｉｏｎｐｌａｓｍａｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓｓｙｓｔｅｍ）で、突然変異育種を行い、ヒアルロニダーゼを効率的に生産する植物性乳酸菌ＣｎＴ０１２－５６を取得する。

当該菌種は、中国微生物菌種保蔵管理委員会普通微生物センター（ＣＧＭＣＣ）に預けられ、寄託日が２０１８年１１月２８日であり、受託番号がＣＧＭＣＣＮＯ．１６８３６であり；植物性乳酸菌として確定され、ＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｐｌａｎｔａｒｕｍＣｎＴ０１２－５６として命名される。当該菌株は、発酵培養基で３８時間培養し、その発酵液で、ヒアルロニダーゼの活性が最高に到達し、６０００ＩＵ／ｍＬに到達することができる。発酵液を遠心して菌体を除去し、微細孔フィルターで不純物を除去し、限外濾過で精製し、濃縮した後、その活性が７００００ＩＵ／ｍＬに到達することができる。

任意に、本開示の実施例の植物性乳酸菌の突然変異株を用いてヒアルロニダーゼを生産する方法は、以下のステップを含む。

（１）ＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｐｌａｎｔａｒｕｍＣｎＴ０１２－５６菌種を殺菌された種培地に接種し、培養温度が３０℃－３７℃であり、回転速度が０－１００ｒｐｍであり、８－２４ｈ培養し、種培養液を取得する；
（２）種培養液を殺菌された発酵培養基に接種し、培養温度が３０℃－３７℃であり、回転速度が０－１５０ｒｐｍであり、２０－４８ｈ培養し、ヒアルロニダーゼ発酵液を取得する；
（３）上述のヒアルロニダーゼ発酵液に対して遠心を行い、上澄みを取得する；
（４）孔径分画分子量が２００ｋＤａである限外濾過膜を用いて上述ヒアルロニダーゼの上澄みに対して限外濾過を行い、ろ液を取得する；
（５）孔径分画分子量が２０ｋＤａである限外濾過膜を用いて上述ろ液に対して限外濾過を行い、低分子不純物を除去し、精製したヒアルロニダーゼを取得する；

任意に、種培地の成分は、ペプトン１０ｇ／Ｌ、酵母浸漬パウダー５ｇ／Ｌ、ヒアルロン酸５ｇ／Ｌ、グルコース３ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム０．１ｇ／Ｌ、硫酸アンモニウム２ｇ／Ｌ、硫酸第一鉄０．０５ｇ／Ｌ、硫酸マグネシウム０．２ｇ／Ｌ、トウェイン－８０１ｍＬであり、ｐＨが６．５である；

任意に、発酵培養基成分は、ペプトン１０ｇ／Ｌ、酵母浸漬パウダー５ｇ／Ｌ、ヒアルロン酸５ｇ／Ｌ、グルコース３ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム０．１ｇ／Ｌ、硫酸アンモニウム２ｇ／Ｌ、硫酸第一鉄０．０５ｇ／Ｌ、硫酸マグネシウム０．２ｇ／Ｌ、トウェイン－８０１ｍＬであり、ｐＨが６．５である。

任意に、本開示の実施例において、低分子ヒアルロン酸又はその塩の分子量の検出方法は、固有粘度測定方法（王彦厚、王鳳山、郭学平ら．ヒアルロン酸ナトリウムによる固有粘度測定方法の研究［Ｊ］．中国薬学雑誌、２００４，３９（６）：４６９－４７１）である。

任意に、本開示の実施例において、白色度、水分含有量、純度含有量の測定は、《ＱＢ／Ｔ４４１６－２０１２化粧品用原料ヒアルロン酸ナトリウム》に準拠する。

任意に、本開示の実施例によって提供される上述の低分子ヒアルロン酸又はその塩を調製する方法は、以下のステップを含む。（１）酵素分解反応液：精製水にヒアルロニダーゼを加え、攪拌し、ヒアルロン酸又はその塩の固体粉末をゆっくり加え、酵素分解反応で酵素分解液を取得する；（２）ヒアルロニダーゼの不活性化：ステップ（１）での前記酵素分解液に対して昇温処理を行い、前記酵素分解液におけるヒアルロニダーゼが変性して不活性化される；（３）吸着：ステップ（２）での前記酵素分解液を吸着し、混合液を取得する；（４）濾過精製：ステップ（３）での混合液から吸着剤及び変性ヒアルロニダーゼを除去し、濾過して純粋な低分子ヒアルロン酸及びその塩溶液を取得する；（５）低温噴霧乾燥：ステップ（４）での前記低分子ヒアルロン酸及びその塩溶液に対して低温噴霧乾燥を行い、所望の分子量の低分子ヒアルロン酸及びその塩の固体粉末を取得する。

任意に、上述した低分子ヒアルロン酸又はその塩を調製する方法において、ステップ（１）でのヒアルロン酸又はその塩の固体粉末をバッチで加えることにより、ヒアルロン酸又はその塩の固体粉末溶解と、ヒアルロニダーゼとの作用を確保し、酵素分解効果を保証する。

任意に、上述した低分子ヒアルロン酸又はその塩を調製する方法において、ステップ（１）でのヒアルロニダーゼ添加量がヒアルロン酸又はその塩グラムあたり１０２－１０５ＩＵヒアルロニダーゼであり、当該比率を採用する主な理由は、ヒアルロニダーゼ添加量が高すぎると、ヒアルロン酸又はその塩酵素の分解が速すぎ、生成物分子量の不均一を招来し、また、ヒアルロニダーゼ添加量が低すぎると、酵素分解効果を保証できないことである。

任意に、上述した低分子ヒアルロン酸又はその塩を調製する方法において、ステップ（４）で、孔径が０．２２μｍであるセルロースフィルターを採用して濾過し、活性炭とヒアルロニダーゼを最大限濾過し、後続の製品の純度を保証することができる。

任意に、上述した低分子ヒアルロン酸又はその塩を調製する方法において、塩酸又は水酸化ナトリウム溶液を用いてｐＨを調節し、最終生成物の安全性を保証するとともに、生産コストを低減することができる。

任意に、上述した低分子ヒアルロン酸又はその塩を調製する方法において、ステップ（４）での低分子ヒアルロン酸又はその塩溶液最終濃度が１０％－２０％であり、当該濃度は、低温噴霧乾燥法に合わせ、後続の乾燥ステップの正常運転を保証することができる。
以下、具体的な実施例を参照しながら、本開示の技術案をさらに説明する。

実施例１
５Ｌの精製水に５ｍＬのヒアルロニダーゼを加え、攪拌し、ｐＨが５．０、温度が３０℃になるまで調節し、２５０ｇの分子量が５００ｋＤａであるヒアルロン酸ナトリウムをゆっくり添加し、素材を均一に溶解させるために、添加速度を遅くしなければならない。任意に、３０ｍｉｎ分解反応させた後、２５０ｇの分子量が５００ｋＤａであるヒアルロン酸ナトリウムをゆっくり添加し続けた。５ｈ酵素分解反応させた後、分子量が６０ｋＤａになり、任意に、酵素分解液を５０℃に昇温して１ｈ維持して、ヒアルロニダーゼが変性して不活性化された。任意に、上述酵素分解液に５ｇの活性炭を加え、６０ｍｉｎ吸着し、粗ろ過板（Ｃｏａｒｓｅｆｉｌｔｒａｔｉｏｎｂｏａｒｄ）で濾過し、孔径が０．２２μｍであるセルロースフィルターで濾過して純粋なヒアルロン酸溶液を取得した。任意に、上述ヒアルロン酸溶液に対して低温噴霧乾燥を行うことにより、低分子ヒアルロン酸の固体粉末を調製した。任意に、低温噴霧の吸気温度が４０℃であり、吹き出し温度が４０℃であり、流速が１００ｍＬ／ｈであった。得られた完成品である低分子ヒアルロン酸の固体粉末の白色度が９５％であり、水分含有量が６．３％であり、分子量が６０ｋＤａであり、ヒアルロン酸の含有量が９７％であり、収率が８９％であった。

実施例２
５Ｌの精製水に６ｍＬのヒアルロニダーゼを加え、攪拌し、ｐＨが５．５、温度が３２℃になるまで調節し、３００ｇの分子量が６５０ｋＤａであるヒアルロン酸ナトリウムをゆっくり添加し、素材を均一に溶解させるために、添加速度を遅くしなければならない。任意に、４０ｍｉｎ分解反応させた後、４００ｇの分子量６５０ｋＤａであるヒアルロン酸ナトリウムをゆっくり添加し続けた。６ｈ酵素分解反応させた後、分子量が５０ｋＤａになり、任意に、酵素分解液を５０℃に昇温して５０ｍｉｎ維持して、ヒアルロニダーゼが変性して不活性化された。

任意に、上述酵素分解液に５ｇの活性炭を加え、６０ｍｉｎ吸着し、粗ろ過板で濾過し、孔径が０．２２μｍであるセルロースフィルターで濾過して純粋なヒアルロン酸溶液を取得した。任意に、上述ヒアルロン酸溶液に対して低温噴霧乾燥を行うことにより、低分子ヒアルロン酸の固体粉末を調製した。任意に、低温噴霧の吸気温度が５０℃であり、吹き出し温度が４０℃であり、流速が１００ｍＬ／ｈであった。得られた完成品である低分子ヒアルロン酸の固体粉末の白色度が９６％であり、水分含有量が７．３％であり、分子量が５０ｋＤａであり、ヒアルロン酸の含有量が９６％であり、収率が９０％であった。

実施例３
５Ｌの精製水に７ｍＬのヒアルロニダーゼを加え、攪拌し、ｐＨが６．０、温度が３４℃になるまで調節し、４００ｇの分子量が７００ｋＤａであるヒアルロン酸ナトリウムをゆっくり添加し、素材を均一に溶解させるために、添加速度を遅くしなければならない。任意に、５０ｍｉｎ分解反応させた後、３００ｇの分子量が７００ｋＤａであるヒアルロン酸ナトリウムをゆっくり添加し続けた。６．５ｈ酵素分解反応させた後、分子量が４０ｋＤａになり、任意に、酵素分解液を５０℃に昇温して１ｈ維持して、ヒアルロニダーゼが変性して不活性化された。任意に、上述酵素分解液に５ｇの活性炭を加え、６０ｍｉｎ吸着し、粗ろ過板で濾過し、孔径が０．２２μｍであるセルロースフィルターで濾過して純粋なヒアルロン酸溶液を取得した。任意に、上述ヒアルロン酸溶液に対して低温噴霧乾燥を行うことにより、低分子ヒアルロン酸の固体粉末を調製した。任意に、低温噴霧の吸気温度が６０℃であり、吹き出し温度が４０℃であり、流速が１５０ｍＬ／ｈであった。得られた完成品である低分子ヒアルロン酸の固体粉末の白色度が９５％であり、水分含有量が８．２％であり、分子量が４０ｋＤａであり、ヒアルロン酸の含有量が９７％であり、収率が９０％であった。

実施例４
５Ｌの精製水に８ｍＬのヒアルロニダーゼを加え、攪拌し、ｐＨが６．５、温度が３６℃になるまで調節し、４００ｇの分子量が５００ｋＤａであるヒアルロン酸ナトリウムをゆっくり添加し、素材を均一に溶解させるために、添加速度を遅くしなければならない。任意に、６０ｍｉｎ分解反応させた後、４００ｇの分子量が５００ｋＤａであるヒアルロン酸ナトリウムをゆっくり添加し続けた。７ｈ酵素分解反応させた後、分子量が３０ｋＤａになり、任意に、酵素分解液を５０℃に昇温して１ｈ維持して、ヒアルロニダーゼが変性して不活性化された。任意に、上述酵素分解液に５ｇの活性炭を加え、６０ｍｉｎ吸着し、粗ろ過板で濾過し、孔径が０．２２μｍであるセルロースフィルターで濾過して純粋なヒアルロン酸溶液を取得した。任意に、上述ヒアルロン酸溶液に対して低温噴霧乾燥を行うことにより、低分子ヒアルロン酸の固体粉末を調製した。任意に、低温噴霧の吸気温度が６５℃であり、吹き出し温度が４０℃であり、流速が１００ｍＬ／ｈであった。得られた完成品である低分子ヒアルロン酸の固体粉末の白色度が９３％であり、水分含有量が７．２％であり、分子量が３０ｋＤａであり、ヒアルロン酸の含有量が９８％であり、収率が９１％であった。

実施例５
５Ｌの精製水に８ｍＬのヒアルロニダーゼを加え、攪拌し、ｐＨが７．０、温度が３８℃になるまで調節し、４００ｇの分子量が６５０ｋＤａであるヒアルロン酸ナトリウムをゆっくり添加し、素材を均一に溶解させるために、添加速度を遅くしなければならない。任意に、７０ｍｉｎ分解反応させた後、４００ｇの分子量６５０ｋＤａであるヒアルロン酸ナトリウムをゆっくり添加し続けた。８ｈ酵素分解反応させた後、分子量が２０ｋＤａになり、任意に、酵素分解液を５０℃に昇温して１ｈ維持して、ヒアルロニダーゼが変性して不活性化された。任意に、上述酵素分解液に５ｇの活性炭を加え、６０ｍｉｎ吸着し、粗ろ過板で濾過し、孔径が０．２２μｍであるセルロースフィルターで濾過して純粋なヒアルロン酸溶液を取得した。任意に、上述ヒアルロン酸溶液に対して低温噴霧乾燥を行うことにより、低分子ヒアルロン酸の固体粉末を調製した。任意に、低温噴霧の吸気温度が７０℃であり、吹き出し温度が４０℃であり、流速が２００ｍＬ／ｈであった。得られた完成品である低分子ヒアルロン酸の固体粉末の白色度が９３％であり、水分含有量が８．３％であり、分子量が２０ｋＤａであり、ヒアルロン酸の含有量が９８％であり、収率が８８％であった。

実施例６
５Ｌの精製水に９ｍＬのヒアルロニダーゼを加え、攪拌し、ｐＨが８．０、温度が４０℃になるまで調節し、５００ｇの分子量が６５０ｋＤａであるヒアルロン酸ナトリウムをゆっくり添加し、素材を均一に溶解させるために、添加速度を遅くしなければならない。任意に、８０ｍｉｎ分解反応させた後、５００ｇの分子量が６５０ｋＤａであるヒアルロン酸ナトリウムをゆっくり添加し続けた。７．５ｈ酵素分解反応させた後、分子量が１０ｋＤａになり、任意に、酵素分解液を５０℃に昇温して１ｈ維持して、ヒアルロニダーゼが変性して不活性化された。任意に、上述酵素分解液に５ｇの活性炭を加え、６０ｍｉｎ吸着し、粗ろ過板で濾過し、孔径が０．２２μｍであるセルロースフィルターで濾過して純粋なヒアルロン酸溶液を取得した。任意に、上述ヒアルロン酸溶液に対して低温噴霧乾燥を行うことにより、低分子ヒアルロン酸の固体粉末を調製した。任意に、低温噴霧の吸気温度が７５℃であり、吹き出し温度が４０℃であり、流速が２５０ｍＬ／ｈであった。得られた完成品である低分子ヒアルロン酸の固体粉末の白色度が９３％であり、水分含有量が７．８％であり、分子量が１０ｋＤａであり、ヒアルロン酸の含有量が９９％であり、収率が８９％であった。

実施例７
５Ｌの精製水に１０ｍＬのヒアルロニダーゼを加え、攪拌し、ｐＨが６．５、温度が３８℃になるまで調節し、４００ｇの分子量が７００ｋＤａであるヒアルロン酸ナトリウムをゆっくり添加し、素材を均一に溶解させるために、添加速度を遅くしなければならない。任意に、９０ｍｉｎ分解反応させた後、５００ｇの分子量が７００ｋＤａであるヒアルロン酸ナトリウムをゆっくり添加し続けた。６ｈ酵素分解反応させた後、分子量が７ｋＤａ－９ｋＤａになり、任意に、酵素分解液を５０℃に昇温して１ｈ維持して、ヒアルロニダーゼが変性して不活性化された。任意に、上述酵素分解液に５ｇの活性炭を加え、６０ｍｉｎ吸着し、粗ろ過板で濾過し、孔径が０．２２μｍであるセルロースフィルターで濾過して純粋なヒアルロン酸溶液を取得した。任意に、上述ヒアルロン酸溶液に対して低温噴霧乾燥を行うことにより、低分子ヒアルロン酸の固体粉末を調製した。任意に、低温噴霧の吸気温度が８０℃であり、吹き出し温度が４０℃であり、流速が３００ｍＬ／ｈであった。得られた完成品である低分子ヒアルロン酸の固体粉末の白色度が９４％であり、水分含有量が６．９％であり、分子量が１ｋＤａであり、ヒアルロン酸の含有量が９９％であり、収率が９０％であった。

さらに、本開示の実施例の低温噴霧乾燥法の代わりに従来のアルコール沈殿方式を採用して低分子ヒアルロン酸の固体粉末を調製した。

比較例１
５Ｌの精製水に１０ｍＬのヒアルロニダーゼを加え、攪拌し、ｐＨが６．５、温度が３８℃になるまで調節し、４００ｇの分子量が７００ｋＤａであるヒアルロン酸ナトリウムをゆっくり添加し、素材を均一に溶解させるために、添加速度を遅くしなければならない。９０ｍｉｎ分解反応させた後、５００ｇの分子量が７００ｋＤａであるヒアルロン酸ナトリウムをゆっくり添加し続けた。６ｈ酵素分解反応させた後、分子量が７ｋＤａ－９ｋＤａになり、酵素分解液を５０℃に昇温して１ｈ維持して、ヒアルロニダーゼが変性して不活性化された。上述酵素分解液に５ｇの活性炭を加え、６０ｍｉｎ吸着し、粗ろ過板で濾過し、孔径が０．２２μｍであるセルロースフィルターで濾過して純粋なヒアルロン酸溶液を取得した。得られた純粋なヒアルロン酸溶液を４倍のアルコールに逆沈殿しながら攪拌した。沈殿が終了し、１時間静置し、上澄みを除去し、一倍体積のアルコールを加えて３回脱水し、遠心し、上澄みを除去し、固形物に対して真空乾燥を行い、低分子ヒアルロン酸の固体粉末を調製した。低分子ヒアルロン酸粉末の白色度が８９％であり、水分含有量が８．９％であり、分子量が９ｋＤａであり、ヒアルロン酸の含有量が９５％であり、収率が７８％であった。

比較例２
５Ｌの精製水に８ｍＬのヒアルロニダーゼを加え、攪拌し、ｐＨが６．５、温度が３６℃になるまで調節し、４００ｇの分子量が５００ｋＤａであるヒアルロン酸ナトリウムをゆっくり添加し、素材を均一に溶解させるために、添加速度を遅くしなければならない。６０ｍｉｎ分解反応させた後、４００ｇの分子量が５００ｋＤａであるヒアルロン酸ナトリウムをゆっくり添加し続けた。７ｈ酵素分解反応させた後、分子量が３０ｋＤａになり、酵素分解液を５０℃に昇温して１ｈ維持して、ヒアルロニダーゼが変性して不活性化された。上述酵素分解液に５ｇの活性炭を加え、６０ｍｉｎ吸着し、粗ろ過板で濾過し、孔径が０．２２μｍであるセルロースフィルターで濾過して純粋なヒアルロン酸溶液を取得した。得られた純粋なヒアルロン酸溶液を４倍のアルコールに加えて逆沈殿しながら攪拌した。沈殿が終了し、１時間静置し、上澄みを除去し、１倍体積のアルコールを加えて３回脱水し、遠心し、上澄みを除去し、固形物に対して真空乾燥を行い、低分子ヒアルロン酸の固体粉末を調製した。低分子ヒアルロン酸粉末の白色度が８７％であり、水分含有量が９．２％であり、分子量が３０ｋＤａであり、ヒアルロン酸の含有量が９４％であり、収率が７９％であった。

比較例１と比較例２から、従来のアルコール沈殿方式を採用して得られたヒアルロン酸の製品品質及び製品収率は、いずれも低温噴霧乾燥法よりも低かったことが分かった。

好ましい実施例を示して本発明を詳しく説明したが、本開示はこれらに限らない。当業者は、本開示の精神及び実質から逸脱することなく、本開示の実施例に対して各種の同等修正、又は切り替えを行うことができる。本発明の範囲は、特許請求の範囲及びその等価物により限定される。さらに、当業者が本開示によって開示される技術範囲内で容易に想到できる変更又は切り替えは、本開示の保護範囲にある。そのため、本開示の保護範囲は、特許請求の範囲に準じる。

本開示の実施例によって提供される低分子ヒアルロン酸又はその塩を調製する方法は、植物性乳酸菌によって産生されるヒアルロニダーゼを用いて、酵素分解、酵素不活性化、吸着、濾過精製及び低温噴霧乾燥等のステップを経て、低分子ヒアルロン酸又はその塩を調製し、当該方法のプロセスフローが簡単であり、用いられるヒアルロニダーゼの不活性化方法が便利であり、効率的な不活性化精製の実現に寄与し；得られる低温噴霧乾燥は、収率が高く、汚染がなく、エネルギー消費が低く、有機溶剤が残留しない長所があり、また、分子構造の完成性と生物活性を最大限保証し；得られる低分子ヒアルロン酸は、白色度が高く、水分含有量が低く、含有量が高く、収率が高く、かつ、異なる分子量への要求を満足でき；植物性乳酸菌は、得られる製品により高い安全性とより低い生産コストを与え、低分子ヒアルロン酸又はその塩の産業化生産及び応用潜在能力を効果的に向上させる。

Claims

以下のステップを含むことを特徴とする、低分子ヒアルロン酸又はその塩を調製する方法。
（１）酵素分解反応液：精製水にヒアルロニダーゼを加え、攪拌し、ヒアルロン酸又はその塩の固体粉末をゆっくり加え、酵素分解反応で酵素分解液を取得し、前記ヒアルロニダーゼは、植物性乳酸菌突然変異株ＣｎＴ０１２－５６が発酵生産して得られ、当該菌株がＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｐｌａｎｔａｒｕｍとして分類命名され、その寄託機関が中国微生物菌種保蔵管理委員会普通微生物センター（ＣｈｉｎａＧｅｎｅｒａｌＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌＣｕｌｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎＣｅｎｔｅｒ）であり、住所が北京市朝陽区北辰西路１号院３号であり、寄託日が２０１８年１１月２８日であり、受託番号がＣＧＭＣＣＮＯ．１６８３６である；
（２）ヒアルロニダーゼの不活性化：ステップ（１）での前記酵素分解液に対して昇温処理を行い、前記酵素分解液におけるヒアルロニダーゼ変性して不活性化される；
（３）吸着：ステップ（２）での前記酵素分解液を吸着し、混合液を取得する；
（４）濾過精製：ステップ（３）での混合液から吸着剤及び変性ヒアルロニダーゼを除去し、濾過して純粋な低分子ヒアルロン酸及びその塩溶液を取得する；
（５）低温噴霧乾燥：ステップ（４）での前記低分子ヒアルロン酸及びその塩溶液に対して低温噴霧乾燥を行い、所望の分子量の低分子ヒアルロン酸及びその塩の固体粉末を取得する。
ステップ（１）において、まず、精製水にヒアルロニダーゼを加え、攪拌し、ｐＨが５－８、温度が３０－４０℃になるまで調節し、質量対体積濃度が５０－１００ｇ／Ｌになるように、ヒアルロン酸又はその塩の固体粉末をゆっくり加え、０．５－１．５ｈ分解反応させた後、質量対体積濃度が１００－２００ｇ／Ｌになるように、ヒアルロン酸又はその塩の固体粉末をゆっくり添加し続け、５－８ｈ酵素分解し続けることを特徴とする、請求項１に記載の低分子ヒアルロン酸又はその塩を調製する方法。
ステップ（１）での前記ヒアルロニダーゼの添加量は、１グラムのヒアルロン酸又はその塩あたり１０２－１０５ＩＵの前記ヒアルロニダーゼであることを特徴とする、請求項１に記載の低分子ヒアルロン酸又はその塩を調製する方法。
ステップ（２）での前記ヒアルロニダーゼが変性して不活性化される条件は、酵素分解液を４５－８０℃に昇温して５－６０ｍｉｎ維持することを特徴とする、請求項１に記載の低分子ヒアルロン酸又はその塩を調製する方法。
ステップ（３）での前記酵素分解液の吸着条件は、０．０１％－１％活性炭を用いて、３０－９０ｍｉｎ吸着し、ステップ（４）で、孔径が０．２２μｍであるセルロースフィルターを用いて前記濾過を行うことを特徴とする、請求項１に記載の低分子ヒアルロン酸又はその塩を調製する方法。
前記ヒアルロン酸塩は、ヒアルロン酸ナトリウムであり、ｐＨの調節は、塩酸又は水酸化ナトリウム溶液を用いることを特徴とする、請求項２に記載の低分子ヒアルロン酸又はその塩を調製する方法。
ステップ（４）での前記低分子ヒアルロン酸又はその塩溶液の最終濃度は、１０％－２０％であることを特徴とする、請求項１に記載の低分子ヒアルロン酸又はその塩を調製する方法。
ステップ（５）での前記低温噴霧乾燥の条件は、吸気温度が４０℃－８０℃であり、吹き出し温度が４０℃であり、仕込み速度が１００ｍＬ／ｈ－３００ｍＬ／ｈであることを特徴とする、請求項１に記載の低分子ヒアルロン酸又はその塩を調製する方法。
ステップ（１）での前記酵素分解に用いられるヒアルロン酸又はその塩の分子量は、５００ｋＤａ－７００ｋＤａであり、ステップ（５）で調製された前記低分子ヒアルロン酸又はその塩の分子量は、１ｋＤａ－６０ｋＤａであることを特徴とする、請求項１に記載の低分子ヒアルロン酸又はその塩を調製する方法。
前記ヒアルロニダーゼの生産方法は、以下のステップを含むことを特徴とする、請求項１－９のいずれか一項に記載の低分子ヒアルロン酸又はその塩を調製する方法。
（ａ）ＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｐｌａｎｔａｒｕｍＣｎＴ０１２－５６菌種を殺菌された種培地に接種し、培養温度が３０℃－３７℃であり、回転速度が０－１００ｒｐｍ、８－２４ｈ培養し、種培養液を取得する；
（ｂ）ステップ（１）での前記種培養液を殺菌された発酵培養基に接種し、培養温度が３０℃－３７℃であり、回転速度が０－１５０ｒｐｍであり、２０－４８ｈ培養し、ヒアルロニダーゼ発酵液を取得する；
（ｃ）ステップ（２）での前記ヒアルロニダーゼ発酵液に対して遠心を行い、上澄みを取得する；
（ｄ）孔径分画分子量が２００ｋＤａである限外濾過膜を用いてステップ（３）での前記ヒアルロニダーゼ上澄みに対して限外濾過を行い、ろ液を取得する；
（ｅ）孔径分画分子量が２０ｋＤａである限外濾過膜を用いてステップ（４）での前記ろ液に対して限外濾過を行い、低分子不純物を除去し、精製したヒアルロニダーゼを取得する。
ステップ（ａ）での前記種培地の成分は、ペプトン１０ｇ／Ｌ、酵母浸漬パウダー５ｇ／Ｌ、ヒアルロン酸５ｇ／Ｌ、グルコース３ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム０．１ｇ／Ｌ、硫酸アンモニウム２ｇ／Ｌ、硫酸第一鉄０．０５ｇ／Ｌ、硫酸マグネシウム０．２ｇ／Ｌ、トウェイン－８０１ｍＬであり、ｐＨが６．５であることを特徴とする、請求項１０に記載の低分子ヒアルロン酸又はその塩を調製する方法。
ステップ（ｂ）での前記発酵培養基の成分は、ペプトン１０ｇ／Ｌ、酵母浸漬パウダー５ｇ／Ｌ、ヒアルロン酸５ｇ／Ｌ、グルコース３ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム０．１ｇ／Ｌ、硫酸アンモニウム２ｇ／Ｌ、硫酸第一鉄０．０５ｇ／Ｌ、硫酸マグネシウム０．２ｇ／Ｌ、トウェイン－８０１ｍＬであり、ｐＨが６．５であることを特徴とする、請求項１０－１１のいずれか一項に記載の低分子ヒアルロン酸又はその塩を調製する方法。