CN118086424A - 一种产酶菌组合及利用产酶菌制备银耳低聚糖的方法 - Google Patents
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- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明提供了一种产酶菌组合及利用产酶菌制备银耳低聚糖的方法。所述产酶菌组合包括耐热克鲁维酵母(Kluyveromyces thermotolerans)和高地芽孢杆菌(Bacillus altitudinis)、耐热克鲁维酵母(Kluyveromyces thermotolerans)和粪产碱杆菌(Alcaligenes faecalis)，或黑曲霉(Aspergillus niger)与类芽孢杆菌(Paenibacillus sp.)。所述方法包括如下步骤：用产酶菌或产酶菌组合进行发酵；酶解银耳多糖以获得含银耳低聚糖的酶解液。本发明的酶法降解技术与传统的物理和化学降解法相比，获得的银耳低聚糖的分子量在1.0～3.3KDa之间，纯度高且收率高，能耗低，产物分子量特征稳定，具有规律化的分子量分布特征。
Description
技术领域
本发明涉及糖类化合物加工领域，具体涉及一种产酶菌组合及利用产酶菌制备银耳低聚糖的方法。
背景技术
银耳在中国是一种有历史传统的滋补食品，其主要活性成分是银耳多糖。银耳多糖主链为α-1,3-糖苷键连接的聚甘露糖，侧链包含葡萄糖、木糖、果糖、阿拉伯糖和葡萄糖醛酸。银耳多糖被报道具有保湿、免疫调节、抗肝癌细胞增殖、降血糖、促进伤口愈合、抗氧化、抗辐射、抗光老化、抗病毒和神经细胞保护活性，其中免疫调节作用最为受到关注。
根据银耳来源的不同，银耳多糖的分子量从几万道尔顿到几百万道尔顿不等。分子量过大的特性阻碍了银耳多糖被食道吸收。口服银耳多糖后，仅有0.4％的多糖从肠道被吸收到血液(Gao,Yang et al.2020"Preparation,characterization,and cytokine-stimulating activity of oligosaccharides from Tremella fuciformis Berk."JFood Biochem 44(7):e13212.)。为了提高银耳多糖的生物利用度，找到银耳多糖起效的最小结构单元。Gao等通过酸水解银耳多糖和凝胶层析分离，制备了一系列分子量不同的低聚糖(从单糖到53KDa)。并发现分子量在1KDa以上的低聚糖都能促进人单核细胞IL-6的分泌；而当分子量小于1KDa时，低聚糖的细胞因子激活效应就显著降低(Gao,Jiang etal.1996"Characterization and cytokine stimulating activities of heteroglycans fromTremella fuciformis."Planta Med 62(4):297-302)。Gao等通过酸/碱法降解银耳多糖，得到聚合度2～8的银耳寡糖。他们发现聚合度大于6的银耳低聚糖才能产生细胞因子激活效应(Gao,Yang et al.2020"Preparation,characterization,and cytokine-stimulating activity of oligosaccharides from Tremella fuciformis Berk."JFood Biochem 44(7):e13212.)。
2002年，以银耳多糖为主要成分的银耳孢糖肠溶胶囊被SFDA批准作为放化疗导致的白细胞减少症的治疗药物。Yalin Zhou等人报道使用环磷酰胺(一种抗肿瘤药)诱导昆明小鼠免疫抑制后，服用银耳多糖能显著增强模型小鼠的免疫能力(Zhou,Chen et al.2018"Immunomodulatory Effect of Tremella Polysaccharides against Cyclophosphamide-Induced Immunosuppressi on in Mice."Molecules 23(2).)。Rui-Zhi Jiang等通过酸水解获得了6种解聚的银耳多糖，分子量从4KDa到500KDa不等。他们发现银耳多糖的分子量越低，就越是能缓解环磷酰胺诱导的小鼠白细胞减少(Jiang,Wang et al.2012"Effect ofthe molecular mass of tremella polysaccharides on accelera ted recovery fromcyclophosphamide-induced leucopenia in rats."Molecules17(4):3609-3617)。
综上所述，银耳多糖具有诸多生理活性，且其起效的最小结构单元要求分子量在1KDa以上。为了既提高银耳多糖的生物利用度，又不使银耳多糖生理活性损失，通过降解银耳多糖制备分子量在1KDa以上的银耳低聚糖具有重要的应用价值。
目前，制备银耳低聚糖的现有技术方案分为物理方法和化学方法。其中物理法通过高剪切、电解、高压均质等方式打断多糖链，生产过程能耗很高；化学方法通过使用酸、双氧水等化学试剂降解多糖，污染大，试剂消耗量大。同时特别要注意的是，无论物理方法还是化学方法，它们都是随机打断多糖链，无法保证产物结构的均一性，也无法有效控制降解产物的分子量。
专利申请CN109053919A提出电Fenton法。在酸性条件下(pH3)，通过通入氧气和电流降解银耳多糖，降解率在30％左右，制备的低分子量银耳多糖为33KDa。该方法消耗酸、耗能，且降解率低，降解程度有限。
专利申请CN110590968A提出超声高剪切法。在超声环境中进行高剪切处理，同时添加石英砂，将银耳多糖的糖链打断。其银耳多糖降解率为90％，制备的银耳低聚糖分子量在340～2000Da，且主要分布在1KDa以下。该方法耗能较高，且无法有效控制低聚糖的分子量分布。
专利申请CN114671959A使用高压均质的方法降解银耳多糖。降解后的多糖分子量95％以上小于10KDa。该方法使用高压均质机，生产效率低且能耗很高，同时银耳多糖降解的程度有限。
专利申请CN112251480A使用生物、化学和物理相结合的方法制备银耳低聚糖。首先将使用微生物对银耳进行3～4天的发酵，然后用2.5％的盐酸浸泡银耳，再使用0.5％的硫酸在60℃下搅拌水解，最后在130～140℃条件下干燥。使用该方法得到的银耳寡糖收率仅14％左右，聚合度在2～15。该方法所得银耳低聚糖收率低，且无法控制低聚糖的分子量分布。
陈丽娟(陈丽娟2017《银耳多糖快速提取及可控降解的研究》硕士,华南理工大学)使用1.5％的H2O2，在60℃条件下让银耳多糖降解40min。其最小的降解产物为4.3kDa的低分子量多糖。该方法所得的低聚糖降解程度有限。
专利文本CN112029006B公开了：用商品化的果胶纤维素复合酶对银耳浸提液处理，制得的银耳多糖分子量在10000Da以下占总多糖的95％，总含糖量大于92％，最高为94.3％。但经过验证发现果胶酶和纤维素酶事实上并不能起到降解银耳多糖的效果。
因此本领域急需一种能够制备银耳低聚糖的方法和由此制备的一定分子量范围的具有免疫调节等作用的银耳低聚糖。
发明内容
针对现有技术中消耗酸、耗能高、降解率低、降解程度有限以及收率低等缺陷，本发明提供了一种产酶菌组合及利用产酶菌制备银耳低聚糖的方法。本发明的酶法降解技术与传统的物理和化学降解法相比，获得的银耳低聚糖的分子量在1.0～3.3KDa之间，纯度高且收率高，能耗低，产物分子量特征稳定，具有规律化的分子量分布特征。
本发明第一方面提供了一种制备银耳低聚糖的方法，其中，所述方法包括如下步骤：
S1：用产酶菌进行产酶发酵；所述产酶菌选自耐热克鲁维酵母(Kluyveromycesthermotolerans)、黑曲霉(Aspergillus niger)、类芽孢杆菌(Paenibacillus sp.)、高地芽孢杆菌(Bacillus altitudinis)和粪产碱杆菌(Alcaligenes faecalis)；
S2：酶解银耳多糖以获得含银耳低聚糖的酶解液。
在一些实施方案中，S1中，将所述产酶菌接种于培养基中，发酵得到粗酶液。
在一些实施方案中，所述产酶菌选自保藏号为CGMCC No.24072的耐热克鲁维酵母(Kluyveromyces thermotolerans)、保藏号为CICC No.40048的黑曲霉(Aspergillusniger)、保藏号为CGMCC No.25534的类芽孢杆菌(Paenibacillus sp.)WSK-2、保藏号为CGMCC No.25745的高地芽孢杆菌(Bacillus altitudinis)B28和保藏号为CGMCC No.25744的粪产碱杆菌(Alcaligenes faecalis)WN6。以上保藏号的产酶菌均来源于现有技术。
在一些优选的实施方案中，所述产酶菌为高地芽孢杆菌(Bacillus altitudinis)B28或高地芽孢杆菌B28与耐热克鲁维酵母(Kluyveromyces thermotolerans)的组合，或耐热克鲁维酵母(Kluyveromyces thermotolerans)与粪产碱杆菌(Alcaligenes faecalis)WN6的组合，或黑曲霉(Aspergillus niger)与类芽孢杆菌(Paenibacillus sp.)WSK-2的组合。
在一些实施方案中，所述培养基包含银耳或银耳多糖、酵母提取物、大豆蛋白胨、牛肉浸膏、磷酸氢二钾、氯化钠、硫酸铵、氯化钙、硫酸镁。
在一些实施方案中，所述发酵的温度为25～40℃，例如30℃。
在一些实施方案中，所述发酵的时间为24～72h，优选为36～48h，例如40h。
在一些实施方案中，所述粗酶液可通过超滤膜过滤得酶浓缩液(浓缩2～10倍)或通过加入硫酸铵，离心、脱盐、冷冻干燥得固体酶制剂。
在一些实施方案中，所述培养基各组分的含量如下，其中比例均为质量体积比(W/V)：
银耳或银耳多糖为0.1％～2％，例如为2％；
酵母提取物为0.1％～2％，例如为1％；
大豆蛋白胨为0.1％～2％，例如为1％；
牛肉浸膏为0.1％～2％，例如为0.5％；
磷酸氢二钾为0.1％～1％，例如为0.5％；
氯化钠为0.1％～1％，例如为0.5％；
硫酸铵为0.1％～1％，例如为0.2％；
氯化钙为0.001％～0.05％，例如为0.001％；
硫酸镁为0.001％～0.1％，例如为0.001％；
余量用水补齐。
在一些实施方案中，所述组合中两种菌的比例为1:(0.5～2)，例如为1:1。
在一些实施方案中，用于酶纯化的超滤膜的截留分子量为10KDa及以上，例如10KDa、30KDa。
在一些实施方案中，S2中，所述银耳多糖的制备包括以下步骤：将银耳或银耳粉放入水中，浸提，得银耳多糖的浸提液。
在一些实施方案中，所述酶解包括以下步骤：将所述粗酶液、酶浓缩液或固体酶制剂与所述浸提液混合，使所述银耳多糖发生降解，然后升温使酶灭活。
在一些实施方案中，浸提的时间为3～5h，例如3h。
在一些实施方案中，所述粗酶液或酶浓缩液与所述浸提液的体积比为1:(5～100)，例如1:9。
在一些实施方案中，所述降解的温度为30～55℃，较佳地为45～55℃，例如为45℃。
在一些实施方案中，所述降解的时间为12～24h，例如为20h。
在一些实施方案中，所述酶灭活的温度为80℃～100℃，例如为90℃。
在一些实施方案中，所述灭活的时间为10～30min，例如为30min。
在一些实施方案中，其中，还包括S3：纯化含银耳低聚糖的酶解液，以获得银耳低聚糖；即，在所述酶解液中加入活性炭，脱色，再加入红硅藻土，过滤，得银耳低聚糖溶液。
在一些优选的实施方案中，所述脱色的温度为60～80℃，例如为80℃。
在一些优选的实施方案中，所述脱色的时间为0.5～1h，例如为1h。
在一些实施方案中，所述银耳低聚糖溶液进一步用超滤膜处理，得银耳低聚糖的浓缩液；所述超滤膜的截留分子量为10KDa及以下，例如4KDa、5KDa或10KDa。
在一些优选的实施方案中，还包括对所述浓缩液进行灭菌的步骤，例如在121℃条件下灭菌30min。
在一些优选的实施方案中，所述浓缩液的含固量为10％～20％(W/V)。
在一些优选的实施方案中，所述浓缩液经干燥即得到银耳低聚糖粉末。
本发明第二方面提供了一种产酶菌组合，其包括耐热克鲁维酵母(Kluyveromycesthermotolerans)和高地芽孢杆菌(Bacillus altitudinis)，或耐热克鲁维酵母(Kluyveromyces thermotolerans)和粪产碱杆菌(Alcaligenes faecalis)，或黑曲霉(Aspergillus niger)与类芽孢杆菌(Paenibacillus sp.)。
在一些优选的实施方案中，所述耐热克鲁维酵母(Kluyveromycesthermotolerans)为保藏号为CGMCC No.24072的耐热克鲁维酵母，所述高地芽孢杆菌(Bacillus altitudinis)为保藏号为CGMCC No.25745的高地芽孢杆菌B28，所述粪产碱杆菌(Alcaligenes faecalis)为保藏号为CGMCCNo.25744的粪产碱杆菌WN6，所述类芽孢杆菌(Paenibacillus sp.)为保藏号为CGMCC No.25534的类芽孢杆菌WSK-2。
本发明第三方面提供了一种产酶菌或产酶菌组合在制备银耳低聚糖中的应用；其中，所述产酶菌如本发明第一方面所述的方法所定义，所述产酶菌组合为如本发明第二方面所述的产酶菌组合。
在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。
本发明所用试剂和原料均市售可得。
本发明的积极进步效果在于：
(1)本发明的酶法降解技术与传统的物理和化学降解法相比，降解过程温和可控，能耗低，不需要额外添加化学试剂，工艺对环境友好。此外，该方法生产效率高、反应条件温和且没有副产物生成。
(2)通过本方法得到的酶解银耳低聚糖分子量分布稳定，分子量在1.0～3.3KDa之间，纯度高且收率高，能耗低，产物分子量特征稳定，具有规律化的分子量分布特征。且本方操作简便，适合大规模生产，具有显著地经济效益。
(3)酶对底物化学键的水解具有选择性，可以通过改变酶解条件实现对银耳多糖的精确可控降解。
附图说明
图1为酶法制备银耳低聚糖工艺流程图。
图2A为酶法生产的银耳低聚糖分子量分析示意图。使用岛津凝胶色谱柱TSK-GELG2000SWXL分析银耳低聚糖产品分子量，流动相0.1M硝酸钠，流速0.5ml/min。靠上部分曲线为4种分子量不同的葡聚糖标准品的分子量分布情况。靠下部分曲线为按本方法制备的银耳低聚糖的分子量分布情况。
图2B为银耳低聚糖三批次产品分子量分析示意图。使用岛津凝胶色谱柱TSK-GELG2000SWXL分析银耳低聚糖产品分子量，流动相0.1M硝酸钠，流速0.5ml/min。三条曲线展示按本方法制备的3个批次的银耳低聚糖的分子量分布情况。
具体实施方式
下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。
实施例1
将耐热克鲁维酵母(Kluyveromyces thermotolerans)(保藏号：CGMCCNo.24072)和高地芽孢杆菌(Bacillus altitudinis)B28(保藏号：CGMCCNo.25745)分别进行活化培养，当OD600达到1.0时，分别以1％(v/v)的接种量将两种菌种同时接种于培养基，培养基组分为(w/v)：2％银耳、1％的酵母提取物、1％的大豆蛋白胨、0.5％牛肉浸膏、0.5％磷酸氢二钾、0.5％氯化钠、0.2％硫酸铵、0.001％氯化钙、0.001％硫酸镁。在30℃、充分搅拌和通气的条件下发酵40小时。4000rpm离心15分钟，去除发酵液中的菌体和不溶性成分，得到粗酶液。使用截留分子量为10KDa超滤膜过滤粗酶液，获得酶浓缩液。将市售干银耳或银耳粉放入水中，制成5％(W/V)银耳溶液，100℃条件下浸提3小时。取上述酶浓缩液1体积与9体积的5％银耳浸提液相混合。在45℃、充分搅拌的条件下降解20小时。然后将酶解液升温至90℃，保温30分钟使酶灭活。再加入5％(W/V)的活性炭，在80℃条件下搅拌1小时脱色。接下来以红硅藻土为助滤剂，使用滤纸过滤混合液，去掉活性炭和不溶性成分。再使用截留分子量为10KDa的超滤膜彻底去除上述银耳低聚糖溶液中的酶分子和部分分子量较大的银耳多糖，即得到银耳低聚糖纯化溶液。将所述银耳低聚糖纯化液浓缩，使其含固量达到10％(W/V)。最后将该浓缩液在121℃条件下灭菌30分钟，再通过喷雾干燥即得到银耳低聚糖粉末。该酶法制备银耳低聚糖工艺流程如图1所示，下同。
实施例2
将耐热克鲁维酵母和高地芽孢杆菌B28分别进行活化培养，当OD600达到1.0时，分别以1％(v/v)的接种量将两种菌种同时接种于培养基，培养基组分为(w/v)：2％银耳、1％的酵母提取物、1％的大豆蛋白胨、0.5％牛肉浸膏、0.5％磷酸氢二钾、0.5％氯化钠、0.2％硫酸铵、0.001％氯化钙、0.001％硫酸镁。在30℃、充分搅拌和通气的条件下发酵40小时。4000rpm离心15分钟，去除发酵液中的菌体和不溶性成分，得到粗酶液。使用截留分子量为10KDa超滤膜过滤粗酶液，获得酶浓缩液。将市售银耳或银耳粉放入水中，制成5％(W/V)银耳溶液，100℃条件下浸提3小时。取上述酶浓缩液1体积与9体积的5％银耳浸提液相混合。在45℃、充分搅拌的条件下降解20小时。然后将酶解液升温至90℃，保温30分钟使酶灭活。再加入5％(W/V)的活性炭，在80℃条件下搅拌1小时脱色。接下来以红硅藻土为助滤剂，使用滤纸过滤混合液，去掉活性炭和不溶性成分。将上述脱色后的银耳低聚糖溶液浓缩，使其含固量达到10％(W/V)。最后将该浓缩液在121℃条件下灭菌30分钟，再通过喷雾干燥即得到银耳低聚糖粉末。
实施例3
将耐热克鲁维酵母和高地芽孢杆菌B28分别进行活化培养，当OD600达到1.0时，分别以1％(v/v)的接种量将两种菌种同时接种于产酶培养基，培养基组分为(w/v)：2％银耳、1％的酵母提取物、1％的大豆蛋白胨、0.5％牛肉浸膏、0.5％磷酸氢二钾、0.5％氯化钠、0.2％硫酸铵、0.001％氯化钙、0.001％硫酸镁。在30℃、充分搅拌和通气的条件下发酵40小时。4000rpm离心15分钟，去除发酵液中的菌体和不溶性成分，得到粗酶液。使用截留分子量为10KDa超滤膜过滤粗酶液，获得酶浓缩液。将市售银耳或银耳粉放入水中，制成5％(W/V)银耳溶液，100℃条件下浸提3小时。取上述酶浓缩液1体积与9体积的5％银耳浸提液相混合。在45℃、充分搅拌的条件下降解20小时。然后将酶解液升温至90℃，保温30分钟使酶灭活。再加入5％(W/V)的活性炭，在80℃条件下搅拌1小时脱色。接下来以红硅藻土为助滤剂，使用滤纸过滤混合液，去掉活性炭和不溶性成分。将10体积上述脱色后的银耳低聚糖溶液加入1体积装有活化LSA-700B树脂的层析柱，杂质被吸附在树脂上，透过液为低聚糖纯化液。将上述低聚糖纯化液浓缩使其含固量达到10％(W/V)。最后将该浓缩液在121℃条件下灭菌30分钟，再通过喷雾干燥即得到银耳低聚糖粉末。
实施例4
将耐热克鲁维酵母和高地芽孢杆菌B28分别进行活化培养，当OD600达到1.0时，分别以1％(v/v)的接种量将两种菌种同时接种于产酶培养基，培养基组分为(w/v)：2％银耳、1％的酵母提取物、1％的大豆蛋白胨、0.5％牛肉浸膏、0.5％磷酸氢二钾、0.5％氯化钠、0.2％硫酸铵、0.001％氯化钙、0.001％硫酸镁。在30℃、充分搅拌和通气的条件下发酵40小时。4000rpm离心15分钟，去除发酵液中的菌体和不溶性成分，得到粗酶液。将市售银耳或银耳粉放入水中，制成5％(W/V)银耳溶液，100℃条件下浸提3小时。取上述粗酶液1体积与9体积的5％银耳浸提液相混合。在45℃、充分搅拌的条件下降解20小时。然后将酶解液升温至90℃，保温30分钟使酶灭活。再加入5％(W/V)的活性炭，在80℃条件下搅拌1小时脱色。接下来以红硅藻土为助滤剂，使用滤纸过滤混合液，去掉活性炭和不溶性成分。再使用截留分子量为10KDa的超滤膜彻底去除上述银耳低聚糖溶液中的酶分子和部分分子量较大的银耳多糖，即得到银耳低聚糖纯化溶液。将所述银耳低聚糖纯化液浓缩，使其含固量达到10％(W/V)。最后将该浓缩液在121℃条件下灭菌30分钟，再通过喷雾干燥即得到银耳低聚糖粉末。
实施例5
将耐热克鲁维酵母和粪产碱杆菌WN6(保藏号：CGMCC No.25744)分别进行活化培养，当OD600达到1.0时，分别以1％(v/v)的接种量将两种菌种同时接种于产酶培养基，培养基组分为(w/v)：2％银耳、1％的酵母提取物、1％的大豆蛋白胨、0.5％牛肉浸膏、0.5％磷酸氢二钾、0.5％氯化钠、0.2％硫酸铵、0.001％氯化钙、0.001％硫酸镁。在30℃、充分搅拌和通气的条件下发酵40小时。4000rpm离心15分钟，去除发酵液中的菌体和不溶性成分，得到粗酶液。使用截留分子量为10KDa超滤膜过滤粗酶液，获得酶浓缩液。将市售银耳或银耳粉放入水中，制成5％(W/V)银耳溶液，100℃条件下浸提3小时。取上述酶浓缩液1体积与9体积的5％银耳浸提液相混合。在45℃、充分搅拌的条件下降解20小时。然后将酶解液升温至90℃，保温30分钟使酶灭活。再加入5％(W/V)的活性炭，在80℃条件下搅拌1小时脱色。接下来以红硅藻土为助滤剂，使用滤纸过滤混合液，去掉活性炭和不溶性成分。再使用截留分子量为10KDa的超滤膜彻底去除上述银耳低聚糖溶液中的酶分子和部分分子量较大的银耳多糖，即得到银耳低聚糖纯化溶液。将所述银耳低聚糖纯化液浓缩，使其含固量达到10％(W/V)。最后将该浓缩液在121℃条件下灭菌30分钟，再通过喷雾干燥即得到银耳低聚糖粉末。
实施例6
取高地芽孢杆菌B28进行活化培养，当OD600达到1.0时，以1％(v/v)的接种量接种于培养基，培养基组分为(w/v)：2％银耳、1％的酵母提取物、1％的大豆蛋白胨、0.5％牛肉浸膏、0.5％磷酸氢二钾、0.5％氯化钠、0.2％硫酸铵、0.001％氯化钙、0.001％硫酸镁。在30℃、充分搅拌和通气的条件下发酵40小时。4000rpm离心15分钟，去除发酵液中的菌体和不溶性成分，得到粗酶液。使用截留分子量为10KDa超滤膜过滤粗酶液，获得酶浓缩液。将市售干银耳或银耳粉放入水中，制成5％(W/V)银耳溶液，100℃条件下浸提3小时。取上述酶浓缩液1体积与9体积的5％银耳浸提液相混合。在45℃、充分搅拌的条件下降解20小时。然后将酶解液升温至90℃，保温30分钟使酶灭活。再加入5％(W/V)的活性炭，在80℃条件下搅拌1小时脱色。接下来以红硅藻土为助滤剂，使用滤纸过滤混合液，去掉活性炭和不溶性成分。再使用截留分子量为10KDa的超滤膜彻底去除上述银耳低聚糖溶液中的酶分子和部分分子量较大的银耳多糖，即得到银耳低聚糖纯化溶液。将所述银耳低聚糖纯化液浓缩，使其含固量达到10％(W/V)。最后将该浓缩液在121℃条件下灭菌30分钟，再通过喷雾干燥即得到银耳低聚糖粉末。
实施例7
将黑曲霉(Aspergillus niger)(保藏号：CICC No.40048)和类芽孢杆菌(Paenibacillus sp.)WSK-2(保藏号：CGMCC No.25534)分别进行活化培养，当各自OD600达到1.0时，分别以1％(v/v)的接种量将两种菌种同时接种于产酶培养基，培养基组分为(w/v)：2％银耳、1％的酵母提取物、1％的大豆蛋白胨、0.5％牛肉浸膏、0.5％磷酸氢二钾、0.5％氯化钠、0.2％硫酸铵、0.001％氯化钙、0.001％硫酸镁。在30℃、充分搅拌和通气的条件下发酵40小时。4000rpm离心15分钟，去除发酵液中的菌体和不溶性成分，得到粗酶液。使用截留分子量为10KDa的超滤膜过滤粗酶液，获得酶浓缩液。将市售银耳或银耳粉放入水中，制成5％(W/V)银耳溶液，100℃条件下浸提3小时。取上述酶浓缩液1体积与9体积的5％银耳浸提液相混合。在45℃、充分搅拌的条件下降解20小时。然后将酶解液升温至90℃，保温30分钟使酶灭活。再加入5％(W/V)的活性炭，在80℃条件下搅拌1小时脱色。接下来以红硅藻土为助滤剂，使用滤纸过滤混合液，去掉活性炭和不溶性成分。再使用截留分子量为10KDa的超滤膜彻底去除上述银耳低聚糖溶液中的酶分子和部分分子量较大的银耳多糖，即得到银耳低聚糖纯化溶液。将所述银耳低聚糖纯化液浓缩，使其含固量达到10％(W/V)。最后将该浓缩液在121℃条件下灭菌30分钟，再通过喷雾干燥即得到银耳低聚糖粉末。
对比例1
将干银耳或银耳粉与水按1：20的重量比混合，在高压灭菌锅内121℃，0.2Mpa条件下保温5小时。随着保温时间的延长，溶液的粘度会逐渐降低，但5小时后下降趋势减缓，粘度不再继续变化。使用滤布将上述银耳多糖热裂解液过滤，去除体积较大的不溶性杂质，再加入5％(W/V)的活性炭，在80℃条件下搅拌1小时脱色。接下来以红硅藻土为助滤剂，使用滤纸过滤混合液，去掉活性炭和不溶性成分。使用截留分子量为10KDa的超滤膜彻底去除上述银耳低聚糖溶液中的酶分子和部分分子量较大的银耳多糖，即得到银耳低聚糖纯化溶液。将所述银耳低聚糖纯化液浓缩，使其含固量达到10％(W/V)。最后将该浓缩液在121℃条件下灭菌30分钟，再通过喷雾干燥即得到银耳低聚糖粉末。
对比例2
将干银耳或银耳粉与水按1：20的重量比混合，使用盐酸将pH至调节到3.0。升温到90℃，充分搅拌3小时。在酸解过程中，pH越低，温度越高，水解时间越久，银耳多糖水解的程度就越高。因此，采用上述较温和的酸解条件，否则银耳多糖将被完全水解为单糖。酸解结束后使用氢氧化钠将溶液pH调至中性，再加入5％(W/V)的活性炭，在80℃条件下搅拌1小时脱色。接下来以红硅藻土为助滤剂，使用滤纸过滤混合液，去掉活性炭和不溶性成分。再使用截留分子量为10KDa的超滤膜彻底去除上述银耳低聚糖溶液中的酶分子和部分分子量较大的银耳多糖，即得到银耳低聚糖纯化溶液。将所述银耳低聚糖纯化液浓缩，使其含固量达到10％(W/V)。最后将该浓缩液在121℃条件下灭菌30分钟，再通过喷雾干燥即得到银耳低聚糖粉末。
测定上述7组实施例和2组对比例所生产的银耳低聚糖产品量，对银耳低聚糖提取率、银耳低聚糖分子量分布和银耳低聚糖总糖含量三个指标进行比较，具体数据如下：
表1不同实施例与对比例所得银耳低聚糖的质量数据
注：a，用所得银耳低聚糖粉末干重比上银耳原料干重为银耳低聚糖收率。
b，使用岛津凝胶色谱柱TSK-GEL G2000SWXL分析银耳低聚糖产品分子量，流动相0.1M硝酸钠，流速0.5ml/min。
c，测定银耳低聚糖粉末中总糖含量(以甘露糖计)，表征低聚糖产品中银耳低聚糖含量。
根据表1和图2A和图2B，得到如下结论：
根据对比例1，高温降解虽然能显著降低银耳多糖溶液的粘度，降低银耳多糖的分子量。但无法得到聚合度在20以下、分子量在3.6KDa以下的低聚糖。同时高温降解过程是随机打开多糖链，断链位置无法控制，产品结构并不稳定。而本发明提供的酶法降解技术能专一性地降解银耳多糖，并在特定位置水解糖苷键，所生产的银耳低聚糖结构稳定。
根据对比例2，酸水解不仅会降解银耳多糖，还会降解银耳中其它生物大分子，如蛋白质或核酸。因此使用酸水解的方法得到的低聚糖收率最高，但纯度最低。另一方面，酸水解过程也是随机打开多糖链，断链位置无法控制，且分子量较低的寡糖更容易被水解，因此产生大量的单糖和聚合度小于6的寡糖，这会使得银耳多糖的生理活性丧失。因此，酸水解手段会将银耳多糖降解为单糖或分子量过低的寡糖。
根据实施例5，当用酵母和产碱杆菌WN6组合时，可以获得与实施例1相近的结果，即产品分子量分布稳定，且收率高(21.07％)，纯度高(85.2％)。
根据实施例2，由于酶解产物中有相当比例的分子量较大的银耳多糖，通过纯化才能得到聚合度在20以下、分子量在3.6KDa以下的低聚糖。同时使用超滤膜截留的分子量较大的银耳多糖可以在后一轮生产中作为底物被继续降解。因此，可优选地对酶解产物进行纯化。
根据实施例3，使用大孔吸附树脂作为替代的纯化手段，一方面会增加成本，降低收率；另一方面使得产品中存在一部分分子量较大的银耳多糖。因此，可优选地使用超滤膜对银耳低聚糖进行纯化。
根据实施例4，由于粗酶液中含有未被消耗的培养基成分和菌株的代谢产物，这些成分被加入酶解体系会导致杂质增加，使得银耳低聚糖的纯度降低。因此，优选地可对银耳多糖酶进行纯化。
根据实施例6，使用单菌高地芽孢杆菌B28单独进行发酵时，产品分子量分布稳定，纯度高(84.7％)，但其收率(17.5％)较克鲁维酵母和高地芽孢杆菌联用例(实施例1，收率22.3％)有所降低。
根据实施例7，当用黑曲霉和类芽孢杆菌WSK-2组合时，可以获得与实施例1相近的结果，即产品分子量分布稳定，且收率高(20.8％)，纯度高(85.4％)。
根据实施例1，表明通过使用超滤膜对酶解产物进行纯化后，结合图2A和图2B发现，按本发明制备的银耳低聚糖呈现出明显规律化的分子量分布。由于传统方法随机断链，各种分子量低聚糖的含量都是随机的。而本实施例通过酶解，只会切割多糖链的某些特定位置，才会造成这种规律化的分子量分布特征。可见，其效果显著优于缺失纯化步骤的方法以及传统的高温降解和酸水解手段。
Claims (11)
1.一种制备银耳低聚糖的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
S1：用产酶菌进行产酶发酵；所述产酶菌选自耐热克鲁维酵母(Kluyveromycesthermotolerans)、黑曲霉(Aspergillus niger)、类芽孢杆菌(Paenibacillus sp.)、高地芽孢杆菌(Bacillus altitudinis)和粪产碱杆菌(Alcaligenes faecalis)；
S2：酶解银耳多糖以获得含银耳低聚糖的酶解液。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，S1中，将所述产酶菌接种于培养基中，发酵得到粗酶液；较佳地，所述产酶菌选自保藏号为CGMCC No.24072的耐热克鲁维酵母(Kluyveromyces thermotolerans)、保藏号为CICC No.40048的黑曲霉(Aspergillusniger)、保藏号为CGMCC No.25534的类芽孢杆菌(Paenibacillus sp.)WSK-2、保藏号为CGMCC No.25745的高地芽孢杆菌(Bacillus altitudinis)B28和保藏号为CGMCC No.25744的粪产碱杆菌(Alcaligenes faecalis)WN6；
更佳地，所述产酶菌为高地芽孢杆菌(Bacillus altitudinis)B28或高地芽孢杆菌(Bacillus altitudinis)B28与耐热克鲁维酵母(Kluyveromyces thermotolerans)的组合，或耐热克鲁维酵母(Kluyveromyces thermotolerans)与粪产碱杆菌(Alcaligenesfaecalis)WN6的组合，或黑曲霉(Aspergillus niger)与类芽孢杆菌(Paenibacillus sp.)WSK-2的组合。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述培养基包含银耳或银耳多糖、酵母提取物、大豆蛋白胨、牛肉浸膏、磷酸氢二钾、氯化钠、硫酸铵、氯化钙、硫酸镁；
和/或，所述发酵的温度为25～40℃，例如30℃；
和/或，所述发酵的时间为24～72h，优选为36～48h，例如40h；
和/或，所述粗酶液可通过超滤膜过滤得酶浓缩液或通过加入硫酸铵，离心、脱盐、冷冻干燥得固体酶制剂。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述培养基各组分的含量如下，其中比例均为质量体积比：
银耳或银耳多糖为0.1％～2％，例如为2％；
酵母提取物为0.1％～2％，例如为1％；
大豆蛋白胨为0.1％～2％，例如为1％；
牛肉浸膏为0.1％～2％，例如为0.5％；
磷酸氢二钾为0.1％～1％，例如为0.5％；
氯化钠为0.1％～1％，例如为0.5％；
硫酸铵为0.1％～1％，例如为0.2％；
氯化钙为0.001％～0.05％，例如为0.001％；
硫酸镁为0.001％～0.1％，例如为0.001％；
余量用水补齐。
5.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述组合中两种菌的比例为1:(0.5～2)，例如为1:1；
和/或，用于酶纯化的超滤膜的截留分子量为10KDa及以上，例如10KDa、30KDa。
6.如权利要求3所述的方法，其特征在于，S2中，所述银耳多糖的制备包括以下步骤：将银耳或银耳粉放入水中，浸提，得银耳多糖的浸提液；
和/或，所述酶解包括以下步骤：将所述粗酶液、酶浓缩液或固体酶制剂与所述浸提液混合，使所述银耳多糖发生降解，然后升温使酶灭活。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，浸提的时间为3～5h，例如3h；
和/或，所述粗酶液或酶浓缩液与所述浸提液的体积比为1:(5～100)，例如1:9；
和/或，所述降解的温度为30～55℃，较佳地为45～55℃，例如为45℃；
和/或，所述降解的时间为12～24h，例如为20h；
和/或，所述酶灭活的温度为80℃～100℃，例如为90℃；
和/或，所述灭活的时间为10～30min，例如为30min。
8.如权利要求1～7任一项所述的方法，其特征在于，还包括S3：纯化含银耳低聚糖的酶解液，以获得银耳低聚糖；即，在所述酶解液中加入活性炭，脱色，再加入红硅藻土，过滤，得银耳低聚糖溶液；
较佳地，所述脱色的温度为60～80℃，例如为80℃；
和/或，所述脱色的时间为0.5～1h，例如为1h。
9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述银耳低聚糖溶液进一步用超滤膜处理，得银耳低聚糖的浓缩液；所述超滤膜的截留分子量为10KDa及以下，例如4KDa、5KDa或10KDa；
较佳地，还包括对所述浓缩液进行灭菌的步骤，例如在121℃条件下灭菌30min；
和/或，所述浓缩液的含固量为10％～20％(W/V)；
和/或，所述浓缩液经干燥即得到银耳低聚糖粉末。
10.一种产酶菌组合，其特征在于，其包括耐热克鲁维酵母(Kluyveromycesthermotolerans)和高地芽孢杆菌(Bacillus altitudinis)，或耐热克鲁维酵母(Kluyveromyces thermotolerans)和粪产碱杆菌(Alcaligenes faecalis)，或黑曲霉(Aspergillus niger)与类芽孢杆菌(Paenibacillus sp.)；
较佳地，所述耐热克鲁维酵母(Kluyveromyces thermotolerans)为保藏号为CGMCCNo.24072的耐热克鲁维酵母，所述高地芽孢杆菌(Bacillus altitudinis)为保藏号为CGMCC No.25745的高地芽孢杆菌B28，所述粪产碱杆菌(Alcaligenes faecalis)为保藏号为CGMCC No.25744的粪产碱杆菌WN6，所述类芽孢杆菌(Paenibacillus sp.)为保藏号为CGMCC No.25534的类芽孢杆菌WSK-2。
11.一种产酶菌或产酶菌组合在制备银耳低聚糖中的应用；其中，所述产酶菌如权利要求1～9所述的方法所定义，所述产酶菌组合为如权利要求10所述的产酶菌组合。
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