CN113493528A - 一种真菌发酵耦合氧化鱿鱼扇形骨制备壳聚糖的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种真菌发酵耦合氧化鱿鱼扇形骨制备壳聚糖的方法，其解决现有壳聚糖化学法易污染环境、酶法反应时间长、物理法产率不佳的问题，其包括以下步骤：1）发酵菌液的制备；2）鱿鱼扇形骨发酵；3）壳聚糖制备；4）纯化。本发明以鱿鱼扇形骨为原料，通过丝状真菌菌体内甲壳素分解酶的释放，并应用于鱿鱼扇形骨初步降解，发酵产物经氧化进一步降解，并联合超临界流体除杂，获得水溶性、生物相容性良好的产品。本发明工艺采用发酵和氧化降解耦合技术，实现了壳聚糖清洁制备，具有工艺流程简单高效，反应条件温和，易控制，利于大规模推广生产。
Description
技术领域
本发明涉及壳质多糖的制备，尤其是一种真菌发酵耦合氧化鱿鱼扇形骨制备壳聚糖的方法。
背景技术
据文献报道，水溶性壳聚糖由甲壳素脱乙酰法、壳聚糖接枝法和壳聚糖解聚法。前两种方法过程复杂、分解程度不可控，最主要需要消耗大量酸碱。壳聚糖解聚法主要有化学法、物理法和酶法，其中化学法易造成环境污染，酶法反应时间长，杂质多，且成熟技术报道少，物理法需采用专门的设备，降解产物的分子量较高，产率不佳，目前还处于实验室研究阶段。
近年来，随着壳聚糖功能的不断开发，市场需求日益增大，促进产业的发展，但现有生产工艺都存在程度不同的缺陷或不足，建立一种生产速度快，且环保、高效的水溶性壳聚糖制备方法亟需解决。
发明内容
为了克服现有壳聚糖化学法易污染环境、酶法反应时间长、物理法产率不佳的不足，本发明的目的在于提供一种工艺流程简单高效、反应条件温和的真菌发酵耦合氧化鱿鱼扇形骨制备壳聚糖的方法。该制备方法是以鱿鱼扇形骨为原料，通过丝状真菌菌体内甲壳素分解酶的释放，并应用于鱿鱼扇形骨初步降解，发酵产物经氧化进一步降解，并联合超临界流体除杂，获得水溶性、生物相容性良好的产品。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：一种真菌发酵耦合氧化鱿鱼扇形骨制备壳聚糖的方法，其特征在于，其经过以下工艺步骤：
1）发酵菌液的制备
取丝状真菌进行平板培养，挑取单菌落，用斜面划线法纯化；配制液体培养基，进行二级菌种培育，在温度25-40℃、150-180r/min振荡培养1-2天，离心取沉淀，用纯净水进行清洗，冻干，超微粉碎后备用；
2）鱿鱼扇形骨发酵
a.取鱿鱼扇形骨，用清水冲洗除杂，粉碎机粉碎；
b.取步骤a中得到的鱿鱼扇形骨粉，加入步骤1）中得到的超微粉碎菌体，加入纯净水，在温度30℃-37℃、pH6-7、120-150r/min振荡恒温培养2-3天；发酵完成后，加热至90-95℃并恒温20-30min，离心取上清液；
3）壳聚糖制备
将步骤b）中获得的上清液中加入双氧水，加热至35-40℃，恒温6-8h，离心取上清液，加入乙醇，离心取沉淀，纯净水冲洗，即得壳聚糖；
4）纯化
将步骤3）中得到的粗壳聚糖真空干燥，再将干燥的粗壳聚糖放入超临界二氧化碳萃取器中处理2-5h，萃取完成后残留物料，即为壳聚糖。
作为优选，在步骤1）中，所述的培养基为LB培养基。
作为优选，在步骤1）中，所述的丝状真菌为黑曲霉、雅致毛霉、米根霉、蓝色犁头霉中的一种或两种，超微粉碎获得的菌粉粒径为200-500nm。
作为优选，在步骤2）b中，所述的鱿鱼扇形骨粉与菌粉重量比为1-5:1，添加的纯净水为鱿鱼扇形骨粉与菌粉总重的10-15倍。
作为优选，在步骤3）中，所述的双氧水的浓度为30-35%，双氧水的加入量为步骤b）中获得的上清液重量的25-30%。
作为优选，在步骤4）中，所述的超临界二氧化碳的处理条件为：压力15-20MPa、温度20-30℃、二氧化碳流速10-15 kg/h、时间10-20min。
作为优选，在步骤2）b中，发酵前还加入了3-5%的矿物溶解菌。
作为优选，在步骤2）b中，所述的矿物溶解菌由乳酸杆菌、双球菌、氧化亚铁硫杆菌、多黏芽孢杆菌、好氧假单胞菌中的两种菌组成，其质量比为1:1。
本发明有益效果：
(1)本发明采用双氧水可控技术，对鱿鱼扇形骨进行物理处理，同时利用其产生的高能释放，对甲壳素改性，产生水溶性甲壳素；
(2)本发明采用生物加物理方式，克服了目前甲壳素应用的酸碱工艺污染环境的问题，为鱿鱼扇形骨的进一步深加工应用创造了条件；
(3)本发明制备的产物均匀，无杂质，克服了酸碱分解不可控，分子量小的问题，赋予壳聚糖良好的应用性状；
(4)本发明采用丝状真菌和矿物溶解菌协同制备水溶性壳聚糖，克服了鱿鱼扇形骨外壳成分交织叠积形成的致密壳质-蛋白有机结构阻碍甲壳素分解，温和反应实现了酸碱激烈反应的技术效果；
(5) 本发明工艺采用发酵和氧化降解耦合技术，实现了壳聚糖清洁制备，具有工艺流程简单高效，反应条件温和，易控制，利于大规模推广生产。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行详细描述，所述的实施案例有助于对本发明的理解和实施，并非构成对本发明的限制。本发明的保护范围并不以具体实施方式为限，而是由权利要求加以限定。
实施例1
一种真菌发酵耦合氧化鱿鱼扇形骨制备壳聚糖的方法，其经过以下工艺步骤：
1）发酵菌液的制备
取丝状真菌进行平板培养，挑取单菌落，用斜面划线法纯化；配制液体培养基，进行二级菌种培育，在温度35℃、160r/min振荡培养1.8天，离心取沉淀，用纯净水进行清洗，冻干，超微粉碎后备用；所述的培养基为LB培养基，所述的丝状真菌为黑曲霉、蓝色犁头霉两种，超微粉碎获得的菌粉粒径为350nm；
2）鱿鱼扇形骨发酵
a.取鱿鱼扇形骨，用清水冲洗除杂，粉碎机粉碎；
b.取步骤a中鱿鱼扇形骨粉，加入步骤1）中得到的超微粉碎菌体，加入纯净水，在温度37℃、pH6、140r/min振荡恒温培养2.5天；发酵完成后，加热至93℃并恒温25min，离心取上清液；其中，鱿鱼扇形骨粉与菌粉重量比为4:1，添加的纯净水为鱿鱼扇形骨粉与菌粉总重的12倍；发酵前还加入了4%的矿物溶解菌，矿物溶解菌由乳酸杆菌、双球菌、氧化亚铁硫杆菌、多黏芽孢杆菌、好氧假单胞菌中的两种菌组成，其质量比为1:1；
3）壳聚糖制备
步骤b）中获得的上清液中加入双氧水，加热至38℃，恒温6.5h，离心取上清液，加入乙醇，离心取沉淀，纯净水冲洗即得壳聚糖；其中，所述的双氧水的浓度为33%，双氧水的加入量为步骤b）中获得的上清液重量的26%；
4）纯化
将步骤3）中得到的粗壳聚糖真空干燥，再将干燥的粗壳聚糖放入超临界二氧化碳萃取器中处理3h，萃取完成后残留物料即为壳聚糖；其中，所述的超临界二氧化碳处理条件为：压力17MPa、温度25℃、二氧化碳流速12kg/h、时间15min。
实施例2
一种真菌发酵耦合氧化鱿鱼扇形骨制备壳聚糖的方法，其经过以下工艺步骤：
1）发酵菌液的制备
取丝状真菌进行平板培养，挑取单菌落，用斜面划线法纯化；配制液体培养基，进行二级菌种培育，在温度25℃、150r/min振荡培养1天，离心取沉淀，用纯净水进行清洗，冻干，超微粉碎后备用；其中，所述的培养基为LB培养基，所述的丝状真菌为黑曲霉、雅致毛霉、米根霉、蓝色犁头霉中的一种或两种，超微粉碎获得的菌粉粒径为200nm；
2）鱿鱼扇形骨发酵
a.取鱿鱼扇形骨，用清水冲洗除杂，粉碎机粉碎；
b.取步骤a中鱿鱼扇形骨粉，加入步骤1）中得到的的超微粉碎菌体，加入纯净水，在温度30℃、pH6、120r/min振荡恒温培养2天；发酵完成后，加热至90℃并恒温20min，离心取上清液；其中，鱿鱼扇形骨粉与菌粉重量比为1:1，添加的纯净水为鱿鱼扇形骨粉与菌粉总重的10倍；发酵前还加入了3%的矿物溶解菌，矿物溶解菌由乳酸杆菌、双球菌、氧化亚铁硫杆菌、多黏芽孢杆菌、好氧假单胞菌中的两种菌组成，其质量比为1:1；
3）壳聚糖制备
步骤b）中获得的上清液中加入双氧水，加热至35℃，恒温6h，离心取上清液，加入乙醇，离心取沉淀，纯净水冲洗，即得壳聚糖；其中，所述的双氧水的浓度为30%，双氧水的加入量为步骤b）中获得的上清液重量的25%；
4）纯化
将步骤3）中得到的粗壳聚糖真空干燥，再将干燥的粗壳聚糖放入超临界二氧化碳萃取器中处理2h，萃取完成后残留物料即为壳聚糖；其中，所述的超临界二氧化碳处理条件为：压力15MPa、温度20℃、二氧化碳流速10kg/h、时间10min。
实施例3
一种真菌发酵耦合氧化鱿鱼扇形骨制备壳聚糖的方法，其经过以下工艺步骤：
1）发酵菌液的制备
取丝状真菌进行平板培养，挑取单菌落，用斜面划线法纯化；配制液体培养基，进行二级菌种培育，在温度40℃、180r/min振荡培养2天，离心取沉淀，用纯净水进行清洗，冻干，超微粉碎后备用；其中，所述的培养基为LB培养基，所述的丝状真菌为黑曲霉、雅致毛霉、米根霉、蓝色犁头霉中的一种或两种，超微粉碎获得的菌粉粒径为500nm；
2）鱿鱼扇形骨发酵
a.取鱿鱼扇形骨，用清水冲洗除杂，粉碎机粉碎；
b.取步骤a中鱿鱼扇形骨粉，加入步骤1）中得到的超微粉碎菌体，加入纯净水，在温度37℃、pH7、150r/min振荡恒温培养3天；发酵完成后，加热至95℃并恒温30min，离心取上清液；其中，鱿鱼扇形骨粉与菌粉重量比为5:1，添加的纯净水为鱿鱼扇形骨粉与菌粉总重的15倍；发酵前还加入了5%的矿物溶解菌，矿物溶解菌由乳酸杆菌、双球菌、氧化亚铁硫杆菌、多黏芽孢杆菌、好氧假单胞菌中的两种菌组成，其质量比为1:1；
3）壳聚糖制备
步骤b）中获得的上清液中加入双氧水，加热至40℃，恒温8h，离心取上清液，加入乙醇，离心取沉淀，纯净水冲洗即得壳聚糖；其中，所述的双氧水的浓度为35%，双氧水的加入量为步骤b）中获得的上清液重量的30%；
4）纯化
将步骤3）中得到的粗壳聚糖真空干燥，再将干燥的粗壳聚糖放入超临界二氧化碳萃取器中处理5h，萃取完成后残留物料，即为壳聚糖；其中，所述的超临界二氧化碳处理条件为：压力20MPa、温度30℃、二氧化碳流速15 kg/h、时间20min。
对比例1
在本对比例中，其制备方法和实施例1基本相同，其区别在于：不进行步骤1）中真菌得粉碎。
对比例2
在本对比例中，其制备方法和实施例1基本相同，其区别在于：不进行步骤1）和2）。
对比例3
在本对比例中，其制备方法和实施例1基本相同，其区别在于：步骤2）b步骤中不添加矿物溶解菌。
对比例4
在本对比例中，其制备方法和实施例1基本相同，其区别在于：不进行步骤3）操作。
对比例5
在本对比例中，其制备方法和实施例1基本相同，其区别在于：不进行步骤4）操作。
提取率和纯度实验分析
将上述实施例和对比例进行提取率和纯度比较，提取率为最终获得的产物与原料重量之比，结果见表1所示。
表1不同处理条件水溶性壳聚糖提取率和纯度分析
| 组别 | 实施例1 | 实施例2 | 实施例3 | 对比例1 | 对比例2 | 对比例3 | 对比例4 | 对比例5 |
| 提取率/% | 97.5 | 93.1 | 97.0 | 50.8 | 41.5 | 30.9 | 80.2 | 96.7 |
| 纯度/% | 99.9 | 99.1 | 99.5 | 98.4 | 82.6 | 78.1 | 97.4 | 90.6 |
表1结果表明，实施例1-3均获得高提取率和纯度，生物-氧化提取工艺构成水溶性壳聚糖制备的先进工艺。对比例1-5壳聚糖的提取受真菌处理方式、发酵工序、矿物分解菌、氧化处理、纯化处理的显著影响，其中真菌处理、发酵工艺和矿物溶解菌是影响提取率的决定因素，三者的结合，提高了壳聚糖的提取率，因真菌粉碎，释放了溶解甲壳素酶，矿物溶解菌破坏了致密壳质-蛋白有机结构，使酶有效作用。对比例4-5影响壳聚糖的率，但影响处于次要位置。
壳聚糖水溶性比较
将上述实施例和对比例进行水溶性比较，溶解度是以产物与水重量之比，结果见表2所示。
表2壳聚糖水溶性分析
| 组别 | 实施例1 | 市售壳聚糖 |
| 溶解性 | 水溶 | 水溶 |
| 溶解度/% | 99.2 | 98.6 |
| 溶解时间/s | 58.3 | 172.1 |
表2结果显示，本发明制备的壳聚糖溶解度与现有技术无显著差异，但是本发明溶解时间显著短，结果表明本发明的壳聚糖水溶性比现有技术好。
Claims (8)
1.一种真菌发酵耦合氧化鱿鱼扇形骨制备壳聚糖的方法，其特征在于，其经过以下工艺步骤：
1）发酵菌液的制备
取丝状真菌进行平板培养，挑取单菌落，用斜面划线法纯化；配制液体培养基，进行二级菌种培育，在温度25-40℃、150-180r/min振荡培养1-2天，离心取沉淀，用纯净水进行清洗，冻干，超微粉碎后备用；
2）鱿鱼扇形骨发酵
a.取鱿鱼扇形骨，用清水冲洗除杂，粉碎机粉碎；
b.取步骤a中得到的鱿鱼扇形骨粉，加入步骤1）中得到的超微粉碎菌体，加入纯净水，在温度30℃-37℃、pH6-7、120-150r/min振荡恒温培养2-3天；发酵完成后，加热至90-95℃并恒温20-30min，离心取上清液；
3）壳聚糖制备
将步骤b）中获得的上清液中加入双氧水，加热至35-40℃，恒温6-8h，离心取上清液，加入乙醇，离心取沉淀，纯净水冲洗，即得壳聚糖；
4）纯化
将步骤3）中得到的粗壳聚糖真空干燥，再将干燥的粗壳聚糖放入超临界二氧化碳萃取器中处理2-5h，萃取完成后残留物料，即为壳聚糖。
2.根据权利要求1所述的一种真菌发酵耦合氧化鱿鱼扇形骨制备壳聚糖的方法，其特征在于，在步骤1）中，所述的培养基为LB培养基。
3.根据权利要求1所述的一种真菌发酵耦合氧化鱿鱼扇形骨制备壳聚糖的方法，其特征在于，在步骤1）中，所述的丝状真菌为黑曲霉、雅致毛霉、米根霉、蓝色犁头霉中的一种或两种，超微粉碎获得的菌粉粒径为200-500nm。
4.根据权利要求1所述的一种真菌发酵耦合氧化鱿鱼扇形骨制备壳聚糖的方法，其特征在于，在步骤2）b中，所述的鱿鱼扇形骨粉与菌粉重量比为1-5:1，添加的纯净水为鱿鱼扇形骨粉与菌粉总重的10-15倍。
5.根据权利要求1所述的一种真菌发酵耦合氧化鱿鱼扇形骨制备壳聚糖的方法，其特征在于，在步骤3）中，所述的双氧水的浓度为30-35%，双氧水的加入量为步骤b）中获得的上清液重量的25-30%。
6.根据权利要求1所述的一种真菌发酵耦合氧化鱿鱼扇形骨制备壳聚糖的方法，其特征在于，在步骤4）中，所述的超临界二氧化碳的处理条件为：压力15-20MPa、温度20-30℃、二氧化碳流速10-15 kg/h、时间10-20min。
7.根据权利要求1所述的一种真菌发酵耦合氧化鱿鱼扇形骨制备壳聚糖的方法，其特征在于，在步骤2）b中，发酵前还加入了3-5%的矿物溶解菌。
8.根据权利要求7所述的一种真菌发酵耦合氧化鱿鱼扇形骨制备壳聚糖的方法，其特征在于，在步骤2）b中，所述的矿物溶解菌由乳酸杆菌、双球菌、氧化亚铁硫杆菌、多黏芽孢杆菌、好氧假单胞菌中的两种菌组成，其质量比为1:1。
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