CN115558040B - 一种无防腐剂添加的透明质酸或其盐的生产方法 - Google Patents
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Abstract
本申请提供一种无防腐剂添加的透明质酸或其盐的生产方法，包括以下步骤：配制包含纯化用盐、过滤助剂、吸附剂的辅料液，并使用碱调节辅料液的pH为10‑13，将辅料液稀释后加入透明质酸或其盐粗品，过滤后得到透明质酸或其盐溶液，将透明质酸或其盐溶液进行紫外杀菌，将经过紫外杀菌后的透明质酸或其盐溶液分装或干燥，得到透明质酸或其盐成品。本申请的生产方法过程，条件温和，且不引入任何防腐剂，对环境及设备更加友好，对于多糖类物质无明显损伤，不会大幅度降低其分子量，且终产品中不存在防腐剂残留，成品的细菌总数＜10cfu/g，霉菌和酵母菌未检出。并且本申请发现，针对地衣芽孢杆菌可以采用较小的剂量的紫外照射，剂量300mWs/cm2即可达到99％杀菌效果。
Description
技术领域
本申请属于生物纯化领域，具体地，涉及一种无防腐剂添加的透明质酸或其盐的生产方法。
背景技术
透明质酸发酵液营养丰富，且粘度高，难过滤，生产周期长，因此，在其生产过程中极易染菌。尽管在后期纯化过程中通过滤膜过滤，以及干燥过程能够杀死并除去绝大多数常见细菌，如大肠杆菌等，但是对于芽孢杆菌等耐高温耐酸耐碱细菌则无法有效杀灭，不能保证成品微生物检测合格。
现有技术中，为了降低成品中微生物，常会在产品纯化过程中使用高温、强碱、强酸等条件长时间处理料液，或者加入双氧水、次氯酸钠等防腐剂，但是上述方法会导致透明质酸降解甚至变质。另外双氧水、次氯酸钠作为强氧化剂，与易燃易爆的乙醇等有机溶剂混合时，容易发生爆燃，在后期醇沉干燥过程中存在很大危险。且其易造成产品中防腐剂的残留，尤其不适用于食品级原料的生产。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本申请提供一种无防腐剂添加的透明质酸或其盐的生产方法。
具体来说，本申请涉及如下方面：
1.一种无防腐剂添加的透明质酸或其盐的生产方法，其特征在于，所述生产方法包括以下步骤：
配制包含纯化用盐、过滤助剂、吸附剂的辅料液，并使用碱调节所述辅料液的pH为10-13，
将所述辅料液稀释后加入透明质酸或其盐粗品，过滤后得到透明质酸或其盐溶液，
将所述透明质酸或其盐溶液进行紫外杀菌，
将经过紫外杀菌后的透明质酸或其盐溶液分装或干燥，得到透明质酸或其盐成品。
2.根据项1所述的生产方法，其特征在于，使用碱调节所述辅料液的pH为10-13后，放置所述所述辅料液0.5h以上，优选放置0.5h-4h之后再对所述辅料液进行稀释。
3.根据项1所述的生产方法，其特征在于，所述辅料液中纯化用盐的质量浓度为0.1％-10％，过滤助剂的质量浓度为1％-20％，吸附剂的质量浓度为1％-10％。
4.根据项1所述的生产方法，其特征在于，所述透明质酸或其盐溶液中透明质酸或其盐的质量浓度为0.01％-40％。
5.根据项4所述的生产方法，其特征在于，
当所述透明质酸或其盐的分子量大于等于1000kDa时，所述透明质酸或其盐溶液中透明质酸或其盐的质量浓度为0.01％-1％，
当所述透明质酸及或其盐的分子量大于100kDa且小于1000kDa时，所述透明质酸或其盐溶液中透明质酸或其盐的质量浓度为0.01％-10％，
当所述透明质酸及或其盐的分子量小于等于100kDa时，所述透明质酸或其盐溶液中透明质酸或其盐的质量浓度为0.01％-40％。
6.根据项1所述的生产方法，其特征在于，所述紫外杀菌的紫外照射剂量为300-6000mWs/cm2。
7.根据项6所述的生产方法，其特征在于，
当所述透明质酸或其盐溶液中透明质酸或其盐的质量浓度为0.01％-1％时，紫外照射剂量为300-1000mWs/cm2，
当所述透明质酸或其盐溶液中透明质酸或其盐的质量浓度大于1％且小于等于10％时，紫外照射剂量为1000～3000mWs/cm2，
当所述透明质酸或其盐溶液中透明质酸或其盐的质量浓度大于10％且小于等于40％时，紫外照射剂量为3000-6000mWs/cm2。
8.根据项1所述的生产方法，其特征在于，所述透明质酸或其盐粗品选自透明质酸或其盐发酵粗品、透明质酸或其盐复溶液、透明质酸或其盐交联后溶液、以及透明质酸或其盐衍生物溶液中的一种。
9.根据项1所述的生产方法，其特征在于，所述纯化用盐选自氯化钠、氯化钙、以及氯化镁中的一种或两种以上。
10.根据项1所述的生产方法，其特征在于，将经过紫外杀菌后的透明质酸或其盐溶液干燥，得到透明质酸或其盐成品的步骤包括：
将经过紫外杀菌后的透明质酸或其盐溶液使用有机溶剂沉淀，
对所得沉淀进行干燥，得到透明质酸或其盐成品，
优选地，所述有机溶剂选自乙醇、丙酮、以及正丁醇中的一种或两种以上。
11.一种根据项1-10中任一项所述的方法得到的透明质酸或其盐产品。
本申请发现了在透明质酸生产过程中，微生物检测不合格主要是由于地衣芽孢杆菌超标造成的，尤其是辅料中引入的地衣芽孢杆菌。本申请的生产方法过程，条件温和，且不引入任何防腐剂，对环境及设备更加友好，对于多糖类物质无明显损伤，不会大幅度降低其分子量，且终产品中不存在防腐剂残留，成品的细菌总数＜10cfu/g，霉菌和酵母菌未检出。并且本申请发现，针对地衣芽孢杆菌可以采用较小的剂量的紫外照射，剂量300mWs/cm2即可达到99％杀菌效果。
附图说明
图1为本申请对比例3紫外辐照后的料液涂板培养后的照片。
图2为本申请实施例5和对比例4的所得成品的颜色对比，其中左图为实施例5、右图为对比例4的成品。
具体实施方式
下面结合实施例进一步说明本申请，应当理解，实施例仅用于进一步说明和阐释本申请，并非用于限制本申请。
除非另外定义，本说明书中有关技术的和科学的术语与本领域内的技术人员所通常理解的意思相同。虽然在实验或实际应用中可以应用与此间所述相似或相同的方法和材料，本文还是在下文中对材料和方法做了描述。在相冲突的情况下，以本说明书包括其中定义为准，另外，材料、方法和例子仅供说明，而不具限制性。以下结合具体实施例对本申请作进一步的说明，但不用来限制本申请的范围。
针对现有透明质酸或其盐的纯化方法中存在的微生物含量过高，必须采用加入防腐剂来杀灭微生物的问题，申请人希望能够确定微生物产生的方法环节，以及微生物种类，从而有针对性采取措施进行灭菌。
为此，申请人对透明质酸生产方法过程常用的辅料如珍珠岩、活性炭、方法用水、方法用盐等进行取样，并进行平板涂布培养，同时监测整个生产方法过程中的样品，如发酵液、透明质酸粗品溶解液、过滤液、醇沉前溶液、醇沉后粉末等进行平板涂布培养。发现透明质酸生产方法过程中杂菌的引入主要来源于珍珠岩、活性炭，二者中的细菌种类多样，包括各种革兰氏阳性菌及革兰氏阴性菌。通过对各种消杀手段进行测试发现，方法过程中引入的革兰氏阴性菌均可以被碱液或短时高温杀死，而成品中反复出现的一种革兰氏阳性菌广泛存在于透明质酸生产常用的辅料中，如珍珠岩、活性炭等。
申请人进一步通过16sRNA测序发酵该菌为产多糖类物质的地衣芽孢杆菌。针对该地衣芽孢杆菌，申请人采用强酸、强碱、高温的方式进行消杀，发现醋酸(pH＝5.5)或NaOH(pH＝11)处理菌悬液4小时，致死率仅仅能够达到75％和68.75％。地衣芽孢杆菌产多糖，菌落较大，无色素，为透明状，对于紫外线敏感，可以用合适的剂量杀死99.9％的地衣芽孢杆菌。
紫外线杀菌是一种低能耗、低时耗杀菌技术，它的杀菌的原理主要是通过紫外线对微生物的照射，破坏及改变微生物组织结构(DNA核酸)，导致核酸结构突变，生物体丧失复制、繁殖能力，功能遭到破坏，从而达到杀菌的目的。近年来，开始逐渐在食品、饮料、化妆品生产过程中推广应用。
本申请基于上述发现提供一种无防腐剂添加的透明质酸或其盐的生产方法，其包括以下步骤：
步骤一：配制包含纯化用盐、过滤助剂、吸附剂的辅料液，并使用碱调节所述辅料液的pH为10-13，
步骤二：将所述辅料液稀释后加入透明质酸或其盐粗品，过滤后得到透明质酸或其盐溶液，
步骤三：将所述透明质酸或其盐溶液进行紫外杀菌，
步骤四：将经过紫外杀菌后的透明质酸或其盐溶液分装或干燥，得到透明质酸或其盐成品。
步骤一中，纯化用盐、过滤助剂和吸附剂为现有透明质酸或其盐生产过程中常见试剂。纯化用盐例如可以选自氯化钠、氯化钙、以及氯化镁中的一种或两种以上。过滤助剂选自珍珠岩、硅藻土中的一种或两种以上。纯化用的吸附剂如活性炭等。纯化用盐、过滤助剂、纯化用吸附剂的用量不作限制，根据通常方法使用的条件设定即可。
在一个具体的实施方式中，所述所述辅料液中纯化用盐的质量浓度为0.1％-10％，过滤助剂的质量浓度为1％-20％，吸附剂的质量浓度为1％-10％。
使用碱调节所述辅料液的pH是为了杀死辅料中的微生物，如果过高，可能会导致珍珠岩中硅元素溶出过多，或影响活性炭的吸附力，过低则无法起到杀死绝大多数微生物的作用。在本申请中将所述辅料液的pH为10-13，例如可以为10、10.5、11、11.5、12、12.5、13。所采用的碱可以为氢氧化钠、氢氧化钙、氢氧化镁、氢氧化锌、氢氧化钠钾等。
使用碱调节所述辅料液的pH为10-13后，需要维持一定时间。可以维持大于等于0.5h，例如0.5h、1h、1.5h、2h、2.5h、3h、3.5h、4h、5h、6h、7h、8h、9h、10h等，优选为0.5h-4h。
步骤二中，透明质酸或其盐的粗品可以为透明质酸或其盐发酵沉淀溶液、透明质酸或其盐复溶液、透明质酸或其盐交联后溶液、或透明质酸或其盐衍生物溶液。即本申请的生产方法可以适用于各种透明质酸或其盐的规模生产的纯化过程中。
在一个具体的实施方式中，所述透明质酸或其盐溶液中透明质酸或其盐的质量浓度为0.01％-40％，例如可以为0.01％、0.1％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％。
进一步地，当透明质酸或其盐的分子量不同时，透明质酸或其盐可以选择采用不同的质量浓度。
例如，当所述透明质酸或其盐的分子量大于等于1000kDa时，所述透明质酸或其盐溶液中透明质酸或其盐的质量浓度为0.01％～1％；当所述透明质酸及或其盐的分子量大于100kDa且小于1000kDa时，所述透明质酸或其盐溶液中透明质酸或其盐的质量浓度为0.01％-10％；当所述透明质酸及或其盐的分子量小于等于100kDa时，所述透明质酸或其盐溶液中透明质酸或其盐的质量浓度为0.01％-40％。
步骤三中，紫外杀菌可以通过过流式紫外杀菌器进行，例如可以是低压过流式紫外杀菌器，也可以是中压过流式紫外杀菌器。
在一个具体的实施方式中，所述紫外杀菌的紫外照射剂量为300-6000mWs/cm2，例如可以为300mWs/cm2、500mWs/cm2、800mWs/cm2、1000mWs/cm2、1500mWs/cm2、2000mWs/cm2、2500mWs/cm2、3000mWs/cm2、3500mWs/cm2、4000mWs/cm2、4500mWs/cm2、5000mWs/cm2、5500mWs/cm2、6000mWs/cm2。其中，mWs/cm2是指单位面积单位时间内受到紫外辐照的剂量，这个量与辐照光源的功率成正比。
进一步地，当所述透明质酸或其盐溶液中透明质酸或其盐的质量浓度不同时，可以选择不同的紫外照射剂量。
例如，当所述透明质酸或其盐溶液中透明质酸或其盐的质量浓度为0.01％-1％时，紫外照射剂量为300-1000mWs/cm2；当所述透明质酸或其盐溶液中透明质酸或其盐的质量浓度为大于1％且小于等于10％时，紫外照射剂量为1000～3000mWs/cm2；当所述透明质酸或其盐溶液中透明质酸或其盐的质量浓度大于10％且小于等于40％时，紫外照射剂量为3000-6000mWs/cm2。
在步骤四中，将经过紫外杀菌后的透明质酸或其盐溶液干燥，得到透明质酸或其盐成品的步骤可以包括：
将经过紫外杀菌后的透明质酸或其盐溶液使用有机溶剂沉淀，
对所得沉淀进行干燥，得到透明质酸或其盐成品。
其中的有机溶剂可以选自乙醇、丙酮、以及正丁醇中的一种或两种以上。
干燥方法可以为真空干燥、喷雾干燥、或者为冷冻干燥。
本申请通过紫外杀菌的方式制备透明质酸或其盐，采用较小的剂量的紫外照射，如300mWs/cm2即可达到99％杀菌效果。本申请的生产方法过程，条件温和，且不引入任何防腐剂，对环境及设备更加友好，对于多糖类物质无明显损伤，不会大幅度降低其分子量，且终产品中不存在防腐剂残留，成品的细菌总数＜10cfu/g，霉菌和酵母菌未检出。
实施例
实施例1
以1吨透明质酸溶液计，向100L纯化水中加入5％的氯化钠，1％的珍珠岩，1％的活性炭，采用氢氧化钠调pH至10.0，维持4h后用纯化水定容至1吨。向辅料液中加入透明质酸钠发酵液沉淀粗品，配制成质量浓度为1％的透明质酸钠溶液，透明质酸钠的初始分子量约1000kDa。搅拌，待透明质酸钠完全溶解，过滤去除珍珠岩、活性炭、菌体等。过滤液经过过流式紫外杀菌器，照射剂量为300mWs/cm2转入沉淀罐中，加入1.5倍的乙醇进行沉淀，沉淀完全后静置1h，移除上清，向沉淀中加入等倍体积的乙醇脱水，静置1h，移除上清，加入真空干燥器减压干燥，得透明质酸钠成品。
对所得到的透明质酸钠成品进行微生物检测，检测方法依据食品安全国家标准GB4789中的微生物检验方法进行。
实施例2-4
实施例2-4与实施例1的区别仅在于碱性维持时间不同。具体地，实施例2中碱性维持时间为0.5h，实施例3中碱性维持时间为2h，实施例4中碱性维持时间为1h。
实施例5-8
实施例8与实施例1的区别仅在于紫外照射剂量不同，其中实施例8的照射剂量为1000mWs/cm2。实施例5-7与实施例8的区别仅在于辅料液的pH不同。具体地，实施例5中辅料液的pH为13，实施例6中辅料液的pH为11，实施例7中辅料液的pH为12。
实施例9-12
实施例9-12与实施例1的不同在于透明质酸钠的分子量、透明质酸溶液的浓度和紫外照射剂量不同。具体地，实施例9中，透明质酸钠的分子量为4000kDa，透明质酸溶液的浓度为0.01％，紫外照射剂量为300mWs/cm2。实施例10中，透明质酸钠的分子量为200kDa，透明质酸溶液的浓度为5％，紫外照射剂量为2000mWs/cm2。实施例11中，透明质酸钠的分子量为100kDa，透明质酸溶液的浓度为10％，紫外照射剂量为1000mWs/cm2。实施例12中，透明质酸钠的分子量为3000kDa，透明质酸溶液的浓度为40％，紫外照射剂量为3000mWs/cm2。
实施例13-14
实施例13-14与实施例1的区别仅在于沉淀所使用的有机溶剂不同。具体地，实施例13所使用的是丙酮，实施例14所使用的是正丁醇。
实施例15-18
实施例15-18与实施例1的区别仅在于所使用的纯化用盐和碱的种类不同。具体地，实施例15使用氯化钙和氢氧化钙，实施例16使用氯化镁和氢氧化镁，实施例17使用氯化钾和氢氧化钾，实施例18使用氯化锌和氢氧化锌。
对比例1
对比例1与实施例1的区别仅在于辅料液的pH不同。具体地，对比例1的pH为9。
对比例2
对比例2与实施例1的区别在于碱液维持时间不同，为0.1h，以及辅料液的pH不同，pH为13。
对比例3
对比例3与实施例1的区别仅在于紫外辐射剂量不同，为200mWs/cm2。
将对比例3紫外辐照后的料液0.2ml涂布平板，37℃培养48h，平板照片如图1所示，可见平板上均为无色透明产粘稠度物质的单菌落，经菌落鉴定为地衣芽孢杆菌。该菌为透明质酸成品中的主要污染菌。
对比例4
对比例4与实施例1的区别仅在于辅料液的pH不同。具体地，对比例4的pH为14。
对比例5
对比例5与实施例1相比，区别在于只采用碱液处理辅料，料液不采用紫外辐照。
对比例6
对比例6与实施例1相比，区别在于辅料不采用碱液处理，料液采用紫外辐照。
上述各实施例和对比例的具体条件如表1所示。
上述实施例制备得到的透明质酸钠成品的微生物检测结果如表2所示。
上述对比例制备得到的透明质酸钠成品的微生物检测结果如表3所示。
表1
表2
表3
实施例5和对比例4所得成品的照片如图2所示，可见，对比例4所得成品虽然微生物指标合格，但是由于碱液过浓，成品部分褐变。
Claims (7)
1.一种无防腐剂添加的透明质酸或其盐的生产方法，其特征在于，所述生产方法包括以下步骤：
配制包含纯化用盐、过滤助剂、吸附剂的辅料液，并使用碱调节所述辅料液的pH为10-13，
将所述辅料液稀释后加入透明质酸或其盐粗品，过滤后得到透明质酸或其盐溶液，
将所述透明质酸或其盐溶液进行紫外杀菌，
将经过紫外杀菌后的透明质酸或其盐溶液分装或干燥，得到透明质酸或其盐成品，
其中使用碱调节所述辅料液的pH为10-13后，放置所述辅料液0.5h以上再对所述辅料液进行稀释，
当所述透明质酸或其盐的分子量大于等于1000 kDa时，所述透明质酸或其盐溶液中透明质酸或其盐的质量浓度为0.01%-1%，
当所述透明质酸及或其盐的分子量大于100 kDa且小于1000 kDa时，所述透明质酸或其盐溶液中透明质酸或其盐的质量浓度为0.01%-10%，
当所述透明质酸及或其盐的分子量小于等于100 kDa时，所述透明质酸或其盐溶液中透明质酸或其盐的质量浓度为0.01%-40%，
当所述透明质酸或其盐溶液中透明质酸或其盐的质量浓度为0.01%-1%时，紫外照射剂量为300-1000 mWs/cm2，
当所述透明质酸或其盐溶液中透明质酸或其盐的质量浓度大于1%且小于等于10%时，紫外照射剂量为1000~3000 mWs/cm2，
当所述透明质酸或其盐溶液中透明质酸或其盐的质量浓度大于10%且小于等于40%时，紫外照射剂量为3000-6000 mWs/cm2。
2.根据权利要求1所述的生产方法，其特征在于，使用碱调节所述辅料液的pH为10-13后，放置0.5h-4h之后再对所述辅料液进行稀释。
3.根据权利要求1所述的生产方法，其特征在于，所述辅料液中纯化用盐的质量浓度为0.1%-10%，过滤助剂的质量浓度为1%-20%，吸附剂的质量浓度为1%-10%。
4.根据权利要求1所述的生产方法，其特征在于，所述透明质酸或其盐粗品选自透明质酸或其盐发酵粗品、透明质酸或其盐复溶液、以及透明质酸或其盐衍生物溶液中的一种；
所述纯化用盐选自氯化钠、氯化钙、以及氯化镁中的一种或两种以上。
5.根据权利要求1所述的生产方法，其特征在于，将经过紫外杀菌后的透明质酸或其盐溶液干燥，得到透明质酸或其盐成品的步骤包括：
将经过紫外杀菌后的透明质酸或其盐溶液使用有机溶剂沉淀，
对所得沉淀进行干燥，得到透明质酸或其盐成品。
6.根据权利要求5所述的生产方法，其特征在于，所述有机溶剂选自乙醇、丙酮、以及正丁醇中的一种或两种以上。
7.一种根据权利要求1-6中任一项所述的方法得到的透明质酸或其盐产品。
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