CN112940148A - 一种透明质酸的纯化方法 - Google Patents

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解增朋
何斌
惠吉阳
苗为超
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Abstract

本发明提供了一种透明质酸钠的纯化方法，包括以下步骤：在低于45℃的温度下，调节透明质酸钠溶液的pH至碱性并保持，搅拌处理至微生物和内毒素含量达标，获得透明质酸钠溶液本发明的纯化方法通过在低温和碱性条件下，保持HA分子量的稳定、不降解，还去除细菌内毒素，杀灭和抑制微生物增长，无有毒有害抑制剂残留。采用的透明质酸的浓度较高，能够与现有浓缩工艺配套，不需要额外浓缩，节省成本。该方法能够有效降低微生物和内毒素含量，操作简便、成本低，适于工业化生产。

Description

一种透明质酸的纯化方法
技术领域
本发明属于生物高分子制备领域，涉及一种不降低分子量的透明质酸纯化方法。
背景技术
商品透明质酸为其钠盐形式，即透明质酸钠(简称SH或HA)。它为白色纤维状或粉末状固体，有很强的吸湿性，溶于水，不溶于醇、酮、乙醚等有机溶剂。它的水溶液带负电，高浓度时有很高的粘弹性和渗透压。此外HA水溶液是一种非牛顿型流体，有着良好的粘弹性和流变形。基于HA特殊的性能，HA可以广泛的应用于医药、化妆品和保健食品当中。HA主要应用于临床治疗、诊断、化妆品基质以及营养保健品等方面。商品HA一般为其钠盐形式，其他金属盐如锌盐很少应用。
透明质酸钠具有多方面的药用价值，在制药产业中可以被用作有效成分和赋形剂。药用透明质酸钠的质量标准要求较高，对微生物、细菌内毒素含量有明确的要求。现有技术中，控制微生物和细菌内毒素的方法有的加入抑菌剂（如甲醛等），但是后期去除效果不佳，仍然有残留，对使用者会造成一定的影响；有的采用树脂吸附，但是由于透明质酸钠高浓度时的粘性，需要采用较稀的溶液才能进行吸附，后续浓缩繁琐、成本高，不适用于大规模生产，而且也容易进一步引入杂质。因此，需要开发一种简便的更安全的提纯HA的方法供大规模生产。
发明内容
针对目前透明质酸钠去除微生物、内毒素不彻底、成本高的问题，本发明提供一种透明质酸的纯化方法，通过控制温度采用碱处理，降低微生物和内毒素含量，方法简便、成本低，适于工业化生产。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案。
一种透明质酸钠的纯化方法，包括以下步骤：在低于45℃的温度下，调节透明质酸钠溶液的pH至碱性并保持，搅拌处理至微生物和内毒素含量达标，获得透明质酸钠溶液。
所述pH为9.0-12.0。
所述调节pH的试剂选自10%-30% NaOH溶液。
所述透明质酸钠溶液可以通过产业上常用的分离纯化、浓缩方法获得液体透明质酸钠产品。
所述透明质酸钠溶液还可以通过常规的分离纯化、干燥方法获得透明质酸钠粉末。
所述透明质酸钠溶液的浓度为0.3-1.0%（w/w）。
所述微生物和内毒素含量达标的标准为：微生物含量不大于10cfu/mL，内毒素含量不大于0.005IU/mL。
本发明具有以下优点：
透明质酸中的糖苷键很容易因为酸、碱或加热处理而断裂，导致较高分子量的HA在酸、碱、加热等条件下，可低分子化。本发明的纯化方法通过在低温和碱性条件下，保持HA分子量的稳定、不降解，还去除细菌内毒素，杀灭和抑制微生物增长，无有毒有害抑制剂残留，而且处理时间短。采用的透明质酸的浓度较高，能够与现有浓缩工艺配套，不需要额外浓缩，节省成本。该方法能够有效降低微生物和内毒素含量，操作简便、成本低，适于工业化生产。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步说明，但本发明不受下述实施例的限制。
实施例1 不同分子量透明质酸钠的纯化
（1）分别称取高分子量透明质酸钠（平均分子量215万Da）、中分子量透明质酸钠（平均分子量155万Da）和低分子量透明质酸钠（平均分子量65万Da）分别投入三个反应釜，加水溶解，配制成浓度为0.5%的透明质酸钠溶液，水循环降温、控制料液温度35±1℃；取样检测微生物、细菌内毒素含量；
（2）搅拌条件下流加浓度20%的氢氧化钠溶液调节并保持透明质酸钠溶液为pH10.7-10.8；持续搅拌7h；每小时检测一次料液中HA分子量和微生物、细菌内毒素含量，结果如表1所示；在搅拌过程中，HA的平均分子量几乎没有变化，说明在该条件下并没有发生分解；随着反应的进行微生物在2h后的含量不再发生明显变化，达到小于10cfu/mL；而内毒素的含量在0-3h内持续降低，当反应3h后含量不再明显变化，达到小于0.005IU/mL；
（4）搅拌结束后，使用活性炭脱色除杂，经过数次过滤后，酒精沉淀、洗涤、脱水，干燥，各步骤均在密闭空间内操作，使用呼吸器保持罐体内外压力平衡，物料转移采用固定管道，以减少后续操作对产品的污染，产品收集、取样、包装在A、B级层流罩下进行，获得透明质酸钠固体产品。
表1 不同分子量的透明质酸钠随反应时间平均分子量、微生物数量、内毒素含量的变化
Figure 770458DEST_PATH_IMAGE002
。
实施例2 不同分子量透明质酸钠的纯化
（1）分别称取高分子量透明质酸钠（平均分子量223万Da）、中分子量透明质酸钠（平均分子量148万Da）和低分子量透明质酸钠（平均分子量65万Da）分别投入三个反应釜，加水溶解，配制成浓度为0.5%的透明质酸钠溶液，水循环降温、控制料液温度20±1℃；取样检测微生物、细菌内毒素含量；
（2）搅拌条件下流加浓度20%的氢氧化钠溶液调节并保持透明质酸钠溶液为pH10.7-10.8左右；继续搅拌7h；每小时检测一次料液中HA分子量和微生物、细菌内毒素含量，结果如表2所示；在搅拌过程中，HA的平均分子量几乎没有变化，说明在该条件下并没有发生分解；随着反应的进行微生物在2h后的含量不再发生明显变化，达到小于10cfu/g；而内毒素的含量在0-3h内持续降低，当反应3h后含量不再明显变化，达到小于0.005IU/mL；
（4）搅拌结束后，经过数次过滤后，使用酒精沉淀、洗涤、脱水，干燥，得到最终产品。
表2 不同分子量的透明质酸钠随反应时间平均分子量、微生物数量、内毒素含量的变化
Figure 94123DEST_PATH_IMAGE004
。
对比例1 高温下高分子量透明质酸钠的纯化
（1）称取高分子量透明质酸钠（平均分子量255万Da）投入反应釜，加水溶解，配制成浓度为0.5%的透明质酸钠溶液，水循环降温、控制料液温度45℃、50℃、60℃；取检测微生物、细菌内毒素含量；
（2）搅拌条件下流加浓度20%的氢氧化钠溶液调节并保持透明质酸钠溶液为pH10.7左右；继续搅拌7h；每小时检测一次料液中HA分子量，结果如表3所示；当温度超过45℃后，分子量下降明显；且随着温度升高，分子量下降幅度更大。这说明，高温下透明质酸钠在碱性环境中降解明显，采用碱性条件去除微生物和内毒素的温度不宜超过45℃。
表3 高温下透明质酸钠随反应时间平均分子量、微生物数量、内毒素含量的变化
Figure 670598DEST_PATH_IMAGE006

Claims (5)

1.一种透明质酸钠的纯化方法，其特征在于，包括以下步骤：在低于45℃的温度下，调节透明质酸钠溶液的pH至碱性并保持，搅拌处理至微生物和内毒素含量达标，获得透明质酸钠溶液。
2.根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于，所述pH为9.0-12.0。
3. 根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于，所述调节pH的试剂为10%-30% NaOH溶液。
4.根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于，所述透明质酸钠溶液的浓度为0.3-1.0%w/w。
5.根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于，所述微生物和内毒素含量达标的标准为：微生物含量不大于10cfu/mL，内毒素含量不大于0.005IU/mL。
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