JP2015515260A - バチルス、ヒアルロン酸酵素、及びそれらの使用 - Google Patents
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Abstract
Description
本発明のバチルスを、斜面培養、種培養、発酵培養、遠心分離、硫酸アンモニウム分画沈殿、限外濾過にかけて、ヒアルロニダーゼを得る工程
を含む、ヒアルロニダーゼの調製方法に関する。
(1)本発明のバチルスを斜面培養にかけて、斜面培養株を得る工程;
(2)斜面培養株を滅菌した種培養培地に植え付け、25℃〜40℃、100〜200rpmで10〜24時間の条件下で培養して、種溶液を得る工程;
(3)種溶液を滅菌した発酵培養培地に植え付け、25℃〜40℃、100〜300rpmで12〜24時間の条件下で培養して、ヒアルロニダーゼ発酵ブロスを得る工程;
(4)遠心分離により発酵ブロスを分離して、上清を得る工程;
(5)上清を硫酸アンモニウム分画沈殿、濾過(例えば、0.65μmの精密濾過膜を使用した濾過)にかけて、粗製ヒアルロニダーゼを得る工程;
(6)工程(5)で沈殿した粗製ヒアルロニダーゼをリン酸緩衝溶液中に溶解させ、限外濾過により低分子量の不純物を除去して、精製ヒアルロニダーゼを得る工程
を含む。
(6−1):工程(5)の粗製ヒアルロニダーゼをpH4.5〜8.0の緩衝溶液中に溶解させて、粗製酵素溶液を得て;粗製酵素溶液を、3.0×103〜1.4×104Daの分子量カットオフを有する透析バッグにローディングし、pH4.5〜8.0の緩衝溶液中に置き、4℃で終夜透析する工程;
(6−2):透析した粗製酵素溶液を、クロマトグラフィーカラムの充填材としてDEAEアガロースゲルFF媒体と勾配溶出のための0〜0.5MのNaCl溶液とを使用したイオン交換クロマトグラフィー分離にかけて、溶出ピークを回収する工程;
(6−3):工程(6−2)で得られたヒアルロニダーゼサンプルを真空凍結乾燥にかけて、ヒアルロニダーゼとして白色の粉末を得る工程
によって実行することができる。
1)ヒアルロン酸又はその塩の溶液の調製:10kDaより大きい分子量を有するヒアルロン酸又はその塩を精製水に添加して、1%w/v〜30%w/vの濃度を有する溶液を得る工程;
2)酵素分解:工程1)の溶液温度を20℃〜48℃、pH4〜9に調節し、前記溶液にバチルス由来ヒアルロニダーゼを添加し、ヒアルロン酸又はその塩を所望の分子量まで分解して、酵素分解溶液を得る工程;
3)不活性化:酵素分解溶液を50℃〜90℃で10〜60分維持して、バチルス由来ヒアルロニダーゼを不活性化する工程;
を含み、好ましくは、以下の工程:
4)濾過:不活性化された酵素分解溶液に可溶性の無機塩を添加し、完全に溶解するまで撹拌し、0.45μmの濾過膜で濾過して、濾液を得る工程、ここで酵素による加水分解産物100mLあたり、0.1〜10gの可溶性の無機塩が添加される;
5)沈殿:工程4)の濾液を、濾液の3〜20倍の体積のアルコール又はケトンと均一に混合して、オリゴマーヒアルロナートを沈殿させる工程;
6)脱水及び乾燥:工程5)のオリゴマーヒアルロナートの沈殿を分離し、有機溶媒で脱水し、真空乾燥し、オリゴマーヒアルロナートを得る工程
をさらに含む。
A.工程1)において、ヒアルロナートは、ヒアルロン酸のナトリウム塩、カリウム塩、マグネシウム塩、カルシウム塩、及び亜鉛塩からなる群より選択される;
B.工程2)において、酸又は塩基を使用して、pHを4〜9に調節し、前記酸は、塩酸、氷酢酸、硫酸、及びリン酸からなる群より選択され、前記塩基は、水酸化ナトリウム又は水酸化カリウムである;
C.工程3)において、酵素分解溶液を55℃〜65℃で20〜30分維持することにより、バチルス由来ヒアルロニダーゼを不活性化する;
D.工程4)において、前記可溶性の無機塩は、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、亜鉛塩、及びマグネシウム塩からなる群より選択され;好ましくは、ナトリウム、カリウム、カルシウム、亜鉛若しくはマグネシウムの塩化物、硫酸塩又は硝酸塩である;
E.工程5)において、前記アルコール又はケトンは、エタノール、アセトン、メタノール、プロパノール、又はイソプロパノールである;
F.工程6)において、脱水に使用される有機溶媒は、ケトン又はアルコールである。
a.標準的な対照溶液:標準的な対照(ヒアルロン酸二糖ΔDiHAナトリウム塩、H9649、Sigma)の量を量り、リン酸緩衝溶液(pH6.0、5mmol/L)で溶解させて、1mg/mL溶液を配合することにより、標準的な対照溶液を得る。
Ax:試験されるサンプルのヒアルロン酸二糖のピーク面積;
AR:標準的な対照のヒアルロン酸二糖のピーク面積;
Wx:試験されるサンプルの量、mg;
CR:標準的な対照溶液の濃度、mg/mL;
h(%)は、試験されるサンプルの乾燥減量である。
1)ヒアルロン酸又はその塩の溶液の調製:1000kDaよりも大きい分子量を有するヒアルロン酸又はその塩を精製水に添加して、0.1%w/v〜2%w/vの濃度を有する溶液を得る工程;
2)酵素分解:工程1)の溶液温度を20℃〜48℃に、pHを4〜9に調節し、次いで前記溶液にバチルス由来ヒアルロニダーゼを添加して、ヒアルロン酸又はその塩を所望の分子量まで分解して、酵素分解溶液を得る工程;
3)不活性化:酵素分解溶液を50℃〜90℃で10〜60分維持して、バチルス由来ヒアルロニダーゼを不活性化する工程;
を含み、好ましくは、以下の工程:
4)濾過:不活性化された酵素分解溶液に可溶性の無機塩を添加し、完全に溶解するまで撹拌し、0.45μmの濾過膜で濾過して、濾液を得る工程、ここで酵素による加水分解産物100mLあたり、0.1〜10gの可溶性の無機塩が添加される;
5)沈殿:工程4)の濾液を、濾液の1〜10倍の体積のアルコール又はケトンと均一に混合して、低分子量ヒアルロナートを沈殿させる工程;
6)脱水及び乾燥:工程5)の低分子量ヒアルロナートの沈殿を分離し、有機溶媒で脱水し、真空乾燥し、低分子量ヒアルロナートを得る工程
をさらに含む。
A.工程1)において、ヒアルロナートは、ヒアルロン酸のナトリウム塩、カリウム塩、マグネシウム塩、カルシウム塩、及び亜鉛塩からなる群より選択される;
B.工程2)において、酸又は塩基を使用して、pHを4〜9に調節し、前記酸は、塩酸、氷酢酸、硫酸、及びリン酸からなる群より選択され、前記塩基は、水酸化ナトリウム又は水酸化カリウムである;
C.工程3)において、酵素分解溶液を55℃〜65℃で20〜30分維持することにより、バチルス由来ヒアルロニダーゼを不活性化する;
D.工程4)において、可溶性の無機塩は、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、亜鉛塩、及びマグネシウム塩からなる群より選択され;好ましくは、ナトリウム、カリウム、カルシウム、亜鉛又はマグネシウムの塩化物、硫酸塩又は硝酸塩である;
E.工程5)において、前記アルコール又はケトンは、エタノール、アセトン、メタノール、プロパノール、又はイソプロパノールである;
F.工程6)において、脱水に使用される有機溶媒は、ケトン又はアルコールである。
また本発明は、本発明のヌクレオチド配列、プロモーター、加えて転写及び翻訳終結シグナルを含む組換え発現ベクターにも関する。上記の様々な核酸及び調節配列は一緒に連結されて、組換え発現ベクターを調製することができ、ベクターは、1つ又は複数の便利な制限部位を含んでいてもよく、これらの部位にヒアルロニダーゼをコードするヌクレオチド配列を挿入又は置換させることができる。又は本発明のヌクレオチド配列は、好適な発現ベクターに本発明のヌクレオチド配列を含有するヌクレオチド配列又はヌクレオチドコンストラクトを挿入することにより発現させてもよい。発現ベクターを調製する際、コードされた配列は、好適な発現調節配列に作動可能に連結されるようにベクター中に配置することができる。
本発明はさらに、ヒアルロニダーゼ生産のための本発明のヌクレオチド配列(ポリヌクレオチド)の組換えのための組換え宿主細胞に関する。本発明のヌクレオチド配列を含有するベクターは、ベクターが染色体に統合された形態で、又は自己増殖性染色体外ベクターの形態で維持されるように宿主細胞に導入することができる。用語「宿主細胞」は、複製中の突然変異による、親細胞とは異なる全ての派生物を包含する。宿主細胞の選択は、主として、ヒアルロニダーゼをコードする遺伝子及びそれらの源に依存する。
本発明はさらに、本発明のヒアルロニダーゼの組換え生産方法に関し、本方法は、(a)ヒアルロニダーゼ生成に好適な条件下でヌクレオチドコンストラクトを含有する宿主細胞を培養すること、前記ヌクレオチドコンストラクトは、本ヒアルロニダーゼをコードするヌクレオチド配列を含む;及び(b)ペプチドを回収することを含む。
本発明において、バチルスを使用して、オリゴマーヒアルロン酸若しくはその塩又は低分子量ヒアルロン酸又はその塩を生産する方法は、操作が簡単であり、中程度の条件を使用し、生成物の構造へのダメージがなく、環境汚染がなく、且つ発酵源からのヒアルロニダーゼが低コストであり、さらにラージスケールでの工業的生産に好適である。本発明のオリゴマーヒアルロナート又は低分子量ヒアルロナートは、例えば一体型の構造、高い純度、細胞毒性がないこと、強い抗酸化能、褐変がないことなどの利点を有し、化粧品、食品、及び医薬品の分野で使用することができる。
本発明のバチルス(バチルス属菌)A50を、2012年2月8日に中国微生物菌株保蔵管理委員会普通微生物中心(CGMCC)に寄託番号CGMCC番号5744で寄託し、その寄託機関の住所は、Institute of Microbiology of Chinese Academy of Sciences、3#、Buld.1、West Beichen Road、Chaoyang District、Beijing、100101である。
斜面培養培地(100mL):0.2〜2.0gのペプトン、0.2〜2.0gの酵母粉末、0.05〜0.15gのK2HPO4・3H2O、0.05〜0.15gのMgSO4・7H2O、0.5〜1.5gのグルコース、2.0gの寒天粉末;pHは、6.0〜8.0に調節され、水、斜面培養の温度は、25℃〜40℃であった。
1.バチルス(バチルス属菌)A50の獲得
強化培養培地を含有するペトリ皿を覆う皿をあけて、皿を空気中に置き、空気から定着した細菌を回収し、1時間後に覆いの皿を閉じ、好気培養のために皿を25℃〜40℃のインキュベーターに置き、24時間培養した後、分離により得られたシングルコロニーをスクリーニング培養培地に植え付け、25℃〜40℃、150rpmで12〜16時間好気培養を行い、そのヒアルロニダーゼ活性を中国薬局方の方法により測定し、最大の酵素活性を有する株を本発明の株として選んだところ、その株の酵素は、最大105IU/mLの活性を示すことができた。
強化培養培地(100mL):0.2〜2.0gのペプトン、0.2〜2.0gの酵母粉末、0.05〜0.15gのK2HPO4・3H2O、0.05〜0.15gのMgSO4・7H2O、0.01〜1gのヒアルロン酸ナトリウム、2.0gの寒天粉末。
バチルスは、単一の形態又は連鎖した形態で棒状の形状を有していた。細菌のコロニーは乳白色であり、しわがあった。
細菌性の16S rDNA万能プライマーをWeisburgの方法に従って合成した:
プライマー1:5’−AGAGTTTGATCCTGGCTCAG−3’;(配列番号4);
プライマー2:5’−GGTTACCTTGTTACGACTT−3’(配列番号5)。
10×PCR緩衝溶液 5.0μl
dNTP(10mM) 1.0μl
プライマー1(10μM) 1.0μl
プライマー2(10μM) 1.0μl
TaqDNAポリメラーゼ(5U/μL) 0.5μl
DNAテンプレート(50ng/μL) 0.5μl
脱イオン水を添加して総体積を50μlにした。
gcggctggct ccttacggtt accccaccga cttcgggtgt tacaaactct cgtggtgtga cgggcggtgt gtacaaggcc cgggaacgta ttcaccgcgg catgctgatc cgcgattact agcgattccg gcttcatgca ggcgagttgc agcctgcaat ccgaactgag aatggtttta tgggattggc taaacctcgc ggtcttgcag ccctttgtac catccattgt agcacgtgtg tagcccaggt cataaggggc atgatgattt gacgtcatcc ccaccttcct ccggtttgtc accggcagtc accttagagt gcccaactga atgctggcaa ctaagatcaa gggttgcgct cgttgcggga cttaacccaa catctcacga cacgagctga cgacaaccat gcaccacctg tcactctgtc ccccgaaggg gaacgtccta tctctaggag tgtcagagga tgtcaagacc tggtaaggtt cttcgcgttg cttcgaatta aaccacatgc tccaccgctt gtgcgggccc ccgtcaattc ctttgagttt cagccttgcg gccgtactcc ccaggcggag tgcttaatgc gttagctgca gcactaaagg gcggaaaccc tctaacactt agcactcatc gtttacggcg tggactacca gggtatctaa tcctgtttgc tccccacgct ttcgcgcctc agcgtcagtt acagaccaga aagccgcctt cgccactggt gttcctccac atctctacgc atttcaccgc tacacgtgga attccgcttt cctcttctgt actcaagtcc cccagtttcc aatgaccctc cacggttgag ccgtgggctt tcacatcaga cttaaaggac cgcctgcgcg cgctttacgc ccaataattc cggacaacgc ttgccaccta cgtattaccg cggctgctgg cacgtagtta gccgtggctt tctggttagg taccgtcaag gtaccggcag ttactccggt acttgttctt ccctaacaac agagctttac gacccgaagg ccttcatcgc tcacgcggcg ttgctccgtc agactttcgt ccattgcgga agattcccta ctgctgcctc ccgtaggagt ctgggccgtg tctcagtccc agtgtggccg atcaccctct caggtcggct acgcatcgtc gccttggtga gccgttacct caccaactag ctaatgcgcc gcgggcccat ctgtaagtgt cagcgtaaac cgactttcag cttttcctca tgagaggaaa aggattatcc ggtattagct ccggtttccc gaagttatcc cagtcttaca ggcaggttgc ccacgtgtta ctcacccgtc cgccgctaac caagaggtgc aagcacctca agattcgctc gacttgca(配列番号1)。
バチルス(バチルス属)A50のゲノムDNAを細菌性ゲノムDNA抽出キットで抽出し、ゲノムDNA抽出の結果を1%アガロースゲル電気泳動で検出した。ゲノムを配列決定して、その株の全ゲノムのショットガン配列を得た。その間、本ヒアルロニダーゼの部分的なアミノ酸配列を得るために、バチルス(バチルス属)A50発酵ブロスから単離され精製されたヒアルロニダーゼのN末端配列を決定し、トリプシン分解後に内部ペプチドセグメントの配列を決定した。アミノ酸配列と100%の類似性を有する遺伝子セグメントを見出し、ヒアルロニダーゼをコードする遺伝子のだいたいの位置を発見するために、全ゲノムのショットガン配列及び部分的なアミノ酸配列を、NCBIのBLASTツールを使用してブラスト処理した。その後、ヒアルロニダーゼのN末端配列、SDS−PAGE電気泳動バンドのサイズ、及びGeneToolソフトウェアを用いたオープンリーディングフレーム(ORF)の分析に基づいて、標的遺伝子の特定の位置及び統合されたヌクレオチド配列を決定し、ヌクレオチド配列をBioEditソフトウェアを使用してアミノ酸配列に翻訳した。
NESTLLLNTSFEETEAPKSGWDQLGAPKWGVWRPTGSPIVTITKEASRTGEYGLKIAAAQSARAAVSQDVPVQGGQTYQLGTWLKTDNIVSGQGARLRVVLYEGTQQLGLLYSSRLTGTHDWSQIKMEVKTPANADSIRVQLFFETGTGTALFDDVSLQLIQPATSIAIEESEITIKEQETGLLHAQMVPADASSKVSWVSADPSIATVDNGKVTGVNPGGTTIMAFTDNGLAATSTVKVIKNDGIERPEVTQLDLQPKELELGSGQVRLLQAIIAPATADAEKLVWSSSNEAVASIQKGLIEAKASGTAVITVETEDGSLKSESQITVTDAVVDEYDQLRKKWKSLMTGLDSYDPTNVRMNEMIQNQTKSAETLWKTMFKNNDRSFLWINFASTDNSADIRDSYRNLTTMAKAFANEHSSLYRNPQLLKDITEALEWLYQNRYNESIAQYSNWWHWEIGVPNELNSLMVLLYDYLDQDSIHRYLKVVDHFQPDPTKSGATTPEKYREALGANRIDVSKVVGVRGVIVKDATKIAAARDALSQTFENVTEGDGFYEDGSFVQHENIAYNGSYGIVLIEGLTDMLELLSNSTWQVTDPKVTNVYDWIETAYEPFMYKGALMDMVRGRAISRNFLQDHQAGHTIIKSVIRMAQFAPEPYAEKYNSMAKYWLQEDTYLDYFKNAGNFRDITLAKQLLEKQEVTPRGDLDFHKTFASMDRVVHRKSGYAFGISMYSNRIQNYEDMNDENRKGWYTGEGMTYLYNGDLAQYSDDFWPTVDPYRMPGTTVDTMRRADGSGEHRSSESWTGGSTLKNFGSAGMSYDAWNSSLIAKKSWFMFDNEIVALGAGITSSEDRNVESIVENRKIRNDGSNQLVINGETLNLSNGGQNQTMAAKWAFLEGNVPGADIGYYFPEGKMLTIKKEERTGAWKDINYGGPAEAIKRSYTTMWFDHGVRPEQDTYSYVLLPGLNKEQTHQYSQNPDITILRNDSAVQAVQDVKENIIGANFWKDEKQSAGPLTVYQKASVTMQEKDGVLEIAVCDPTMENKGSIEIEIDGKAFKVLEADESITVENTKPSIKLKVNVNEAKGKTFTAKLKMIPSQKGNSPNSIR(配列番号2)
AATGAATCTACTTTACTATTGAATACTAGTTTTGAAGAGACGGAGGCGCCAAAATCAGGCTGGGATCAATTAGGTGCACCAAAATGGGGTGTCTGGAGACCTACCGGAAGCCCCATTGTAACCATTACAAAGGAAGCAAGCCGTACGGGTGAGTATGGTTTAAAAATTGCCGCGGCGCAATCTGCTAGAGCTGCCGTGTCACAGGATGTACCTGTTCAGGGCGGGCAGACCTATCAGTTAGGCACCTGGCTGAAGACAGATAATATCGTCAGCGGTCAAGGGGCGCGGCTGAGGGTTGTTTTATATGAAGGAACCCAGCAGCTGGGCTTACTTTACTCTTCAAGATTAACTGGGACCCACGATTGGTCGCAAATAAAAATGGAGGTAAAGACTCCTGCCAATGCCGATAGCATCCGTGTCCAGCTTTTCTTTGAAACAGGAACGGGTACAGCCCTATTTGATGATGTTTCACTGCAGCTCATCCAGCCAGCTACGTCGATTGCTATCGAAGAAAGTGAAATCACCATCAAAGAGCAGGAAACAGGTTTATTGCATGCACAGATGGTTCCTGCTGATGCCAGCTCCAAAGTATCTTGGGTGTCGGCGGATCCATCGATTGCCACCGTTGATAACGGTAAGGTTACGGGTGTAAATCCCGGGGGGACAACGATTATGGCTTTTACCGATAACGGGCTTGCTGCCACTAGTACCGTAAAAGTGATCAAAAATGATGGTATTGAACGGCCGGAGGTAACACAGTTGGATCTACAACCAAAGGAACTCGAGCTTGGATCAGGTCAAGTGCGATTGCTTCAGGCAATTATCGCACCAGCCACTGCCGATGCAGAAAAGTTGGTATGGAGCTCTTCCAATGAAGCAGTCGCTTCTATTCAAAAAGGACTTATTGAAGCGAAAGCCTCAGGAACTGCTGTGATTACCGTAGAAACGGAAGATGGCAGCTTAAAGAGTGAAAGCCAGATTACCGTTACCGATGCAGTCGTAGATGAATATGATCAACTTCGGAAAAAGTGGAAAAGCCTGATGACTGGTCTTGATTCGTACGACCCGACGAATGTGCGGATGAACGAAATGATTCAGAACCAGACAAAATCAGCGGAAACCCTTTGGAAAACAATGTTTAAAAATAACGATCGTTCGTTCTTATGGATTAACTTTGCAAGCACTGACAATTCGGCTGATATTCGCGACAGCTACCGGAATCTAACGACCATGGCTAAAGCGTTTGCCAATGAACACTCCAGCCTTTATCGAAATCCGCAATTGCTAAAGGATATCACGGAGGCGCTAGAGTGGCTGTACCAAAATCGCTATAACGAAAGTATTGCTCAATATAGCAATTGGTGGCATTGGGAAATCGGTGTCCCGAATGAATTAAACAGTTTAATGGTTCTTCTATATGATTATTTGGATCAAGATAGTATTCATCGCTACTTGAAAGTAGTCGACCACTTTCAACCAGATCCAACGAAATCCGGAGCCACCACTCCCGAGAAATACCGGGAAGCTCTTGGCGCCAATCGGATTGATGTCAGCAAGGTAGTCGGTGTGCGAGGGGTAATTGTGAAGGACGCCACGAAAATTGCGGCTGCACGAGATGCCCTAAGCCAAACTTTTGAAAACGTAACTGAAGGAGACGGTTTTTATGAAGATGGCTCCTTCGTTCAGCATGAGAATATCGCCTATAACGGGTCATACGGCATTGTCTTAATTGAAGGCTTGACTGACATGCTCGAACTCTTAAGTAATTCTACTTGGCAAGTGACTGACCCTAAGGTTACCAATGTTTATGACTGGATTGAAACTGCCTATGAACCATTTATGTATAAAGGTGCTTTGATGGATATGGTGAGAGGAAGAGCGATTTCACGTAATTTCCTTCAGGATCATCAGGCTGGACACACCATTATCAAAAGTGTGATTCGAATGGCACAATTTGCTCCAGAGCCATATGCAGAGAAGTATAATTCCATGGCAAAATACTGGCTTCAAGAAGATACTTACCTGGATTATTTTAAAAACGCGGGTAACTTCCGCGATATCACTCTTGCAAAGCAGCTTTTGGAAAAACAAGAGGTCACCCCTCGCGGAGATCTTGATTTTCATAAGACTTTCGCCTCCATGGACCGGGTTGTCCACAGAAAATCGGGCTATGCGTTTGGTATCAGTATGTATTCAAACAGGATTCAAAATTATGAAGACATGAATGATGAAAACCGCAAAGGCTGGTATACCGGAGAAGGGATGACCTACTTATATAATGGTGACCTCGCTCAATATAGTGATGATTTCTGGCCGACAGTGGACCCGTACCGGATGCCAGGGACAACGGTTGATACGATGAGACGAGCGGATGGAAGTGGTGAGCACAGGTCGTCAGAGTCATGGACTGGCGGTTCAACCCTAAAGAATTTTGGTTCTGCAGGAATGTCTTATGATGCTTGGAATAGTTCATTGATTGCCAAAAAGTCATGGTTTATGTTCGATAACGAAATCGTTGCCCTTGGTGCAGGGATTACTAGCAGTGAAGACCGGAATGTTGAGAGTATTGTCGAAAACCGAAAGATTCGAAATGACGGTTCCAATCAATTGGTCATCAATGGTGAAACGCTGAATTTAAGCAATGGTGGTCAAAACCAAACGATGGCCGCTAAATGGGCTTTTCTTGAAGGGAATGTCCCAGGAGCAGATATTGGTTACTATTTCCCAGAAGGTAAAATGCTGACGATTAAAAAAGAAGAACGTACCGGTGCATGGAAAGATATTAATTATGGCGGTCCAGCTGAAGCGATCAAGCGATCCTACACAACGATGTGGTTTGACCATGGTGTCCGTCCTGAGCAGGATACGTACTCCTATGTTCTATTGCCAGGTTTAAATAAGGAACAAACACACCAATATTCTCAAAATCCTGATATTACGATTTTACGAAATGATTCTGCTGTCCAAGCGGTACAAGACGTAAAGGAGAATATCATAGGGGCTAATTTCTGGAAGGATGAAAAGCAAAGTGCTGGTCCGTTAACTGTTTATCAAAAAGCCTCCGTGACCATGCAGGAGAAGGATGGAGTCCTTGAGATTGCTGTATGTGATCCGACGATGGAAAACAAGGGTTCTATCGAAATCGAAATTGATGGCAAGGCGTTCAAGGTTTTAGAAGCCGATGAAAGTATCACGGTAGAAAATACGAAGCCGTCAATCAAGTTGAAGGTCAATGTGAATGAGGCAAAAGGGAAAACGTTCACAGCGAAATTGAAAATGATTCCGAGCCAAAAGGGCAATAGCCCGAACTCAATCAGATAATAA(配列番号3)
斜面培養培地の組成(100mL):0.2gのペプトン、2.0gの酵母粉末、0.05gのK2HPO4・3H2O、0.05gのMgSO4・7H2O、0.5gのグルコース、2.0gの寒天粉末;塩酸を使用してpHを6.0に調節した。
斜面培養培地の組成(100mL):1.0gのペプトン、1.0gの酵母粉末、0.1gのK2HPO4・3H2O、0.1gのMgSO4・7H2O、1.0gのグルコース、2.0gの寒天粉末;リン酸を使用してpHを7.0に調節した。
斜面培養培地の組成(100mL):1.5gのペプトン、1.5gの酵母粉末、0.15gのK2HPO4・3H2O、0.15gのMgSO4・7H2O、1.5gのグルコース、2.0gの寒天粉末;硫酸を使用してpHを8.0に調節した。
斜面培養培地の組成(100mL):2.0gのペプトン、0.5gの酵母粉末、0.05gのK2HPO4・3H2O、0.05gのMgSO4・7H2O、1.0gのグルコース、2.0gの寒天粉末;硫酸を使用してpHを6.5に調節した。
斜面培養培地の組成(100mL):0.5gのペプトン、1.5gの酵母粉末、0.15gのK2HPO4・3H2O、0.1gのMgSO4・7H2O、0.5gのグルコース、2.0gの寒天粉末;リン酸を使用してpHを7.5に調節した。
斜面培養培地の組成(100mL):1.0gのペプトン、1.0gの酵母粉末、0.1gのK2HPO4・3H2O、0.15gのMgSO4・7H2O、1.5gのグルコース、2.0gの寒天粉末;塩酸を使用してpHを7.0に調節した。
斜面培養培地の組成(100mL):2.0gのペプトン、1.5gの酵母粉末、0.05gのK2HPO4・3H2O、0.15gのMgSO4・7H2O、0.5gのグルコース、2.0gの寒天粉末;リン酸を使用してpHを7.0に調節した。
バチルス属菌A50の発酵ブロス(例えば、例3〜9のいずれか1つの発酵ブロス)を4℃で遠心分離し、細菌を除去し、上清を回収した。上清に、硫酸アンモニウムの固体粉末を濃度が最大20%w/vになるまでゆっくり添加し、沈殿を濾過で取り除いて、濾液に硫酸アンモニウムの固体粉末を濃度が最大40%w/vになるまで連続的に添加し、沈殿を濾過により回収した。沈殿を4.5のpHを有するNa2HPO4−クエン酸緩衝溶液に溶解させ、粗製酵素溶液を得た。粗製酵素溶液を3.0×103Daの分子量カットオフを有する透析バッグに入れ、pH4.5のNa2HPO4−クエン酸緩衝溶液中に置き、4℃で終夜透析した。透析バッグ中の溶液をイオン交換クロマトグラフィーで分離し、ここでクロマトグラフィーのカラムの充填材はDEAEアガロースゲルFF媒体であり、0〜0.5MのNaCl溶液を用いて勾配溶出を実行し、溶出ピークを回収した。最終的に回収された溶出液をSDS−PAGE電気泳動で処理し、分離及び精製の効果を検出した。図1に、電気泳動の結果をレーン1として示した:ヒアルロニダーゼ純度は、97.6%であった。その間に、最終的に回収された目的のプロテアーゼの溶出液を真空凍結乾燥にかけ、ヒアルロニダーゼとして白色の粉末を得た。得られたヒアルロニダーゼは、1.3×107IU/mgの特異的な活性を有する。
バチルス属菌A50の発酵ブロス(例えば、例3〜9のいずれか1つの発酵ブロス)を4℃で遠心分離し、細菌を除去し、上清を回収した。上清に、硫酸アンモニウムの固体粉末をその濃度が最大25%w/vになるようにゆっくり添加し、沈殿を濾過で取り除いて、濾液に硫酸アンモニウムの固体粉末を濃度が最大40%w/vになるまで連続的に添加し、沈殿を濾過により回収した。沈殿を6.5のpHを有する50mMのNa2HPO4−NaH2PO4緩衝溶液に溶解させ、粗製酵素溶液を得た。粗製酵素溶液を1.0×104Daの分子量カットオフを有する透析バッグに入れ、50mMのpH6.5のNa2HPO4−NaH2PO4緩衝溶液中に置き、4℃で終夜透析した。透析バッグ中の溶液をイオン交換クロマトグラフィーで分離し、ここでクロマトグラフィーのカラムの充填材はDEAEアガロースゲルFF媒体であり、0〜0.5MのNaCl溶液を用いて勾配溶出を実行し、溶出ピークを回収した。最終的に回収された溶出液をSDS−PAGE電気泳動で処理し、分離及び精製の効果を検出した。図1に、電気泳動の結果をレーン2として示した:ヒアルロニダーゼ純度は、98.1%であった。その間に、最終的に回収された目的のプロテアーゼの溶出液を真空凍結乾燥にかけ、ヒアルロニダーゼとして白色の粉末を得た。得られたヒアルロニダーゼは、1.4×107IU/mgの特異的な活性を有する。
バチルス属菌A50の発酵ブロス(例えば、例3〜9のいずれか1つの発酵ブロス)を4℃で遠心分離し、細菌を除去し、上清を回収した。上清に、硫酸アンモニウムの固体粉末を濃度が最大20%になるようにゆっくり添加し、沈殿を濾過で取り除いて、濾液に硫酸アンモニウムの固体粉末を濃度が最大40%w/vになるまで連続的に添加し、沈殿を濾過により回収した。沈殿を50mMのpH8.0のNa2HPO4−NaH2PO4緩衝溶液に溶解させ、粗製酵素溶液を得た。粗製酵素溶液を1.4×104Daの分子量カットオフを有する透析バッグに入れ、50mMのpH8.0のNa2HPO4−NaH2PO4緩衝溶液中に置き、4℃で終夜透析した。透析バッグ中の溶液をイオン交換クロマトグラフィーで分離し、ここでクロマトグラフィーのカラムの充填材はDEAEアガロースゲルFF媒体であり、0〜0.5MのNaCl溶液を用いて勾配溶出を実行し、溶出ピークを回収した。最終的に回収された溶出液をSDS−PAGE電気泳動で処理し、分離及び精製の効果を検出した。図1に、電気泳動の結果をレーン3として示した:ヒアルロニダーゼ純度は、97.5%であった。その間に、最終的に回収された目的のプロテアーゼの溶出液を真空凍結乾燥にかけ、ヒアルロニダーゼとして白色の粉末を得た。得られたヒアルロニダーゼは、1.5×107IU/mgの特異的な活性を有する。
1m3のステンレス鋼の溶解タンクに、1m3の精製水を添加し、300kgの2×104Daの分子量を有するヒアルロン酸ナトリウムを撹拌しながら溶解タンクに添加し、完全に溶解した後、pHを氷酢酸で4.0に調節し、温度を20℃に高め、1.35×1010IUのバチルス由来ヒアルロニダーゼ(例3で調製した)を添加し、分子量が104Da未満になるまで酵素分解を続け(この期間中に、連続的にサンプリングしGPC−MALLS法により検出した)、温度を50℃に高め、60分維持し、1kgのNaClを添加し、酵素分解溶液を0.45μmの混成のセルロース濾過膜で濾過し、次いで沈殿のために20m3のエタノールを使用して、ヒアルロン酸ナトリウムの沈殿を得て、この沈殿をエタノールで脱水し、次いで真空乾燥して、オリゴマーヒアルロン酸ナトリウムを得た。このオリゴマーヒアルロン酸ナトリウムは、白色の顆粒であり、HPLC法により測定されたその含量は、96.8%であり;カルバゾール法により測定されたその含量は、97.5%であり;このオリゴマーヒアルロン酸ナトリウムは、pH6.8で8.6kDaの分子量を有していた。図2(C)にその赤外線スペクトルを示すが、これは、欧州薬局方の標準スペクトル図2(A)と一致した(欧州薬局方の標準スペクトルのサンプルは分解していなかった)。
1m3のステンレス鋼の溶解タンクに、1m3の精製水を添加し、10kgの3×106Daの分子量を有するヒアルロン酸カリウムを撹拌しながら溶解タンクに添加し、完全に溶解した後、pHを水酸化ナトリウムで9.0に調節し、温度を48℃に高め、4×108IUのバチルス由来ヒアルロニダーゼ(例4で調製した)を添加し、分子量が104Da未満になるまで酵素分解を続け、温度を90℃に高め、10分維持し、100kgのKClを添加し、酵素分解溶液を0.45μmのポリスルホン濾過膜で濾過し、次いで沈殿のために5m3のケトンを使用して、ヒアルロン酸カリウムの沈殿を得て、この沈殿をアセトンで脱水し、次いで真空乾燥して、オリゴマーヒアルロン酸カリウムを得た。このオリゴマーヒアルロン酸カリウムは、白色の粉末であり、HPLC法により測定されたその含量は、98.8%であり;カルバゾール法により測定されたその含量は、98.3%であり;このオリゴマーヒアルロン酸カリウムは、pH6.5で3.2kDaの分子量を有していた。図2(D)にその赤外線スペクトルを示すが、これは、欧州薬局方の標準スペクトルと一致した。
1m3のステンレス鋼の溶解タンクに、1m3の精製水を添加し、30kgの1.6×106Daの分子量を有するヒアルロン酸ナトリウムを撹拌しながら溶解タンクに添加し、完全に溶解した後、pHを水酸化カリウムで8.0に調節し、温度を40℃に高め、1.2×109IUのバチルス由来ヒアルロニダーゼ(例5で調製した)を添加し、分子量が104Da未満になるまで酵素分解を続け、温度を60℃に高め、60分維持し、50kgのNaClを添加し、酵素分解溶液を0.45μmのナイロン濾過膜で濾過し、次いで沈殿のために10m3のプロパノールを使用して、ヒアルロン酸ナトリウムの沈殿を得て、この沈殿をプロパノールで脱水し、次いで真空乾燥して、オリゴマーヒアルロン酸ナトリウムを得た。このオリゴマーヒアルロン酸ナトリウムは、白色の粉末であり、HPLC法により測定されたその含量は、97.6%であり;カルバゾール法により測定されたその含量は、97.8%であり;その分子量は、6.2kDaであり、pHは、7.1であった。図2(E)にその赤外線スペクトルを示すが、これは、欧州薬局方の標準スペクトルと一致した。
1m3のステンレス鋼の溶解タンクに、1m3の精製水を添加し、60kgの8×105Daの分子量を有するヒアルロン酸カルシウムを撹拌しながら溶解タンクに添加し、完全に溶解した後、pHを氷酢酸で7.0に調節し、温度を35℃に高め、2.4×109IUのバチルス由来ヒアルロニダーゼ(例6で調製した)を添加し、分子量が104Da未満になるまで酵素分解を続け、温度を70℃に高め、30分維持し、35kgのCaCl2を添加し、酵素分解溶液を0.45μmのポリエーテルスルホン濾過膜で濾過し、次いで沈殿のために3m3のイソプロパノールを使用して、ヒアルロン酸カルシウムの沈殿を得て、この沈殿をイソプロパノールで脱水し、次いで真空乾燥して、オリゴマーヒアルロン酸カルシウムを得た。このオリゴマーヒアルロン酸カルシウムは、白色の粉末であり、HPLC法により測定されたその含量は、96.6%であり;カルバゾール法により測定されたその含量は、97.3%であり;その分子量は、5.6kDaであり、pHは、6.5であった。図2(F)にその赤外線スペクトルを示すが、これは、欧州薬局方の標準スペクトルと一致した。
1m3のステンレス鋼の溶解タンクに、1m3の精製水を添加し、200kgの2×105Daの分子量を有するヒアルロン酸ナトリウムを撹拌しながら溶解タンクに添加し、完全に溶解した後、pHを硫酸で6.0に調節し、温度を25℃に高め、8×109IUのバチルス由来ヒアルロニダーゼ(例7で調製した)を添加し、分子量が104Da未満になるまで酵素分解を続け、温度を80℃に高め、20分維持し、60kgのNaClを添加し、酵素分解溶液を0.45μmのポリエーテルスルホン濾過膜で濾過し、次いで沈殿のために6m3のメタノールを使用して、ヒアルロン酸ナトリウムの沈殿を得て、この沈殿をメタノールで脱水し、次いで真空乾燥して、オリゴマーヒアルロン酸ナトリウムを得た。このオリゴマーヒアルロン酸ナトリウムは、白色の粉末であり、HPLC法により測定されたその含量は、98.7%であり;カルバゾール法により測定されたその含量は、98.3%であり;その分子量は、7.6kDaであり、pHは、7.3であった。図2(G)にその赤外線スペクトルを示すが、これは、欧州薬局方の標準スペクトルと一致した。
1m3のステンレス鋼の溶解タンクに、1m3の精製水を添加し、100kgの105Daの分子量を有するヒアルロン酸ナトリウムを撹拌しながら溶解タンクに添加し、完全に溶解した後、pHを水酸化ナトリウムで5.0に調節し、温度を20℃に高め、4×109IUのバチルス由来ヒアルロニダーゼ(例8で調製した)を添加し、分子量が104Da未満になるまで酵素分解を続け、温度を55℃に高め、40分維持し、20kgのZnCl2を添加し、酵素分解溶液を0.45μmのニトロセルロース濾過膜で濾過し、次いで沈殿のために4.5m3のエタノールを使用して、ヒアルロン酸亜鉛の沈殿を得て、この沈殿をエタノールで脱水し、次いで真空乾燥して、オリゴマーヒアルロン酸亜鉛を得た。このオリゴマーヒアルロン酸亜鉛は、白色の粉末であり、HPLC法により測定されたその含量は、96.8%であり;カルバゾール法により測定されたその含量は、97.6%であり;その分子量は、9.1kDaであり、pHは、6.8であった。図2(H)にその赤外線スペクトルを示すが、これは、欧州薬局方の標準スペクトルと一致した。
1m3のステンレス鋼の溶解タンクに、1m3の精製水を添加し、1kgの3×106Daの分子量を有するヒアルロン酸ナトリウムを撹拌しながら溶解タンクに添加し、完全に溶解した後、温度を48℃に制御し、pHを水酸化ナトリウムで9.0に調節し、酵素分解のために107IUのバチルス由来ヒアルロニダーゼ(例9で調製した)を撹拌しながら添加した。所望の分子量になるまで酵素分解を続けた;温度を50℃に高め、60分維持した。2kgのNaClを添加し、完全に溶解した後、0.45μmのポリプロピレン濾芯で濾過を行い、次いで沈殿のために1m3のアセトンを使用して、低分子量ヒアルロン酸ナトリウムの沈殿を得て、この沈殿をアセトンで脱水し、次いで真空乾燥して、低分子量ヒアルロン酸ナトリウムを得た。この低分子量ヒアルロン酸ナトリウムは、白色の粉末であり、HPLC法により測定されたその含量は、98.3%であり;カルバゾール法により測定されたその含量は、98.5%であり;その分子量は、931kDaであった。
1m3のステンレス鋼の溶解タンクに、1m3の精製水を添加し、20kgの1×106Daの分子量を有するヒアルロン酸カリウムを撹拌しながら溶解タンクに添加し、完全に溶解した後、温度を20℃に制御し、pHを氷酢酸で4.0に調節し、酵素分解のために108IUのバチルス由来ヒアルロニダーゼ(例7で調製した)を撹拌しながら添加した。所望の分子量になるまで酵素分解を続けた;温度を90℃に高め、10分維持した。100kgのKClを添加し、完全に溶解した後、0.45μmのニトロセルロース濾芯で濾過を行い、次いで沈殿のために10m3のエタノールを使用して、低分子量ヒアルロン酸カリウムの沈殿を得て、この沈殿をエタノールで脱水し、次いで真空乾燥して、低分子量ヒアルロン酸カリウムを得た。この低分子量ヒアルロン酸カリウムは、白色の粉末であり、HPLC法により測定されたその含量は、96.8%であり;カルバゾール法により測定されたその含量は、97.5%であり;その分子量は、15kDaであった。
1m3のステンレス鋼の溶解タンクに、1m3の精製水を添加し、12kgの1.61×106Daの分子量を有するヒアルロン酸ナトリウムを撹拌しながら溶解タンクに添加し、完全に溶解した後、温度を45℃に制御し、pHを氷酢酸で5.0に調節し、酵素分解のために2×107IUのバチルス由来ヒアルロニダーゼ(例8で調製した)を撹拌しながら添加した。所望の分子量になるまで酵素分解を続けた;温度を80℃に高め、20分維持した。40kgのZnCl2を添加し、完全に溶解した後、0.45μmのポリエーテルスルホン濾芯で濾過を行い、次いで沈殿のために3m3のメタノールを使用して、低分子量ヒアルロン酸亜鉛の沈殿を得て、この沈殿をメタノールで脱水し、次いで真空乾燥して、低分子量ヒアルロン酸亜鉛を得た。この低分子量ヒアルロン酸亜鉛は、白色の粉末であり、HPLC法により測定されたその含量は、98.5%であり;カルバゾール法により測定されたその含量は、98.2%であり;その分子量は、754kDaであった。
1m3のステンレス鋼の溶解タンクに、1m3の精製水を添加し、10kgの1.77×106Daの分子量を有するヒアルロン酸カリウムを撹拌しながら溶解タンクに添加し、完全に溶解した後、温度を38℃に制御し、pHをリン酸で6.0に調節し、酵素分解のために5×107IUのバチルス由来ヒアルロニダーゼ(例9で調製した)を撹拌しながら添加した。所望の分子量になるまで酵素分解を続けた;温度を60℃に高め、30分維持した。30kgのK2SO4を添加し、完全に溶解した後、0.45μmのポリエーテルスルホン濾芯で濾過を行い、次いで沈殿のために5m3のイソプロパノールを使用して、低分子量ヒアルロン酸カリウムの沈殿を得て、この沈殿をイソプロパノールで脱水し、次いで真空乾燥して、低分子量ヒアルロン酸カリウムを得た。この低分子量ヒアルロン酸カリウムは、白色の粉末であり、HPLC法により測定されたその含量は、96.3%であり;カルバゾール法により測定されたその含量は、97.3%であり;その分子量は、421kDaであった。
1m3のステンレス鋼の溶解タンクに、1m3の精製水を添加し、8kgの2.55×106Daの分子量を有するヒアルロン酸マグネシウムを撹拌しながら溶解タンクに添加し、完全に溶解した後、温度を42℃に制御し、pHを硫酸で5.5に調節し、酵素分解のために3×107IUのバチルス由来ヒアルロニダーゼ(例6で調製した)を撹拌しながら添加した。所望の分子量になるまで酵素分解を続けた;温度を55℃に高め、50分維持した。60kgのMgCl2を添加し、完全に溶解した後、0.45μmのポリプロピレン濾芯で濾過を行い、次いで沈殿のために2.5m3のプロパノールを使用して、低分子量ヒアルロン酸マグネシウムの沈殿を得て、この沈殿をプロパノールで脱水し、次いで真空乾燥して、低分子量ヒアルロン酸マグネシウムを得た。この低分子量ヒアルロン酸マグネシウムは、白色の粉末であり、HPLC法により測定されたその含量は、97.2%であり;カルバゾール法により測定されたその含量は、98.1%であり;その分子量は、538kDaであった。
1m3のステンレス鋼の溶解タンクに、1m3の精製水を添加し、5kgの2.46×106Daの分子量を有するヒアルロン酸カルシウムを撹拌しながら溶解タンクに添加し、完全に溶解した後、温度を40℃に制御し、pHを氷酢酸で7.0に調節し、酵素分解のために5×107IUのバチルス由来ヒアルロニダーゼ(例5で調製した)を撹拌しながら添加した。所望の分子量になるまで酵素分解を続けた;温度を65℃に高め、40分維持した。50kgのCaCl2を添加し、完全に溶解した後、0.45μmのポリプロピレン濾芯で濾過を行い、次いで沈殿のために4.5m3のアセトンを使用して、低分子量ヒアルロン酸カルシウムの沈殿を得て、この沈殿をアセトンで脱水し、次いで真空乾燥して、低分子量ヒアルロン酸カルシウムを得た。この低分子量ヒアルロン酸カルシウムは、白色の粉末であり、HPLC法により測定されたその含量は、98.1%であり;カルバゾール法により測定されたその含量は、98.2%であり;その分子量は、205kDaであった。
1m3のステンレス鋼の溶解タンクに、1m3の精製水を添加し、2kgの2.78×106Daの分子量を有するヒアルロン酸ナトリウムを撹拌しながら溶解タンクに添加し、完全に溶解した後、温度を35℃に制御し、pHを氷酢酸で6.5に調節し、酵素分解のために2×107IUのバチルス由来ヒアルロニダーゼ(例4で調製した)を撹拌しながら添加した。所望の分子量になるまで酵素分解を続けた;温度を58℃に高め、50分維持した。70kgのNa2SO4を添加し、完全に溶解した後、0.45μmのニトロセルロース濾芯で濾過を行い、次いで沈殿のために4.8m3のエタノールを使用して、低分子量ヒアルロン酸ナトリウムの沈殿を得て、この沈殿をエタノールで脱水し、次いで真空乾燥して、低分子量ヒアルロン酸ナトリウムを得た。この低分子量ヒアルロン酸ナトリウムは、白色の粉末であり、HPLC法により測定されたその含量は、98.6%であり;カルバゾール法により測定されたその含量は、98.3%であり;その分子量は、332kDaであった。
1m3のステンレス鋼の溶解タンクに、1m3の精製水を添加し、15kgの1.41×106Daの分子量を有するヒアルロン酸ナトリウムを撹拌しながら溶解タンクに添加し、完全に溶解した後、温度を43℃に制御し、pHを水酸化ナトリウムで8.0に調節し、酵素分解のために4×107IUのバチルス由来ヒアルロニダーゼ(例3で調製した)を撹拌しながら添加した。所望の分子量になるまで酵素分解を続けた;温度を65℃に高め、40分維持した。80kgのNaClを添加し、完全に溶解した後、0.45μmのポリスルホン濾芯で濾過を行い、次いで沈殿のために8m3のエタノールを使用して、低分子量ヒアルロン酸ナトリウムの沈殿を得て、この沈殿をエタノールで脱水し、次いで真空乾燥して、低分子量ヒアルロン酸ナトリウムを得た。この低分子量ヒアルロン酸ナトリウムは、白色の粉末であり、HPLC法により測定されたその含量は、98.2%であり;カルバゾール法により測定されたその含量は、99.1%であり;その分子量は、38kDaであった。
1m3のステンレス鋼の溶解タンクに、1m3のpH6.0リン酸緩衝溶液を調製し、50kgの5×104Daの分子量を有するコンドロイチン硫酸を撹拌しながら溶解タンクに添加し、完全に溶解した後、温度を37℃に制御し、9×108IUのバチルス由来ヒアルロニダーゼ(例えば、例3〜9のいずれか1つで調製したヒアルロニダーゼ)を添加し、分子量が5000Daになるまで酵素分解を続け、温度を50℃に高め、60分維持し、酵素分解溶液を0.45μmの濾芯で濾過し、次いで沈殿のために20m3のエタノールを使用して、低分子量コンドロイチン硫酸の沈殿を得て、この沈殿をエタノールで脱水し、次いで真空乾燥して、低分子量コンドロイチン硫酸を得た。この低分子量コンドロイチン硫酸は、白色の粉末であり、その含量は、95.8%であり;その分子量は、5.1kDaであり;そのpHは、6.8であった。
1Lのビーカーに、1Lの精製水を添加し、このビーカーに、50gの8×105Daの分子量を有するヒアルロン酸ナトリウムを撹拌しながら添加し、完全に溶解した後、10mLの濃塩酸を添加し、分子量が104Da未満になるまで分解処理する際に、pHを水酸化ナトリウムで6.2に調節し、分解溶液を0.45μmの混成のセルロース濾過膜で濾過し、次いで沈殿のために10Lのエタノールを使用して、ヒアルロン酸ナトリウムの沈殿を得て、この沈殿をエタノールで脱水し、次いで真空乾燥して、オリゴマーヒアルロン酸ナトリウムを得た。このオリゴマーヒアルロン酸ナトリウムは淡黄色の粉末であり、HPLC法により測定されたその含量は、63.8%であり;カルバゾール法により測定されたその含量は、98.9%であり;その分子量は、8.1kDaであり、pHは、4.8であった。図2(B)にその赤外線スペクトルを示すが、これは、欧州薬局方の標準スペクトルと一致しなかった。
1Lのビーカーに、1Lの精製水を添加し、このビーカーに、100gの5×105Daの分子量を有するヒアルロン酸ナトリウムを撹拌しながら添加し、完全に溶解した後、10mLの濃塩酸を添加し、分子量が104Da未満になるまで分解処理する際に、pHを水酸化ナトリウムで6.5に調節し、分解溶液を0.45μmのポリスルホン濾過膜で濾過し、次いで沈殿のために10Lのエタノールを使用して、ヒアルロン酸ナトリウムの沈殿を得て、この沈殿をエタノールで脱水し、次いで真空乾燥して、オリゴマーヒアルロン酸ナトリウムを得た。このオリゴマーヒアルロン酸ナトリウムは淡黄色の粉末であり、HPLC法により測定されたその含量は、60.2%であり;カルバゾール法により測定されたその含量は、99.2%であり;その分子量は、7.6kDaであり、pHは、4.2であった。
1Lのビーカーに、1Lの精製水を添加し、このビーカーに、10gの1×106Daの分子量を有するヒアルロン酸ナトリウムを撹拌しながら添加し、完全に溶解した後、5gの水酸化ナトリウムを添加し、温度を65℃に高め、所望の分子量になるまで分解処理する際に、pHを氷酢酸で6.5に調節し、分解溶液を0.45μmのポリスルホン濾過膜で濾過し、次いで沈殿のために5Lのエタノールを使用して、低分子量ヒアルロン酸ナトリウムの沈殿を得て、この沈殿をエタノールで脱水し、次いで真空乾燥して、低分子量ヒアルロン酸ナトリウムを得た。この低分子量ヒアルロン酸ナトリウムは淡黄色の粉末であり、HPLC法により測定されたその含量は、68.2%であり;カルバゾール法により測定されたその含量は、97.5%であり;その分子量は、15kDaであり、pHは、6.9であった。
1Lのビーカーに、1Lの精製水を添加し、このビーカーに、15gの1.41×106Daの分子量を有するヒアルロン酸ナトリウムを撹拌しながら添加し、完全に溶解した後、6gの水酸化ナトリウムを添加し、温度を65℃に高め、所望の分子量になるまで分解処理する際に、pHを塩酸で6.2に調節し、分解溶液を0.45μmのポリスルホン濾過膜で濾過し、次いで沈殿のために4Lのエタノールを使用して、低分子量ヒアルロン酸ナトリウムの沈殿を得て、この沈殿をエタノールで脱水し、次いで真空乾燥して、低分子量ヒアルロン酸ナトリウムを得た。この低分子量ヒアルロン酸ナトリウムは淡黄色の粉末であり、HPLC法により測定されたその含量は、70.5%であり;カルバゾール法により測定されたその含量は、96.8%であり;その分子量は、39.2kDaであり、pHは、6.4であった。
1Lのビーカーに、1Lの精製水を添加し、このビーカーに、8gの1.61×106Daの分子量を有するヒアルロン酸ナトリウムを撹拌しながら添加し、完全に溶解した後、6gの水酸化ナトリウムを添加し、温度を60℃に高め、所望の分子量になるまで分解処理する際に、pHを氷酢酸で6.8に調節し、分解溶液を0.45μmのポリスルホン濾過膜で濾過し、次いで沈殿のために4Lのエタノールを使用して、低分子量ヒアルロン酸ナトリウムの沈殿を得て、この沈殿をエタノールで脱水し、次いで真空乾燥して、低分子量ヒアルロン酸ナトリウムを得た。この低分子量ヒアルロン酸ナトリウムは淡黄色の粉末であり、HPLC法により測定されたその含量は、73.2%であり;カルバゾール法により測定されたその含量は、98.5%であり;その分子量は、330kDaであり、pHは、6.2であった。
1Lのビーカーに、1Lの精製水を添加し、このビーカーに、5gの2.25×102Daの分子量を有するヒアルロン酸ナトリウムを撹拌しながら添加し、完全に溶解した後、5gの水酸化ナトリウムを添加し、温度を60℃に高め、所望の分子量になるまで分解処理する際に、pHを氷酢酸で6.6に調節し、分解溶液を0.45μmのポリスルホン濾過膜で濾過し、次いで沈殿のために2Lのエタノールを使用して、低分子量ヒアルロン酸ナトリウムの沈殿を得て、この沈殿をエタノールで脱水し、次いで真空乾燥して、低分子量ヒアルロン酸ナトリウムを得た。この低分子量ヒアルロン酸ナトリウムは淡黄色の粉末であり、HPLC法により測定されたその含量は、89.9%であり;カルバゾール法により測定されたその含量は、96.8%であり;その分子量は、530kDaであり、pHは、7.5であった。
1Lのビーカーに、1Lの精製水を添加し、このビーカーに、4gの2.46×102Daの分子量を有するヒアルロン酸ナトリウムを撹拌しながら添加し、完全に溶解した後、4gの水酸化ナトリウムを添加し、温度を60℃に高め、所望の分子量になるまで分解処理する際に、pHを塩酸で6.2に調節し、分解溶液を0.45μmのポリスルホン濾過膜で濾過し、次いで沈殿のために3Lのエタノールを使用して、低分子量ヒアルロン酸ナトリウムの沈殿を得て、この沈殿をエタノールで脱水し、次いで真空乾燥して、低分子量ヒアルロン酸ナトリウムを得た。この低分子量ヒアルロン酸ナトリウムは淡黄色の粉末であり、HPLC法により測定されたその含量は、95.8%であり;カルバゾール法により測定されたその含量は、98.5%であり;その分子量は、770kDaであり、pHは、7.6であった。
全てのオリゴマーヒアルロン酸又は低分子量ヒアルロン酸、加えて通常のヒアルロン酸は、N−アセチルグルコサミンとD−グルクロン酸の二糖の反復単位からなるため、それらの含量はそれらの二糖の含量に等しく、オリゴマーヒアルロン酸又は低分子量ヒアルロン酸又は通常のヒアルロン酸は、バチルス由来ヒアルロニダーゼで二糖に分解することができ、二糖の含量は、オリゴマーヒアルロナート又は低分子量ヒアルロナートの含量が得られるようにHPLC法により決定することができた。その間に、オリゴマーヒアルロナート又は低分子量ヒアルロナートの含量もカルバゾール法により決定した。ヒアルロン酸又はその塩の構造が破壊されている場合、ヒアルロニダーゼは破壊された部分のグルコシド結合を切らないと予測されるため、それにより二糖の含量の低下が起こると予想される。HPLC法の測定値とカルバゾール法の測定値との差が大きければ大きいほど、オリゴマーヒアルロナート又は低分子量ヒアルロナートの破壊された部分が大きい。
a.標準的な対照溶液:標準的な対照(ヒアルロン酸二糖ΔDiHAナトリウム塩、H9649、Sigma)の量を量り、リン酸緩衝溶液(pH6.0、5mmol/L)で溶解させ、1mg/mL溶液を配合することにより、標準的な対照溶液を得た。
b.サンプルの前処理:試験されるサンプル(比較例1〜7、例13〜26により調製された)の量を量り、リン酸緩衝溶液(pH6.0、5mmol/L)で溶解させて、1mg/mL溶液を配合した。1mLのサンプル溶液に1000IUのヒアルロニダーゼ(例10〜12で調製することができる)を添加し、42℃の水浴に2時間入れ;酵素分解後に、酵素分解溶液を2分沸騰させて酵素を不活性化することにより、サンプルの酵素分解溶液を得た。
Ax:試験されるサンプルのヒアルロン酸二糖のピーク面積;
AR:標準的な対照のヒアルロン酸二糖のピーク面積;
Wx:試験されるサンプルの量、mg;
CR:標準的な対照溶液の濃度、mg/mL;
h(%)は、試験されるサンプルの乾燥減量である。
表2〜3に、比較例3〜7及び例19〜26で得られた低分子量ヒアルロナートの含量の比較を示した。
pH6.0を有するリン酸緩衝溶液を使用して、最終濃度2mg/mLのHA溶液を調製し、9.9mLを採取し、基質溶液として使用し、100μLの適切に希釈された(ただし232nmにおける吸収値が0.3〜0.7の)ヒアルロニダーゼ溶液(例えば、例3〜12のいずれか1つで調製されたヒアルロニダーゼ)を添加し、水槽中での反応を異なる温度で30分行い、次いで2分沸騰させ、前もって不活性化した希釈酵素溶液を対照として使用し、これらを室温に冷却したら、232nmにおける吸収値を測定し(これらの値はヒアルロニダーゼの活性で示す)、その結果を図3(A)に示すが、ここで最も適切な反応温度は42℃であった。
pH1.0〜pH12.0の緩衝溶液をそれぞれ調製し、これらの緩衝溶液を使用して、対応するpHを有する2mg/mLのヒアルロン酸溶液を調製し、9.9mLの異なるpHを有するHA溶液を別々に採取し、基質溶液として使用し、100μLの適切に希釈された(ただし232nmにおける吸収値が0.3〜0.7の)ヒアルロニダーゼ溶液(例えば、例3〜12のいずれか1つで調製されたヒアルロニダーゼ)を添加し、水槽中での反応を30分行い、次いで2分沸騰させ、前もって不活性化した希釈酵素溶液を対照として使用し、これらを室温に冷却したら、232nmにおける吸収値を測定し、その結果を図4Aに示した:この酵素にとって最も好適なpHは6.5であり、この酵素は、pH4.0以下又はpH9.0以上の場合活性がなかった。
最終濃度10mg/mLのコンドロイチン硫酸、アルギン酸ナトリウム、ヘパリンナトリウム、キトサン、キチン、及びカルボキシメチルセルロースナトリウムの溶液をpH6.0のリン酸緩衝溶液で別々に調製し、それから各9.9mLを基質溶液として採取し、100μLの適切に希釈された(ただし232nmにおける吸収値が0.3〜0.7の)ヒアルロニダーゼ溶液(例えば、例3〜12のいずれか1つで調製されたヒアルロニダーゼ)を添加し、水槽中での反応を42℃で30分行い、次いで2分沸騰させ、前もって不活性化した希釈酵素溶液を対照として使用し、これらを室温に冷却したら、232nmにおける吸収値を測定した。表4に結果を示した。
実験で使用したL929マウス線維芽細胞(Committee on Type Culture Collection of Chinese Academy of Sciencesの細胞バンクから購入)を観察用細胞として使用し、10%ウシ胎児血清を添加したRPMI−1640培地を完全培地として使用し、陰性対照は、試験されるサンプルをまったく含まない完全培地であり、陽性対照は、5g/Lフェノール溶液(完全培地に溶解させた)であり、ブランク対照は、無細胞完全培地であり、試験されるサンプルは、オリゴマーヒアルロン酸ナトリウムサンプルを添加した完全培地であった。72時間培養した後、相対増殖速度(RGR)を以下の式によって計算した。
式中:
RGRは、相対増殖速度、%であり;
Aは、ブランクを差し引いた、試験されるサンプルのグループ(陰性グループ、陽性グループ)の吸光度であり;
A0は、ブランクを差し引いた陰性対照グループの吸光度である。
1.酵素消化法により調製されたオリゴマーヒアルロナートの経皮吸収に関する研究
無毛マウスの皮膚材料を経皮吸収機器の拡散セルに固定し、拡散セルのドナー側に0.5%のオリゴマーヒアルロナート(別々に例13〜18で調製された)の溶液を添加し、3時間ごとにサンプルを採取し、採取された溶液中のオリゴマーヒアルロナートの含量を測定した。図5(A)に結果を示した。この図表から、オリゴマーヒアルロナートは皮膚内部に入り吸収され得ることが示された。
酵素消化法及び化学分解法により調製されたオリゴマーヒアルロナート及び低分子量ヒアルロナートを別々に、それらのDPPHフリーラジカル捕捉能力及びそれらの還元能力に関して予備的に研究した。
様々な分子量を有するヒアルロナート:
酵素消化されたオリゴマーヒアルロナート:例13〜18で調製された;
化学的方法によるオリゴマーヒアルロナート:比較例1〜2に従って調製された;
酵素消化された低分子量ヒアルロナート:例19〜26で調製された;
化学的方法による低分子量ヒアルロナート:比較例3〜7で調製された;
高分子量ヒアルロン酸ナトリウム(分子量:1610,000、HA−1610k):Furuida Biological Medicine Co., Ltdにより生産された。
DPPHフリーラジカルを捕捉する能力を測定するメカニズム:ジフェニル−ピクリルヒドラジン(DPPH)は、窒素中心を有する安定なフリーラジカルであり、メタノール溶液又はDPPHのエタノール溶液は紫色であり、波長510〜530nmで最大吸光度を有し、その濃度とその吸光度とは直線関係を有していた。フリーラジカルスカベンジャーが存在する場合、フリーラジカルスカベンジャーが1つの電子を供給して、DPPHの孤立電子対の電子と対を形成することにより退色が起こり、この退色の程度は受け取った電子と定量的な関係にあり、すなわち溶液の色が明るくなり、吸光度が減少した(Alisi、C.S.ら、薬草ヒマワリヒヨドリ(Chromolaena odorata Linn)のエタノール抽出物のフリーラジカル捕捉及びインビトロでの抗酸化作用(Free radical scavenging and in−vitro antioxidant effects of ethanol extract of the medicinal herb Chromolaena odorata Linn).British Journal of Pharmaceutical Research、2011,1(4)、141〜155)。フリーラジカルスカベンジャーの能力が大きければ大きいほど、吸光度はより小さくなる。5.0mLの0.1mMのDPPH(2−メチル−2,3−ジヒドロ−5,6−ジフェニルピラジン)エタノール溶液、及び様々な濃度の5.0mLのオリゴマーヒアルロナート又は低分子量ヒアルロナートを別々に正確に計量し、蓋付き試験管に入れ、均一に混合した。水及び95%エタノールの等量混合溶液をブランク対照として使用した。室温で30分静置した後、溶液の吸光度値を523nmで別々に測定した。
還元能力を測定するメカニズム:pH6.6の弱酸環境におけるフェリシアン化カリウムが還元性物質により還元されて、ヘキサシアノ鉄(II)酸カリウムK4Fe(CN)6を生成し、これがさらにFeCl3によって供給される第二鉄イオンと反応して、プルシアンブルー(Fe4[K4Fe(CN)6]3)を生成し、これが700nmにおいて特定の吸光度を有することから、プルシアンブルーの生産量を指標として使用すれば、吸光度が大きければ大きいほど、還元能力がより強い。したがって、原材料としてヒアルロナート水溶液を使用した場合、その還元能力は、このシステムにおけるプルシアンブルーの生成量を測定することにより判断することができる(Oyaizu、M.有機溶媒及び薄層クロマトグラフィーにより分画されたグルコサミンの吹込成形産物の抗酸化活性(Antioxidant activity of browing products of glucosamine fractionated by organic solvent and thin−layer chromatography).Japanese Journal of Nutrition、1986、44、307〜315)。
1.健康管理食品における酵素消化オリゴマーヒアルロナートの機能に関する研究
例えば、主な機能的な成分としてオリゴマーヒアルロナートを含む健康管理用経口溶液において、添加されたオリゴマーヒアルロナートの量は0.05〜2%であった。経口溶液の配合は以下の通りであった:0.5%オリゴマーヒアルロナート(例13〜18のいずれか1つで調製された)を添加し、次いで25%の食用の糖又はハチミツを添加し、精製水で溶解させた。完全に溶解した後、限外濾過装置を使用して滅菌を行い、次いでこれを10mLの経口溶液ボトル(高温又は紫外オゾンで滅菌済)に注ぎ入れ、蓋をして密封し、上記全ての操作を清潔な作業場で行った。次いで生成物に品質試験を行い、オリゴマーヒアルロナートの経口溶液を得た。対象の年齢は30〜65歳であり、対象を、各グループ30人の6つのグループに分け、それぞれのヒトに、1日あたり10〜20mLのオリゴマーヒアルロナート経口溶液を連続1か月間投与し、その作用を表7に示した。別の30人のヒトを対照グループとして使用し、彼らには食用の糖又はハチミツの溶液を毎日投与した。
例えば、主要な機能的な成分として低分子量ヒアルロナートを含む健康管理用経口溶液において、添加された低分子量ヒアルロナートの量は0.05〜2%であった。経口溶液の配合は以下の通りであった:1.0%低分子量ヒアルロナート(例19〜26のいずれか1つで調製された)を添加し、次いで25%食用の糖又はハチミツを添加した。配合方法:クリーンルームで配合を行い、室温で精製水を分取し撹拌し、所定比率の低分子量ヒアルロナートを添加し、次いで完全に溶解するまで撹拌しながら食用の糖又はハチミツを添加し、水を添加して100%にした。完全に溶解した後、湿熱滅菌で滅菌を行い、次いでこれを10mLの経口溶液ボトル(高温又は紫外オゾンで滅菌済)に注ぎ入れ、蓋をして密封し、上記全ての操作を清潔な作業場で行った。次いで生成物に品質試験を行い、低分子量ヒアルロナートの経口溶液を得た。対象の年齢は22〜55歳であり、対象を、各グループ32人の8つのグループに分け、それぞれのヒトに、1日あたり20mLの低分子量ヒアルロナート経口溶液を連続1か月間投与した。別の30人のヒトを対照グループとして使用し、彼らには食用の糖又はハチミツの溶液を毎日投与した。
ヒト臍帯静脈内皮細胞(HUVEC、Shandong Province Academy of Medical Sciences提供)培養試験及びニワトリ漿尿膜(CAM)モデル試験(孵化した卵をPoultry Institute of Shandong Province Academy of Agricultural Sciencesから購入した)を使用して、酵素消化オリゴマーヒアルロナート(例13〜18のいずれか1つで調製された)は血管新生を促進することができるのかどうかを研究した。表9に、HUVEC増殖に対する作用とCAM血管新生に対する作用を示す。実験的工程は、例えば、WANG Yanhou、WANG Fengshan、GUO Xueping、比較的低い分子量のヒアルロン酸の調製及び血管新生の促進に対するその作用(Preparation of relatively low molecular weight hyaluronic acid and effects thereof on promoting angiogenesis)、Chinese Journal of Biochemical Pharmaceutics、2007,28(2):107〜109を参考にすることができる。
太陽光中の紫外線(主としてUVA及びUVBを含む)は、皮膚の日焼け及び太陽光による老化、加えて皮膚癌を引き起こす重要な要因である。皮膚本体の3種の細胞、すなわちケラチノサイト、線維芽細胞、及びメラニン細胞は全て、紫外線に敏感である。UVAダメージは、主として皮膚線維芽細胞のDNAの酸化的ダメージを引き起こすことであり、それにより、DNA突然変異及び皮膚癌が出現する可能性がある。この実験では、マウス線維芽細胞L929(Committee on Type Culture Collection of Chinese Academy of Sciencesの細胞バンクから購入)を所定線量のUVAに晒し、次いで、UVA照射に晒されたL929細胞に対する、様々な分解方法により調製されたヒアルロナート及び異なる分子量を有するヒアルロナートの作用を研究するために、細胞をヒアルロナートで処理した;さらに、マウス線維芽細胞L929をヒアルロナートで処理し、次いで、L929細胞へのUVA照射の防御に対する、様々な分解方法により調製されたヒアルロナート及び異なる分子量を有するヒアルロナートの作用を研究するために、細胞を所定線量のUVA照射に晒した。
線維芽細胞株L929:Committee on Type Culture Collection of Chinese Academy of Sciencesの細胞バンクから購入した;
異なる分子量を有するヒアルロナート:
酵素消化オリゴマーヒアルロナート:例13〜18で調製された;
化学分解オリゴマーヒアルロナート:比較例1〜2に従って調製された;
酵素消化低分子量ヒアルロナート:例19〜26で調製された;
化学分解低分子量ヒアルロナート:比較例3〜7で調製された;
高分子量ヒアルロン酸ナトリウム(分子量:1610,000、HA−1610k):Huaxi Furuida Biomedical Co.,Ltdにより生産された。
UVA放射線照射後のL929マウス線維芽細胞に対する様々な製造方法により調製されたヒアルロナート及び異なる分子量を有するヒアルロナートの修復作用、
対数増殖期中のL929細胞を採取し、膵臓の酵素で消化し、2×104/mLの細胞密度になるように調節し、96−ウェルの細胞培養プレートに、1ウェルあたり100μLの細胞懸濁液を植え付け、二酸化炭素インキュベーター中に置き、従来通り37℃、5%CO2で終夜培養した。96−ウェルプレートから培養培地を取り出し、次いで1ウェルあたり100μLのPBSを添加した。陰性対照グループには放射線照射しなかったが、一方で他の試験グループのL929細胞には7.2J/cm2のUVAを照射した。放射線照射の後にPBSを除去し、細胞を以下の操作で処理した:
非放射線照射グループ(陰性対照グループ):100μLの完全培地を添加した;
放射線照射グループ(陽性対照グループ):100μLの完全培地を添加した;
放射線照射+ヒアルロナート:0.0625%のヒアルロナートを含有する100μLの完全培地を添加した。
式中Acは、試験グループの吸光度値を示し、Ac,0は、陰性対照グループの吸光度値を示す。
L929マウス線維芽細胞における異なる方法で調製されたオリゴマーヒアルロナート及び異なる分子量を有するヒアルロナートのUVA照射に対する保護作用を研究した。
放射線照射グループ(陽性対照グループ):100μLの完全培地を添加した;
放射線照射+ヒアルロナート:0.0625%のヒアルロナートを含有する100μLの完全培地を添加した。
式中、Acは、試験グループの吸光度値を示し、Ac,0は、陰性対照グループの吸光度値を示す。
Claims (29)
- 中国微生物菌株保蔵管理委員会普通微生物中心(CGMCC)という名称の寄託機関に、寄託日2012年2月8日に寄託番号CGMCC番号5744で寄託されたバチルス属菌。
- ヒアルロニダーゼの調製方法であって、請求項1に記載のバチルスを使用する工程を含み;特に、以下の工程:
請求項1に記載のバチルスを、斜面培養、種培養、発酵培養、遠心分離、硫酸アンモニウム分画沈殿、限外濾過にかけて、ヒアルロニダーゼを得る工程
を含む、上記調製方法。 - 以下の工程:
(1)請求項1に記載のバチルスを斜面培養にかけて、斜面培養株を得る工程;
(2)斜面培養株を滅菌した種培養培地に植え付け、25℃〜40℃、100〜200rpmで10〜24時間の条件下で培養して、種溶液を得る工程;
(3)種溶液を滅菌した発酵培養培地に植え付け、25℃〜40℃、100〜300rpmで12〜24時間の条件下で培養して、ヒアルロニダーゼ発酵ブロスを得る工程;
(4)遠心分離により発酵ブロスを分離して、上清を得る工程;
(5)上清を硫酸アンモニウム分画沈殿、濾過(例えば、0.65μmの精密濾過膜を使用した濾過)にかけて、粗製ヒアルロニダーゼを得る工程;
(6)工程(5)で得られた粗製ヒアルロニダーゼをリン酸緩衝溶液中に溶解させ、限外濾過により低分子量の不純物を除去して、精製ヒアルロニダーゼを得る工程
を含み、
任意選択で、工程(6)は、以下の工程(6−1)〜(6−3):
(6−1):工程(5)の粗製ヒアルロニダーゼをpH4.5〜8.0の緩衝溶液中に溶解させて、粗製酵素溶液を得て;粗製酵素溶液を、3.0×103〜1.4×104Daの分子量カットオフを有する透析バッグに入れ、pH4.5〜8.0の緩衝溶液中に置き、4℃で終夜透析する工程;
(6−2):透析した粗製酵素溶液を、クロマトグラフィーカラムの充填材としてDEAEアガロースゲルFF媒体と勾配溶出のための0〜0.5MのNaCl溶液とを使用したイオン交換クロマトグラフィー分離にかけて、溶出ピークを回収する工程;
(6−3):工程(6−2)で得られたヒアルロニダーゼサンプルを真空凍結乾燥にかけて、ヒアルロニダーゼとして白色の粉末を得る工程
によって実行することができる、請求項2に記載の方法。 - 請求項2又は3に記載の方法により調製されるヒアルロニダーゼ。
- 単離されたポリペプチドであって、前記ポリペプチドのアミノ酸配列は、配列番号2に示され;特に、前記ポリペプチドは、ヒアルロニダーゼである、上記ポリペプチド。
- 単離されたポリヌクレオチドであって、前記ポリヌクレオチドは、配列番号2で示されるアミノ酸配列をコードし;特に、前記ポリヌクレオチドは、配列番号3で示される配列又は配列番号3の相補配列である、上記ポリヌクレオチド。
- 請求項6に記載のポリヌクレオチドを含む組換えベクター。
- 請求項7に記載の組換えベクターを含む組換え宿主細胞。
- 請求項4に記載のヒアルロニダーゼ又は請求項5に記載のポリペプチドを使用することにより、10kDaより大きい分子量を有するヒアルロン酸又はその塩を分解する工程を含む、オリゴマーヒアルロン酸又はオリゴマーヒアルロナートの調製方法。
- 以下の工程:
1)ヒアルロン酸又はその塩の溶液の調製:10kDaより大きい分子量を有するヒアルロン酸又はその塩を精製水に添加して、1%w/v〜30%w/vの濃度を有する溶液を得る工程;
2)酵素分解:工程1)の溶液温度を20℃〜48℃に、pHを4〜9に調節し、次いで前記溶液にバチルス由来ヒアルロニダーゼを添加して、ヒアルロン酸又はその塩を所望の分子量まで分解して、酵素分解溶液を得る工程;
3)不活性化:酵素分解溶液を50℃〜90℃で10〜60分維持して、バチルス由来ヒアルロニダーゼを不活性化する工程;
を含み、
好ましくは、以下の工程:
4)濾過:不活性化された酵素分解溶液に可溶性の無機塩を添加し、完全に溶解するまで撹拌し、次いで0.45μmの濾過膜で濾過して、濾液を得る工程、ここで酵素分解溶液100mLあたり、0.1〜10gの可溶性の無機塩が添加される;
5)沈殿:工程4)の濾液を、濾液の3〜20倍の体積のアルコール又はケトンと均一に混合して、オリゴマーヒアルロナートを沈殿させる工程;
6)脱水及び乾燥:工程5)のオリゴマーヒアルロナートの沈殿を分離し、有機溶媒で脱水し、次いで真空乾燥し、オリゴマーヒアルロナートを得る工程
をさらに含む、請求項9に記載の方法。 - 工程1)において、1kgのヒアルロン酸又はその塩あたり、2×107〜5×107IUのバチルス由来ヒアルロニダーゼが添加される、請求項10に記載の方法。
- 工程2)において、酵素分解の温度は35℃〜45℃であり、酵素分解のpHは5.5〜7.5であり、ヒアルロン酸を酵素溶解して、3000Da以上104Da未満の分子量にする、請求項10に記載の方法。
- 以下のA〜Fのうち1つ又は複数を満たす、請求項10に記載の方法:
A.工程1)において、ヒアルロナートは、ヒアルロン酸のナトリウム塩、カリウム塩、マグネシウム塩、カルシウム塩、及び亜鉛塩からなる群より選択される;
B.工程2)において、酸又は塩基を使用して、pHを4〜9に調節し、前記酸は、塩酸、氷酢酸、硫酸、及びリン酸からなる群より選択され、前記塩基は、水酸化ナトリウム又は水酸化カリウムである;
C.工程3)において、酵素分解溶液を55℃〜65℃で20〜30分維持することにより、バチルス由来ヒアルロニダーゼを不活性化する;
D.工程4)において、前記可溶性の無機塩は、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、亜鉛塩、及びマグネシウム塩からなる群より選択され;好ましくは、ナトリウム、カリウム、カルシウム、亜鉛又はマグネシウムの塩化物、硫酸塩又は硝酸塩である;
E.工程5)において、前記アルコール又はケトンは、エタノール、アセトン、メタノール、プロパノール、又はイソプロパノールである;
F.工程6)において、脱水に使用される有機溶媒は、ケトン又はアルコールである。 - 請求項9から13までのいずれか一項に記載の方法により得られるオリゴマーヒアルロン酸又はオリゴマーヒアルロナート。
- 65%以上、70%以上、75%以上、80%以上、85%以上、90%以上又は95%以上(w/w)の量でN−アセチルグルコサミン及びD−グルクロン酸の二糖を有するオリゴマーヒアルロン酸又はオリゴマーヒアルロナートであって;特に、N−アセチルグルコサミンとD−グルクロン酸の二糖の量は、HPLC法により測定される、上記オリゴマーヒアルロン酸又はオリゴマーヒアルロナート。
- 分子量が、3000Da以上104Da未満である、請求項14又は15に記載のオリゴマーヒアルロン酸又はオリゴマーヒアルロナート。
- 請求項4に記載のヒアルロニダーゼ又は請求項5に記載のポリペプチドを使用して、1000kDaより大きい分子量を有するヒアルロン酸又はその塩を分解する工程を含む、低分子量ヒアルロン酸又は低分子量ヒアルロナートの調製方法。
- 以下の工程:
1)ヒアルロン酸又はその塩の溶液の調製:1000kDaよりも大きい分子量を有するヒアルロン酸又はその塩を精製水に添加して、0.1%wt/vol〜2%w/vの濃度を有する溶液を調製する工程;
2)酵素分解:工程1)の溶液温度を20℃〜48℃に、pHを4〜9に調節し、次いで前記溶液にバチルス由来ヒアルロニダーゼを添加して、ヒアルロン酸又はその塩を所望の分子量まで分解して、酵素分解溶液を得る工程;
3)不活性化:酵素分解溶液を50℃〜90℃で10〜60分維持して、バチルス由来ヒアルロニダーゼを不活性化する工程;
を含み、
好ましくは、以下の工程:
4)濾過:不活性化された酵素による加水分解産物に可溶性の無機塩を添加し、完全に溶解するまで撹拌し、0.45μmの濾過膜で濾過して、濾液を得る工程、ここで酵素分解溶液100mLあたり、0.1〜10gの可溶性の無機塩が添加される;
5)沈殿:工程4)の濾液を、濾液の1〜10倍の体積のアルコール又はケトンと均一に混合して、低分子量ヒアルロナートを沈殿させる工程;
6)脱水及び乾燥:工程5)の低分子量ヒアルロナートの沈殿を分離し、有機溶媒で脱水し、次いで真空乾燥し、低分子量ヒアルロナートを得る工程
をさらに含む、請求項17に記載の方法。 - 工程1)において、1kgのヒアルロン酸又はその塩あたり、106〜107IUのバチルス由来ヒアルロニダーゼが添加される、請求項18に記載の方法。
- 工程2)において、酵素分解の温度は35℃〜45℃であり、酵素分解のpHは5.5〜7.5であり、ヒアルロン酸を酵素溶解して、10kda〜1000kDaの分子量にし;特に、低分子量ヒアルロン酸又は低分子量ヒアルロナートは、酵素消化法により得られる、請求項18に記載の方法。
- 以下のA〜Fのうち1つ又は複数を満たす、請求項18に記載の方法:
A.工程1)において、ヒアルロナートは、ヒアルロン酸のナトリウム塩、カリウム塩、マグネシウム塩、カルシウム塩、及び亜鉛塩からなる群より選択される;
B.工程2)において、酸又は塩基を使用して、pHを4〜9に調節し、前記酸は、塩酸、氷酢酸、硫酸、及びリン酸からなる群より選択され、前記塩基は、水酸化ナトリウム又は水酸化カリウムである;
C.工程3)において、酵素による加水分解産物を55℃〜65℃で20〜30分維持することにより、バチルス由来ヒアルロニダーゼを不活性化する;
D.工程4)において、前記可溶性の無機塩は、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、亜鉛塩、及びマグネシウム塩からなる群より選択され;好ましくは、ナトリウム、カリウム、カルシウム、亜鉛又はマグネシウムの塩化物、硫酸塩又は硝酸塩である;
E.工程5)において、前記アルコール又はケトンは、エタノール、アセトン、メタノール、プロパノール、又はイソプロパノールである;
F.工程6)において、脱水に使用される有機溶媒は、ケトン又はアルコールである。 - 請求項17から21までのいずれか一項に記載の方法により調製される低分子量ヒアルロン酸又は低分子量ヒアルロナート。
- 90%以上又は95%以上(w/w)の量でN−アセチルグルコサミンとD−グルクロン酸の二糖を有する低分子量ヒアルロン酸又は低分子量ヒアルロナートであって;特に、N−アセチルグルコサミンとD−グルクロン酸の二糖の量は、HPLC法により測定される、上記低分子量ヒアルロン酸又は低分子量ヒアルロナート。
- 分子量が、10kDa〜1000kDa;好ましくは10kDa〜770kDa、又は10kDa〜700kDa、又は10kDa〜600kDa、又は10kDa〜500kDa;より好ましくは10kDa〜400kDa;さらに好ましくは10kDa〜300kDa、10kDa〜200kDa、10kDa〜150kDa、10kDa〜100kDa、10kDa〜50kDa、又は10kDa〜30kDaである、請求項22又は23に記載の低分子量ヒアルロン酸又は低分子量ヒアルロナート。
- 請求項4に記載のヒアルロニダーゼ、請求項5に記載のペプチド、請求項6に記載のポリヌクレオチド、請求項7に記載の組換えベクター、請求項8に記載の組換え宿主細胞、請求項14から16までのいずれか一項に記載のオリゴマーヒアルロン酸又はオリゴマーヒアルロナート、又は請求項22から24までのいずれか一項に記載の低分子量ヒアルロン酸若しくは低分子量ヒアルロナートを含む組成物であって;任意選択で、薬学的に許容される、又は食品学的に許容されるキャリアー若しくは添加剤をさらに含み;特に、前記組成物は、化粧品、食品、又は医薬品であり;とりわけ、前記化粧品は、日焼け防止、日焼け後の修復、アンチエイジング、又は保湿化粧品である、上記組成物。
- ヒアルロニダーゼ製造における、請求項1に記載のバチルス、又は請求項6に記載のポリヌクレオチド、又は請求項7に記載の組換えベクター、又は請求項8に記載の組換え宿主細胞の使用。
- オリゴマーヒアルロン酸若しくはオリゴマーヒアルロナート、低分子量ヒアルロン酸若しくは低分子量ヒアルロナート、又は低分子量コンドロイチン硫酸の調製における、請求項4に記載のヒアルロニダーゼ、又は請求項5に記載のポリペプチドの使用。
- 血管新生を促進する、及び/又は創傷治癒若しくは抗酸化若しくはフリーラジカル捕捉若しくは日焼け防止若しくは日焼け後の修復を促進する、又はHUVEC細胞増殖を促進する、又は抗腫瘍、又は免疫性を強化するための医薬品の製造における、又は食品若しくは健康管理製品若しくは化粧品の製造における、請求項14から16までのいずれか一項に記載のオリゴマーの酸又はオリゴマーヒアルロナート、又は請求項22から24までのいずれか一項に記載の低分子量ヒアルロン酸若しくは低分子量ヒアルロナートの使用であって;特に、前記化粧品は、日焼け防止、日焼け後の修復、アンチエイジング、又は保湿化粧品である、上記使用。
- インビボ若しくはインビトロで、血管新生を促進する、及び/又は創傷治癒若しくは抗酸化若しくはフリーラジカル捕捉若しくは日焼け防止若しくは日焼け後の修復を促進する、又はHUVEC細胞増殖を促進する、又は腫瘍を抑制する方法であって、対象に、請求項14から16までのいずれか一項に記載のオリゴマーの酸若しくはオリゴマーヒアルロナート、又は請求項22から24までのいずれか一項に記載の低分子量ヒアルロン酸若しくは低分子量ヒアルロナートの有効量を投与又は使用する工程を含み;特に、前記対象は哺乳動物であり、とりわけ、前記対象はヒトである、上記方法。
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