BRPI0713215A2 - processo eficiente de produção e purificação de ácido hialurÈnico de elevado peso molecular e produto resultante - Google Patents

Abstract

PROCESSO EFICIENTE DE PRODUçãO E PURIFICAçãO DE áCIDO HIALURÈNICO DE ELEVADO PESO MOLECULAR E PRODUTO RESULTANTE. A presente invenção fornece um processo eficiente e melhorado de produção e purificação de ácido hialurónico (HA) de elevado peso molecular, sendo que uma configuração se refere ao fornecimento de condições de crescimento à produção de 1-IA de elevado peso molecular em Sreptococcus zooepidemicus. Por exemplo, o meio de crescimento compreendendo uma concentração mais baixa de proteína, isto é, hidrolisado de caseína a 1 % e uma concentração mais alta dc açúcar, ou seja, sacarose a 5% resultou em 5-6 g/L de HA de elevado peso molecular na proporção de 3,5-4,Ox 10^ 6^ Da. A presente invenção também fornece um processo eficiente de purificação de HA que compreende o tratamento com sílica gel seguido de carbono ativo e a respectiva diafiltragem com menos volume de solvente.

Description

PROCESSO EFICIENTE DE PRODUÇÃO E PURIFICAÇÃO DE ÁCIDO HIALURÔNICO DE ELEVADO PESO MOLECULAR E PRODUTO RESULTANTE.

REFERÊNCIAS CRUZADAS A APLICAÇÕES RELACIONADAS

O presente pedido reivindica o benefício do Pedido de patente indiano provisório N9 1065/MUM/2006 depositado em 06 de julho de 2006 e 1874/MUM/2006, depositado em 13 de novembro de 2006, os quais estão inteiramente incorporadas ao presente por referência.

CAMPO DA INVENÇÃO

A presente invenção refere-se a técnicas aperfeiçoadas de produção e purificação de ácido hialurônico e seu sal. A presente invenção também se refere à produção e à otimização do processo e purificação do ácido hialurônico e seu sal, que têm aplicações biomédicas.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

O ácido hialurônico (HA) é um biopolímero que ocorre na natureza e tem funções biológicas em bactérias e animais superiores, inclusive em humanos. O HA que ocorre na natureza pode ser encontrado em tecidos de animais superiores, principalmente preenchendo o espaço intercelular. (Balazs, Viscosupplementation: a new concept in the treatment of osteoarthritis., J. Rheumatol. Suppl.; 39:3-9, (Aug. 1993)). Ele é encontrado nas maiores proporções no humor vítreo do olho e no fluido sinovial das juntas articulares. (0'Regan, M., Martini, I., Crescenzi, F., De Luca, C., e Lansing, M., Molecular mechanisms and genetics of hyaluronan biosynthesis. International Journal of Biological Macromolecules 16: 283-286 (1994)). Em Streptococci gram-positivos, ele é encontrado na forma de uma cápsula mucóide circundando a bactéria.

O ácido hialurônico, também chamado de hialuronano ou hialuronato, é um glicosaminoglicano distribuído amplamente pelos tecidos conectivos, epiteliais e neurais. Ele é um dos principais componentes da matriz extracelular. Ele contribui significativamente para a proliferação e migração da célula, e também pode estar envolvido na progressão de alguns tumores malignos. Hialuronano é encontrado na natureza em muitos tecidos do corpo como a pele, cartilagem e o humor vítreo. Ele é, portanto, adequado a aplicações que têm como alvo esses tecidos. O primeiro produto biomédico de hialuronano, Healon®, foi desenvolvido nas décadas de 1970 e 1980 e foi aprovado para uso em cirurgia do olho (isto é, transplante de córnea, cirurgia de catarata, cirurgia de glaucoma e cirurgia de reparação de descolamento de retina). Outras empresas biomédicas também produzem marcas de hialuronano para cirurgia oftálmica.

Hialuronano também é usado para tratar osteoartrite do joelho. Esses tratamentos são administrados como uma seqüência de injeções na junta do joelho e podem agir para suplementar a viscosidade do fluido da junta, dessa forma lubrificando a junta, dotando a junta de um suporte flexível e produzindo um efeito analgésico. Hialuronano também pode ter efeitos biomédicos positivos sobre células de cartilagem.

Devido a sua alta biocompatibilidade e a sua presença comum na matriz extracelular de tecidos, hialuronano está ganhando popularidade como uma estrutura de biomaterial na pesquisa de engenharia de tecido. Em alguns cânceres, os níveis de hialuronano estão bastante correlacionados com malignidade e prognóstico desfavorável. Hialuronano pode ser usado como um marcador de tumor para câncer de próstata e de mama. Ele também pode ser usado para monitorar a progressão dessas doenças.

Hialuronano também pode ser usado no pós-operatório para induzir a cicatrização de tecido, notavelmente após cirurgia de catarata. Modelos atuais de cicatrização de ferimento propõem que polímeros maiores de ácido hialurônico aparecem nos primeiros estágios da cicatrização para dar fisicamente espaço para glóbulos brancos do sangue que intermedeiam a resposta imune. Hialuronano é um ingrediente comum em produtos de tratamento da pele.

O termo "hialuronato" refere-se à base conjugada de ácido hialurônico (HA). Devido ao fato de a molécula existir tipicamente in vivo em sua forma polianiônica, ela é mais comumente chamada de "hialuronano". HA é constituído de unidades de dissacarídeo lineares, sem ramificação, polianiônicas que consistem em ácido glicurônico (GlcUA) e N- acetil glicosamina (GlcNAc) reunidos alternativamente por ligações glicosídicas beta 1-3 e beta 1-4, como mostra a Figura 1. HA é um membro da família glicosaminoglicano, que inclui condroitina sulfato, dermatina sulfato e heparan sulfato. Ao contrário de outros membros desta família, ele não se liga por covalência a proteínas.

Em uma solução aquosa neutra, devido à formação de ligação de hidrogênio, as moléculas de água e os grupos carboxil e N-acetil adjacentes dão uma rigidez de conformação ao polímero, a qual limita sua flexibilidade. A formação da ligação de hidrogênio resulta na capacidade de ligação com água e de retenção de água exclusiva do polímero. Daí também decorre que a capacidade de ligação com água está diretamente relacionada com o peso molecular da molécula. Sabe-se que até seis litros de água podem se ligar a uma grama de HA. (Sutherland, Novel and established applications of microbial polysaccharides. Trends Biotechnol 16:41-46, 1998).

O ácido hialurônico e seus derivados têm sido extensivamente estudados devido a suas aplicações em práticas biomédicas. As características de biocompatibilidade deste polímero têm atraído a atenção de ortopedistas, uma vez que ele pode ser usado em viscocirurgia e permite aos cirurgiões criar com segurança espaço entre os tecidos.

Implantes viscocirúrgicos são construídos a partir de HA. (Balazs, Aug 1993, id). O caráter viscoelástico do HA tem sido usado para suplementar a lubrificação em juntas artríticas. Ele também tem sido usado para liberação com alvo de medicamento, na forma de microcápsula. Finalmente, devido a sua alta capacidade de retenção de água, este EPS (polissacarídeo extracelular) também ocupa um nicho no lucrativo mercado de cosméticos.

Em 2003 a FDA aprovou injeções de hialuronano para preencher defeitos de tecido flácido tais como rugas faciais. Restylane® é uma marca registrada comum do produto. Injeções de hialuronano alisam temporariamente rugas adicionando volume sob a pele, com os efeitos durando geralmente seis meses. Além disso, soluções de HA são caracteristicamente viscoelásticas e pseudoplásticas. Essas características são observadas mesmo em soluções muito diluídas deste polímero, em que géis muito viscosos são formados. A propriedade viscoelástica das soluções de HA, que é importante para seu uso como um biomaterial, é controlada pela concentração e peso molecular do HA. O peso molecular de HA de diferentes fontes é altamente variável, variando de IO4 a IO7 Da. A extrusão de HA através da membrana da célula à medida que é produzido permite alongamento irrestrito do polímero, o que pode resultar em um peso molecular bastante alto do HA.

O peso molecular é o parâmetro que mais afeta as propriedades físicas dos dispositivos médicos baseados no ácido hialurônico. O peso molecular influencia os perfis de viscosidade versus concentração das soluções de ácido hialurônico, e desempenha um papel importante em suas outras propriedades viscoelásticas. Particularmente, as soluções que exigem uma certa viscosidade para a eficácia farmacêutica necessitam de concentrações menores de ácido hialurônico se o peso molecular é aumentado. Isto, tem-se demonstrado, proporciona vantagens em aplicações oculares assim como nas ortopédicas. Um processo capaz de gerar ácido hialurônico de grau médico com um peso molecular maior do que 750.000 dáltons tem, portanto, um potencial comercial significativo. Em muitas aplicações farmacêuticas, não é desejável ter ácido hialurônico de baixo peso molecular na formulação, por exemplo, tendo em vista os efeitos inflamatórios de HA de baixo peso molecular, como relata a Pat. norte-americana N- 4.141.973.

O ácido hialurônico é usado em alguns produtos comerciais líderes de vendas, incluindo Synvisc (Genzyme), Orthovisc (Anika), Seprafilm (Genzyme), Restylane (Q- Med), Healon (Pharmacia), Amvisc (Med-Chem), etc. Devido a seu alto custo, entretanto, ele é usado somente em concentrações muito baixas nesses produtos. HA tem mais valor comercial do que outros EPS microbianos. Com um valor estimado de mercado mundial de $US 500 milhões, ele é vendido por cerca de $US 100.00 por quilograma.

HA tem sido extraído convencionalmente de cristas de galo e de humor vítreo bovino. Entretanto, é difícil isolar HA de alto peso molecular em proporções industrialmente viáveis dessas fontes, porque ele forma complexos com proteoglicans presentes em tecido animal (0'Regan et al., 1994). Atualmente não é prático controlar o peso molecular do biopolímero enquanto ele é sintetizado em tecido animal. Além disso, o uso de produtos bioquímicos derivados de animal para terapêutica humana tem levantado questões éticas, e encontra uma resistência crescente. Além das questões éticas, há um risco potencial de doença infecciosa associado ao uso de produtos bioquímicos derivados de animal para terapêutica humana. Uma vez que cadeias de 10 MDa podem ser obtidas de tecido animal, há um horizonte considerável para aperfeiçoamento.

As desvantagens acima discutidas forçaram a indústria a adotar processos de fermentação bacteriana com a esperança de obter biopolímero comercialmente viável. Usando um processo de fermentação bacteriana, HA é liberado no meio de cultura, o que ajuda no controle das características do polímero e resulta em aumento da quantidade de HA produzida. A quantidade de biopolímero que pode ser produzida pela via acima referida é teoricamente ilimitada. O uso de fermentação bacteriana tem, entretanto, desvantagens. A tendência recente é de usar Streptococci de grupo A e C de Lancefield, que produzem de forma natural uma cápsula mucóide de HA. A cápsula de HA é um fator de biocompatibilidade que permite a essa bactéria grampositiva escapar das defesas imunes do hospedeiro e é responsável por seu nível de virulência caracteristicamente alto.

Aperfeiçoamentos subsequentes anteriores dos processos de extração e purificação com o uso de bactérias resultaram em uma redução inerente do peso molecular de HA. As fermentações com Streptococci têm sido apenas capaz de produzir HA com um peso molecular médio na faixa de 1 a 4 MDa. Como discutido acima, peso molecular alto é uma propriedade desejável do biopolímero HA. A presente invenção proporciona métodos para obter HA com um peso molecular alto.

Os Streptocoeei são nutricionalmente exigentes, anaeróbios facultativos, que produzem ácido lático como subproduto do catabolismo de glicose. Portanto, a energia recuperada por essas bactérias é relativamente mais baixa do que a de bactérias aeróbicas. A produção de HA a partir de fermentação bacteriana com o uso de métodos anteriormente conhecidos é caracteristicamente baixa (0,1 g/g de glicose, 0,15 g/libra). Essas produções baixas certamente têm dificuldade de satisfazer a demanda do mercado. Além disso, exigências nutricionais estritas para fermentação influenciam a economia ao proibirem o uso de meios quimicamente definidos para fermentações em escala de produção e limitam a seleção dos meios complexos que podem ser empregados.

Vários grupos têm fornecido otimização de parâmetro do processo proposto, seleção do modo de processo de HA, otimização do rendimento por projeto de meio complexo e controle de fermentação de HA baseado em modelo. Cooney, M.J., Goh, L.T., Lee, P.L. e Johns, R.R., Structure model-based analysis and control of the hyaluronic acid fermentation by Streptococcus zooepidemicus: Physiological implications of glucõse and complex-nitrogen-limited growth, Bioteehnology Progress, 15: 898-910 (1999); Lars M. Blank, Riehard L. MeLaughlin5 Lars K. Nielsen, Stable production of hyaluronic acid in Streptococcus zooepidemicus chemostats operated at high dilution rate, Biotechnology and Bioengineering, 90(6): 685-693 (2005); Johns, M.R., Goh, L.T. e Oeggerli, A., Effect of pH, agitation and aeration on hyaluronic acid production by Streptoeoceus zooepidemicus. Biotechnology Letters 16: 507-512 (1994); Kitchen, J.R. e Cysyk, R.L. Synthesis and release of hyaluronic acid by Swiss 3T3 fibroblasts, Biochemical Journal, 309: 649-656 (1995); Armstrong D, Johns MR, Culture conditions affect the molecular weight properties of hyaluronic acid produced by Streptococcus zooepidemicus, Appl. Environ. Microbiol., 63: 2759-2764(1997).

Com o tempo, o peso molecular do HA tornou-se uma área importante de estudo para os pesquisadores. Pesquisadores como Armstrong e Johns examinaram o efeito dos parâmetros de processo para determinar os efeitos sobre o peso molecular de HA. Armstrong D.C. e Johns M.R., Effect of Culture Conditions on Molecular Weight of Hyaluronic Acid Produced by Streptoeoceus zooepidemicus, Applied and Environmental Microbiology, 63: 2759-2764 (1997); Armstrong D.C. e Johns M.R., Improved molecular weight analysis of streptococcal hyaluronic acid by size exclusion chromatography, Biotechnology Techniques, 9: 491-496 (1995).

Esses grupos descobriram que certos parâmetros de fermentação afetam o peso molecular do HA produzido. Armstrong et al. (1997) relataram que condições como temperatura, aeração e concentração de glicose afetam o peso molecular de HA, enquanto o pH e a agitação não afetam. Descobriu-se que temperaturas baixas da cultura (28 °C), a aeração da cultura e concentração inicial alta de glicose (40 g/l) resultaram na produção de HA com peso molecular mais alto em S. zooepidemicus. Grupos anteriores também descobriram que o pH e a agitação da cultura não afetam o resultado em peso molecular das fermentações de HA. Especificamente, Johns et al. (1994) relataram anteriormente que o pH e a agitação afetaram a produção de HA em geral, mas não a do peso molecular.

Já é um fato conhecido que a taxa de crescimento específico da bactéria e o peso molecular de HA são inversamente proporcionais. Esse efeito pode ser explicado por um modelo metabólico baseado em recurso, da síntese de HA, como ilustra a Figura 2. Em sua forma mais simplista, dois processos em competição ocorrem dentro de uma célula bacteriana, isto é, o crescimento da célula e a biossíntese de HA. Esses dois processos competem pelos recursos limitados, tais como carbono, nitrogênio e energia. A taxas de crescimento específico baixas, a célula dirige mais precursores ativados derivados de glicose (a saber, UDP-Glc e UDP-GlcNac) para a síntese de HA do que para a síntese da parede da célula. O rendimento mais alto de ATP a partir do catabolismo aeróbico de glicose favorece a formação de UTP, o qual é necessário para a formação dos dois precursores ativados da síntese de HA, a saber, UDP-GlcUA e UDP-GlcNac. A glicose, que pode ser usada para sintetizar HA, também é depletada pela produção de lactato sob crescimento aeróbico.

Também se observou anteriormente que a taxa específica de produção de HA (g g"1 h"1) aumenta com a redução da taxa de crescimento específico. Dado o fato de que a densidade das enzimas sintetizadoras de HA ativo provavelmente não muda, a taxa mais alta de produção pode ser atribuída a uma taxa de polimerização mais alta ao longo de cada sintase. Uma atividade aumentada de sintase pode surgir da concentração mais alta de substrato intracelular resultante da taxa de crescimento baixa.

O peso molecular do HA produzido é determinado pelo número de precursores que a sintase é capaz de polimerizar durante sua duração. Com base nesta teoria, a superexpressão da sintase resulta em redução do peso molecular do HA sintetizado. De fato, ela pode reduzir o peso molecular médio, porque há mais enzimas competindo pelos mesmos recursos. Um efeito semelhante foi relatado para a superexpressão da sintase poliidroxibutirato em E. coli recombinante. (Sim et al., PHA synthase activity controls the molecular weight and polydispersity of polyhydroxybutyrato in vivo, "Nature Biotech. 15: 63-67,1997).

A Pat. norte-americana N2 4.897.349 demonstrou que produções gerais melhoradas de HA puderam ser obtidas pelo controle do oxigênio disponível para metabolismo por um microorganismo produtor de ácido hialurônico. O oxigênio disponível foi limitado para estimular uma produção desproporcionalmente maior do ácido hialurônico desejado. As condições de cultivo no que se refere à fonte de carbono não foram estudadas. Entretanto, o processo exigiu modificação do oxigênio dissolvido, o que usualmente não resultou em quantidades consistentes do HA produzido.

A patente européia EP 0694616 empregou uma concentração de 2,5% de uma cultura de Streptococcus zooepidemicus obtida de uma coleção. A fermentação durou cerca de 24 horas a 37°C, com o pH mantido a 7,00 através de adição automática contínua de NaOH. 33% da dextrose foram adicionados no momento da inoculação e o restante foi administrado continuamente. O rendimento do processo, determinado por análise de HPLC, foi tão baixo quanto 0,8 g/l, com um peso molecular médio estimado de cerca de 500.000 Da.

A patente japonesa JP62215397 demonstrou que um microorganismo capaz de produzir ácido hialurônico foi cultivado aerobicamente em um meio sob agitação, à medida em que se acrescentaram sacarídeos ao meio várias vezes, a concentração dos sacarídeos foi mantida sempre a 0,1-3 w/v% [peso sobre volume] no meio. O ácido hialurônico acumulado no meio foi coletado. O sacarídeo preferido foi glicose ou lactose. O ácido hialurônico acumulado na mistüra da cultura foi separado por um método convencional de separação de polissacarídeos. O processo apresentado nesta patente foi um processo de lote alimentado, que não é aplicável a um processo de lote contínuo.

A patente japonesa JP62257901 revelou um processo para produzir HA que pode ser obtido pelo cultivo de bactéria produtora de ácido hialurônico em um meio contendo carboidrato (por exemplo, com um pH de 7,5 contendo 0,50% de extrato de levedura, 0,75% de peptona, 0,02% de sulfito de sódio e 1-3% de glicose).

A patente japonesa JP62289198 apresentou um processo no qual uma cepa microbiana produtora de ácido hialurônico como um Streptococcus equi NK-850214 foi inoculada em um meio líquido contendo arginina e/ou ácido glutâmico a uma concentração de 0,01-1 wt% [em peso], além de peptona, NaCl, traço de vitaminas, etc., por um processo de cultivo compreendendo a adição de > 20 g de carboidrato tal como glicose por 1 1 do meio, dividida em > 3 doses de uma forma tal que mantivesse constantemente a concentração de carboidrato em 0,1-3 w/v% ao longo do cultivo. Na patente japonesa JP05276972, um microorganismo capaz de produzir ácido hialurônico foi cultivado em uma solução de cultura contendo um surfactante. O ácido hialurônico foi formado e acumulado na solução de cultura e coletado.

A patente japonesa JP06038783 forneceu um processo de produção de ácido hialurônico em escala industrial através do cultivo de uma cepa microbiana produtora de ácido hialurônico pertencente ao gênero Streptococcus em um meio nutriente. O meio continha uma quantidade específica de um componente de açúcar (como a principal fonte de carbono) sob condições específicas, enquanto era agitado por aeração. Uma cepa microbiana pertencente ao gênero Streptococcus e capaz de produzir ácido hialurônico (por exemplo, Streptoeoeeus zooepidemieus) foi inoculada em um meio nutriente contendo > 3% de componente de açúcar como fonte principal de carbono e foi cultivada a pH 7 e 33°C por 4 dias sob agitação por aeração. O rendimento obtido por este processo foi de 2,1 g/l.

A patente japonesa JP06319579 apresentou a produção de ácido hialurônico em um meio contendo glicose e frutose como fonte principal de carbono para acumular ácido hialurônico de alto peso molecular na mistura de cultura.

A patente norte-americana N2 4.784.990 demonstrou um método para obter hialuronato sódico compreendendo o cultivo com agitação vigorosa de um microorganismo do gênero Streptoeoeeus sob condições adequadas em um meio nutriente contendo um componente de açúcar como fonte de carbono. O microorganismo produziu grandes quantidades de ácido hialurônico de alto peso molecular, e esta patente refere-se a um método de seleção de microorganismos que produzem quantidades aumentadas de ácido hialurônico e que não têm atividade hemolítica. S. zooepidemieus HA-116 ATCC 39920, que é uma cepa mutante. O hialuronato sódico foi então recuperado pela remoção do microorganismo e de outros materiais insolúveis do meio, precipitando o hialuronato sódico do meio, usando, por exemplo, solventes orgânicos, e recuperando o precipitado. O precipitado foi então moído e secado. Composições de hialuronato sódico caracterizadas pela ausência de pirogenicidade e de atividade inflamatória podem ser produzidas por esses métodos. O meio apresentou um pH substancialmente constante entre cerca de 6,0 e 7,5, e o hialuronato sódico excretado no meio pelo organismo foi purificado como uso de métodos envolvendo precipitação, redissolução e reprecipitação do hialuronato. O hialuronato sódico pode ser precipitado do meio ou filtrado pela adição de um primeiro solvente orgânico, como isopropanol, ao meio. O precipitado foi redissolvido em acetato sódico aquoso a 3% e então reprecipitado com um segundo solvente orgânico como etanol. O segundo precipitado foi redissolvido em lactato sódico aquoso a 3% e foi adicionado carvão ativado para formar uma suspensão. A suspensão foi filtrada e um terceiro solvente orgânico, por exemplo, acetona, foi adicionado para produzir um precipitado de hialuronato sódico. Cada um do primeiro, segundo e terceiro solventes orgânicos pode ser isopropanol, etanol ou acetona. Alternativamente, o hialuronato pode ser precipitado pelo mesmo solvente orgânico em cada etapa. Por exemplo, hialuronato sódico ser precipitado do meio pelo uso de isopropanol em todas as três etapas de precipitação. O processo desta patente de HA de grau médico envolve o uso de detergentes como cetil piridínio cloreto, etapas múltiplas de precipitação por solvente, tratamento com florisil, etc.

A patente norte-americana N° 4.946.780 forneceu um método de produção de HA a partir de fermentação pelo emprego de surfactantes como cetil peridínio cloreto. O método também envolveu um procedimento de purificação compreendendo o contato da solução contendo hialuronato sódico com alumina, carvão ativado ou misturas dos mesmos e então com sílica para formar uma solução purificada de hialuronato sódico. O método então acrescentou álcool à solução purificada de hialuronato sódico para precipitar o hialuronato sódico purificado e secou o hialuronato sódico purificado. É difícil eliminar os surfactantes do produto, e são necessárias etapas múltiplas de lavagem com água isenta de pirogênio.

A patente norte-americana N9 5.563.051 revelou um processo no qual, após o processo de fermentação, a biomassa foi morta com um agente particularmente adequado. O agente usado para matar a biomassa foi formaldeído, por exemplo, na forma de solução aquosa comumente conhecida como formalina. O HA foi extraído com um meio aquoso contendo um surfactante aniônico, isto é, dodecil sulfato sódico. A patente revelou ainda o uso de uma membrana de ultrafiltragem com um corte adequado de peso molecular que foi usualmente de 10.000 a 25.000 dáltons, e preferivelmente 20.000 dáltons. A solução filtrada contendo o HA dissolvido foi diafiltrada com 8 a 20 volumes de água purificada, preferivelmente cerca de 10 volumes de água purificada, em que o filtrado foi descartado continuamente.

A patente norte-americana N° 6.489.467 reivindicou um processo para purificar ácido hialurônico de alto peso molecular a partir de uma fonte biológica, incluindo as etapas de ajuste do pH de uma solução aquosa contendo ácido hialurônico de alto peso molecular a partir de uma fonte biológica a pH na faixa de 1,7 a 3,3. O processo envolveu ainda a diafiltragem da solução aquosa ao mesmo pH usando um filtro com um tamanho de poro na faixa de corte molecular nominal de 100.000 dáltons a 0,45 □, e removendo células da solução aquosa contendo ácido hialurônico de alto peso molecular a partir de fonte biológica.

A patente norte-americana N° 7.002.007 revelou métodos envolvendo o contato de uma fonte contendo hialuronato com um ácido para produzir uma suspensão ácida de hialuronato, contatando essa suspensão com um meio de troca aniônica na presença de um tampão ácido, e então contatar o meio com um tampão ácido com um teor mais alto de sal para dessorver o hialuronato do meio.

Os métodos anteriores para produção de HA geralmente usam glicose como fonte de carbono. Usando esses métodos, constata-se freqüentemente que o peso molecular do HA obtido está entre 2 e 4 χ 10^5 Da, isto é, um peso molecular relativamente baixo. Além disso, a viscosidade inerente do HA aumenta com o aumento de seu peso molecular. Essa viscosidade aumentada tem apresentado um obstáculo importante durante a fermentação, assim como na purificação do HA. Apesar de o alto peso molecular de HA poder ser excessivamente grande para que este penetre na pele e na corrente sangüínea, ele possui vários usos benéficos. Em preparações tópicas, por exemplo, o alto peso molecular de HA é útil na cirurgia de olho e em cosmética. Da mesma forma, o alto peso molecular de HA pode ser usado em um filme viscoelástico para reter a umidade da pele e bloquear substâncias estranhas.

Portanto, tornou-se um desafio e uma necessidade obter um processo de produção de HA de alto peso molecular, incluindo aquele que satisfaça as especificações definidas para aplicações médicas, por exemplo, as descritas na FarmaCopéia Britânica, 2003.

Os métodos anteriores para purificação de HA têm envolvido no mínimo três etapas sucessivas de precipitação com solvente, dessa forma resultando em um número maior de etapas de processo e uma sobrecarga no liofilizador. Os métodos anteriores de precipitação do caldo de fermentação também envolvem o uso de surfactantes ou detergentes, como cetil piridínio cloreto / hexadeciltrimetil brometo de amônia. A remoção do detergente ou surfactante residual aumenta o número de etapas de processo necessárias, apresentando complexidade e custo.

Além disso, os procedimentos de purificação conhecidos anteriormente, como as etapas de diafiltragem empregadas para obter o alto peso molecular de HA, envolvem o uso de grandes volumes de solvente orgânico. O uso desse solvente cria problemas de manuseio em operações em grande escala e resulta em riscos ambientais.

A presente invenção refere-se a melhorias nos métodos de produção e purificação de HA, como HA de alto peso molecular e seu sal, incluindo o que apresenta aplicações médicas na Farmacopéia Britânica, 2003. A presente invenção aborda um processo simples e economicamente viável com alto rendimento de produção de HA através de fermentação contínua de bactérias como Streptococcus zooepidemicus, em um meio de cultura adequado para produzir grandes quantidades de HA de alto peso molecular. O processo da presente invenção é vantajoso em comparação com o cultivo tradicional em lotes, na qual enzimas de degradação podem começar a destruir as paredes da célula de Streptococcus, e liberar o conteúdo da célula no caldo fomentador conduzindo a dificuldades na purificação de HA. Além disso, a presente invenção também apresenta um processo de purificação de ácido hialurônico que inclui filtragem em gel de sílica combinada com tratamento por carvão ativado e diafiltragem subsequente usando quantidade menor de solvente, dessa forma produzindo uma qualidade melhor de ácido hialurônico com aplicações biomédicas. Da mesma forma, a presente invenção proporciona um processo comercialmente viável de purificação de ácido hialurônico assim como de seus sais, com aplicações industriais.

OBJETO DA INVENÇÃO É objeto da presente invenção proporcionar um processo de produção de ácido hialurônico que satisfaz as especificações definidas para aplicações médicas na Farmacopéia.

Da mesma forma, é objeto da presente invenção proporcionar um processo comercialmente viável de produção de ácido hialurônico e de seu sal.

É objeto da presente invenção proporcionar um ácido hialurônico de alto peso molecular de grau médico produzido por S. zooepidemicus.

E objeto da presente invenção proporcionar um ácido hialurônico de alto peso molecular sem o uso de surfactantes ou detergentes no processo de fabricação de HA.

É objeto da presente invenção otimizar o efeito de várias condições, como fonte de carbono, íon metálico e composição dos meios, sobre o peso molecular de HA, sob a presente invenção.

É objeto da presente invenção proporcionar um processo de purificação de ácido hialurônico, produzindo uma qualidade melhor de ácido hialurônico e tendo aplicações biomédicas.

E objeto da presente invenção proporcionar um processo eficiente de remoção, de impurezas de proteína do ácido hialurônico empregando duas etapas de purificação com gel de sílica e tratamento com carvão.

É objeto da presente invenção proporcionar um processo eficiente de diafiltragem usando quantidade menor de solvente na purificação de ácido hialurônico.

É objeto da presente invenção proporcionar ácido hialurônico de alto peso molecular de grau médico.

E objeto da presente invenção proporcionar um processo isento de surfactantes ou detergentes.

E objeto da presente invenção proporcionar um processo de ciclo único de purificação de ácido hialurônico. É objeto da presente invenção proporcionar um processo que compreende uma quantidade mínima de solventes.

É objeto da presente invenção remover no mínimo 90% das impurezas de proteína empregando gel de sílica e tratamento com carvão ativado.

É objeto da presente invenção proporcionar um processo de diafiltragem de volume constante resultando em HA de alto peso molecular.

Também é objeto da presente invenção proporcionar HA que atende às especificações da Farmacopéia Britânica 2003.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

A presente invenção proporciona um processo econômico de produção de ácido hialurônico de alto peso molecular e seu sal. A presente invenção produz uma qualidade melhor de ácido hialurônico com aplicações biomédicas, isento de surfactantes ou detergentes.

A presente invenção compreende as seguintes etapas de produção de ácido hialurônico de grau médico:

a) Preparação de HA por fermentação

b) Remoção de impurezas de proteína

c) Diafiltragem

Em uma configuração, a presente invenção usa técnica de fermentação para a produção de ácido hialurônico de alto peso molecular usando bactérias. Em uma configuração, a bactéria é Streptococcus zooepidemicus.

Em outra configuração, a presente invenção usa uma fonte de carbono, íon metálico e composição de meios que otimizam a produção de HA de alto peso molecular.

Em uma configuração, HA é preparado por cultivo inicial do microorganismo Streptococcus zooepidemicus em um meio adequado, preparação esta seguida de fermentação do caldo em um fermentador de 1-10 litros a cerca de 30-40°C, com agitação a cerca de 300-500 rpm e aeração a 1-3 wm (volume/volume/minuto) por cerca de 15-28 horas, mantendo o pH em uma faixa neutra. (Taxa de aeração wm = fluxo de gás em volume por unidade de volume de líquido por minuto (volume por volume por minuto)).

Após incubação, o caldo de fermentação é diluído adequadamente com água e clarificado. O HA presente no caldo clarificado é reprecipitado com volumes iguais de solvente adequado, incluindo isopropanol, mas não se limitando a este. O HA de alto peso molecular precipitado é então convertido em seu sal, quando então ele pode ser solubilizado para o subsequente procedimento de purificação. Em uma configuração, o HA é convertido em seu sal sódico pela adição de acetato de sódio a 3% e homogeneizado até dissolução total.

Em uma configuração, a presente invenção proporciona condições de cultivo que otimizam o rendimento e o peso molecular de HA. Constatou-se que a produção de HA é um fenômeno associado ao crescimento. Pode-se produzir HA com alto peso molecular controlando as condições de cultivo. Por exemplo, o peso molecular do HA produzido aumenta com o crescimento das bactérias. No começo do processo de fermentação, a população de peso molecular mais baixo (~ 5.000 Da) é cerca de 60% do HA total. Cerca de 70% do HA total é de peso molecular alto (> 800 kDa) ao fim de 22 h de fermentação (Figura 4).

Além disso, podem ser usados diferentes metais no processo de fermentação de HA. Sabe-se que íons metálicos aumentam a produção de cápsula em várias bactérias. O efeito de CuSÜ4, MnSO4 e ZnSO4 a 0,025% (concentração final) sobre o rendimento de HA foi testado ao final de 24 horas de fermentação. Enquanto não houve diferença significativa entre o controle (sem adição de metal) e os frascos tratados com CUSO4 ou MnSO4, constatou-se que uma parte significativa (60%) do HA total do meio tratado com ZnSO4 ficou na região de alto peso molecular (> 800 kDa) (Figura 5).

Da mesma forma, a fonte de carbono, isto é, açúcar, do meio de cultura pode variar. O crescimento e a produção de HA em meio contendo vários tipos de açúcar foram testados. Diferentes açúcares em meio de cultura afetaram o peso molecular de HA durante a produção. Enquanto o crescimento foi bastante constante para a maioria dos açúcares (concentração final de 2%), lactose e sacarose deram rendimento melhor de HA de alto peso molecular (> 800 k) em comparação com glicose, a qual deu HA de peso molecular mais baixo. (Figura 6). O rendimento de HA obtido com o uso de sacarose foi no mínimo 10 vezes maior e o peso molecular de HA apresentado foi muito mais alto, em comparação com glicose. Como mostra a Figura 6, o peso molecular de HA usando sacarose com a presente invenção foi maior do que 8 χ IO5 Da (isto é, 800 kDa), enquanto em meio de glicose constatou-se um peso molecular entre 2 e 4 χ IO5 Da (isto é, 200-400 kDa).

O efeito dos meios sobre a produção de HA de alto peso molecular foi examinado. Em um experimento, foram variados os teores de açúcar e da enzima do hidrolisado de caseína do meio. Nesse experimento, o açúcar forneceu a energia necessária e a enzima de hidrolisato de caseína forneceu a fonte de nitrogênio necessária. A Figura 7 mostra os resultados quando a concentração de açúcar foi aumentada de 2% para 5% e quando a concentração da enzima de hidrolisato de caseína foi baixada no meio de 2,5 % para 1%. Os parâmetros proporcionaram um rendimento aumentado de 5-6 g/l de HA (Figura 7). "Açúcar" na Figura 7 refere-se a sacarose, "biomassa" refere-se à densidade de célula, que reflete o crescimento do microorganismo. O rendimento foi menor quando a concentração de açúcar foi menor (2%) assim como a concentração da enzima de hidrolisato de caseína foi mais alta (2,5%), ou quando somente a concentração de açúcar foi aumentada para 5% (dados não mostrados).

Em uma configuração, HA é preparado por um cultivo inicial do microorganismo Streptococcus zooepidemicus, em um meio adequado, e a fermentação subsequente do caldo em um fermentador de 1-10 1 a cerca de 30-40 0C, com agitação a cerca de 300-500 rpm e aeração a 1-3 vvm por cerca de 15-28 horas mantendo o pH na faixa de neutro.

Em uma configuração, a presente invenção proporciona um processo eficiente para remoção de impurezas de proteína do ácido hialurônico. A presente invenção emprega filtragem com gel de sílica e tratamento com carvão ativado para remoção eficiente de impurezas de proteína.

Em uma configuração, a presente invenção proporciona um processo eficiente de purificação do ácido hialurônico por diafiltragem. A presente invenção emprega quantidade menor de solvente no processo.

Após incubação, o caldo de fermentação é adequadamente diluído com água e clarificado. O HA presente no caldo clarificado é reprecipitado com volumes iguais de solvente adequado, incluindo isopropanol, mas não se limitando a este.

O HA de alto peso molecular precipitado é então convertido em seu sal e pode então ser solubilizado para o procedimento subsequente de purificação. A presente invenção converte o HA em seu sal sódico pela adição de acetato sódico a 3% e é homogeneizado até a dissolução total.

A presente invenção também proporciona um processo de purificação eficiente que remove impurezas de proteína do ácido hialurônico. O processo emprega filtragem com gel de sílica e tratamento com carvão ativado para remoção eficiente das impurezas de proteína. O tratamento inicial com gel de sílica remove cerca de 68-70% da proteína. Após a remoção do gel de sílica por centrifugação, o HA de alto peso molecular é tratado com carvão ativado, o qual remove então 85-90% da proteína. Em uma configuração, o processo envolve a passagem da amostra tratada de sílica através de um cartucho de celulose impregnado com carvão.

Em uma configuração, a solução obtida após a remoção das impurezas de proteína é ainda purificada por diafiltragem. A presente invenção emprega menos solvente no processo. Por exemplo, em uma configuração, a etapa de diafiltragem envolve diluição da solução de HA com o solvente, isto é, água isenta de pirogênio, e a diluição é feita somente 5 vezes, em comparação a 10 vezes descritas na Pat. norte-americana N2 6.489.467 (Carlino et al. (2002), Process for purifying high molecular weight hyaluronic acid), o qual reduz significativamente o manuseio de volume. Um modo contínuo de diafiltragem pode ser usado, o que envolve diluição com água estéril, isenta de pirogênio, por exemplo, cinco vezes. Em uma configuração, o processo envolve ainda o isolamento de ácido hialurônico purificado estéril por filtragem através de um filtro com poro de 0,22 μm. Em outra configuração, o produto hialuronato sódico para fins biomédicos pode ser obtido por filtragem asséptica. Opcionalmente, o hialuronato sódico pode ser reprecipitado com isopropanol para produzir HA purificado de alto peso molecular. O HA obtido pode ser liofilizado até o teor de umidade ser menor do que 5%.

Resumindo, a presente invenção proporciona um processo de purificação melhorado de HA que não emprega condições de pH ácido, e não usa nenhum detergente nem surfactante. A etapa de remoção das impurezas de proteína não emprega produtos químicos perigosos, como formalina. Além disso, o processo de purificação emprega menos diluições de solvente e portanto reduz a carga sobre o liofilizador.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

Os desenhos que se seguem fazem parte da presente especificação e foram incluídos para demonstrar melhor certos aspectos da presente revelação. Dessa forma, a invenção pode ser mais bem entendida por referência a um ou mais desses desenhos em combinação com a descrição detalhada das configurações aqui apresentadas.

Figura 1: Mostra a unidade de dissacarídeo que se repete no HA, compreendendo GlcUA e GlcNAc.

Figura 2: Mostra o caminho de biossíntese de HA em Streptococci.

Figura 3: Ilustra a folha de fluxo do processo de preparação de ácido hialurônico de alto peso molecular de grau médico.

Figura 4: Distribuição de HA de vários pesos moleculares durante o crescimento de S. zooepidemicus

Figura 5: Efeito dos íons metálicos sobre a população de HA de pesos moleculares variáveis.

Figura 6: Perfil de HPLC de HA a partir de meios contendo diferentes fontes de carbono. O meio de cultura foi suplementado com glicose, sacarose, lactose ou frutose em uma concentração final de 2%.

Figura 7: Otimização do meio para aumento do rendimento de HA. O teor inicial de sacarose foi de 5% e a concentração de hidrolisado de caseína foi de 1%. A "%" corresponde a g/100 ml de meio; "açúcar" refere-se a sacarose e "biomassa" é a densidade de célula refletindo o crescimento do microorganismo. A enzima do hidrolisado de caseína atua como uma fonte de nitrogênio durante o crescimento das bactérias.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

A presente invenção proporciona métodos de obtenção de alto rendimento de HA de grau médico de peso molecular alto a partir de caldo de fermentação bacteriana. A presente invenção também proporciona métodos econômicos de purificação de HA.

Definições:

O termo "ácido hialurônico" ou "HA" usado neste documento indica ácido hialurônico obtido de qualquer fonte biológica.

O termo "hialuronato" usado neste documento refere-se a qualquer forma de sal HA, como o sal sódico de HA.

O termo "alto peso molecular" usado neste documento refere-se a HA ou a um sal de HA com um peso molecular de no mínimo 1.000 kDa (1 milhão Da).

O termo "gel de sílica" significa uma forma granular, porosa, de sílica fabricada sinteticamente a partir de silicato sódico com porosidades variáveis, e continua sendo o adsorvente da mais alta capacidade disponível. Um exemplo é um gel de sílica vendido pela Ineos.

O termo "carvão ativado" significa um material com uma área de superfície excepcionalmente alta. Apenas um grama de carvão ativado tem uma área de superfície de aproximadamente 500 m2, tipicamente determinada por adsorção de gás nitrogênio, e inclui uma grande quantidade de microporosidade. Um exemplo é o vendido pela Millipore (Millistak +, minicápsula de Carvão Ativado M40AC23HH3).

O termo "diafiltrando" ou "diafiltragem" refere-se a um processo de filtração tangencial que permite a transferência de espécimes de baixo peso molecular, água e/ou solventes através de uma membrana sem alterar o volume da solução. Esse processo é usado para purificar espécimes de alto peso molecular retidos, aumentando a recuperação de espécimes de baixo peso molecular, troca de tampão e simplesmente alterando as propriedades de uma dada solução. Ele pode ser executado, por exemplo, por cartucho de membrana Sartocon modelo Nq 3051465001E-SG, 50 kDa MWCO.

O termo "pH neutro" significa pH igual a 7,0.

Em uma configuração, a fonte microbiana é uma espécie de Streptococcus capaz de produzir ácido hialurônico de alto peso molecular. Por exemplo, a fonte microbiana pode ser selecionada a partir de Streptoeoceus zooepidemieus, Streptoeoeeus equi e Streptoeoeeus pyogenes.

O termo "solvente" usado no presente documento indica quaisquer solventes orgânicos ou solventes inorgânicos. Em uma configuração, o solvente é isopropanol.

Como se observou anteriormente, a produção de HA é um fenômeno associado com o crescimento, e é inversamente relacionado com o crescimento. Em uma configuração da presente invenção, os parâmetros de cultivo e fermentação são selecionados de forma a balancear esses dois processos.

O peso molecular de HA aumenta com o tempo em cultivo, com cadeias menores sendo detectadas no início da fase de crescimento seguidas de HA de alto peso molecular sendo detectado durante a última parte do crescimento. Estudos anteriores, como os de Armstrong e Johns, sugeriram que a temperatura, o pH e a velocidade de agitação afetam o peso molecular de HA drasticamente ao se produzir HA em bactérias. Ao comparar os resultados com aqueles do estudo efetuado por Armstrong et al. (Armstrong e Johns, 1997) e outros processos convencionais, outros pesquisadores constataram que o pH e a velocidade de agitação não afetam o peso molecular de HA drasticamente durante a produção.

Na presente invenção, o uso de temperatura mais baixa e aeração, entre outros parâmetros, pode aumentar o rendimento de produção de HA e aumentar o peso molecular do HA que é produzido. Estudos anteriores constataram que a concentração inicial de glicose tem um efeito profundo no peso molecular de HA. Um grupo, Armstrong e Johns, ofereceu uma explicação, isto é, quando os monômeros de açúcar ativado UDP-GlcUA e UDP-GlcNAc estavam presentes em altas concentrações, o alongamento da cadeia de HA persistia. A concentração de glicose externa podia estar ligada às concentrações internas desses monômeros, porque eles eram derivados de glicose e sua síntese requeria consumo substancial de energia. (Armstrong e Johns, 1997).

Na presente invenção, entretanto, os inventores descobriram que a sacarose e a lactose são fontes melhores de carbono do que a glicose para a produção de HA de alto peso molecular. Devido ao fato de a sacarose e a lactose serem dissacarídeos, elas podem servir como fontes melhores de energia do que a glicose. A presente invenção em uma configuração proporciona que o crescimento baseado em sacarose e lactose em alta concentração, e proteína, como hidrolisado de caseína, em uma concentração baixa, gera 5- 6 g/l de HA de alto peso molecular. Constatou-se que o peso molecular de HA está na faixa de 3,5-4,0 x 10^6 Da.

O efeito de vários íons metálicos sobre o peso molecular do HA produzido também tem sido estudado. Os íons de metal presentes no meio de cultura são responsáveis por stress oxidativo das bactérias, nas quais radicais livres que estão sendo liberados durante o processo podem ter um efeito bactericida. Para evitá-lo, várias bactérias, particularmente algumas espécies de Pseudomonas, produzem EPSs (polissacarídeos extracelulares) como alginatos, etc., que ajudam as bactérias a invadir o hospedeiro, e assim sobreviver. Keith LMW, Bender CL. AlgT (ζ22) Controls Alginate Production and Tolerance to Environmental Stress in Pseudomonas syringae, J. Bacteriol., 181: 7176-7184 (1999).

Pelo menos um grupo sugeriu que as sintases de hialuronato de estreptococos e de mamíferos preferem íon de magnésio a outros íons metálicos para a produção de HA de alto peso molecular. (Yamada e Kawasaki, Microbial synthesis of hyaluronan and chitin: new approaches. J. Biosci. Bioeng. 99: 521-528, 2005). Yamada T e Kawasaki, 2005 proporciona um outro sistema novo de vírus Chlorella produtor de HA estimulado por íons de manganês, que produziu cerca de 0,5-1 g/l de HA. Na presente invenção, íons metálicos como os de Cu e Mn não induzem a produção de HA de alto peso molecular, apesar de que uma população significativa de HA no meio contendo Zn estava na faixa de peso molecular alto.

Resumindo, a presente invenção otimizou as condições de cultivo que resultaram em melhora do rendimento, como 5-6 g de HA/1, de HA de alto peso molecular. Em uma configuração, a enzima do hidrolisado de caseína é reduzida e a concentração de açúcar é aumentada no meio. Essas condições resultam em velocidade de crescimento mais baixa. Devido ao fato de a produção de HA ser inversamente proporcional ao crescimento, obtém-se um aumento no rendimento de HA. Em uma configuração, o peso molecular do HA obtido pela presente invenção é de cerca de 3,5 χ IO6 a 3,9 χ IO6 Da após 24 horas de fermentação.

Em uma configuração da presente invenção, um processo de produção de ácido hialurônico de alto peso molecular (HA) ou de seu sal com um peso molecular de no mínimo 1 milhão Da, processo este que compreende: (a) proporcionar uma bactéria capaz de produzir HA; (b) proporcionar um meio nutriente compreendendo um sal com íon metálico divalente (como MgS04, CuSO4 e MnSO4 e ZnSO4), hidrolisado de caseína e uma fonte de carbono (como lactose ou sacarose); (c) cultivo da bactéria no meio nutriente; e (d) fermentação, tal como fermentação contínua, o meio nutriente sob condições aeróbicas. As bactérias capazes de produzir HA incluem as selecionadas de um grupo que consiste em Streptococcus zooepidemieus, Streptococcus equi e Streptoeoeeus pyogenes.

Em outra configuração, ò meio nutriente compreende hidrolisado de caseína a 1% e/ou 5% de lactose ou sacarose. Em uma outra configuração, o meio nutriente compreende zinco, por exemplo, na forma de ZnSO4, hidrolisado de caseína em uma concentração de 10 g/l e uma fonte de carbono selecionada do grupo que consiste em lactose e sacarose em uma concentração de 50 g/l. Em outra configuração, a etapa de fermentação é conduzida por pelo menos 15 horas a uma temperatura de 30-40 0C, uma velocidade de agitação de 300-500 rpm, uma aeração de 1-3 vvm e um pH neutro.

Em outra configuração, o processo produz HA ou seu sal com um peso molecular na faixa de cerca de 3,5 χ IO6 Da a 4,0 χ IO6 Da. Em uma configuração, o processo produz no mínimo 5 g de HA de alto peso molecular por litro de meio nutriente.

Em uma configuração, o peso molecular do HA é no mínimo de 3 χ 10^6 Da após 24 horas de fermentação.

A presente invenção também proporciona um método de remoção de impurezas de proteína do HA produzido, o qual compreende as duas etapas de tratamento com gel de sílica seguidas por tratamento com carvão ativado. Uma etapa subsequente de diafiltragem também ajuda a assegurar um sal de HA altamente purificado. O produto assim obtido pode então ser filtrado assepticamente para aplicações biomédicas.

Os processos de purificação anteriormente conhecidos precipitam HA com o uso de detergentes ou surfactantes, como cetil piridínio cloreto ou hexadeciltrimetil amônia brometo. Isto requer, entretanto, etapas múltiplas para remover o detergente ou surfactante residual. A presente invenção proporciona um método de purificação eficiente de HA, que não emprega detergentes ou surfactantes.

Processos conhecidos anteriormente de purificação de HA usando técnicas de diafiltragem envolvem um grande número de diluições com solvente, por exemplo fazer 10 diluições. Vide a patente norte-americana Ns 6.489.467 (Carlino et al., Process for purifying high molecular weight hyaluronic acid (2002)). O uso de grandes volumes de solvente cria problemas durante o manuseio em larga escala, como vasos de processamento maiores e tempo maior para completar o processo e, naturalmente, custo de produção mais alto. A presente invenção evita esses problemas usando menos diluições.

Em uma configuração, um processo de purificação de ácido hialurônico (HA) ou seu sal, a partir de um caldo de fermentação, compreende: (a) diluição e clarificação do caldo de fermentação; (b) precipitação do HA presente no caldo com um volume igual de um solvente, como isopropanol, etanol ou acetona; (c) dissolução do HA precipitado ou de seu sal em uma solução, como acetato sódico a 3%; (d) adição de gel de sílica à solução de HA ou solução de sal de HA da etapa (c) e então remoção do gel de sílica, por exemplo por centrifugação; (e) tratamento da solução de HA ou solução de sal de HA da etapa (d) com carvão ativado; e (f) diafiltragem da solução de HA ou solução de sal de HA da etapa (e) usando um solvente, como água estéril isenta de pirogênio em cerca de 5 volumes; o processo é então conduzido na ausência de qualquer detergente ou surfactante ou formalina, e a um pH neutro.

Em outra configuração, o processo compreende ainda a conversão do HA precipitado na etapa (b) em seu sal, e então a homogeneização do sal de HA na solução da etapa (c). Em outra configuração, o carvão ativado é impregnado no cartucho de celulose na etapa (e). Em outra configuração, o processo compreende ainda o isolamento de HA estéril purificado ou seu sal por filtragem através de um filtro asséptico, e/ou liofilização do Ha ou de seu sal até o teor de umidade ser menor do que 5%.

Os exemplos que se seguem foram incluídos para demonstrar as configurações preferidas da invenção. Os peritos na arte devem apreciar que as técnicas reveladas nos exemplos que se seguem representam técnicas descobertas pelo inventor para funcionar bem na prática da invenção, e assim podem ser consideradas como os modos preferidos parra sua prática. Entretanto, os peritos na arte devem, à luz da presente revelação, apreciar que muitas alterações podem ser feitas nas configurações específicas que são reveladas e que ainda obtêm o mesmo resultado ou semelhante sem divergir do espírito e do escopo da invenção.

EXEMPLO 1: Linhagem bacteriana e meios.

Streptococcus equi, subespécie zooepidemicus ATCC 39920 foi obtido da Coleção Americana de Cultura de Tipo. As bactérias foram mantidas em agar de infusão de coração/cérebro ou caldo de soja tríptico.

EXEMPLO 2: Estimativa de HA

HA foi estimado rotineiramente pelo ensaio de carbazol (Bitter, T.,e Muir M., A modified uronic acid carbazole reaction. Anal Biochem 4: 330-334, 1962) no caldo fermentado após precipitação com volume igual de isopropanol e redissolução em solução de acetato sódico a 3%.

EXEMPLO 3: Otimização do meio

Para os experimentos de otimização do meio, o Streptococcus zooepidemicus foi cultivado em um meio constituído de enzima de hidrolisado de caseína a 2,5%, extrato de levedura a 1%, K2HPO4 a 0,2%, NaCl a 0,15%, MgSO4JH2O a 0,04% e fonte de carbono a 2% (sacarose). O organismo foi cultivado em frascos Erlenmeyer a 37 °C a 200 rpm por 24 horas. Para avaliar o efeito dos íons de metal sobre a produção de HA, soluções filtradas esterilizadas de CuSO4, ZnSO4 e MnSO4 foram adicionadas ao meio em concentração final de 0,025%. Veja a Figura 5.

EXEMPLO 4: Determinação do peso molecular

O peso molecular de HA foi determinado por cromatografia de exclusão de tamanho em HPLC usando colunas Shodex OH-Pak SB805804HQ conectadas em série. A fase móvel usada foi NaNÜ3 a 1 M com velocidade de fluxo de 1 ml/min e os picos foram detectados com o uso de um detector RI. A coluna foi calibrada com padrões de pullulan de tamanhos moleculares variáveis.

EXEMPLO 5: Remoção de impurezas de proteína

Tratamento com gel de sílica

Uma parte da suspensão homogeneizada, 100 ml, foi tratada em modo de lote com gel de sílica com concentração final de 2% para adsorção de proteína. Esta etapa remove 68-70% da proteína. O gel de sílica é separado da solução de hialuronato sódico por centrifugação a 12.000 rpm por 20 min a 4 °C.

Tratamento com carvão ativado

Foi realizado tratamento adicional da solução de ácido hialurônico de alto peso molecular com montagem de filtro de 0,45 μ adsorvido de carvão (Millipore, Millistak +, minicápsula de Carvão Ativado M40AC23HH3). A velocidade de fluxo foi 14 ml/min. Esta etapa removeu 85-90% da proteína restante.

EXEMPLO 6: Purificação

Modo contínuo de diaflltragem

O fluxo através do filtro de carvão ainda foi purificado usando o modo contínuo do processo de diafiltragem. A solução diluída de HA foi bombeada (velocidade de fluxo de 15 ml-20 ml/min) para o suporte do filtro tangencial (cross flow) equipado com cassete de sulfona de poliéter de corte de 50 kDa. (cassete de membrana Sartocon modelo N° 3051465001E-SG). No início da alimentação do caldo aquoso no filtro, a válvula de permeado foi fechada para recircular o caldo aquoso por várias vezes até o sistema se estabilizar e não se verem bolhas no retido.A válvula de permeado foi aberta após 10 min e o caldo aquoso foi recirculado no reservatório de alimentação por 10 min adicionais para assegurar que não ocorresse mais fluxo de HA ao longo da membrana através da válvula de permeado. Após 15 min, o permeado e o retido foram coletados separadamente. Cinco volumes equivalentes de água destilada estéril isenta de pirogênio foram adicionados continuamente ao reservatório contendo a solução de HA. Esta adição de água à solução de HA foi feita com a mesma velocidade de fluxo da velocidade do fluxo de saída do filtrado. A pressão da entrada do suporte de filtro tangecial (cross flow) foi mantida em cerca de 0,5-1,5 bar. O retido foi usado para recuperação adicional de ácido hialurônico e o permeado foi descartado. Essencialmente, o permeado não continha HA. O retido foi concentrado para o volume original e analisado quanto à pureza. A etapa de diafiltragem remove 80-85% da proteína restante.

Filtragem asséptica

A solução concentrada de ácido hialurônico do processo de diafiltragem é finalmente submetida à filtragem asséptica de 0,22 μπα. (Stericup Millipore: SCGPU02RE, material de filtro PVDF) que torna o produto qualificado para aplicação biomédica. O produto assim formado foi liofilizado para obter hialuronato sódico de grau médico de alto peso molecular.

EXEMPLO 7: Parâmetros otimizados de preparação e purificação de HA

Streptococcus zooepidemicus ATCC 39920 foi cultivado em um meio composto de extrato de levedura a 1%, enzima de hidrolisado de caseína a 1%, K2HPO4 a 0,2%, NaCl a 0,15%, MgSO4JH2O a 0,04% e sacarose a 5%. O organismo foi cultivado em meio de 1 1 a 37 0C a 400 rpm por 24 h com aeração de 1 wm. O pH do meio foi mantido a 7,0 por adição contínua de solução aquosa de NaOH. Após a incubação, o caldo foi diluído com 1 volume de água e clarificado por centrifügação a 10.000 rpm por 20 min a 4°C. O HA do caldo clarificado foi precipitado com volume igual de isopropanol. o precipitado separado por centrifügação a 10.000 rpm por 20 min a 4°C foi suspenso em 1 1 de acetato sódico a 3% usando um homogeneizador mecânico (Kinematica-A.G., polytron PT 2100) a 15.000 rpm por 10 min χ 3 ciclos. A solução homogeneizada foi então tratada com gel de sílica em concentração final de 2% para adsorção de proteína. Esta etapa remove 85% da proteína. O gel de sílica é separado da solução de hialuronato sódico por centrifügação a 12.000 rpm por 20 min a 4°C. Fez-se tratamento adicional da solução de ácido hialurônico de alto peso molecular com montagem de filtro de 0,45 μιη de carvão adsorvido (Millipore Millistak +, minicápsula de Carvão Ativado M40AC23HH3). A velocidade de fluxo foi de 14 ml/min. Esta etapa removeu 60% da proteína restante.

O fluxo através do filtro de carvão foi ainda purificado com o uso de processo de diafiltragem de modo contínuo. A solução diluída de HA foi bombeada (velocidade de fluxo de 15 ml-20 ml/min) para o suporte do filtro tangencial equipado com cassete de sulfona de poliéter de corte de 50 kDa. (cassete de membrana Sartocon modelo N2 3051465001E-SG). No início da alimentação do caldo aquoso no filtro, a válvula de permeado foi fechada para recircular o caldo aquoso por várias vezes até o sistema se estabilizar e não se verem bolhas no retido.A válvula de permeado foi aberta após 10 min e o caldo aquoso foi recirculado no reservatório de alimentação por 10 min adicionais para assegurar que não ocorresse mais fluxo de HA ao longo da membrana através da válvula de permeado. Após 15 min, o permeado e o retido foram coletados separadamente. Cinco volumes equivalentes de água destilada estéril isenta de pirogênio foram adicionados continuamente ao reservatório contendo a solução de HA. Esta adição de água à solução de HA foi feita com a mesma velocidade de fluxo da velocidade do fluxo de saída do filtrado. A pressão da entrada do suporte do filtro tangencial foi mantida em cerca de 0,5-1,5 bar. O retido foi usado para recuperação adicional de ácido hialurônico e o permeado foi descartado. Essencialmente, o permeado não continha HA. O retido foi concentrado para o volume original e analisado quanto à pureza. A etapa de diafiltragem remove 70% da proteína restante.

A solução concentrada de ácido hialurônico do processo de diafiltragem é finalmente submetida à filtragem asséptica de 0,22 μm. (Stericup Millipore: SCGPU02RE, material de filtro PVDF) que torna o produto qualificado para aplicação biomédica. O produto assim formado foi liofilizado para obter hialuronato sódico de grau médico de alto peso molecular com um teor residual de proteína de 0,031 % no que se refere a HA com uma recuperação de 51%.

EXEMPLO 8

Aumentou-se a escala do processo do Exemplo 1 para até 10 1. A recuperação de HA e o perfil de purificação puderam ser reproduzidos. O produto final resultou em um produto com 0,066% de proteína no que se refere a HA e a recuperação de HA foi de 82%.

EXEMPLO 9: Análise relativa

A tabela seguinte indica a análise relativa:

<table>table see original document page 29</column></row><table>

EXEMPLO 10: Especificação do produto

O produto final foi testado quanto à sua proteína, ácido nucléico, aparência, pH, teor de ácido glicurônico, peso molecular, espectros IR, teor de cloreto e teor de umidade. Foi produzido HA com peso molecular de 3,0-3,5 milhões de dáltons. Os testes mencionados acima e as especificações do material estão em conformidade com a definição da Farmacopéia Britânica 2003. Resultados comparativos estão tabulados abaixo:

<table>table see original document page 29</column></row><table> <table>table see original document page 30</column></row><table>

Determinação do peso molecular

O peso molecular de HA foi determinado por cromatografia por exclusão de tamanho em coluna Shodex OH Pak SB 804-805HQ por HPLC. A fase móvel usada foi - NaNC>3 a 0,1 Ma uma velocidade de fluxo de 1 ml/min usando um detector RI. 0 peso molecular foi 3,9 χ 106 D A em 24 h.

Todas as composições e métodos revelados e reivindicados no presente documento podem ser feitos e executados sem experimentação indevida à luz da presente revelação. Enquanto as composições e métodos desta invenção foram descritos em termos de configurações preferidas, estará claro para os peritos na arte que podem ser aplicadas variações às composições e/ou métodos e às etapas ou à seqüência de etapas dos métodos descritos no presente documento, sem divergência do conceito, espírito e escopo da invenção. Mais especificamente, ficará claro que certos agentes relacionados quimicamente ou fisiologicamente podem substituir os agentes descritos no presente documento enquanto os mesmos resultados ou resultados semelhantes sejam obtidos. Todos esses substitutos e modificações semelhantes claras para os peritos na arte são considerados como estando dentro do espírito, escopo e conceito da invenção.

Claims (25)

1. Processo para a produção de ácido hialurônico (HA) ou seu sal, que compreende: (a) fornecer uma bactéria capaz de produzir HA; (b) fornecer um meio nutriente para o cultivo da bactéria, compreendendo sal de íons metálicos divalentes, hidrolisado de caseína a 1% e 5% de fonte de carbono selecionada a partir do grupo que consiste em lactose e sacarose; (c) cultivar a bactéria no meio nutriente; e (d) fermentar o meio nutriente sob condições aeróbicas, caracterizado pelo fato de que o ácido hialurônico tem peso molecular de, no mínimo, 1 milhão Da.

2. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato da fermentação ser contínua;

3. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato do sal de íons metálicos divalente ser selecionado de MgS04, CuSÜ4, MnSO4 e ZnS04.

4. Processo de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato do sal ser ZnSO4.

5. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato da etapa de fermentação ser conduzida por, no mínimo, 15 horas a uma temperatura de 30 a 40°C, sob agitação a uma velocidade de 300-500 rpm, aeração de 1-3 vvm, com pH neutro.

6. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que HA tem peso molecular na proporção de aproximadamente 3,5x10^6 a 4,0x10^6 Da e o processo de produção tem um rendimento de, no mínimo, 5g de HA de elevado peso molecular por litro de meio nutriente.

7. Processo de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato do peso molecular do HA ser de, no mínimo, 3 χ IO6 Da após 24 horas de fermentação.

8. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato da bactéria ser selecionada a partir do grupo que consiste em Streptococcus zooepidemicus, Streptococcus equi e Streptoeoceus pyogenes.

9. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato do meio nutriente compreender hidrolisado de caseína a 1% e 5% do açúcar.

10. Processo de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato da bactéria ser Streptoeoceus zooepidemicus.

11. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato da etapa de fermentação ser conduzida por, no mínimo, 15 horas a uma temperatura de 30 a -40°C, sob agitação a uma velocidade de 300-500 rpm, aeração de 1-3 vvm, com pH neutro.

12. Processo para a purificação de ácido hialurônico (HA) ou seu sal a partir do caldo de fermentação bacteriana, que compreende: (a) diluir e clarificar o caldo de fermentação; (b) precipitar o HA presente no caldo com igual volume de solvente; (c) dissolver em solução o HA precipitado ou seu sal; (d) adicionar sílica gel à solução de HA, ou solução de sal de HA a partir da etapa (c) e, em seguida, remover a sílica gel; (e) tratar a solução de HA, ou solução de sal de HA a partir da etapa (d) com carbono ativo; e (f) efetuar a diafiltragem da solução de HA, ou solução de sal de HA a partir da etapa (e) utilizando em torno de 5 volumes de solvente; caracterizado pelo fato do processo ser conduzido na ausência de detergentes ou surfactantes ou formalina, com pH neutro.

13. Processo de acordo com a reivindicação 13, caracterizado por compreender ainda, converter o HA precipitado na etapa (b) ao seu sal e, em seguida, homogeneizar o sal de HA na solução da etapa (c).

14. Processo de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato do solvente utilizado na etapa (b) ser selecionado a partir de isopropanol, etanol e acetona.

15. Processo de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato do solvente ser isopropanol.

16. Processo de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato da solução na etapa (c) ser acetato de sódio a 3%.

17. Processo de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato da sílica gel ser removida por centrifugação na etapa (d).

18. Processo de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato do carbono ativo ficar impregnado no cartucho de celulose na etapa (e).

19. Processo de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato do solvente na etapa (f) ser água livre de pirogênio estéril.

20. Processo de acordo com a reivindicação 13, caracterizado por compreender ainda: (a) isolar o HA purificado estéril, ou seu sal, por filtragem em filtro asséptico; e (b) liofllizar o HA purificado, ou seü sal, até o teor de umidade ficar abaixo de 5%.

21. Processo de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato do solvente da etapa (b) ser isopropanol, e o método ainda compreender uma etapa (g) liofilizar o HA, ou seu sal, até o teor de umidade ficar abaixo de 5%.

22. Processo para a produção de ácido hialurônico (HA) ou seu sal, que compreende: (a) fornecer uma bactéria capaz de produzir HA; (b) fornecer um meio nutriente para o cultivo da fonte microbiana, compreendendo sal de íons metálicos divalentes, hidrolisado de caseína a 1% e 5% de fonte de carbono selecionada a partir do grupo que consiste em lactose e sacarose; (c) cultivar a bactéria no meio nutriente; (d) fermentar o meio nutriente sob condições aeróbicas; (e) diluir e clarificar o meio nutriente; (f) precipitar o HA presente no meio diluído com solvente; (g) dissolver em solução o HA precipitado ou seu sal; (h) adicionar sílica gel à solução de HA, ou solução de sal de HA a partir da etapa (g) e, em seguida, remover a sílica gel; (i) tratar a solução de HA, ou solução de sal de HA a partir da etapa (h) com carbono ativo; e (j) efetuar a diafiltragem da solução de HA, ou solução de sal de HA a partir da etapa (i) utilizando um solvente; caracterizado pelo fato de o processo ser conduzido na ausência de detergentes ou surfactantes ou formalina, com pH neutro; em que o HA tem peso molecular de, no mínimo, 1 milhão Da.

23. Processo para a produção de ácido hialurônico (HA) ou seu sal, que compreende: (a) fornecer Uma bactéria capaz de produzir HA; (b) fornecer um meio nutriente para o cultivo da bactéria, compreendendo zinco, hidrolisado de caseína a uma concentração de 10 g/L e fonte de carbono selecionada a partir do grupo que consiste em lactose e sacarose a uma concentração de 50 g/L; (c) cultivar a bactéria no meio nutriente; e (d) fermentar o meio nutriente sob condições aeróbicas, caracterizado pelo fato de que o ácido hialurônico tem peso molecular de, no mínimo, 1 milhão Da.

24. Ácido hialurônico, ou seu sal, caracterizado por ser produzido pelos processos definidos nas reivindicações 1,7, 13, 14, 24 ou 25.

25. Ácido hialurônico, ou seu sal, bem como seu método de preparação segundo as reivindicações acima ilustradas substancialmente nos exemplos e figuras.